JP5837935B2

JP5837935B2 - 医薬品の調製のための１５−ベンジリデン−１４−デオキシ−１１，１２−ジデヒドロアンドログラホリド誘導体の使用

Info

Publication number: JP5837935B2
Application number: JP2013534154A
Authority: JP
Inventors: ダイ，グイフ; シュ，ハイウェイ; チュ，リーピン; ドン，ルイジン; ウー，フェンジュアン; ワン，ヤナン; ジャン，チーウェン; ヤン，リージュン; リー，ウェイイ; リュー，ホンミン
Original assignee: ツェンチョウユニバーシティー
Priority date: 2010-10-22
Filing date: 2011-10-19
Publication date: 2015-12-24
Anticipated expiration: 2031-10-19
Also published as: CN101972247B; WO2012051941A1; JP2013544789A; US20130237596A1; CN101972247A; US9198894B2

Description

本発明はアンドログラホリド誘導体の医薬品用途に関し、具体的には、化合物15-ベンジリデン-14-デオキシ-11,12-ジデヒドロアンドログラホリド誘導体及びその3,19エステル化物に関し、医薬技術分野に属す。

近年、現代社会競争の加速、生活ストレスの増大、環境汚染の深刻化等の原因により悪性腫瘍の発症率と死亡率は高止まりしており、現在には人類の健康を脅かす二番目の深刻な「キラー疾患」となっている。故に抗腫瘍薬の研究開発は重要な意味を持つ。

アンドログラホリド（Andrographolide）はキツネノマゴ科植物である穿心蓮（Andrographis paniculata (Burm. f.) Nees）から抽出されたジテルペンラクトン系化合物であり、漢方薬穿心蓮の主要な有効成分の一つで、解熱、抗炎症、抗菌、抗ウイルス、抗腫瘍等の効果がある。抗腫瘍についての研究は主に構造修飾により細胞毒活性を高めること、およびアンドログラホリドにより誘導された細胞のアポトーシス及びそのメカニズムを解明することに集中している。インドReddy’s実験室有限公司は「抗腫瘍活性を有する化合物、その調製方法、及びこの化合物を含有する医薬品組成物」という出願（特許文献１）を行い、この種の化合物を癌、HSV、HIV、乾癬等の治療に使用することを保護している。北京大学第一付属病院は特許出願（特許文献２）において、血管生成抑制のためのアンドログラフィスのジテルペンラクトン化合物の使用を開示している。河南大学が出願した、タイトルが「イソアンドログラホリドを含む医薬品組成物及びその医薬用途」（特許文献３）である特許は活性成分としてイソアンドログラホリドと、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬品組成物、並びに抗炎症薬及び抗腫瘍薬の調製のための使用に関する。韓光が出願した、タイトルが「トリアセチルアンドログラホリドを含有する医薬品組成物及びその医薬用途」（特許文献４）である特許は活性成分としてトリアセチルアンドログラホリドと、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬品組成物、並びに抗炎症薬、免疫抑制薬及び抗腫瘍薬の調製のための使用に関する。和記黄埔医薬企業有限公司はタイトルが「アンドログラホリド及びその誘導体、類似物の医薬用途」（特許文献５）である出願を提出し、TNF-α及び/又はIL-1β抑制剤の調製のためのこの種の化合物又はそのプロドラッグの使用に関する。

インドの科学者Nanduri等は主にアンドログラホリドC-3、C-14、C-19を改造し、100種に近い誘導体を合成し、これら化合物がインビトロにおいて種々のヒトの癌細胞、例えば、乳腺癌細胞Mcf-7、結腸癌細胞SW-620及びHT29、肺癌H522、メラノーマUACC62及びM14、卵巣癌SKOV-3、OVCAR及び PA1、前立腺癌 DU145及び PC-3、腎細胞癌 A498及び ACHN等に対して明らかな抑制作用があることを実証した。Srinivas等の研究では、8,17-エポキシ化アンドログラホリドがアンドログラホリドの細胞毒性を保ち、その上で得られたエステル化誘導体が活性を顕著に高めることが明らかになった。王新楊等はイソアンドログラホリドジオキサリルエステル系及びアミド系誘導体を設計合成し、MTT法により、一部誘導体がアンドログラホリドに相当する抗腫瘍活性及び更に良い化学安定性を有することを実証した。徐浩等はN-アセチル-12-アミノメチレン-14-デオキシアンドログラホリド誘導体の抗癌活性を研究し、10個の目標化合物（4a〜4j）がいずれもヒト胃腺癌BGC823、SGC-7901 及びヒト肝癌 SMMC7721細胞に対して異なる程度の抑制活性を持ち、そのうちヒトの肝細胞肝癌SMMC7721に対する化合物4cの抑制作用はアンドログラホリドを超え、シスプラチンに近いことを初歩的に証明した。

しかし、上記の構造修飾は主にC-3、C-14及びC-19のヒドロキシル基、及びΔ⁸、Δ¹²等の部位の二重結合において行われる。アンドログラホリドC15位の置換化合物の抗腫瘍作用を研究することはこの種の化合物の応用の開拓と我が国の自主知的財産権の保護に重要な意味を持つ。

CN1416428 CN1511522 CN1785177 CN101129354 CN1666985

本発明者は前期研究（CN 1978437、CN100999520、CN100999535、 CN101003527）において伝統的な改造モデルを打ち破り、100個余りの構造が新規的な化合物を得た。抗腫瘍活性最適化を行うことで、15-ベンジリデン-14-デオキシ-11,12-ジデヒドロアンドログラホリド誘導体及びその3,19エステル化物が顕著な抗腫瘍作用を有することを見出した。本発明の目的は15-ベンジリデン-14-デオキシ-11,12-ジデヒドロアンドログラホリド誘導体及びその3,19エステル化物の抗腫瘍薬の調製における使用を提供することにある。

本発明に記載の化合物は一般式1で表される構造を有する。

式中、R₁は水素、R₂はフェニル、p-メトキシフェニル又はp-ハロフェニル、R₃、R₄はそれぞれが水素又はCOR₅、R₅は3-ピリジル又はCH₂CH₂COOHである。

好ましい化合物：R₁は水素、R₂はフェニル、p-メトキシフェニル、p-フルオロフェニル、p-クロロフェニル、p-ブロモフェニル、3-フルオロフェニル、3-クロロフェニル又は3-ブロモフェニル、R₃、R₄はそれぞれが水素である。

好ましい化合物：R₁は水素、R₂はフェニル、p-メトキシフェニル、p-フルオロフェニル、p-クロロフェニル、p-ブロモフェニル、3-フルオロフェニル、3-クロロフェニル又は3-ブロモフェニル、R₃、R₄はそれぞれがCOR₅、R₅=3-ピリジル又はR₅=CH₂CH₂COOHである。

本発明の上記化合物の調製方法は本研究の前期出願の発明特許CN： 200510107247.4に既に開示されており、その合成方法は以下のとおり：14-デオキシ-11,12-ジデヒドロアンドログラホリド又は14-デオキシ-11,12-ジデヒドロ-3,19-エステル化アンドログラホリドのうちの一種と異なるアルデヒドとをメタノール又はエタノール又はテトラヒドロフランに溶解し、塩基触媒で、15〜70℃の温度で加熱反応すると、一般式1で表されるアンドログラホリド誘導体を得ることができる。そのうち使用する塩基は炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウム、トリエチルアミン、ピリジン、N,N-ジメチルアミノピリジンのうちの一種であり、その用量は0.2〜5モル%である。

使用するアルデヒドは芳香族アルデヒドであり、好ましくはベンズアルデヒド、ハロゲン化ベンズアルデヒド等であり、より好ましくはベンズアルデヒド、p-フルオロベンズアルデヒド、p-クロロベンズアルデヒド、p--ブロモベンズアルデヒド、p-メトキシベンズアルデヒドであり、使用する14-デオキシ-11,12-ジデヒドロ-3,19-エステル化アンドログラホリドは一般式1においてR₃、R₄それぞれがCOR₅であり、R₅が3-ピリジル又はCH₂CH₂COOHである場合に対応する。

本発明の目的を実現するために、プレートクローン形成試験を用いて上記化合物の腫瘍細胞クローン形成に対する抑制作用を研究し、スクッラチ法を用いて化合物の抗腫瘍細胞移動作用を研究し、スクッラチ法とトランスウェルチャンバー（Transwell）法を用いてヒト血管内皮細胞ECV304の移動に対する化合物の抑制作用を研究した。さらに、化合物2および3を例にH22マウス移植腫瘍モデルを用いてその腫瘍抑制作用及び抗腫瘍血管生成作用を研究し、S180肉腫マウス移植腫瘍モデルを用いて化合物2および3の腫瘍抑制作用及び抗侵襲転移作用を研究した。マウスメラノーマB16-F10肺転移モデルを用いて、化合物の抗転移作用を研究した。その結果、上記化合物は確たる抗腫瘍作用を持ち、活性成分として抗胃癌薬、抗肺癌薬、抗子宮頸癌薬、抗膀胱癌薬、抗食道癌薬、抗結腸癌薬、抗肝癌薬、抗前立腺癌薬又は抗メラノーマ薬の調製に用いることができることが実証された。化合物2および3を例にマウス限度毒性実験により本発明化合物の毒性は極めて弱いことが実証された。

この種の化合物を有効薬用成分として又はその他の医薬品と組み合わせて、現在の通常の各種製薬方法及びプロセス要求に基づき、製薬学的に許容可能な補助及び/又は添加成分と混合した後、抗腫瘍用の経口型製剤、注射型製剤等の薬剤に調製する。経口型製剤は、錠剤、丸剤、カプセル、顆粒剤、シロップであり、注射型製剤は注射液又は凍結乾燥粉末製剤等を含む。

本発明の利点と新規なポイント：活性スクリーニングにより、この種の化合物は確たる抗腫瘍活性を有し、高い効果と低い毒性を示し、活性成分として抗腫瘍薬の開発に用いることができることが確認され、腫瘍の治療と転移予防に新たな医薬品経路を提供し、臨床用薬の選択可能範囲を広げることができ、アンドログラフィス・パニクラタ植物資源の十分な利用に重要な意味を持つ。

図1は本発明化合物2-8の腫瘍細胞二次元移動に対する抑制活性である。そのうち、A図はEca-109細胞二次元移動に対する抑制活性（24h）であり、B図はHT29細胞二次元移動に対する抑制活性（24h）であり、C図は5637細胞二次元移動に対する抑制活性（24h）であり、D図はヒト胃腺癌SGC-7901細胞二次元移動に対する抑制活性（36h）であり、E図はヒト非小細胞肺癌A549細胞二次元移動に対する抑制活性（36h）であり、F図はヒトの前立腺癌PC-3細胞二次元移動に対する抑制活性（36h）である。図１−１の続き。図2は本発明化合物2-8のヒト血管内皮細胞ECV304二次元移動及び三次元移動に対する抑制作用であり、そのうち、A図はECV304二次元移動に対する抑制作用であり、B図はECV304三次元移動に対する抑制作用である。図3は本発明化合物3が作用されたC57マウスの薬剤投与前と薬剤投与終了後（24d）の各群の体重の変化状況。

薬理試験により、本発明で合成したアンドログラホリド誘導体2-8、重点的には15-p-クロロベンジリデン-14-デオキシ-11,12-ジデヒドロアンドログラホリド（化合物2）及び15-p-クロロベンジリデン-3,19-ニコチネート-14-デオキシ-11,12-ジデヒドロアンドログラホリド（化合物3）を例に、その抗腫瘍活性を詳細に説明する。

実施例1 腫瘍細胞クローン形成抑制作用
1.1材料と方法
1）細胞株：ヒト胃腺癌SGC-7901細胞株、ヒト非小細胞肺癌A549細胞株及びヒト子宮頸癌Hela細胞株は中国科学院上海生命科学研究院細胞資源中心から購入。

2）試薬と器材：RPMI1640培地、DMEM高グルコース培地及びトリプシンは全てGIBICO製品。標準ウシ胎児血清（FBS）は天津市浩洋生物製品科技有限公司から購入。マイコプラズマ無しウシ胎児血清（FCS）は杭州四季青生物工程材料有限公司から購入。アンドログラホリド（1）は輔仁薬業集団有限公司より提供、本発明で合成したアンドログラホリド誘導体は鄭州大学新薬研究開発中心より提供。CB150型CO₂培養箱はドイツBinder社より製造、TS100-F-PH型倒立顕微鏡は日本ニコン社より製造。細胞培養プレートはアメリカCostar社から購入。

3）実験方法：プレートクローン形成法を用いた。成長状態が良好な細胞を取り、細胞懸濁液を作り、6ウェル培養プレートに接種し、細胞数は100/ウェルであり、化合物の最終濃度がそれぞれ0、1.25、2.50、5.00、7.50、10.00μmol/Lになるように薬剤含有培地10mL/ウェルを加え、二つのプレートを平行にした。CO₂培養箱の中に置き、37℃で、5%CO₂及び飽和湿度条件で2週間培養した。培養プレートに肉眼で見えるクローンが現れたとき、培養を終了し、培養液を捨てて、PBSで2回丁寧に浸洗し、メタノール5mLで15分固定した後、固定液を捨て、HE染色し、顕微鏡下で50個の細胞を超えるクローンの数をカウントした。相対クローン形成率（%）=（薬剤投与ウェルクローン数/対照ウェルクローン数）×100%。結果としては、その平均値を取った。IC₅₀値を算出した。

1.2 試験結果
本発明化合物のA549、SGC-7901及びHela細胞クローン形成に対する抑制活性を表1に示す。その結果、本発明にかかる化合物は顕著な抗腫瘍細胞クローン形成作用を有することが明らかになった。そのうち、化合物2、5、6及び7のこの三株の腫瘍細胞に対するクローン形成抑制作用は、アンドログラホリド（1）に比べて、その差はいずれも有意な意味を持ち、化合物4のA549及びSGC-7901に対するクローン形成抑制作用もアンドログラホリド（1）に比べ顕著に向上している。

実施例2 腫瘍細胞移動抑制作用
2.1材料と方法
1）細胞株：ヒト膀胱癌5637細胞株、ヒト食道癌Eca-109細胞株、ヒト結腸癌HT29細胞株、ヒト胃腺癌SGC-7901細胞株、ヒト非小細胞肺癌A549細胞株及び前立腺癌PC-3細胞株は中国科学院上海生命科学研究院細胞資源中心から購入。

2）試薬と器材：実施例1と同じ。

3）実験方法：通常に培養した細胞をパンクレアチンで消化し、カウントし、希釈後、200μL/ウェルで96ウェルプレート内に敷きた。単層融合状態まで培養した後、血清含有量が1％である培地に差し替え、さらに12h同調培養後に線を描き、PBSで2回洗浄し、薬剤を加えた後すぐに顕微鏡下で撮影し、スクラッチ距離を測定した。薬剤濃度はそれぞれ2.50、5.00、10.00μmol/Lであり、4ウェルは繰り返し、溶媒対照を設けた。24h、36h培養した後、それぞれ顕微鏡下で撮影、測定し、その移動抑制率を算出した。移動抑制率（%）=1-（薬剤投与群0hスクラッチ距離-24h又は36hスクラッチ距離）/（空白群0hスクラッチ距離-24h又は36hスクラッチ距離）×100%。

2.2 実験結果
本発明化合物2-8の腫瘍細胞二次元移動の抑制活性を図1に示す。その結果、本発明化合物は明らかな抗腫瘍細胞移動作用を有することが明らかになった。そのうち、本発明化合物2-8は腫瘍細胞Eca-109、HT29、5637、SGC-7901、A549及びPC-3の二次元移動に対していずれも顕著な抑制作用を持ち、そのうち、化合物2は5637 及びSGC-7901に対して作用が強く、化合物3、5、8はA549及びEca-109に対して作用が強く、化合物4、6は5637及びPC-3に対して作用が強く、化合物7は5637及びA549に対して作用が強かった。アンドログラホリド（1）は5637及びA549に対して作用が強かった。

（注釈：化合物の濃度は10.00μmol/Lであり、化合物は一般式1に記載の構造を有し、但し、2：R₁=H、R₂=4-Cl-C₆H₄、R₃=R₄=H；3：R₁=H、R₂=4-Cl-C₆H₄、R₃=R₄=COR₅、R₅=3-ピリジル；4：R₁=H、R₂=C₆H₅、R₃=R₄=H；5：R₁=H、R₂=4-F-C₆H₄、R₃=R₄=H；6：R₁=H、R₂=4-Br-C₆H₄、R₃=R₄=H；7：R₁=H、R₂=4-CH₃O-C₆H₄、R₃=R₄=H；8：R₁=H、R₂=4-Cl-C₆H₄、R₃=R₄=COR₅、R₅=CH₂CH₂COOH）。

実施例3 抗血管生成作用
3.1 材料と方法
1）抗ECV304二次元移動（実施例2と同じ）
2）抗ECV304三次元移動
まず、無血清培地をトランスウェルチャンバーの上、下室に入れ、37℃の培養箱に1h放置し、80-90%まで培養したヒト血管内皮細胞ECV304（中国科学院典型培養物保蔵中心から購入）を消化し、10％ウシ胎児血清を含む培地に再懸濁し、細胞濃度を1×10⁶/mLに調整し、トランスウェルチャンバーの上、下室の培地を取り出し、上記細胞液を100μL/ウェルで上室に入れ、下室に600μLの10％血清を含む培地を入れ、CO₂培養箱の中に置き、37℃で、5%CO₂及び飽和湿度条件で2h培養した後、上室の培地を無血清又は薬剤含有無血清培地に差し替え、各群3つのデュプリケートを設け、18h培養し続けて、上室の内表面の転移していない細胞をコットンで拭き取り、フィルター膜をメタノール中で30分固定し、ヘマトキシリン染色し、下表面の細胞量をカウントした。顕微鏡下で、各ウェル5個の視野を選び、200倍の拡大倍率でカウントし、その平均値を求め、薬剤の細胞移動に対する抑制率を算出した。移動抑制率（%）=1-（薬剤投与群細胞移動数量/空白群細胞移動数量）×100%。

3.2 実験結果
本発明化合物2-8のECV304二次元移動及び三次元移動に対する抑制作用の結果をそれぞれ図2A和図2Bに示す。その結果、本発明化合物2-7はECV304の二次元移動に対していずれも異なる程度の有効な抑制作用を有し、化合物2が最も顕著であり、化合物2-8はECV304の三次元移動に対していずれも有効な抑制作用を有し、化合物2-8の抗移動作用はアンドログラホリド（1）に比べいずれも顕著に強くなっていることが明らかになった。

（注釈：化合物の濃度は10.00μmol/Lであり、化合物は一般式1に記載の構造を有し、そのうち、2：R₁=H、R₂=4-Cl-C₆H₄、R₃=R₄=H；3：R₁=H、R₂=4-Cl-C₆H₄、R₃=R₄=COR₅、R₅=3-ピリジル；4：R₁=H，R₂=C₆H₅、R₃= R₄=H；5：R₁=H、R₂=4-F-C₆H₄、R₃=R₄=H；6：R₁=H、R₂=4-Br-C₆H₄、R₃=R₄=H；7：R₁=H、R₂=4-CH₃O-C₆H₄、R₃=R₄=H；8：R₁=H、R₂=4-Cl-C₆H₄、R₃=R₄=COR₅、R₅=CH₂CH₂COOH）。

実施例4 H22担癌マウスに対する腫瘍抑制作用及び抗血管新生作用
4.1 材料と方法
1）動物：クリーングレード昆明マウス、雄性と雌性はそれぞれ半分、体重20±2g，河南省実験動物中心から購入、合格証明書番号：SCXK（豫）2005-0001。

2）細胞： H22マウス肝癌細胞、河南省医薬科学研究院より贈呈。

3）薬品、試薬及びその調合
シクロホスファミドは天津金世製薬有限公司（承認番号：国薬準字H12021006）製造。ゼラチンとカルミンはSigma社製造。その他の試薬はいずれも市販分析純グレード試薬。薬剤を0.5%のCMC-Na溶液に調合し、Tween-80（最終濃度0.1%）で助溶する。10%（W/V）カルミン溶液を使用直前に5%（W/V）のゼラチンを含む塩溶液で調合し、5%（W/V）のゼラチンを含む塩溶液を生理食塩水で調合し、使用する直前に調合する。他の薬品、試薬及びその調合は実施例1と同じ。

4）実験方法
体内で7日間継代したマウス肝癌細胞H22を取り、生理食塩水で希釈し、濃度1×10⁷/mLまで調整し、マウスの右前肢のわき下に接種し（0.2mL/匹）、体重によってランダムに群分けし、各群12匹とした。腫瘍細胞を接種し24h後から、毎日、0.2mL/10g体重で胃内投与し、7日間連続に投与した。最後の1回の投与後、8h食事（水を除く）を禁止した。1%ペントバルビタールナトリウム（80mg/kg）で動物を麻酔させ、空白対照群のマウスに対して尾静脈より5%（W/V）のゼラチンを含む40°C塩溶液1mLを注射し、残りの各群のマウスに対して尾静脈より10%（W/V）カルミン、5%（W/V）ゼラチンを含む40°C塩溶液1mLを注射し、マウスを-20℃で2h冷凍し、ゼラチンを凝固させた。腫瘍組織を分離し、重さを秤量した。3M NaOHで均質化した（10mL/g腫瘍重量）。14000rpm で20分遠心し、上清を取り、490nm波長で吸光度値を測定した。カルミン検量線に基づき、カルミンの含有量を算出し、実験結果を腫瘍抑制率及び血管指数（vascular index）で示す。SPSS17.0統計ソフトウエアで処理し、データは平均±標準偏差（x(平均)±s ）で示し、有意性テストはt検定を用いた。P<0.05は差が統計学的意味を持つ。腫瘍抑制率（%）=（モデル群腫瘍重量−薬剤投与群腫瘍重量）/モデル群腫瘍重量×100% 、血管指数（VI、mg/g）=腫瘍組織中のカルミン含有量/腫瘍重量。
4.2実験結果
アンドログラホリド（1）及び本発明化合物2、3の腫瘍抑制効果と腫瘍血管指数に対する影響の結果を表2に示す。その結果、陽性対照群、アンドログラホリド（1）の用量が1.35mmol/kgのときに腫瘍成長が顕著に抑制され（P＜0.05）、アンドログラホリド（1）に比べ、化合物3及び2の腫瘍抑制作用はいずれも有意に向上し、且つ、用量依存性を呈したことが明らかになった。

モデル群の血管指数は4.82±2.43であり、陽性対照群（シクロホスファミド20mg/kg）と化合物1（1.35mmol/kg）は血管生成に有意な抑制作用が発現しなかった。化合物3群の低（0.65mmol/kg）、中（1.00mmol/kg）、高（1.35mmol/kg）用量のマウス腫瘍組織中の血管指数はいずれも異なる程度の低下があり、そのうち、中用量群の血管生成抑制作用は低用量群と高用量群よりも強かった。化合物2は実験用量範囲内において、血管指数が用量依存的に低下した。よって、化合物2及び3はH22腫瘍成長を有意に抑制でき、血管生成を抑制できた。

実施例5 S180肉腫成長、侵襲及び転移に対する抑制作用
5.1 材料と方法
1）試験動物：実施例4と同じ。

2）細胞：腹水腫瘍細胞S180、河南省医薬科学研究院より贈呈。

3）薬品、試薬及びその調合：実施例4と同じ。

4実験方法
腹腔内で7日間継代した成長状態が良好なマウス腹水腫瘍細胞S180を取り、生理食塩水で希釈し、濃度1×10⁷/mLまで調整し、マウスの右上肢のわき下に接種し（0.2mL/匹）、体重によってランダムに群分けし、各群12匹とした。翌日より胃内投与し始め、9日間連続に投与した。そのうち、モデル群Iと本発明化合物1及び3群は第1ロット接種とし、正常組、モデル群II、シクロホスファミド群及び本発明化合物2群は第2ロット接種とした。10日目に死なせ、腫瘍を剥ぎ、腫瘍重量を秤量し、腫瘍抑制率を算出し、腫瘍組織侵襲、拡散程度を観察、記録した。SPSS17.0統計ソフトウエアで処理し、データは平均±標準偏差（(平均)x±s ）で示し、有意性テストはt検定を用いた。P<0.05は差が統計学的意味を持つ。腫瘍抑制率（%）=（1-薬剤投与群平均腫瘍指数/モデル群平均腫瘍指数）×100%。

5.2 実験結果
結果（表3）により、モデル群に比べ、シクロホスファミド群は腫瘍の成長を有意に抑制し（P＜0.01）、30mg/kg用量における腫瘍抑制率は53.61%であり、実験用量範囲内においてアンドログラホリド（1）及び本発明化合物2と3はいずれも腫瘍の成長を有意に抑制できたことが明らかになった。化合物1群と比べ、本発明化合物2（0.85 mmol/kg、P＜0.01；1.10 mmol/kg、P＜0.05）と3（1.35mmol/kg）の差は有意な意味を持つ。さらに、本発明化合物2のS180に対する腫瘍抑制作用は本発明化合物3よりも強かった。

グレーディング法を採用し、化合物の抗腫瘍侵襲、転移作用を評価したところ（表4参照）、本発明化合物2及び3はいずれも強い抗侵襲、転移作用を表したことが明らかになった。

実施例6 本発明化合物3の抗腫瘍転移作用
6.1 材料と方法
1）動物：クリーングレードC57マウス20匹、雌性、体重18g-22g、湖南斯莱克景達実験動物有限公司から購入、合格証明書番号：SCXK（湘）2009-0004。
2）細胞株：マウスメラノーマ肺転移細胞株B16-F10は南京凱基生物科技発展有限公司から購入。

3）薬品と試薬：シクロホスファミド、天津金世製薬有限公司（承認番号：国薬準字H12021006）製造。マウス腫瘍壊死因子-α（TNF-α）ELISAキット（EK 0527）、マウスインターロイキン-1β（IL-1β）ELISAキット（EK0394）はいずれも武漢博士徳生物工程有限公司から購入。

4）実験方法
対数増殖期のB16-F10細胞を取り、0.25%トリプシンで消化した後、10%ウシ胎児血清を含むRPMI1640培地で再懸濁し、1000r.p.m.で5分遠心し、上清を捨て、無菌PBSを加えて単細胞懸濁液（10⁷/mL）を調製し、C57マウス毎に0.2mLずつ尾静脈より注射し、実験マウスの体重によってランダムに4群に分け、それぞれがモデル対照群、シクロホスファミド群（30mg/kg）、化合物3の低用量群（0.85mmol/kg）、化合物3の高用量群（1.1mmol/kg）とし、各群5匹とした。細胞を接種し24h後から、毎日胃内投与し、24日間連続に投与し、毎日にマウスの体重を記録した。最後の1回の投与から24h後に、眼球採血し、マウスを死なせ、解剖後、解剖鏡下でマウスの肺上におけるメラノーマノジュール数をカウントした。4℃で、3000r/minで20分遠心し、血清を調製し、分装し、-20℃で保存した。TNF-α及びIL-1βの含有量測定はいずれもエライザ法を用い、キット操作説明に基づき行なった。SPSS17.0統計ソフトウエアで処理し、データは平均±標準偏差（(平均)x±s ）で示し、有意性テストはt検定を用いた。P<0.05は差が統計学的意味を持つ。腫瘍転移抑制率（%）=（モデル群平均ノジュール数-薬剤投与群平均ノジュール数）/モデル群平均ノジュール数×100%。

6.2 実験結果
実験マウスの肺表面のメラノーマノジュール数の統計結果（表5参照）により、化合物3の低、高用量とシクロホスファミドはいずれもメラノーマの試験マウスの肺表面転移巣の形成を抑制でき、モデル群に比べ、差はいずれも極めて有意なレベル（P<0.01）に達し、抑制率はそれぞれ58.04%、65.18%、47.92%であり、化合物3は1.10mmol/kg（ig）の用量レベルで表した抑制作用が最も強く、且つシクロホスファミド（P<0.05）よりも顕著に強かったことが明らかになった。

C57マウスの薬剤投与前と薬剤投与終了後（24d）の各群の体重の変化状況を比較すると（図3）、シクロホスファミド群のマウスの体重の増加が最小（平均0.7g）で、モデル群（平均2.1g）よりも低かったが、差は有意なレベルには達しておらず、シクロホスファミドは一定の毒副作用を持つ可能性があることを示唆し、化合物3の低（0.85mmol/kg）、高（1.10mmol/kg）用量群のマウスの体重の平均ネット増量がそれぞれ1.64g、2.00gであり、モデル群に比べ、差に統計学的意味はなかった（P>0.05）ことを見出した。

マウス血清中のTNF-α及びIL-1βの含有量を表6に示す。低用量（0.85mmol/kg）と高用量（1.1mmol/kg）の化合物3を投与することは、いずれもIL-1βの表現を減低させ、かつ高用量群とモデル群に比べて、差は有意なレベルに達し（P<0.05）、化合物3の用量が0.85mmol/kgである場合に、マウス血清中のTNF-αの表現が顕著に抑制され、モデル群に比べ、差に統計学的意味はあった（P<0.05）。

実施例7 本発明化合物2及び3の限度毒性実験
6.1 材料と方法
1）動物：実施例4と同じ。

2）薬剤：本発明のアンドログラホリド誘導体2及び3。

3）実験方法：体重20±2gのマウス20匹を取り、雌性と雄性はそれぞれ半分、ランダムに群分けし、各群10匹とした。動物は12h食事（水を除く）を禁止させた後、用量5.00g/kgの本発明化合物2及び3を1回でそれぞれに胃内投与した。動物の中毒表現を観察し、記録した。毎日1回重さを秤量した。14日間観察を続け、結果を表7に示す。

6.2 実験結果
マウスに明らかな中毒表現は見られず、死亡もなく、これは化合物2及び3の急性毒性が極めて弱く、抗腫瘍薬の調製に用いることができ、高い実用性と開発価値を有することを説明している。

以上より、この種の誘導体は明らかな抗腫瘍活性を有し、且つ、高い効果と低い毒性を示し、抗腫瘍薬として開発できる潜在力を持ち、腫瘍の治療と転移予防に用いることができる。

以上の実験で使用した化合物番号は統一されており、番号1はアンドログラホリドであり、番号2-8は本発明化合物である。

Claims

一般式1

（R₁は水素であり、R₂はp-ハロフェニルであり、R₃、R₄はそれぞれが水素である）で表されるアンドログラホリド誘導体の、抗腫瘍薬の調製における活性成分としての使用。
R₂はp-フルオロフェニル、p-クロロフェニル又はp-ブロモフェニルであることを特徴とする医薬品の調製のための請求項1に記載のアンドログラホリド誘導体の使用。
抗胃癌薬、抗肺癌薬、抗子宮頸癌薬、抗膀胱癌薬、抗食道癌薬、抗結腸癌薬、抗肝癌薬、抗前立腺癌薬又は抗メラノーマ薬の調製における活性成分として用いることを特徴とする医薬品の調製のための請求項1又は2に記載のアンドログラホリド誘導体の使用。
活性成分として、又は他の医薬品と組み合わせて、製薬学的に許容可能な補助及び/又は添加成分と混合した後、通常の製薬方法及びプロセス要求に基づき、抗腫瘍用の経口型製剤、注射型製剤の医薬品の調製に用いることを特徴とする医薬品の調製のための請求項3に記載のアンドログラホリド誘導体の使用。
経口型製剤は、錠剤、丸剤、カプセル、顆粒剤、シロップであり、注射型製剤は注射液又は凍結乾燥粉末製剤であることを特徴とする医薬品の調製のための請求項4に記載のアンドログラホリド誘導体の使用。