JP6013516B2

JP6013516B2 - １５−ベンジリデン−１４−デオキシ−１１，１２−ジデヒドロアンドログラホリド誘導体の肝臓保護及び抗ｃ型肝炎ウイルス医薬品製造における使用

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Publication number: JP6013516B2
Application number: JP2014555931A
Authority: JP
Inventors: ダイ，グイフ; シュ，ハイウェイ; チュ，ソンリン; リュー，メンジャオ; ワン，ヤナン; チャオ，ジン; ウー，ジャン; ハン，ウェイ; チャオ，ダン; ウー，チェンウェイ; ウー，ディ; ワン，ハン; リュー，ファンフェイ; リュー，ホンミン
Original assignee: ツェンチョウユニバーシティー
Priority date: 2012-02-10
Filing date: 2013-02-05
Publication date: 2016-10-25
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Also published as: US9388169B2; WO2013117149A1; JP2015506964A; US9636324B2; US20160279096A1; US20150051403A1

Description

本発明はアンドログラホリド誘導体の医薬品使用に関し、具体的には、15-ベンジリデン-14-デオキシ-11,12-ジデヒドロアンドログラホリド誘導体の肝臓保護作用及び抗C型肝炎ウイルス作用に関し、医薬化学分野に属す。

肝臓疾患は世界でよく見られる病気であり、よく発病する。肝臓損傷とは肝臓が外界要因の侵入を受けることにより起こる肝臓損傷である。ウイルス、生物、薬物、物理化学因子、アルコール等の多くの要因により肝臓は損傷する。全世界で無症状のB型肝炎ウイルス（HBV）キャリア（HBsAgキャリア）は2.8億人を超え、我が国は約9300万人を占める。そのうち、約30%のB型肝炎ウイルスキャリアに肝臓損傷の臨床症状が現れる。C型肝炎ウイルス（HCV）感染は慢性肝炎、肝硬変、肝障害、肝細胞癌に至るよくある感染であり、少なくとも85%のC型肝炎ウイルスが慢性肝炎に至る。C型肝炎はB型肝炎と同様、その組織浸潤細胞はCD3+を主とし、細胞毒性T細胞（TCL）がHCV感染した標的細胞を特異的に攻撃することで肝細胞の損傷を引き起こすことが研究によりわかっている。

現在、効果的な抗HCV治療はまだインターフェロン治療又はインターフェロンとリバビリン(ribavirin)との併用治療に限られており、効果的なHCV予防ワクチンは未だ研究されていない。しかしながら、これら既知の医薬品治療を受けている患者の約半数の体内のHCVウイルスはまだ除去されていないため、代替性抗HCV薬は依然として強く求められている。HCVはフラビウイルス科C型肝炎ウイルス属(hepadnaviruses)の唯一の成員である。牛ウイルス性下痢ウイルス（BVDV）はフラビウイルス科フラビウイルス属ウイルスに属し、HCVと共通の抗原を有する。HCVは今現在まだ体外で安定的に培養できないが、BVDVは牛腎上皮由来株化細胞（MDBK）の中で成長しやすく、その遺伝子コード化生成物も容易に得られ、比較的便利に遺伝子組研究で利用できる。BVDV AV69(NADL)株は細胞の中で病変を形成できるため、細胞病変保護率により医薬品の抗ウイルス活性を評価できる。BVDVが細胞の中で複製されるのを抑制できる医薬品は一般的にHCV感染治療に用いることができることから、BVDVは既にHCVの模擬株として、抗HCV薬の選別に広く用いられている。

アンドログラホリドは穿心蓮Andrographis paniculata (Burm.f.)Nees から抽出されたジテルペンラクトン系化合物であり、漢方薬穿心蓮の主要な有効成分の一つである。臨床では主に上呼吸道感染や細菌性赤痢等の治療に用いられる。近年、アンドログラホリドの抗腫瘍、肝臓保護及び利胆、抗ウイルス等における応用研究が深まっている。アンドログラホリドは多種の動物実験性肝臓損傷に良好な保護作用を持つ。姚青等は、アンドログラホリドはコカインによる急性肝臓損傷に一定の保護作用があり、その肝臓保護のメカニズムは脂質過酸化反応の抑制、組織中の酸素フリーラジカル生成の低下と関係があることを発見した。Visen PK[J Ethnopharmacol, 1993, 40(2), 131-136]とHanda S[Indian J Med Res..1990, 92: 284-292]はアンドログラホリドがパラセタモール誘導肝臓損傷に保護作用があることを証明した。そのうち、Handa Sの研究はさらにアンドログラホリドはガラクトサミンによる肝臓中毒に保護作用があることを示した。Kapil A [Biochem Pharmacol, 1993,46(1):182-185]等はアンドログラホリド、アンドログラホシド（andrographoside）とネオアンドログラホリドが四塩化炭素とtert-ブチルヒドロペルオキシドによる肝臓中毒に保護作用があることを証明した。Singha P [J Ethnopharmacol. 2007; 111(1): 13-21] 等の研究はアンドログラホリドがエタノールによるマウスの肝臓腎臓損傷に一定の保護作用があることを示した。Roy DN等[Toxicol Appl Pharmacol. 2011; 250(1): 54-68] の研究は、銅中毒に対するアンドログラホリドとD-ペニシラミンの併用治療が、単独のD-ペニシラミンよりも抗繊維化と細胞壊死において効果がより優れていることを証明した。寧光等は出願した特許（CN201010266185.2）の中で、アンドログラホリドが急性肝臓損傷治療薬の製造に使用され、コンカナバリンA誘導肝臓損傷を著しく抑制でき、コンカナバリンAによる肝細胞のアポトーシスを抑制でき、肝臓の炎症反応を抑制できるため、コンカナバリンA誘導肝臓損傷の治療に使用できることを開示している。

アンドログラホリド及びその誘導体の抗フラビウイルス、ペスチウイルス属又はC型肝炎ウイルス（CN: 200580046253.1）、及び抗SARSウイルス(CN：03129127.9)における使用は優れた前途を有することが研究により示されている。穿心蓮中の成分とその他の植物又はその成分で形成された組成物は抗ウイルス作用を持つ。米国特許（US 5，833，994）は芳香族炭化水素受容体リガンドとアンドログラホリドのウイルス感染に対する併用治療の使用を開示している。アンドログラホリドコハク酸モノエステルはウイルスと細胞の結合、及びウイルス複製周期後からウイルスと細胞の結合までの段階を干渉することによりHIVを干渉抑制できる。穿心蓮メタノール抽出物はc-Mos を抑制することによりHIV-1の複製を体外抑制できる。

本発明者は前期研究（CN 1978437；CN100999520；CN100999535; CN101003527）において新規な構造を持つ化合物を多く得た。本発明者はこの類の化合物の抗腫瘍、抗炎症、抗 HBVへの応用について既に特許出願し、さらに15-ベンジリデン-14-デオキシ-11,12-ジデヒドロアンドログラホリド誘導体及びその3，19エステルの抗HCV、肝臓保護作用について活性実験研究を行った。

CN201010266185.2 CN200580046253.1 CN03129127.9 US5833994 CN1978437 CN100999520 CN100999535 CN101003527

Visen PK[J Ethnopharmacol, 1993, 40(2), 131-136] Handa S[Indian J Med Res..1990, 92: 284-292] Kapil A [Biochem Pharmacol, 1993,46(1):182-185] Singha P [J Ethnopharmacol. 2007; 111(1): 13-21] Roy DN等[Toxicol Appl Pharmacol. 2011; 250(1): 54-68]

本発明者は前期研究成果を基に、合成した化合物に対して抗HCV活性及び肝臓保護活性の選定を行ったことにより、一般式1 の構造のアンドログラホリド誘導体が肝臓損傷治療に対して明らかな予防及び治療の作用を持つことを発見した。そのうち、幾つかの化合物はさらにBVDVに起因するMDBK細胞病変を著しく抑制することができ、効果は高く、毒性が低く、抗C型肝炎ウイルス薬開発の潜在力を有する。本発明は15-ベンジリデン-14-デオキシ-11,12-ジデヒドロアンドログラホリド誘導体の肝臓保護及び抗HCV医薬品製造における使用を提供することを目的とする。

本発明に記載の15-ベンジリデン-14-デオキシ-11,12-ジデヒドロアンドログラホリド誘導体は一般式1で表される構造を有する。

式中、R₁は水素、R₂はフェニル、4-フルオロフェニル、4-クロロフェニル、4-ブロモフェニル、3-フルオロフェニル、3-クロロフェニル、3-ブロモフェニル、R₃、R₄はそれぞれ水素又はCOR₅、R₅は3-ピリジル又はCH₂CH₂COOH。

上記化合物は肝臓保護作用を有する。好ましくは、R₁は水素；R₂は4-フルオロフェニル、4-クロロフェニル、4-ブロモフェニル、3-フルオロフェニル、3-クロロフェニル、3-ブロモフェニル；R₃、R₄はそれぞれ水素又はCOR₅、R₅は3-ピリジル又はCH₂CH₂COOH。

好ましい化合物は次のとおり：
A: R₁=H，R₂=4-Cl-C₆H₄， R₃= R₄=H；
B: R₁=H，R₂=C₆H₅， R₃= R₄=H；
C: R₁=H，R₂=3-Br-C₆H₄， R₃= R₄= H；
D: R₁=H，R₂=4-Cl-C₆H₄， R₃= R₄=COR₅，R₅=3-ピリジル；
E：R₁=H，R₂=4-Cl-C₆H₄， R₃= R₄=COR₅，R₅=CH₂CH₂COOH。

そのうち、抗HCV作用を兼ねる化合物は次のとおり：R₁は水素；R₂はフェニル、4-フルオロフェニル、4-クロロフェニル、4-ブロモフェニル；R₃、R₄はそれぞれ水素又はCOR₅；R₅は3-ピリジル又は-CH₂CH₂COOH。

抗HCVの好ましい化合物は次のとおり：R₁は水素；R₂は4-クロロフェニル、4-フルオロフェニル、4-ブロモフェニル；R₃、R₄はそれぞれH又はCOR_5，R₅=3-ピリジル又はR₅=-CH₂CH₂COOH。

抗HCVのより好ましい化合物は次のとおり：
A: R₁=H，R₂=4-Cl-C₆H₄， R₃= R₄=H；
D: R₁=H，R₂=4-Cl-C₆H₄， R₃= R₄=COR₅，R₅=3-ピリジル；
E: R₁=H，R₂=4-Cl-C₆H₄， R₃= R₄=COR₅，R₅= CH₂CH₂COOH。

本発明で提案した上記化合物の製造方法は特許 CN: 200510107247.4に開示されている。その合成方法は以下のとおり：14-デオキシ-11,12-ジデヒドロアンドログラホリド又は14-デオキシ-11,12-ジデヒドロ-3,19-エステル化アンドログラホリドのうちの一種と異なるアルデヒドとをメタノール又はエタノール又はテトラヒドロフランに溶解し、塩基触媒で、15〜70℃の温度で加熱反応すると、一般式1で表されるアンドログラホリド誘導体を得ることができる。そのうち使用する塩基は炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウム、トリエチルアミン、ピリジン、N,N-ジメチルアミノピリジンのうちの一種であり、その用量は0.2〜5モル%である。使用するアルデヒドは芳香族アルデヒドであり、好ましくはベンズアルデヒド、ハロゲン化ベンズアルデヒド等であり、より好ましくはp-フルオロベンズアルデヒド、p-クロロベンズアルデヒド、p-ブロモベンズアルデヒド、m-フルオロベンズアルデヒド、m-クロロベンズアルデヒド、m-ブロモベンズアルデヒドであり、使用する14-デオキシ-11,12-ジデヒドロ-3,19-エステル化アンドログラホリドは一般式1においてR₃、R₄それぞれがCOR₅であり、R₅が3-ピリジル又はCH₂CH₂COOHである場合に対応する。

本発明の目的を実現するために、コンカナバリンA（ConA）誘導免疫性肝臓損傷モデルを採用し、マウス血清中アラニンアミノ基転移酵素（ALT）、アスパラギン酸アミノ基転移酵素（AST）活性、及び肝ホモジネート中マロンジアルデヒド（MDA）、炎症メディエータープロスタグランジンE₂（PGE₂）の含有量に対する本発明に記載の15-ベンジリデン-14-デオキシ-11,12-ジデヒドロアンドログラホリド誘導体の影響を研究した。本発明に記載の15-ベンジリデン-14-デオキシ-11,12-ジデヒドロアンドログラホリド誘導体が血清中アミノフェラーゼの活性を効果的に低下させ、脂質過酸化物MDAの生成を抑制し、炎症メディエーターPGE₂の発生を抑制し、肝臓の損傷を効果的に低減できることが実験により証明された。

本発明の目的を実現するために、MDBK（NBL-1）細胞、BVDV牛ウイルス性下痢ウイルス株（BVDV-AV69）を採用し、BVDV感染による細胞病変に対する本発明に記載の15-ベンジリデン-14-デオキシ-11,12-ジデヒドロアンドログラホリド誘導体の治療作用を研究した。MTT法を採用し、MDBKに対する化合物の細胞毒性を研究した。この類のアンドログラホリド誘導体はBVDVによるMDBK細胞病変を著しく抑制でき、抗HCV薬を製造できる潜在力を有することが研究により示された。

本発明の目的を実現するために、さらに、四塩化炭素誘導化学性肝臓損傷モデルを採用し、マウス血清中ALT、AST活性、及び肝ホモジネート中MDAとPGE₂の含有量に対する本発明に記載の15-ベンジリデン-14-デオキシ-11,12-ジデヒドロアンドログラホリド誘導体の影響を研究した。15-ベンジリデン-14-デオキシ-11,12-ジデヒドロアンドログラホリド誘導体は、血清中アミノフェラーゼの活性を効果的に低下させ、肝中MDA、PGE₂含有量を低減できることが実験により証明された。

本発明の目的を実現するために、さらに、エタノール誘導肝臓損傷モデルを採用し、マウス血清中ALT、AST活性、及び肝ホモジネート中MDAの含有量に対する15-ベンジリデン-14-デオキシ-11,12-ジデヒドロアンドログラホリド誘導体の影響を研究した。15-ベンジリデン-14-デオキシ-11,12-ジデヒドロアンドログラホリド誘導体は、血清中アミノフェラーゼの活性を効果的に低下させ、肝中MDA含有量を低減できることが実験により証明された。

この類の化合物を有効薬用成分として、又はその他の薬物と組みあわせ、製薬的に許容可能な補助及び／又は添加成分と混合した後、現在の各種通常の製薬方法及びプロセス要求に基づき、抗HCVのための又は肝臓保護効果のある経口型製剤、注射型製剤等の医薬品に調製することができる。経口型製剤は錠剤、丸剤、カプセル、顆粒剤、シロップ等であり、注射型製剤は注射液又は凍結乾燥粉末製剤等である。

本発明の利点と新規なポイント：活性選定により、上記化合物は明確な体外抗BVDV活性と肝臓保護活性を有することが確認され、効果は顕著、かつ、母体化合物アンドログラホリド（AD）より優れ、効果は高く、毒性が低く、C型肝炎及びその他の各種肝臓損傷の治療と予防のための医薬品の開発に、新たな医薬品のルートを提供し、臨床用医薬品の選択可能範囲を広げた。

ConA誘導肝臓損傷マウス血清中ALT活性に対する化合物A、B、C、ADの測定結果照合。 ConA誘導肝臓損傷マウス血清中AST活性に対する化合物A、B、C、ADの測定結果照合。 ConA誘導肝臓損傷マウス肝ホモジネート中MDA含有量に対する化合物A、B、C、ADの測定結果照合。 ConA誘導肝臓損傷マウス肝ホモジネート中PGE₂含有量に対する化合物A、B、C、ADの測定結果照合。 ConA誘導肝臓損傷マウス肝組織病理切片（HE染色；200X）の測定結果照合。図中I は正常、II はモデル、IIIは陽性組、IVはAD組、V は化合物A低用量組、VI は化合物A高用量組。 ConA誘導肝臓損傷マウス肝組織病理切片（HE染色；200X）の測定結果照合。図中I は正常、II はモデル、IIIは陽性組、IVはAD組、V は化合物A低用量組、VI は化合物A高用量組。 ConA誘導肝臓損傷マウス血清中ALT活性に対する化合物D及びADの測定結果照合。 ConA誘導肝臓損傷マウス血清中AST活性に対する化合物D及びADの測定結果照合。 ConA誘導肝臓損傷マウス肝ホモジネート中MDA含有量に対する化合物D及びADの測定結果照合。 ConA誘導肝臓損傷マウス肝ホモジネート中PGE₂含有量に対する化合物D及びADの測定結果照合。 MDBKに対する化合物A、D、E の細胞毒性作用の結果図。ウイルスによる細胞病変に対する化合物 A、D、E の半数抑制濃度の結果図。 MDBKに対する陽性薬物リバビリンの細胞毒性作用の結果図。四塩化炭素誘導肝臓損傷マウス血清中ALT活性に対する化合物A、B、C、D、ADの測定結果照合。四塩化炭素誘導肝臓損傷マウス血清中AST活性に対する化合物A、B、C、D、ADの測定結果照合。四塩化炭素誘導肝臓損傷マウス肝ホモジネート中MDA含有量に対する化合物A、B、C、D、ADの測定結果照合。四塩化炭素誘導肝臓損傷マウス肝ホモジネート中PGE₂含有量に対する化合物A、B、C、D、ADの測定結果照合。エタノール誘導肝臓損傷マウス血清中ALT活性に対する化合物A、B、ADの測定結果照合。エタノール誘導肝臓損傷マウス血清中AST活性に対する化合物A、B、ADの測定結果照合。エタノール誘導肝臓損傷マウス肝ホモジネート中MDA含有量に対する化合物A、B、ADの測定結果照合。四塩化炭素誘導肝臓損傷マウス血清中ALT活性に対する化合物E及びADの測定結果照合。四塩化炭素誘導肝臓損傷マウス血清中AST活性に対する化合物E及びADの測定結果照合。 ConA誘導肝臓損傷マウス血清中ALT活性に対する化合物E及びADの測定結果照合。 ConA誘導肝臓損傷マウス血清中AST活性に対する化合物E及びAD測定結果照合。

図1-4、図6-9及び図13-23において：モデル組と比較：^*P< 0.05，^**P< 0.01。AD組と比較：^ΔP< 0.05，^ΔΔP< 0.01。

以下に具体的な実施形態と合わせて本発明を詳細に説明する。これら実施形態は本発明を説明するために用いられるものであって、本発明の範囲を限定するものではないと理解されるべきである。当業者は肝臓損傷を引き起こす各種原因を研究対象として、本発明物が有する肝臓保護作用を得ることができる。

［実施例１］
ConA誘導免疫性肝臓損傷モデルにおいて、化合物A、B、C、ADは肝臓損傷に対して明らかな保護作用を表した。

1.実験方案
クリーングレード昆明マウス（雄、体重20±2g、河南省実験動物中心から提供）をランダムに組分けし、各組6匹とする。ビフェンダート（浙江医薬股ふん有限公司新昌製薬工場、200mg/kg）を陽性対照組とし、アンドログラホリド（AD）は輔仁薬業集団有限公司から提供、試験薬物は本発明者が合成し、純度99.0%超え。正常対照組とモデル組に0.5%のカルボキシメチルセルロースナトリウム塩（CMC-Na）を投与し、投与組にそれぞれ0.5% のCMC-Naが懸濁されたAD（0.88mmol/kg）と化合物A、B及びCの低用量（0.66mmol/kg）及び高用量（0.88mmol/kg）を与えた。3日間、薬物を投与し、最後の投与から1時間後、正常対照組を除き、他のマウスに対してConA(20mg/kg)を一回のみ尾静脈注射し、8時間後、眼球採血し、3000rpmで15min分間遠心し、血清を分離し、キットの説明書の要求（南京建成生物工程研究所）に基づき、ALTとASTをそれぞれ測定した。肝臓の左葉を取り、生理塩水で10%のホモジネートを作り、キットの説明書の要求（南京建成生物工程研究所）に基づき、MDAを測定した。50μLの肝ホモジネート液を2mL 0.5 mol/L のKOH-メチルアルコール溶液に入れ、50℃の水浴で、20分間異性化した後、波長 278nm 箇所で吸光度（A値）を測定し、毎ミリリットルのホモジネート液相当の A 値はPGE₂含有量を表す。実験データは平均±標準偏差

で表し、SPSS 11.5 統計ソフトで分析し、P<0.05 は差異が顕著な意味を持つことを表す。

2.実験結果
マウス血清中ALT、AST活性及び肝ホモジネート中MDA、PGE₂含有量に対する化合物A、B、C、ADの影響の結果は図1-4のとおり。この結果、AD組に比べ、化合物の各用量組はみな、ある程度においてAD組より優れる。また、各化合物の高用量組（0.88mmol/kg）は同じ用量のAD組に比べ、酵素低下效果がより優れている（P<0.05）。特に、化合物Aの高用量組（0.88mmol/kg）は基本的に正常レベルまで下がった。

AD組と本発明の各化合物の異なる用量組はみな、肝臓損傷マウス肝ホモジネート中MDA含有量が低下し（P<0.05）、特に、化合物A の低用量組（0.66mmol/kg）、化合物B及びCの高用量組（0.88mmol/kg）の効果はより明らかである（P<0.01）。AD組に比べ、化合物A の低用量組（0.66mmol/kg）、化合物B及びCの高用量組（0.88mmol/kg）の抗肝臓脂質過酸化能力はより強い（P<0.01）。

化合物A（高用量、P<0.01。低用量、P<0.05）、B（高用量、P<0.01）及びC（高用量、P<0.01）は、肝臓損傷マウス肝ホモジネート中PGE₂含有量が更に著しく低下した。

以上より、化合物A、B、CはConA誘導免疫性肝臓損傷に対して明らかな保護作用を持ち、作用効果は母体化合物ADより優れる。

肝組織病理切片HE染色の結果は図5のとおり。正常組肝小葉構造は完全で、肝細胞は中央静脈を中心に放射状に配列され、変性や壊死改変は見られず、肝類洞も異常は見られない。モデル組マウス肝小葉の破壊は大きく、肝細胞が腫れ、細胞質がゆるみ、粒子変性や空泡変性があり、肝類洞が拡張して血液が滲出し、一部の肝細胞核が濃縮、消失し、明らかな点を形成し、巣状壊死している。AD組肝細胞は軽度に腫れ、ゆるみ、一部の肝細胞が点状壊死、変性し、大面積の肝細胞の巣状壊死領域は見られなかった。化合物A組の肝類洞内に血液滲出は見られず、肝細胞は軽度に粒子変性や空泡変性し、点状・巣状壊死領域は見られなかった。

［実施例２］
ConA誘導免疫性肝臓損傷モデルにおいて、15- p-クロロベンジリデン-3，19-ニコチネート-14-デオキシ-11,12-ジデヒドロアンドログラホリド（化合物D）は肝臓損傷に対して明らかな保護作用を表した。

1.実験方案
クリーングレード昆明マウス（雄、20±2g）をランダムに正常組、モデル組、ビフェンダート（浙江万邦薬業有限公司）陽性対照組（200mg/kg）、AD組（0.88mmol/kg）、化合物Dの低用量組（0.66mmol/kg）及び高用量組（0.88mmol/kg）に分けた。ALT、AST、MDA測定キットは南京建成生物工程研究所から購入した。その他の試剤、薬品、実験方法は実施例1と同じ。

2 実験結果
血清中ALT、AST及び肝ホモジネート中MDA、PGE₂に対する化合物Dの影響の結果図6-9のとおり。
化合物Dの低用量組（P<0.05）、高用量組（P<0.01）のマウス血清中ALT、AST活性はモデル組に比べ明らかに低い。低、高用量の化合物Dは肝ホモジネート中MDA、PGE₂含有量（P<0.01）が明らかに低下している。高用量組PGE₂含有量は正常組に近い。AD 組に比べ、化合物Dの高用量組（0.88mmol/kg）の酵素低下及び抗肝臓脂質過酸化能力は明らかに向上した（P<0.05）。

以上より、化合物DはConA誘導肝臓損傷に対して明らかな保護作用を持ち、作用効果は母体化合物ADより優れる。

［実施例３］
アンドログラホリド誘導体体外抗BVDV活性実験
1.細胞培養と医薬品処理
MDBK (NBL-1)細胞(中科院上海典型培養物保藏中心から購入)、牛ウイルス性下痢ウイルス(BVDV-AV69)(中国獣医薬品監査所から購入)を利用し、BVDVウイルス接種による細胞病変に対する本発明の医薬品の治療作用を研究した。リバビリン(R;河南潤弘製薬股ふん有限公司、許可番号:1102261)を陽性薬物対照とした。MDBK細胞をRPMI1640培養液で調製した懸濁液 (1 × 10⁵/mL)を96ウェルプレート中(美国Costar社)に200 μ L/ウェル接種し、培養液には体積分数10%のウシ胎児血清(浙江天杭生物科技有限公司、許可番号:100524)、100 μg/ mLストレプトマイシン(深せん華薬南方製薬有限公司、許可番号:N09081)、100U/ mLペニシリン(華北製薬股ふん有限公司生産、許可番号:E0909604)が含まれ、体積分数5%CO₂培養ケース(ドイツBinder社製)に入れ、37℃で24 時間培養し、細胞が単層に成長した後、100TCID₅₀のウイルス液(TCID₅₀=10^-2.5)を入れて1.5時間孵化する。PBSで三回洗浄した後、薬物を含有した維持液200 μ L/ウェルを加える。

2.MTT法で細胞毒性を測定
成長状態が良好であるMDBK細胞をトリプシンで消化し、数えた後、7× 10⁴/mLで96ウェルプレートに入れ、200 μ L/ウェル、37℃、5% のCO₂の培養ケースの中で24時間培養し、薬物を含有した培養基を加え、続けて48時間培養し、MTT(5mg/mL)を入れ、 20 μ L/ウェル、4時間培養し、上澄みを除き、150μ L のDMSOを入れ、10分間振動させ、マイクロプレートリーダーで吸光値を測定する。測定波長は570nm、参考波長は450nm。化合物作用後の細胞生存率を計算し、生存率(%)=医薬品組A値/細胞対照組A値× 100%、結果は図10のとおり。細胞増殖値抑制率(%)=100%-生存率、Reed-Muench法で半数毒性濃度(TC₅₀)を計算する。

3.CPE法で細胞病変に対する医薬品の治療作用を観察
MDBK細胞をトリプシンで消化した後、1 × 10⁵/mL濃度で96ウェルプレート培養板に接種し、200μ L/ウェル、37℃、5%の CO₂培養ケースで24時間培養し、細胞が単層に成長した後、100TCID₅₀ウイルスで攻撃し、1. 5時間孵化し、ウイルス含有維持液を捨て、PBSで洗浄し、異なる濃度の薬物含有維持液200 μ Lを加え、 37℃、 5%の CO₂の条件で培養する。正常細胞対照組、ウイルス対照組、医薬品処理組、リバビリン処理組を設ける。毎日、逆向きの顕微鏡で観察し、細胞病変の発生状況を記録する。本発明の化合物と陽性薬物病変抑制率は約50%の最低濃度(IC₅₀)であり、図11のとおり。治療指数TI 値(TC₅₀/IC₅₀₎を計算、結果は表1のとおり。

4.実験結果
測定される化合物の抗ウイルス実験を行う前に、化合物がBVDVウイルスに作用する際にMDBK細胞の正常活性に影響しないことを保証するために測定される化合物のMDBK細胞に対する最低無毒濃度を確定する必要がある。本発明の化合物A、D、Eは0 -7.5 μ mol/L濃度範囲内においてMDBK細胞に48時間作用した後、明らかな細胞毒性は見られず、そのうち、化合物Eは濃度が30 μ mol/Lまで高くなった際も細胞毒性は見られなかった。化合物A、D、E、特に化合物EはADよりも良好な抗ウイルス效果を見せた。TI値の結果、AD及び化合物A、D、Eは陽性薬物よりも高い治療指数を見せ、中でも化合物Eの治療指数が最高であった。

以上より、ウイルスによる細胞病変に対する本発明の化合物A、D、Eの治療作用はリバビリンよりも強く、より安全である。

［実施例４］
四塩化炭素誘導化学性肝臓損傷モデルにおいて、化合物A、B、C、Dは肝臓損傷に対して明らかな保護作用を表した。

1.実験方案
クリーングレード昆明マウス（雄、20±2g）に3日間、適応性餌付けを行いその後、ランダムに正常組、モデル組、ビフェンダート（200mg/kg）、AD組（0.88mmol/kg）、化合物A、B、C、Dの低用量組（0.66mmol/kg）及び高用量組（0.88mmol/kg）に分け、各組8匹とする。陽性薬物組と各薬物投与組に0.5% のCMC-Naで調製した対応濃度の懸濁液を投与し、正常組とモデル組に0.5%の CMC-Na投与した。3日間投与し、最後の薬物を投与してから1時間後に、正常組を除き、その他の組に一回のみ、0.3%の四塩化炭素落花生油溶液（0.1mL/10g）を腹腔注射した。16時間後、各組マウスの眼球採血し、3000rpmで15min分間遠心し、血清を分離し、それぞれ、血清中ALT及びAST（南京建成生物工程研究所）の活性を測定した。肝臓の左葉を取り、生理塩水で10%のホモジネートを作り、肝ホモジネート中MDA（南京建成生物工程研究所）とPGE₂の含有量を測定した。実験データは平均±標準偏差

で表し、SPSS 11.5 統計ソフトで分析し、P<0.05 は差異が顕著な意味を持つことを表す。その他の試剤、薬品、実験方法は実施例1と同じ。

2.実験結果
血清中ALT、AST及び肝ホモジネート中MDA、PGE₂ に対する各組の影響結果は図13-16のとおり。その結果、化合物A、B、C、Dは四塩化炭素による肝臓損傷マウス血清中アミノフェラーゼ（ALT、AST）活性の上昇を効果的に抑制した（P<0.01）。化合物A、B、C、Dの低用量組（0.66mmol/kg）と高用量組（0.88mmol/kg）における酵素低下の幅は明らかにADよりも優れている（P<0.05）。

化合物A、B、C、Dは肝臓損傷マウス肝ホモジネート中MDA及びPGE₂のレベルを効果的に低下させ、差異は極めて顕著なレベルに達した（P<0.01）。AD 組に比べ、化合物Aの低用量（0.66mmol/kg）、高用量（0.88mmol/kg）、化合Bの低用量、化合物C、Dの高用量（0.88mmol/kg）は肝ホモジネート中脂質過酸化物のレベルを下げる能力がより強い（P<0.05）。化合物A及びC の高用量組、化合物Bの低用量、及び化合物Dの低、高用量組マウス肝ホモジネート液中PGE₂の含有量はAD組よりも明らかに低い（P<0.05）。

以上より、化合物A、B、C、Dは四塩化炭素誘導化学性肝臓損傷に対して保護作用を持ち、効果は母体化合物ADより優れる。

［実施例５］
エタノール誘導肝臓損傷モデルにおいて、化合物A、B、ADは肝臓損傷に対して明らかな保護作用を表した。

1.実験方案
クリーングレード昆明マウス（雄、20±2g，）に3日間、適応性餌付けを行いその後、ランダムに正常組、モデル組、ビフェンダート組（200mg/kg）、AD組（0.88mmol/kg）、化合物Aの低用量組（0.44mmol/kg）、中用量組（0.66mmol/kg）、高用量組（0.88mmol/kg）及び化合物Bの中用量組（0.66mmol/kg）、高用量組（0.88mmol/kg）に分け、各組8匹とする。陽性薬物組と各薬物投与組に0.5% CMC-Naで調製した対応濃度の懸濁液を投与し、正常組とモデル組に0.5% CMC-Na投与した。3日間投与し、最後の薬物を投与してから1時間後に、正常組を除き、その他の組に一回のみ、50% エタノール溶液（1.2mL/10g）を投与した。16時間後、各組マウスの眼球採血し、3000rpmで15min分間遠心し、血清を分離し、それぞれ、血清中ALT及びAST（南京建成生物工程研究所）の活性を測定した。肝臓の左葉を取り、生理塩水で10%のホモジネートを作り、肝ホモジネート中MDA（南京建成生物工程研究所）の含有量を測定した。実験データは平均±標準偏差

で表し、SPSS 11.5 統計ソフトで分析し、P<0.05 は差異が顕著な意味を持つことを表す。その他のキット、薬剤、実験方法は実施例1と同じ。

2.実験結果
血清中ALT、AST及び肝ホモジネート中MDAに対する各組の影響結果は図17-19のとおり。その結果、化合物A及びBは有效抑制エタノールによる肝臓損傷マウス血清中アミノフェラーゼ（ALT、AST）活性と肝組織ホモジネート中MDA含有量の上昇を効果的に抑制した（P<0.01）。化合物A（P<0.01）とB（P<0.05）の高用量組（0.88mmol/kg）のALT活性に対する低下の幅は明らかにAD組よりも優れ、化合物A高用量組（0.88mmol/kg）のAST活性に対する低下の幅は明らかにAD組（P<0.01）よりも優れている。化合物AとBは肝臓損傷マウス肝ホモジネート中MDAレベルを効果的に低下させている（P<0.01）。

以上より、化合物A及びBはエタノール誘導肝臓損傷に対して保護作用を持ち、効果は母体化合物AD組より優れる。

［実施例６］
四塩化炭素誘導化学性肝臓損傷モデル及びConA誘導免疫性肝臓損傷モデルを採用し、肝臓損傷に対する化合物Eの保護作用を研究した。
1.実験方案
2種類のモデルにおける実験研究は、以下の組分けを採用する：クリーングレード昆明マウス（雄、20±2g）をランダムに正常組、モデル組、ビフェンダート組（200mg/kg）、AD組（0.88mmol/kg）、化合物Eの低用量組（0.66mmol/kg）及び高用量組（0.88mmol/kg）に分け、各組8匹とする。ALT、AST検査キットは南京建成生物工程研究所から購入。その他のキット、薬剤、実験方法は実施例2及び実施例4と同じ。

2.実験結果
四塩化炭素誘導化学性肝臓損傷研究において、血清中ALT、AST活性に対する各組の影響結果はそれぞれ図20-21のとおり。化合物Eは低く、高用量組マウス血清中ALT、AST活性はモデル組よりも明らかに低く（P<0.01）、AST及び高用量組のALT活性はAD組よりも明らかに低い（P<0.05）。ConA誘導免疫性肝臓損傷研究において、血清中ALT、AST活性に対する各組の影響結果はそれぞれ図22-23のとおり。その結果、化合物Eは低く、高用量組マウス血清中ALT、AST活性がモデル組よりも明らかに低く（P<0.01）、AD組（P<0.05）よりも明らかに低い。

以上より、化合物Eは四塩化炭素及びConA誘導肝臓損傷に対して明らかな保護作用を持ち、作用効果は母体化合物ADより優れる。

Claims

活性成分として抗C型ウイルス性肝炎医薬品の製造に用いられることを特徴とする、一般式1で表される構造を有する15-ベンジリデン-14-デオキシ-11,12-ジデヒドロアンドログラホリド誘導体の医薬品製造における使用。

式中、R₁は水素、R₂はフェニル、4-フルオロフェニル、4-クロロフェニル、4-ブロモフェニル、R₃、R₄はそれぞれ水素又はCOR₅、R₅は3-ピリジル又はCH₂CH₂COOH。
前記化合物は、R₁は水素、R₂は4-フルオロフェニル、4-クロロフェニル、4-ブロモフェニル、R₃、R₄はそれぞれ水素又はCOR₅、R₅は3-ピリジル又はCH₂CH₂COOHであることを特徴とする、請求項1に記載の15-ベンジリデン-14-デオキシ-11,12-ジデヒドロアンドログラホリド誘導体の医薬品製造における使用。
前記化合物は、好ましくは下記のうちのいずれかであることを特徴とする、請求項2に記載の15-ベンジリデン-14-デオキシ-11,12-ジデヒドロアンドログラホリド誘導体の医薬品製造における使用。
A: R₁=H，R₂=4-Cl-C₆H₄， R₃= R₄=H；
D: R₁=H，R₂=4-Cl-C₆H₄， R₃= R₄=COR₅，R₅=3-ピリジル；
E: R₁=H，R₂=4-Cl-C₆H₄， R₃= R₄=COR₅，R₅=CH₂CH₂COOH。
抗HCVの予防又は治療のための医薬品製造に用いられることを特徴とする、請求項1〜3のいずれかに記載の15-ベンジリデン-14-デオキシ-11,12-ジデヒドロアンドログラホリド誘導体の医薬品製造における使用。
活性成分として肝臓損傷（HBV由来の肝臓損傷を除く）の予防又は治療のための医薬品製造に用いられることを特徴とする、一般式1で表される構造を有する15-ベンジリデン-14-デオキシ-11,12-ジデヒドロアンドログラホリド誘導体の医薬品製造における使用。

式中、R₁は水素、R₂はフェニル、4-フルオロフェニル、4-クロロフェニル、4-ブロモフェニル、3-フルオロフェニル、3-クロロフェニル、3-ブロモフェニル、R₃、R₄はそれぞれ水素又はCOR₅、R₅は3-ピリジル又はCH₂CH₂COOH。
前記化合物は、R₁は水素、R₂は4-フルオロフェニル、4-クロロフェニル、4-ブロモフェニル、3-フルオロフェニル、3-クロロフェニル、3-ブロモフェニル、R₃、R₄はそれぞれ水素又はCOR₅、R₅は3-ピリジル又はCH₂CH₂COOHであることを特徴とする、請求項5に記載の15-ベンジリデン-14-デオキシ-11,12-ジデヒドロアンドログラホリド誘導体の医薬品製造における使用。
前記化合物は、好ましくは下記のうちのいずれかであることを特徴とする、請求項5に記載の15-ベンジリデン-14-デオキシ-11,12-ジデヒドロアンドログラホリド誘導体の医薬品製造における使用。
A: R₁=H，R₂=4-Cl-C₆H₄，R₃= R₄=H；
B: R₁=H，R₂=C₆H₅，R₃= R₄=H；
C: R₁=H，R₂=3-Br-C₆H₄，R₃= R₄= H；
D: R₁=H，R₂=4-Cl-C₆H₄，R₃= R₄=COR₅，R₅=3-ピリジル；
E: R₁=H，R₂=4-Cl-C₆H₄，R₃= R₄=COR₅，R₅=CH₂CH₂COOH。
ウイルス感染又は薬物による肝臓損傷（HBV由来の肝臓損傷を除く）の予防又は治療のための医薬品製造に用いられることを特徴とする、請求項5〜7のいずれかに記載の15-ベンジリデン-14-デオキシ-11,12-ジデヒドロアンドログラホリド誘導体の医薬品製造における使用。
活性成分として、又は他の薬物と組み合わせて、製薬的に許容可能な補助及び／又は添加成分と混合した後、通常の製薬方法及びプロセス要求に基づき、肝臓損傷（HBV由来の肝臓損傷を除く）および抗C型肝炎ウイルスの治療又は予防のための経口型製剤、注射型製剤の医薬品に調製することを特徴とする、請求項1又は5に記載の15-ベンジリデン-14-デオキシ-11,12-ジデヒドロアンドログラホリド誘導体の医薬品製造における使用。
経口型製剤は錠剤、丸剤、カプセル、顆粒剤又はシロップであり、注射型製剤は注射液又は凍結乾燥粉末製剤であることを特徴とする、請求項9に記載の15-ベンジリデン-14-デオキシ-11,12-ジデヒドロアンドログラホリド誘導体の医薬品製造における使用。