JP6764651B2 - 細胞接着分子発現抑制剤 - Google Patents
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Description
霊芝(Ganoderma lucidum)の乾燥物20gに400mLの精製水を加え、95〜100℃で2時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥して霊芝熱水抽出物を1.4g得た。
霊芝(Ganoderma lucidum)の乾燥物100gに900mLのエタノールを加え、常温で7日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、霊芝エタノール抽出物を1.6g得た。
黒霊芝(Ganoderma sinensis)の乾燥物20gに400mLの精製水を加え、95〜100℃で2時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥して黒霊芝熱水抽出物を1.1g得た。
黒霊芝(Ganoderma sinensis)の乾燥物100gに900mLのエタノールを加え、常温で7日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、黒霊芝エタノール抽出物を1.4g得た。
霊芝(Ganoderma lucidum)の胞子乾燥物20gを微粒化処理し、400mLの精製水を加え、95〜100℃で2時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥して霊芝胞子熱水抽出物を1.2g得た。
霊芝(Ganoderma lucidum)の胞子乾燥物100gを微粒化処理し、900mLのエタノールを加え、常温で7日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、霊芝胞子エタノール抽出物を1.5g得た。
<処方>
成分 含有量(%)
1.霊芝熱水抽出物(製造例1) 30.0
2.米胚芽油 60.0
3.ミツロウ 7.0
4.ビタミンE 3.0
<製造方法>
成分1〜4を混合し、ゼラチン、グリセリン、カラメル色素で構成される被膜に、250mg充填し、乾燥後、軟カプセル剤を得る。
<用法>
1日当り4粒摂取する。
<処方>
成分 含有量(%)
1.黒霊芝熱水抽出物(製造例3) 20.0
2.コーンスターチ 72.0
3.ショ糖脂肪酸エステル 8.0
<製造方法>
成分1〜3を混合し、2号硬カプセルに250mg充填してカプセル剤を得る。
<用法>
1日当り4粒摂取する。
<処方>
成分 含有量(%)
1.霊芝熱水抽出物(製造例1) 0.5
2.クエン酸 6.0
3.ショ糖 10.0
4.香料 1.0
5.水 82.5
<製造方法>
成分1〜4を成分5の一部の水に撹拌溶解する。次いで、成分5の残りの水を加えて混合し、殺菌したものを飲料とする。
<用法>
1日当り50mL摂取する。
<処方>
成分 含有量(%)
1.霊芝エタノール抽出物(製造例2) 8.0
2.乳糖 80.0
3.セルロース 12.0
<製造方法>
成分1〜3を乾式法により造粒し、顆粒剤を得る。
<用法>
1日当り1g摂取する。
<処方>
成分 含有量(%)
1.霊芝胞子熱水抽出物(製造例5) 11.0
2.乳糖 60.0
3.還元麦芽糖水飴 25.0
4.ショ糖脂肪酸エステル 4.0
<製造方法>
成分1〜4を混合して打錠成型し、0.5gの錠剤を得る。
<用法>
1日当り2粒摂取する。
<処方>
成分 含有量(%)
1.黒霊芝エタノール抽出物(製造例4) 0.1
2.カラギーナン 2.0
3.ゼラチン 1.0
4.砂糖 28.5
5.精製水 68.4
<製造方法>
成分1〜5を混合し、加熱しながら煮詰め、ゼリーの型に流し込み、冷却する。
<用法>
1日当り1個(100g)を摂取する。
比較例1
実施例1の軟カプセル剤において、霊芝熱水抽出物を米胚芽油に置き換えたものを従来の軟カプセル剤とした。
細胞は血管内皮細胞HUVEC(クラボウ)、培地はHumedia−EG2(クラボウ)を用いて細胞培養を行った。コンフルエントにしたHUVECに、血管内皮細胞機能障害を誘発する物質として、酸化LDLに含まれる7−ケトコレステロールを7.5μg/mL、霊芝熱水抽出物(製造例1)を1mg/mLとなるように添加して培養した。次いで、回収した細胞を超音波粉砕して、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。分離後、Immunobilon−P膜(ミリポア)に転写してブロッキングし、抗ICAM−1抗体(ウサギポリクローナル抗体、Proteintech)、抗ウサギIgG抗体(ヤギポリクローナル抗体、Rockland)を反応させた。次いで、ECL Prime Western Blotting Detection Reagent(GE Healthcare)により発した蛍光シグナルをライトキャプチャーAE6972(ATTO)にて検出し、CS Analyzer(ATTO)にて定量した。また、抗β−Actin抗体(マウスモノクローナル抗体、Abcam)、抗マウスIgG抗体(ウマポリクローナル抗体、Vector Laboratories)を用いた同様の方法により、β−Actinの定量を行い、ICAM−1とβ−Actinの比率からICAM−1タンパク質発現量を算出した。そして、7−ケトコレステロール未添加のタンパク質発現量を1として、7−ケトコレステロール及び霊芝熱水抽出物を添加した際のタンパク質発現量比を算出した。
細胞は血管内皮細胞HUVEC(クラボウ)、培地はHumedia−EG2(クラボウ)を用いて細胞培養を行った。コンフルエントにしたHUVECに、7−ケトコレステロールを10μg/mL、霊芝熱水抽出物(製造例1)、黒霊芝熱水抽出物(製造例3)、又は霊芝胞子熱水抽出物(製造例5)を1mg/mLとなるように添加して24時間培養した。RNAiso Plus(タカラバイオ株式会社)を用いてRNAを抽出し、High Capacity RNA−to−cDNA Kit(ライフテクノロジーズジャパン株式会社)によりcDNA溶液を調製した。調製したcDNAを用いて、Step One Plus(Applied Biosystems)によるリアルタイムPCR法で遺伝子発現解析を行った。遺伝子発現解析は、血管内皮細胞機能障害に関連する遺伝子であるICAM−1、VCAM−1、セレクチン、PAI−1、MCP−1、eNOSで行った。その際、GAPDH(Glyceraldehyde−3−Phosphate Dehydrogenase)を内部標準として、目的遺伝子とGAPDHの比率から発現量を算出した。そして、7−ケトコレステロールにより変動した遺伝子発現量を1として、霊芝熱水抽出物、黒霊芝熱水抽出物、霊芝胞子熱水抽出物を添加した際の遺伝子発現量比を算出した。尚、遺伝子発現解析に使用したプライマーは次の通りである。
CCGGTATGAGATTGTCATCATCA(配列番号1)
GGCCTGCAGTGCCCATTATGA(配列番号2)
VCAM−1用のプライマーセット
CAAATCCTTGATACTGCTCATC(配列番号3)
TTGACTTCTTGCTCACAGC(配列番号4)
セレクチン用のプライマーセット
CTGCCTGTACCAATACATCC(配列番号5)
CAGTTCACAATTTGCTCACAC(配列番号6)
PAI−1用のプライマーセット
CGTGGTTTTCTCACCCTATGG(配列番号7)
CTGGGTTTCTCCTCCTGTTGTC(配列番号8)
MCP−1用のプライマーセット
TCAGCCAGATGCAATCAATGC(配列番号9)
GGACACTTGCTGCTGGTGATTC(配列番号10)
eNOS用のプライマーセット
CCTGTGTATGGATGAGTATGAC(配列番号11)
CGGATCTTATAACTCTTGTGCT(配列番号12)
GAPDH用のプライマーセット
TGCACCACCAACTGCTTAGC(配列番号13)
TCTTCTGGGTGGCAGTGATG(配列番号14)
細胞は血管内皮細胞HUVEC(クラボウ)、培地はHumedia−EG2(クラボウ)を用いて細胞培養を行った。コンフルエントにしたHUVECに、7−ケトコレステロールを7.5μg/mL、霊芝熱水抽出物(製造例1)を1mg/mLとなるように添加して24時間培養した。次いで、BCECF(2',7’−Bis(carboxyethyl)−4 or 5−carboxyfluorescein、株式会社同仁化学研究所)で標識した単球THP−1(理化学研究所バイオリソースセンター)を加えて4時間培養した。培養後に未接着のTHP−1を取り除き、SPECTRA MAX GEMIN EM(モレキュラーデバイスジャパン株式会社)により蛍光強度を測定することで、接着した単球数を比較した。
健康な男女20人(27〜62歳)を10人ずつ対照群及び試験群に分け、対照群には従来の軟カプセル剤(比較例1)、試験群には霊芝を含有する軟カプセル剤(実施例1)を用いて、1回4粒を1日1回、12月〜2月の3ヶ月間摂取させ、試験期間中の急性上気道炎の罹患回数と罹患時の自覚症状に関するアンケートを行った。アンケートでは、罹患時の自覚症状の程度について、「少しある」「ある」「ひどい」の3段階の回答を設け、「少しある」を1点、「ある」を2点、「ひどい」を3点として、期間中における罹患一回あたりの自覚症状の程度の平均点を算出した。
Claims (1)
- 霊芝(赤芝)熱水抽出物及び/又は黒霊芝熱水抽出物を含有することを特徴とする7−ケトコレステロール処理された血管内皮細胞のVCAM−1又はセレクチン発現抑制剤(動脈硬化症の予防剤を除く)。
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JP2016001648A JP6764651B2 (ja) | 2016-01-07 | 2016-01-07 | 細胞接着分子発現抑制剤 |
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2016
- 2016-01-07 JP JP2016001648A patent/JP6764651B2/ja active Active
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