CN101416958B - 15-亚甲基取代穿心莲内酯衍生物在制备抗乙型肝炎药物中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了如通式1所示15-亚甲基取代穿心莲内酯衍生物的药物用途，涉及其在制备抗乙型肝炎病毒(HBV)药物中的应用，属药物化学领域。本发明利用HepG2.2.15细胞，检测培养液上清中乙肝病毒表面抗原(HBsAg)、乙肝病毒核心抗原(HBeAg)分泌量及病毒颗粒相关的HBV DNA水平，表明：15-亚甲基取代穿心莲内酯衍生物具有良好的体外抗HBV作用。将其应用于制备治疗、预防乙型肝炎药物，具有较好的开发应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及穿心莲内酯的药物用途，具体涉及15-亚甲基取代穿心莲内酯衍生物的抗乙型肝炎病毒药物作用，属药物化学领域。
背景技术
穿心莲内酯是穿心莲Andrographis paniculata(Burm.f.)Nees中提取的二萜内酯类化合物，是中药穿心莲的主要有效成分之一，临床上主要用于治疗上呼吸道感染、细菌性痢疾等。近年来，现代药理学研究发现，穿心莲内酯不仅具有抗菌消炎作用，还具有抗肿瘤、保肝利胆、抗病毒作用。关于穿心莲及其提取物抗病毒研究已有许多报道。穿心莲提取物可有效治疗呼吸道感染和病毒性肺炎，有效降低与普通感冒有关症状的流行性和强度；穿心莲总黄酮和穿心莲内酯或其衍生物组合对流感病毒、腺病毒有抑制作用、对疱疹病毒有一定的延缓作用(CN：200610080719.6)。穿心莲内酯及其衍生物有抗黄病毒、瘟病属或丙型肝炎病毒(CN：200580046253.1)、抗SARS(CN：03129127.9)作用。穿心莲中的成分与其它植物或其成分形成的组合物具有抗病毒作用。美国专利5,833,994公开了芳烃受体配体和穿心莲内酯联合用于治疗病毒感染的用途。穿心莲内酯琥珀酸单酯通过干扰病毒与细胞结合和在病毒复制周期随后至病毒细胞结合阶段干扰抑制HIV。穿心莲甲醇提取物可通过抑制c-Mos在体外抑制HIV-1复制。然而，也有报道称，穿心莲的水性提取物对HIV-1活性作用很小或无抗病毒作用；穿心莲的提取物对乙型肝炎表面抗原的表达作用很小或无作用。
肝炎B病毒(hepatitis B virus，HBV)是人类hepadnaviradae病毒家族的一员，是乙型肝炎的病原体。全球有超过3.5亿人感染了HBV，在中国约有1.2亿人长期携带乙肝病毒，其中35％可发展为慢性乙型肝炎，65％可演变为肝硬化，而抗乙型肝炎的治疗应以抗病毒为主，因此，抗HBV药物的市场需求巨大。目前抗HBV的药物主要是以拉米夫定为代表的核苷类似物和干扰素类，然而临床应用中存在的不良反应和耐药性等问题使其使用受到一定的限制。
抗HBV另一类极具开发潜力的药物是葡萄糖苷酶抑制剂。最近，有两种新的葡萄糖苷酶抑制剂N-壬基-脱氧野尻霉素(DNJ)和N-壬基-脱氧半乳糖野尻霉素(DGJ)表现出很好的抗HBV活性。葡萄糖苷酶抑制剂可通过破坏肝炎病毒糖蛋白的正确折叠和运输而抗HBV。以穿心莲内酯(AD)为先导化合物合成的新型α-葡萄糖苷酶抑制剂15-亚甲基取代穿心莲内酯衍生物，在专利CN：200510107247.4已有所报导，为本申请人前期研究成果，后期又对其进行了更为深入的研究，研究表明：此类化合物具有显著的体外抗HBV作用，目前将其作为制备治疗和预防乙型肝炎药物(抗HBV)的应用还未见相关报道。
发明内容
本发明目的在于提供15-亚甲基取代穿心莲内酯衍生物在制备抗HBV药物中的应用。
为实现本发明目的，采用乙型肝炎病毒基因转染的人肝癌细胞HepG2.2.15细胞，研究15-亚甲基取代穿心莲内酯衍生物对HepG2.2.15细胞培养液上清中HBV表面抗原(HBsAg)、HBV核心抗原(HBeAg)和HBV DNA含量的影响。研究证实15-亚甲基取代穿心莲内酯衍生物具有抗HBV作用，可以用于制备抗HBV药物。通过小鼠急性毒性实验证实本发明15-亚甲基取代穿心莲内酯衍生物的毒性甚微。以该类化合物为有效药用成分，或与其它药物组合，按目前各种常规的制药方法和工艺要求，与制药中可以接受的辅助和/或添加成分混合后，制成用于抗HBV的口服型制剂、注射型制剂等药物。口服型制剂为含片、丸剂、胶囊、冲剂或糖浆等；注射型制剂包括注射液或冻干粉针剂型等。
15-亚甲基取代穿心莲内酯衍生物具有通式1所示结构，式中R1、R2为氢、C1-16烃基、芳香基、卤代芳基、芳香烷基、芳酰基、烷酰基、链烯基、链烯酰基、杂芳基、杂芳酰基、芳烯酰基、芳烷酰基、杂芳烷基或杂芳酰基；R3、R4为氢、COR5，R5为C1-16烃基、芳香基、芳香烷基、链烯基、杂芳基或杂芳烷基基团。
通式1
优选15-对苯基亚甲基-14-脱氧-11，12-脱氢穿心莲内酯(ADD-1)和15-对氯苯基亚甲基-3，19-烟酸酯-14-脱氧-11，12-脱氢穿心莲内酯(ADD-2)，其制备方法已在本研究前期申请的的发明专利CN：200510107247.4中公开，还可以参考文献BMC，2007(Xu HW，et al.)。
本发明优点及创新点：通过活性筛选，确定15-亚甲基取代穿心莲内酯衍生物具有明确的体外抗HBV活性，高效低毒，用于乙型肝炎的治疗和预防，为开发抗HBV药物提供了新的药物途径，而且扩大了临床用药的可选择范围，对充分利用穿心莲植物资源具有重要意义。
具体实施方式
通过药理试验，以15-对苯基亚甲基-14-脱氧-11，12-脱氢穿心莲内酯(ADD-1)和15-对氯苯基亚甲基-3，19-烟酸酯-14-脱氧-11，12-脱氢穿心莲内酯(ADD-2)为例，详细说明其抗HBV活性。
实施例1 15-亚甲基取代穿心莲内酯衍生物体外抗HBV活性实验
1.细胞培养和药物处理
采用乙型肝炎病毒基因转染的人肝癌细胞系HepG2.2.15细胞(由河南省医药科学研究院提供)，检测本发明药物对HepG2.2.15细胞培养液上清中HBV表面抗原(HBsAg)、HBV核心抗原(HBeAg)和HBV DNA含量的影响。将2.2.15细胞悬液接种于48孔板中(美国Costar公司)，细胞数为1.25×104/孔，加RPMI1640培养液0.5mL，培养液中含体积分数10％胎牛血清(天津市灏洋生物制品科技责任有限公司，批号：XA080329)、380μg/mL G418(美国Invitrogen生命技术公司)、100μg/mL链霉素(100万单位/支，为华北制药股份有限公司生产，批号：060606)、100IU/mL青霉素(160万单位/支，为华北制药股份有限公司生产，批号：Y0806110)，置体积分数5％二氧化碳培养箱(德国Binder公司)37℃培养，24h换含药培养液。用拉米夫定(lamivudine，3TC；葛兰素史克制药(苏州)有限公司，批号：08060024)做阳性药物对照。分别于培养3d、6d更换一次培养液，培养第9天取出培养孔中的上清液，3次取出的上清液进行HBsAg、HBeAg和HBV DNA检测.板中细胞用MTT法测细胞活性。药物浓度分5级，重复3次。
2.ELISA法检测HepG2.2.15细胞培养上清中的HBsAg和HBeAg
乙型肝炎病毒e抗原诊断试剂盒(上海科华生物技术有限公司，批号20080117)和s抗原诊断试剂盒(上海科华生物技术有限公司，批号：20071117)是采用ELISA原理分别对HBeAg和HBsAg进行检测。待测标本经适量稀释后，每孔加入50μL于96孔微孔反应板中，每孔加入酶结合物50μL(空白对照孔除外)，充分混匀，封板，置于37℃孵育30分钟；每孔加显色剂A液、B液各50μL，充分混匀，封板，置于37℃孵育15分钟；每孔加入终止液50μL，混匀。用酶标仪(美国BIO-TEK公司Powerwave X型)读数，使用双波长的酶标仪比色，即取波长450nm，参考波长630nm，读取各孔OD值。样品OD值/阴性对照平均OD值≥2.1判断为阳性，否则为阴性。阴性对照OD值低于0.05作0.05计算，高于0.05按实际值计算。计算药物对HBsAg(或HBeAg)的抑制率和治疗指数。
抑制率＝[对照孔HBsAg(或HBeAg)OD-实验孔HBsAg(或HBeAg)OD]÷对照孔HBsAg(或HBeAg)OD×100％；HBsAg和HBeAg的治疗指数(TI)＝半数毒性浓度(TC50)/半数有效浓度(IC50)。其中TI≥2为有效低毒。
3.HBV DNA检测
使用深圳匹基生物技术开发有限公司生产的乙肝病毒(HBV)核酸扩增(PCR)荧光检测试剂盒对加药处理和不加药处理的HePG2.2.15细胞的培养上清中HBVDNA进行定量分析。按试剂盒说明书操作，提取培养上清和试剂盒提供的阴性对照、强阳性对照以及临界阳性对照的总HBV DNA，分别取2μL HBV DNA提取液和2μL阳性工作标准品加入已加有18μL HBV DNA PCR荧光检测试剂(按试剂盒说明配制)的Roche毛细管(瑞士Roche公司生产)中，2000r/min离心10秒，将毛细管放入PCR仪(瑞士Roche公司生产，型号
1.5)中，设循环参数如下：37℃ 3min，1 cycle；92℃ 1min，1 cycle；92℃ 5s，60℃30s，40 cycle；40℃ 0s，1 cycle。反应结束后由计算机自动分析出HBV DNA定量结果，计算HBV DNA抑制率。HBV DNA抑制率(％)＝(空白对照孔HBV DNA拷贝数—加药孔HBV DNA拷贝数)/空白对照孔HBV DNA拷贝数×100％。
4.MTT法测定细胞毒
培养9d后，吸出各孔上清液用于病毒HBsAg、HBeAg和HBV DNA检测。每孔加质量浓度为0.5mg/mL MTT的PBS溶液100μL，37℃培养4h，弃去培养液，每孔加入100μL二甲基亚砜，振荡10min，置酶标仪下490nm测定A值，与空白对照孔A值比较，以空白对照孔的细胞存活率为100％，计算各孔存活细胞百分比。
5.结果与结论
通过对部分15-亚甲基取代穿心莲内酯衍生物进行筛选，发现ADD-1、ADD-2的治疗指数大于2，是高效低毒体外抗HBV药物，其中α-葡萄糖苷酶抑制活性最高的衍生物ADD-2的治疗指数为11.8(HBsAg)和12.52(HBeAg)，结果见表1。
表1本发明衍生物体外抗HBV作用
注：Ni：治疗指数TI＜2
表2是关于ADD-2对HepG2.2.15细胞培养液上清中HBV的HBsAg、HBeAg和DNA含量的影响。结果表明，ADD-2在1.25-20μg/mL浓度范围内，显著降低培养液中HBsAg、HBeAg的含量，呈剂量依赖性。在2.5-20μg/mL浓度范围内，显著降低培养液中HBV DNA的含量，呈剂量依赖性。而当HBV的抗原抑制率达94％时的细胞存活率仍为70％。
表2本发明衍生物对HepG2.2.15细胞培养上清HbsAg、HbeAg和HBV DNA的抑制作用(x±s)
| 组别 | 浓度(μg/mL) | HBsAg抑制率(％) | HBeAg抑制率(％) | HBV DNA含量log(copies·mL<sup>-1</sup>) | HBV DNA的抑制率(％) | 细胞存活率(％) |
| 空白对照 | 0 | / | / | 6.63±0.052 | / | 100±2.96 |
| 拉米夫定 | 10 | 49.87±3.46<sup>*</sup> | 32.12±2.48 | 5.81±0.046<sup>**</sup> | 84.88±5.24<sup>**</sup> | 66.71±2.56 |
| ADD-2 | 1.25 | 38.25±2.04<sup>*</sup> | 40.12±3.66<sup>*</sup> | 6.54±0.065 | 16.80±1.02 | 100±3.48 |
| ADD-2 | 2.5 | 71.06±5.47<sup>**</sup> | 73.86±5.24<sup>**</sup> | 6.48±0.060<sup>*</sup> | 27.63±1.24<sup>*</sup> | 91.76±1.44 |
| ADD-2 | 5 | 84.92±4.92<sup>**</sup> | 85.08±5.79<sup>**</sup> | 6.44±0.087<sup>*</sup> | 33.59±2.56<sup>*</sup> | 84.01±2.02 |
| ADD-2 | 10 | 94.14±5.62<sup>**</sup> | 94.23±6.21<sup>**</sup> | 6.20±0.038<sup>**</sup> | 62.21±3.22<sup>**</sup> | 70.73±2.89 |
| ADD-2 | 20 | 97.22±6.18<sup>**</sup> | 98.53±6.76<sup>**</sup> | 4.85±0.026<sup>**</sup> | 98.32±5.18<sup>**</sup> | 49.84±4.61 |
注：细胞培养上清中HBV DNA量采用HBV核酸扩增荧光定量法检测；差异显著性用t检验，与空白组比*P＜0.05，**P＜0.01；
实施例2 ADD-2的急性毒性实验
动物：清洁级昆明种小鼠，体重20±2g，雌雄各半，合格证号：0009898河南省实验动物中心提供。
药物：本发明15-亚甲基取代穿心莲内酯衍生物
实验方法：取体重20±2g小鼠20只，雌雄各半，随机分成ADD-2低剂量组和ADD-2高剂量组，每组10只。动物禁食12h后(不限饮水)，分别一次性灌胃给予剂量为2.00g/kg和5.00g/kg的ADD-2，灌胃量为0.2mL/10g。观察、记录动物的中毒表现。每周称重一次。连续观察14天，结果见表3。
实验结果：小鼠没有出现明显中毒表现，且未有死亡，说明ADD-2的急性毒性甚微。作为制备抗HBV药物，具有较高的实用、开发价值。
表3 ADD-2急性毒性实验
综上所述，该类衍生物具有明确的体外抗HBV活性，是高效低毒的抗HBV药物，用于制备乙型肝炎的治疗和预防药物具有较好的开发应用前景。
Claims (4)
1.15-对氯苯基亚甲基-3，19-烟酸酯-14-脱氧-11，12-脱氢穿心莲内酯在制药中的应用，其特征在于，将其应用于制备治疗、预防乙型肝炎药物。
2.如权利要求1所述的15-对氯苯基亚甲基-3，19-烟酸酯-14-脱氧-11，12-脱氢穿心莲内酯在制药中的应用，其特征在于，将其作为有效成分制成口服、注射乙型肝炎药物。
3.如权利要求2所述的15-对氯苯基亚甲基-3，19-烟酸酯-14-脱氧-11，12-脱氢穿心莲内酯在制药中的应用，其特征在于，所述的口服型制剂为含片、丸剂、胶囊、冲剂或糖浆。
4.如权利要求2所述的15-对氯苯基亚甲基-3，19-烟酸酯-14-脱氧-11，12-脱氢穿心莲内酯在制药中的应用，其特征在于，所述的注射型制剂为注射液或冻干粉针剂型。
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