CN102526026A

CN102526026A - 15-苄亚基-14-脱氧-11,12-脱氢穿心莲内酯衍生物在制备保肝药物中的用途

Info

Publication number: CN102526026A
Application number: CN2012100296336A
Authority: CN
Inventors: 戴桂馥; 徐海伟; 赵靖; 蒋志雯; 王亚楠; 王杭; 吴笛; 刘宏民
Original assignee: Zhengzhou University
Current assignee: Zhengzhou University
Priority date: 2012-02-10
Filing date: 2012-02-10
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2032-02-10
Also published as: CN102526026B

Abstract

本发明公开了如通式1所示穿心莲内酯衍生物的药物用途，涉及其在肝损伤保护方面的应用，属药物化学领域。本发明通过建立刀豆蛋白a诱导的免疫性肝损伤模型和四氯化碳、乙醇诱导的化学性肝损伤模型，证实该类化合物对肝损伤具有显著的保护作用，为肝损伤的预防及治疗提供了一种新的药物来源。通式1。

Description

15-苄亚基-14-脱氧-11,12-脱氢穿心莲内酯衍生物在制备保肝药物中的用途

技术领域

本发明涉及对肝损伤具有保护作用的穿心莲内酯衍生物，具体涉及15-苄亚基-14-脱氧-11,12-脱氢穿心莲内酯衍生物的保肝作用，属药物化学领域。

背景技术

肝脏疾病是世界范围内常见病，多发病。肝损伤是肝脏受到外界因素的入侵，从而引起的肝脏受损。许多因素，如病毒、生物、药物、理化、酒精等，都可导致肝损伤。当前我国肝脏疾病以病毒性感染为主，而乙型及丙型肝炎病毒感染已成为我国最主要的致病及致死因素之一。全世界无症状乙肝病毒携带者（HBsAg携带者）超过2.8亿，而我国约占9300万。其中约有30%的乙肝病毒携带者出现肝损伤的临床表现。现代医学从多方面研究了肝损伤的发生机制，并研制开发出了膜保护剂、抗脂质过氧化剂、抗免疫反应剂等保肝药物。

穿心莲内酯是穿心莲Andrographis paniculata (Burm.f.)Nees 中提取的二萜内酯类化合物，是中药穿心莲的主要有效成份之一。临床上主要用于治疗上呼吸道感染、细菌性痢疾等。近年来，穿心莲内酯在抗肿瘤、保肝利胆、抗病毒等方面的应用研究不断深入。穿心莲内酯对多种动物实验性肝损伤具有良好的保护作用。姚青等发现穿心莲内酯对可卡因引起的急性肝脏损害有一定的保护作用，其保肝机制可能与抑制脂质过氧化反应，降低组织中氧自由基的生成有关。Visen PK与Handa S皆证明穿心莲内酯对扑热息痛诱导的肝损伤具有保护作用，其中Handa S的研究还显示穿心莲内酯对半乳糖胺引起的肝中毒具有保护作用。Kapil A等证明了穿心莲内酯、穿心莲内酯甙和新穿心莲内酯对四氯化碳和叔丁基过氧化氢引起的肝中毒具有保护作用。Singha P等的研究显示穿心莲内酯对乙醇引起的小鼠肝肾损伤具有一定的保护作用。Roy DN等的研究证明穿心莲内酯与D-青霉胺联合治疗铜中毒比单一D-青霉胺在抗纤维化及细胞坏死方面效果更佳。宁光等在其申请的专利中公开了穿心莲内酯作为制备治疗急性肝损伤药物的应用, 穿心莲内酯可以显著抑制刀豆素A诱发的肝损伤, 抑制刀豆素A引起的肝细胞的凋亡, 抑制肝脏的炎症反应。因此，可以用来治疗刀豆素A诱发的肝损伤。

本发明人在前期研究中（CN 1978437；CN100999520；CN100999535; CN101003527）打破传统的结构修饰模式，获得了大量结构新颖的化合物。本发明人已对该类化合物在抗肿瘤、抗炎，以及抗 HBV方面的应用申请了专利保护，进一步通过对15-苄亚基-14-脱氧-11,12-脱氢穿心莲内酯衍生物及其3，19酯化物的保肝作用进行优选，发现该类化合物对刀豆蛋白A（ConA）和四氯化碳、乙醇诱导的小鼠肝损伤具有显著的保护作用，且其效果显著优于母体化合物。

发明内容

本发明人在前期研究成果的基础上，通过对合成的化合物进行保肝活性筛选，发现通式1 结构的穿心莲内酯衍生物具有显著的预防和治疗肝损伤的作用。本发明目的在于提供15-苄亚基-14-脱氧-11,12-脱氢穿心莲内酯衍生物在制备保肝药物中的应用。

15-苄亚基-14-脱氧-11,12-脱氢穿心莲内酯衍生物具有通式1所示结构。

通式1

其中：R₁为氢；R₂为苯基、4-氟苯基、4-氯苯基、4-溴苯基、3-氟苯基、3-氯苯基、3-溴苯基；R₃、R₄各自为氢或COR₅；R₅为3-吡啶基。

优选化合物为：R₁为氢；R₂为苯基、4-氯苯基、3-溴苯基；R₃、R₄为氢。

优选化合物为：R₁为氢；R₂为4-氯苯基；R₃、R₄为COR₅；R₅=3-吡啶基。

更优选化合物A: R₁=H，R₂=4-Cl-C₆H₄， R₃= R₄=H；

B: R₁=H，R₂=C₆H₅， R₃= R₄=H；

C: R₁=H，R₂=3-Br-C₆H₄， R₃= R₄= H；

D: R₁=H，R₂=4-Cl-C₆H₄， R₃= R₄=COR₅，R₅=3-吡啶基；

本发明提出的上述化合物其制备方法已在发明专利 CN: 200510107247.4中公开，其合成方法如下：将14-脱氧-11,12-脱氢穿心莲内酯或者14-脱氧-11,12-脱氢-3,19-酯化穿心莲内酯中的一种与不同的醛溶解于甲醇或者乙醇或者四氢呋喃中，在碱催化下，于温度15~70℃下加热反应即可得到通式1所示的穿心莲内酯衍生物。其中所用的碱是碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钾、碳酸氢钠、三乙胺、吡啶、N,N-二甲基氨基吡啶中的一种；其用量为0.2~5%摩尔。所用醛是芳香醛，优选苯甲醛、卤代苯甲醛等，更优选对氟苯甲醛，对氯苯甲醛，对溴苯甲醛, 间氟苯甲醛，间氯苯甲醛，间溴苯甲醛；所用14-脱氧-11,12-脱氢-3,19-酯化穿心莲内酯与通式1中当 R₃、R₄为COR₅，R₅为3-吡啶基时相对应。

为实现本发明目的，采用刀豆蛋白A（ConA）诱导的免疫性肝损伤模型，研究15-苄亚基-14-脱氧-11,12-脱氢穿心莲内酯衍生物对小鼠血清中谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）活力的影响，对肝匀浆中脂质过氧化物丙二醛（MDA）、炎症介质前列腺素E₂（PGE₂）含量的影响。研究证实15-苄亚基-14-脱氧-11,12-脱氢穿心莲内酯衍生物能够有效降低血清中转氨酶的活力，抑制脂质过氧化物MDA的生成，抑制炎症介质PGE₂产生，能够有效减轻肝脏的损伤。

为实现本发明目的，还采用四氯化碳诱导的化学性肝损伤模型研究15-苄亚基-14-脱氧-11,12-脱氢穿心莲内酯衍生物对小鼠血清中ALT、AST活力的影响和对肝匀浆中MDA和PGE₂含量的影响。研究证实15-苄亚基-14-脱氧-11,12-脱氢穿心莲内酯衍生物能够有效降低血清中转氨酶的活力，降低肝中MDA、PGE₂的含量。

为实现本发明目的，还采用乙醇诱导肝损伤模型研究15-苄亚基-14-脱氧-11,12-脱氢穿心莲内酯衍生物对小鼠血清中ALT、AST活力的影响和对肝匀浆中MDA含量的影响。研究证实15-苄亚基-14-脱氧-11,12-脱氢穿心莲内酯衍生物能够有效降低血清中转氨酶的活力，降低肝中MDA含量。

本发明优点及创新点：通过活性筛选，确定上述化合物具有明确的保肝活性，效果显著且优于母体化合物穿心莲内酯（AD），高效低毒，为开发用于肝损伤的治疗和预防药物提供了新的药物途径，而且扩大了临床用药的可选择范围。

附图说明

图1本发明化合物A、B、C和AD对ConA诱导的肝损伤小鼠血清中ALT活力测定结果比对；

图2本发明化合物A、B、C和AD对ConA诱导的肝损伤小鼠血清中AST活力测定结果比对；

图3本发明化合物A、B、C和AD对ConA诱导的肝损伤小鼠肝匀浆中MDA含量测定结果比对；

图4本发明化合物A、B、C和AD对ConA诱导的肝损伤小鼠肝匀浆中PGE₂含量测定结果比对；

图5 ConA诱导的肝损伤小鼠肝组织病理切片（HE染色；200X）测定结果比对；图中I 为正常，II 为模型， III为阳性组，IV为AD组，V 为本发明化合物A低剂量组，VI 为本发明化合物A高剂量组。

图6本发明化合物D和AD对ConA诱导的肝损伤小鼠血清中ALT活力测定结果比对；

图7本发明化合物D和AD对ConA诱导的肝损伤小鼠血清中AST活力测定结果比对；

图8本发明化合物D和AD对ConA诱导的肝损伤小鼠肝匀浆中MDA含量测定结果比对；

图9本发明化合物D和AD对ConA诱导的肝损伤小鼠肝匀浆中PGE₂含量测定结果比对；

图10本发明化合物A、B、C、D和AD对四氯化碳诱导的肝损伤小鼠血清中ALT活力测定结果比对；

图11本发明化合物A、B、C、D和AD对四氯化碳诱导的肝损伤小鼠血清中AST活力测定结果比对；

图12本发明化合物A、B、C、D和AD对四氯化碳诱导的肝损伤小鼠肝匀浆中MDA含量测定结果比对；

图13本发明化合物A、B、C、D和AD对四氯化碳诱导的肝损伤小鼠肝匀浆中PGE₂含量测定结果比对；

图14本发明化合物A、B和AD对乙醇诱导的肝损伤小鼠血清中ALT活力测定结果比对；

图15本发明化合物A、B和AD对乙醇诱导的肝损伤小鼠血清中AST活力测定结果比对；

图16本发明化合物A、B和AD对乙醇诱导的肝损伤小鼠肝匀浆中MDA含量测定结果比对；

1-4图中、6-9图及图10-16中：与模型组比较：^*P< 0.05，^**P<0.01；与AD组相比：^△P< 0.05，^△△P<0.01。

具体实施方式

下面结合具体实施方案来详细阐述本发明。应理解这些实施方案仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，本领域的技术人员可以用各种导致肝损伤的原因作为研究对象来得出本发明物具有保肝作用。

实施例1 在ConA诱导的免疫性肝损伤模型上，本发明化合物A、B、C和AD均对肝损伤表现出明显的保护作用

1 、实验方案

清洁级昆明小鼠（雄性，体重20±2g; 由河南省实验动物中心提供，合格证号：SCXK（豫）2010-0002）随机分为10个组，即正常对照组、模型组、联苯双酯（浙江医药股份有限公司新昌制药厂，批号：20100513）阳性对照组、AD组（0.88mmol/kg）和本发明化合物A、B和C的低剂量（0.66mmol/kg）及高剂量（0.88mmol/kg）组，每组6只。AD组穿心莲内酯由辅仁药业集团有限公司提供，供试药物由本发明人合成，纯度大于99.0%，正常对照组和模型组灌胃给予0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na），给药组给予0.5% CMC-Na混悬的相应药物。给药3d，末次给药后1h，除正常对照组外，其余小鼠均一次性尾静脉注射ConA(20mg/kg)，8h后摘眼球采血，3000rpm离心15min分离血清，按照试剂盒说明书要求分别测定ALT（南京建成生物工程研究所，批号：20110328）和AST（南京建成生物工程研究所，批号：20110328）。取肝左叶用生理盐水制备10%匀浆。按照试剂盒说明书要求（南京建成生物工程研究所，批号：20110321）测定MDA。取50μL肝匀浆液加入2mL 0.5 mol/L 的KOH-甲醇溶液，50℃ 水浴异构20min 后，于波长 278nm 处测定吸光度（A值），以每毫升匀浆液相当的 A 值代表PGE₂含量。实验数据以均数±标准差（

）表示，用SPSS 11.5 统计软件分析， P<0.05 表示差异具有显著性意义，P<0.01表示差异具有极显著性意义。

2 、实验结果

本发明化合物A、B、C和AD对小鼠血清中ALT、AST活力和肝匀浆中MDA、PGE₂含量的影响结果见图1-4。结果表明，模型组ALT、AST活力显著高于正常对照组（P<0.01），说明造模成功。

AD组和各组化合物在给药剂量均能显著降低血清中ALT、AST活力，与模型组相比，差异具有显著性意义（P<0.05），尤其是化合物A的高剂量组（0.88mmol/kg）基本上降到了正常水平。与AD组相比，本发明化合物的各剂量组都在一定程度上优于AD组；且本发明各化合物的高剂量（0.88mmol/kg）组与相同剂量的AD组相比，降酶效果更好，差异具有显著性意义（P<0.05）。

AD组和本发明各化合物的不同剂量组均能降低小鼠肝匀浆中MDA含量，与模型组相比，差异具有显著性意义（P<0.05），尤其化合物A 的低剂量组（0.66mmol/kg）、化合物B和C的高剂量组（0.88mmol/kg）效果更明显，差异具有极显著性意义（P<0.01）。与AD组相比，化合物A 的低剂量组（0.66mmol/kg）、化合物B和C的高剂量组（0.88mmol/kg）抗肝脏脂质过氧化能力更强，差异具有显著性意义（P<0.01）。

化合物A（高剂量，P<0.01；低剂量，P<0.05）、B（高剂量，P<0.01）和C（高剂量，P<0.01）均显著降低肝损伤小鼠肝匀浆中PGE₂含量。

综上所述，本发明化合物A、B、C对ConA诱导的免疫性肝损伤具有显著的保护作用，且作用效果优于母体化合物AD。

肝组织病理切片HE染色结果如图5所示。正常组肝小叶结构完整，肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列，未见变性和坏死改变，肝窦未见异常。模型组小鼠肝小叶破坏严重，肝细胞肿胀，胞浆疏松，颗粒变性和空泡变性，肝窦扩张淤血，部分肝细胞核浓缩、消失，形成明显的点、灶状坏死。AD组肝细胞轻度肿胀、疏松，部分肝细胞点状坏死、变性，未见成片肝细胞灶状坏死区；本发明化合物A组肝窦内未发现淤血，肝细胞轻度颗粒变性和空泡变性，未见点、灶状坏死区。

实施例2在ConA诱导的免疫性肝损伤模型上，15-对氯苄亚基-3，19-烟酸酯-14-脱氧-11,12-脱氢穿心莲内酯（本发明化合物D）对肝损伤表现出明显的保护作用

1、实验方案

清洁级昆明小鼠（雄性，20±2g）随机分为正常组、模型组、联苯双酯（浙江万邦药业有限公司，生产批号：101226）阳性对照组、AD组（0.88mmol/kg）、本发明化合物D的低（0.66mmol/kg）和高剂量组（0.88mmol/kg）。ALT、AST和MDA检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，批号分别为：20110608、20110607和20110719。其它试剂、药品及实验方法同实施例1。

2、实验结果

本发明化合物D对血清中ALT、AST和肝匀浆中MDA、PGE₂的影响结果见图6-9。模型组ALT、AST活力显著高于正常对照组，差异具有极显著性意义（P<0.01），说明造模成功。

本发明化合物D的低（P<0.05）、高剂量组（P<0.01）小鼠血清中ALT、AST活力较模型组显著降低。低、高剂量的化合物D均能显著降低肝匀浆中MDA、PGE₂含量（P<0.01）。高剂量组PGE₂含量与正常组接近。与AD 组相比，化合物D的高剂量组（0.88mmol/kg）降酶和抗肝脏脂质过氧化能力均显著提高（P<0.05）。

综上所述，本发明化合物D对ConA诱导的肝损伤具有显著的保护作用，且作用效果优于母体化合物AD。

实施例3 在四氯化碳诱导的化学性肝损伤模型上，本发明化合物A、B、C和D对肝损伤表现出明显的保护作用

1 、实验方案

清洁级昆明小鼠（雄性，20±2g，）适应性喂养3天后，随机分为正常组、模型组、阳性药组、AD组（0.88mmol/kg）、本发明化合物A、B、C和D的低（0.66mmol/kg）和高剂量（0.88mmol/kg）组。每组8只。阳性药组和各给药组给予用0.5% CMC-Na配制成相应浓度的混悬液灌胃给药，正常组和模型组给予0.5% CMC-Na。阳性对照药为联苯双酯（浙江医药股份有限公司新昌制药厂，批号：20100513）。给药3d，末次给药后1h，除正常组外，其它组一次性腹腔注射0.3%四氯化碳花生油溶液（0.1mL/10g）。16h后，各组小鼠摘眼球取血，3000rpm离心15min分离血清，分别测定血清中ALT（南京建成生物工程研究所；20110720）和AST（南京建成生物工程研究所；20110716）活力。取肝左叶用生理盐水制备10%肝匀浆。测定肝匀浆中MDA（南京建成生物工程研究所；20110719）和PGE₂含量。实验数据以均数±标准差（

）表示，用SPSS 11.5 统计软件分析，P<0.05 表示差异具有显著性意义，P<0.01表示差异具有极显著性意义。其它试剂、药品及实验方法同实施例1。

2 、实验结果

各组对血清中ALT、AST和肝匀浆中MDA、PGE₂ 的影响结果见图10-13。结果表明，模型组ALT、AST活力、MDA和PGE₂含量显著升高，与正常组相比，差异具有极显著性意义（P<0.01），说明造模成功。

本发明化合物A、B、C和D均能有效抑制四氯化碳致肝损伤小鼠血清中转氨酶（ALT、AST）活力升高（P<0.01）。化合物A、B、C和D的低剂量（0.66mmol/kg）和高剂量（0.88mmol/kg）组降酶幅度显著大于AD组（P<0.05）。

本发明化合物A、B、C和D均能有效降低肝损伤小鼠肝匀浆中MDA和PGE₂水平，差异均达到极显著水平（P<0.01）。与AD 组相比，化合物A的低剂量（0.66mmol/kg）和高剂量（0.88mmol/kg）、化合B的低剂量、化合物C和D的高剂量（0.88mmol/kg）降低肝匀浆中脂质过氧化物水平的能力更强，与模型组比，差异具有显著性意义（P<0.05）。化合物A和C 的高剂量组，以及化合物D的低、高剂量组小鼠肝匀浆液中PGE₂的含量显著低于AD组（P<0.05）。

综上所述，本发明化合物A、B、C和D对四氯化碳诱导的化学性肝损伤具有保护作用，且效果均优于母体化合物AD组。

实施例4 在乙醇诱导的损伤模型上，化合物A、B和AD对肝损伤表现出明显的保护作用

1、实验方案

清洁级昆明小鼠（雄性，20±2g，）适应性喂养3天后，随机分为正常组、模型组、阳性药组、AD组（0.88mmol/kg）、本发明化合物A低（0.44mmol/kg）、中（0.66mmol/kg）、高（0.88mmol/kg）剂量组和化合物B的中（0.66mmol/kg）、高（0.88mmol/kg）剂量组。每组8只。阳性药组和各给药组给予用0.5% CMC-Na配制成相应浓度的混悬液灌胃给药，正常组和模型组给予0.5% CMC-Na。阳性对照药为联苯双酯（浙江医药股份有限公司新昌制药厂，批号：20100513）。给药3d，末次给药后1h，除正常组外，其它组一次性灌胃给予50% 乙醇溶液（1.2mL/10g）。16h后，各组小鼠摘眼球取血，3000rpm离心15min分离血清，分别测定血清中ALT（南京建成生物工程研究所；20111130）和AST（南京建成生物工程研究所；20111203）活力。取肝左叶用生理盐水制备10%肝匀浆。测定肝匀浆中MDA（南京建成生物工程研究所；20111130）含量。实验数据以均数±标准差（

2、实验结果

各组对血清中ALT、AST和肝匀浆中MDA的影响结果见图14-16。结果表明，模型组ALT、AST活力和MDA含量显著升高，与正常组相比，差异具有极显著性意义（P<0.01），说明造模成功。

本发明化合物A和B均能有效抑制乙醇致肝损伤小鼠血清中转氨酶（ALT、AST）活力和肝组织匀浆中MDA含量升高（P<0.01）。化合物A（P<0.01）和B（P<0.05）的高剂量（0.88mmol/kg）组对ALT活力降低幅度显著大于AD组；化合物A高剂量（0.88mmol/kg）组对AST活力降低幅度显著大于AD组（P<0.01）。化合物A和B均能有效降低肝损伤小鼠肝匀浆中MDA水平，差异均达到极显著水平（P<0.01）。

综上所述，本发明化合物A和B对乙醇诱导的肝损伤具有保护作用，且效果均优于母体化合物AD组。

Claims

1.结构如通式1所示的15-苄亚基-14-脱氧-11,12-脱氢穿心莲内酯衍生物在制备药物中的应用，其特征在于，将其作为活性成份用于制备治疗或预防肝损伤的药物，

Figure 2012100296336100001DEST_PATH_IMAGE002

通式1

R₁为氢；R₂为苯基、4-氟苯基、4-氯苯基、4-溴苯基、3-氟苯基、3-氯苯基或3-溴苯基；R₃、R₄各自为氢或COR₅；R₅为3-吡啶基。

2.如权利要求1所述的15-苄亚基-14-脱氧-11,12-脱氢穿心莲内酯衍生物在制备药物中的应用，其特征在于，所述的化合物为：R₁为氢；R₂为苯基、4-氟苯基、4-氯苯基、4-溴苯基、3-氟苯基、3-氯苯基或3-溴苯基； R₃、R₄各自为氢。

3.如权利要求1所述的15-苄亚基-14-脱氧-11,12-脱氢穿心莲内酯衍生物在制备药物中的应用，其特征在于，所述的化合物为：R₁为氢；R₂为苯基、4-氟苯基、4-氯苯基、4-溴苯基、3-氟苯基、3-氯苯基或3-溴苯基；R₃、R₄各自为COR₅；R₅=3-吡啶基。

4.如权利要求1所述的15-苄亚基-14-脱氧-11,12-脱氢穿心莲内酯衍生物在制备药物中的应用，其特征在于，所述的化合物为以下其中之一：

A: R₁=H，R₂=4-Cl-C₆H₄， R₃= R₄=H；

B: R₁=H，R₂=C₆H₅， R₃= R₄=H；

C: R₁=H，R₂=3-Br-C₆H₄， R₃= R₄= H；

D: R₁=H，R₂=4-Cl-C₆H₄， R₃= R₄=COR₅，R₅=3-吡啶基。

5.如权利要求1-4其中之一所述的15-苄亚基-14-脱氧-11,12-脱氢穿心莲内酯衍生物在制备药物中的应用，其特征在于，将其作为活性成份或与其它药物组合，与制药中可以接受的辅助和/或添加成份混合后，按常规的制药方法和工艺要求，制成用于治疗或预防肝损伤的口服型制剂、注射型制剂药物。

6.如权利要求5所述的15-苄亚基-14-脱氧-11,12-脱氢穿心莲内酯衍生物在制备药物中的应用，其特征在于，口服型制剂为片剂、丸剂、胶囊、冲剂或糖浆；注射型制剂为注射液或冻干粉针剂型。

7.如权利要求5所述的15-苄亚基-14-脱氧-11,12-脱氢穿心莲内酯衍生物在制备药物中的应用，其特征在于，将其用于制备预防或治疗包括免疫性或化学性等因素引起的各类肝损伤药物中。

8.如权利要求5所述的15-苄亚基-14-脱氧-11,12-脱氢穿心莲内酯衍生物在制备药物中的应用，其特征在于，将其用于制备预防或治疗包括病毒感染或各种药物引起的肝损伤药物中。