CN104083393A - 狗肝菜多糖在制备抗结核药物导致肝损伤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于中医药领域，涉及以狗肝菜全草为原料提取纯化出狗肝菜多糖，及其作为制备治疗结核药物肝损伤药物的应用。本发明公开了其制备方法，通过动物实验证明具有较好的抗结核药物异烟肼和利福平联合用药引起的小鼠药物性肝损伤。狗肝菜多糖不仅可以应用于化学性肝损伤，且对结核药物性肝损伤同样有确切的疗效，这种新用途为其药用价值开拓了新领域，具有重要的应用价值和经济效益。

Description

狗肝菜多糖在制备抗结核药物导致肝损伤药物中的应用

技术领域

本发明属于中医药领域，涉及以狗肝菜Dicliptera chinensis ( L.) Nees.全草为原料，提取纯化出狗肝菜多糖及其在制备抗结核药物导致肝损伤药物中的应用。

背景技术

狗肝菜Dicliptera chinensis ( L.) Nees. 是爵床科九头狮子草属狗肝菜的全草。全草味甘、微苦、性寒, 归心、肝、肺经, 具有清热、凉血、利湿、解毒、生津、利尿等功效, 临床常用于治疗感冒发热、热病发斑、暑热烦渴、吐衄血、便血、尿血、崩漏、肺热咳嗽、咽喉肿痛、肝热目赤、眼结膜炎、小儿惊风、小便淋沥、带下、带状疱疹、痈肿疔疖、蛇犬咬伤等症。狗肝菜资源非常丰富，分布云南、广东、广西等地，为西南民间常用药材。狗肝菜为广西民间药食两用的中草药, 也是壮族地区常用壮药, 主要含有多糖、有机酸、氨基酸等物质。目前，研究发现狗肝菜多糖成分具有抗氧化及免疫调节作用, 有抗化学性肝损伤及肝纤维化作用，但对抗结核药药物性肝损伤的研究尚属首次。

抗结核化疗在结核病控制中起到了至关重要的作用，但抗结核药物诱导的药物性肝损害却限制了它们的应用。抗结核药物诱导肝损害的发生率在我国大约为20%，如果在肝功能受损的情况下,继续抗结核治疗而保肝措施不当的话,那将加重患者的病情和痛苦,若此时停止抗结核药物的服用,则结核病将迁延不愈,反复发作蔓延导致耐药菌株的出现,这些都为以后的治疗增加了困难。异烟肼、利福平为目前预防和治疗结核病的临床一线药物。随着耐药结核菌的增多，目前的抗结核化疗方案主要以异烟肼和利福平为主的多药联合化疗。由于这些抗结核药物对肝脏均有不同程度的损害，如何减轻抗结核治疗过程中的药物性肝损伤，使化疗过程得以顺利进行，是结核治疗过程中的一个关键问题，也是临床医生在工作中遇到的实际问题。

已有的中医药防治药物性肝损伤的实验研究多采用CCL₄等药物造模，但化学药物等造成的肝损伤是否与抗结核药所致肝损伤的发生机制相吻合，值得我们深入思考。采用异烟肼、利福平临床常用的具有肝毒性的抗结核药直接造成肝损伤模型进行相关研究，更贴近临床。近年来对狗肝菜多糖的研究多为化学性肝损伤的研究，此外，狗肝菜药用资源丰富，获得狗肝菜多糖的成本低，适宜大量生产。检索国内外狗肝菜多糖的研究，尚未见狗肝菜多糖对结核药药物性肝损伤保护作用方面的研究报道。

发明内容

本发明的目的是以狗肝菜全草为原料提取纯化出狗肝菜多糖，并将其制备成抗结核性肝损伤药物，这在国内尚属首次公布。

实现本发明目的的技术方案是：

狗肝菜多糖的新用途，用于制备抗结核性药物导致肝损伤的药物，狗肝菜多糖可制备成供口服的中药制剂，如片剂、口服液、颗粒剂，胶囊和丸剂等，其制法与现有的相应剂型的制法通用。有效成分与药用辅料的重量比例范围如下：制剂中含狗肝菜多糖1.0%～99.9%，余量为药剂成型辅料。

本发明狗肝菜多糖的制备是称取干燥的狗肝菜全草粗粉, 加入石油醚回流脱脂提取1-2h，药渣挥发尽石油醚后，沸水提取1-3次，每次1-3h，合并并浓缩提取液，用氯仿与正丁醇的比例4:1，采用Sevag法多次萃取，得到除去蛋白质的上清液，加无水乙醇使醇含量达到 70-99%，于4℃冰箱中醇沉，抽滤 ,弃去上清液，滤渣依次用乙醚、无水乙醇、丙酮洗涤，即得狗肝菜粗多糖；将狗肝菜粗多糖溶于水，加样到经pH=7-9的磷酸盐缓冲液前处理的DE52型树脂层析柱中,静止12h，用蒸馏水，流速以1-3mL/min洗脱，合并洗脱液，真空干燥得白色粉末状狗肝菜多糖（DCP）。

本发明与现有技术相比，狗肝菜药材资源丰富，制备狗肝菜多糖工艺简单、成本低，无任何毒副作用，口感好，具有良好的开发价值。此外，本发明发掘了狗肝菜多糖适用于抗结核药物导致肝损伤的防治，疗效确切，在制备抗结核药物性肝损伤的药物具有良好的药用价值，并为将狗肝菜多糖进一步开发成新制剂提供研究基础。

附图说明

图1为本发明实施例空白组小鼠的病理切片图(HE染色×200)；

图2为本发明实施例阳性组小鼠的病理切片图(HE染色×200)；

图3为本发明实施例模型组小鼠的病理切片图(HE染色×200)；

图4为本发明实施例狗肝菜多糖高剂量组小鼠的病理切片图(HE染色×200)；

图5为本发明实施例狗肝菜多糖中剂量组小鼠的病理切片图(HE染色×200)；

图6为本发明实施例狗肝菜多糖低剂量组小鼠的病理切片图(HE染色×200)。

具体实施方式

下列结合实施例对本发明内容作进一步的说明，但不是对本发明的限定。

一、     狗肝菜多糖的提取与纯化方法

称取干燥的狗肝菜全草粗粉 2000g, 加入20000ML石油醚回流脱脂提取2h,药渣挥尽石油醚后，沸水提取2次，每次 1.5 h，合并提取液，浓缩至200 mL，用氯仿与正丁醇的比例4:1，采用Sevag法多次萃取，得到除去蛋白质的上清液，加 95%乙醇使醇含量达到80%，于4℃冰箱中醇沉 12h。抽滤 ,弃去上清液， 滤渣依次用乙醚、无水乙醇、丙酮洗涤，即得狗肝菜粗多糖。将狗肝菜粗多糖溶于水，加样到经pH=8的磷酸盐缓冲液前处理的DE52型树脂层析柱中,静止12h，用蒸馏水，流速以2mL/min洗脱，合并洗脱液，真空干燥得白色粉末状狗肝菜多糖（DCP）。狗肝菜多糖用葡萄糖作对照品，采用苯酚-硫酸法显色，经紫外-可见分光计测定样品中的多糖纯度达76.8%。

二、     将狗肝菜多糖制备成药物制剂

将狗肝菜多糖可加入相应辅料，制备成片剂、口服液、颗粒剂，胶囊和丸剂等。

三、     狗肝菜多糖抗结核药物致肝损伤药效实验方法和结果

1 、材料、试剂和仪器

1.1  动物 

 　　SPF级昆明种小鼠60只，体重18-22g，雌雄各半，由桂林医学院SPF实验动物中心提供(许可证号SCXK2007-0001)。

1.2 药品与试剂 

狗肝菜经广西中医药大学韦松基教授鉴定为爵床科九头狮子草属狗肝菜Dicliptera chinensis ( L.) Nees.的全草。用“狗肝菜多糖的提取与纯化方法”制备得到实验用狗肝菜多糖供试药品。

谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（AKP）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）以及微粒体一氧化氮（NO）购于南京建成生物工程研究所，批号分别为：20131210、20130324、20131016、20130428、20131010、20130620。

1.3 仪器  

TLL-C台式冷冻离心机，北京四环科学仪器厂；TSN-695B型放免测量仪，上海日环仪器一厂；AU600全自动生化检测仪，奥林巴斯生产； 752型分光光度计，上海第三分析仪器厂；01ymPus BX51显微镜，奥林巴斯生产；BS1105电子天平，德国sartorius公司。

2.实验方法

60只小鼠随机分成6组，每组10只，分别为正常对照组，模型组，联苯双酯阳性组和狗肝菜多糖高、中、低剂量组。模型组给予异烟肼联合利福平各100mg/kg，狗肝菜多糖高、中、低剂量组剂量分别为600mg/kg、400mg/kg、200mg/kg、阳性药葡醛内酯200mg/kg，正常对照组每天ig给予注射用水, 阳性对照组和受试药的动物每天按剂量ig给药1次。在给药的第10天，禁食不禁水18h后,取血和取肝组织。参照试剂盒的说明，生物化学法检测血清中ALT、AST和AKP生化指标；Elisa法检测肝组织中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）以及微粒体一氧化氮（NO）含量；应用HE染色进行肝组织病理学检查；应用SPSS13.0软件进行统计分析，数据均以                                                ±s表示。

3.实验结果

3.1狗肝菜多糖对肝损伤小鼠ALT、AST、AKP、TNF-α、IL-6和NO水平的影响。

由表1结果可见，肝炎模型组与正常对照组相比较，ALT、AST和AKP差异有极显著性(P < 0.01)，说明本实验造模成功。与模型组比较，小鼠口服阳性药和狗肝菜多糖用药组均能非常明显的抑制ALT、AST和AKP活性 ( P <0.01，P < 0.05)，且成量效关系。因此可判断狗肝菜多糖具有保肝护肝的作用。

由表2中 ELISA结果表明，模型组肝损伤小鼠肝组织中TNF-α、IL-6和 NO水平明显增加，与正常组比较差异有统计学意义（P<0.01）。由表2结果可见，经受试药物治疗后，各组肝损伤小鼠肝组织中TNF-α、IL-6和 NO的水平逐渐减少，与模型组比较差别有统计学意义（P<0.01），即受试药物组中肝损伤小鼠炎症细胞因子和毒性介质的表达有效地减少，表明狗肝菜多糖可通过抑制肝内的炎症反应和细胞毒性作用来达到保肝作用。

表1 狗肝菜多糖对异烟肼联合利福平致肝损伤小鼠ALT、AST和AKP 的影响( ±s, n=10)

Compared with model group：*P<0.05，**P<0.01。

　　表 2  狗肝菜多糖对肝损伤小鼠肝组织中TNF-α、IL-6和 NO的影响 (±s, n=10)

Compared with model group：*P<0.05，**P<0.01。

3.2肝组织病理变化

参照图1，经HE染色，光镜下观察，正常小鼠肝细胞均匀排列，胞浆丰富，肝小叶结构完整，肝索及肝窦清晰可辨，汇管区未出现炎症浸润。

参照图2，模型组肝组织损伤严重，镜下见肝小叶结构被破坏，肝细胞数量减少，小叶内肝细胞出现不同程度的水肿，部分区域出现明显点灶状坏死和淤血，病变以环中央静脉分布为主。

参照图3-6，阳性组和狗肝菜多糖用药组的肝细胞坏死程度较模型组都有明显改善，肝小叶结构基本正常，细胞索状排列较整齐，肝内淤血及细胞肿胀明显减轻，点灶状坏死偶见，肝细胞数量也得到逐渐增加。从HE组织病理学检查提示狗肝菜多糖能够有效改善药物性肝损伤小鼠的肝功能，且与阳性组无明显差异。

综上所述，本发明首次对狗肝菜多糖进行了抗结核性药物性肝损伤的研究，通过实验表明，狗肝菜多糖对抗结核药物诱导的小鼠肝损伤具有明显的保护作用，其机制与狗肝菜多糖降低炎性介质的抗炎作用有关。狗肝菜多糖可用于制备片剂、口服液、颗粒剂和丸剂等剂型的治疗药物性肝损伤的中药制剂。

Claims (4)

1.狗肝菜多糖在制备抗结核药物导致肝损伤药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征是：所述狗肝菜多糖的制备是称取干燥的狗肝菜全草粗粉, 加入石油醚回流脱脂提取1-2h，药渣挥发尽石油醚后，沸水提取1-3次，每次1-3h，合并并浓缩提取液，用氯仿与正丁醇的比例4:1，采用Sevag法多次萃取，得到除去蛋白质的上清液，加无水乙醇使醇含量达到 70-99%，于4℃冰箱中醇沉，抽滤 ,弃去上清液，滤渣依次用乙醚、无水乙醇、丙酮洗涤，即得狗肝菜粗多糖；将狗肝菜粗多糖溶于水，加样到经pH=7-9的磷酸盐缓冲液前处理的DE52型树脂层析柱中,静止12h，用蒸馏水，流速以1-3 mL/min洗脱，合并洗脱液，真空干燥得白色粉末状狗肝菜多糖。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征是：所述药物按常规方法制成临床常用制剂。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征是：所述制剂的剂型包括片剂、口服液、颗粒剂，胶囊和丸剂。