CN102190711A - 多黏菌素e组合物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，具体地涉及多黏菌素E组合物及其制备方法和用途。该组合物中，多黏菌素E₁、E₂、E₃、E_1-1和E_1-7MOA的总含量大于等于80％。其中多粘菌素E优选为硫酸多粘菌素E或多粘菌素E甲磺酸钠，更优选为多粘菌素E甲磺酸钠。该多粘菌素E组合物可以用于制备治疗革兰氏阴性菌感染药物。

Description

多黏菌素E组合物及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体地涉及多黏菌素E组合物及其制备方法和用途。

背景技术

多黏菌素E(colistin)是一个由多种组份组成的多肽类抗生素，主要由E₁和E₂组成(或称为A或B)。在20世纪50年代，多黏菌素E就应用于临床，主要用于革兰氏阴性菌引起的感染，特别是由多重耐药绿脓杆菌(P.aeruginosa)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)等引起感染的治疗。临床使用的多黏菌素E有两种，一种是口服或局部使用的硫酸多黏菌素E(也称硫酸黏菌素)，另一种是供注射用的多黏菌素E甲磺酸钠(Colistimethate Sodium)。这两种药物都是多组份药物，在硫酸多黏菌素E中，含有包括E₁、E₂、E₃等至少5种组份(参见欧洲药典5.0)，同样在多黏菌素E甲磺酸钠也至少含有多黏菌素E₁甲磺酸钠和多黏菌素E₂甲磺酸钠等5种组份。

自上世纪80年代开始因高发的肾脏毒性和神经毒性，多黏菌素E(colistin)的应用受到限制，并几乎被临床弃用。但是近年来，由于革兰氏阴性菌耐药株尤其是多耐药菌株感染病例的出现以及新药开发有限的情况下多黏菌素E(colistin)再次引起了全球医疗界的重视。同样如何提高多黏菌素E(colistin)的抗菌活性、降低其毒性从而扩大临床适用人群也成为了药学研究者所面临的技术难点。

多黏菌素E的结构通式见式I

式I

众所周知多组份药物制剂的稳定性较难控制，尤其对于注射剂而言多组分药物的理化稳定性、渗透压、澄明度、酸碱度等方面因易受组分间相互作用不容易形成稳定的药物制剂，并且由于储存、温度、光照等因素多组份药物制剂更容易出现变色、沉淀、分解等变化。此外多组分药物的有效性和潜在的安全性也存在一定的缺陷。另外，多组份药物由于组份间的化学结构差异会导致它们在体内的药代动力学行为的差异，增加了药代动力学研究的难度，从而对设计安全的药物剂量以及合理给药方式带来技术障碍。

因此，对多黏菌素E各个成分的含量进行控制是非常必要的。

当前对由于多黏菌素E的组份分析已有成熟的、法定的标准分析方法，如美国药典和欧洲药典都收录有HPLC法测定多黏菌素E的各组份组成。不过遗憾的是，尽管多黏菌素E甲磺酸钠也被这些药典所收录，但是却没有相应HPLC法来分析该产品中各组份的组成，仅仅是用硅钨酸显色法来控制多黏菌素E甲磺酸钠中不含有多黏菌素E。

发明内容

本发明的目的在于提供一种多粘菌素E组合物，该组合物中，多黏菌素E₁、E₂、E₃、E_1-1和E_1-7MOA的总含量大于等于80％，优选大于等于85％，更优选大于等于90％，最优选大于等于94％。其中多粘菌素E优选为硫酸多粘菌素E或多粘菌素E甲磺酸钠，更优选为多粘菌素E甲磺酸钠。

其中，多黏菌素E₃、E_1-1和E_1-7MOA的含量单个均不高于10％，优选不高于8％，更优选不高于5％。

多黏菌素E₁与E₂的含量之和不得低于75％，优选不低于80％，更优选不低于85％。

上述含量均按高效液相色谱的峰面积归一化法计算，所述的色谱条件如下：

仪器：Waters公司高效液相色谱仪(Waters 2489紫外检测器、alliance e2695)

色谱柱：Waters XBridge C18(5μm，4.6×250mm)

流动相：硫酸钠溶液(取无水硫酸钠4.46g，加水900ml，用磷酸调节pH值至2.5，加水定容至1000ml，混匀)-乙腈(体积比78∶22)

检测波长选择：215nm；

流速：1.0ml/min；柱温：30℃；进样体积：20μl

本发明的目的还在于提供一种多粘菌素E组合物的方法制备：

本发明提供的制备方法包括如下步骤：(a)将硫酸多粘菌素E溶解，上样于反相层析介质；(b)用含1-10％乙醇的硫酸稀溶液洗涤3-20CV；(c)再用含15-50％乙醇的硫酸稀溶液，洗脱5-30CV，收集并合并洗脱液；(d)取上步骤(c)中合并的洗脱液，去除硫酸和/或有机溶剂；(e)干燥，即得硫酸多黏菌素E组合物；(f)如需要，制备成为多黏菌素E甲磺酸钠组合物或其它衍生物。

具体而言，(a)将原料硫酸多粘菌素E加水溶解，上样于已处理好的反相层析介质上；(b)用含1-10％乙醇的硫酸稀溶液洗涤3-20CV；(c)再用含15-50％乙醇的硫酸稀溶液，洗脱5-30CV，收集并合并洗脱液；(d)取上步骤(c)中合并的洗脱液，为去除硫酸和有机溶剂可以是先使用减压蒸馏去除有机溶剂后，再使用膜分离技术去除部分硫酸，也可以仅使用膜分离去除有机溶剂和硫酸，若仅为去除有机溶剂可以单独使用减压蒸馏；(d)使用常规干燥技术，如喷雾干燥和真空干燥等，把上步得到的多黏菌素E溶液干燥，即得到硫酸多黏菌素E组合物；(e)如需要，采用现有技术制备成多黏菌素E甲磺酸钠组合物或其它衍生物。

本发明所提供的制备方法，其中步骤(a)中所说的“原料硫酸多粘菌素E”，是指工业级的硫酸多粘菌素E，或质量符合欧洲药典(5.0)或美国药典(29)规定的硫酸多黏菌素E。硫酸多粘菌素E溶解后浓度可以为1-20％，优选为10-15％；步骤(a)中选用的反相层析介质可以为以二氧化硅(硅胶)或聚合物为骨架的反相层析介质，反相硅胶可由链长在C₁-C₃₀(C₄、C₈和C₁₈最为常见)的直链烷烃基或其它疏水配基(如苯基或氰基)衍生而来，以聚合物为骨架的反相层析介质，通常指以聚苯乙烯/二乙烯苯或聚丙烯酸酯为骨架并键合苯基的反相层析介质；

其中步骤(b)中乙醇的硫酸溶液，溶液的pH值控制在1.0-5.0，优选pH值控制在2.0-3.0。优选使用含乙醇3-8％的硫酸稀溶液洗涤，更优选使用含乙醇5-6％的硫酸稀溶液洗涤。优选洗涤4-15cv，更优选5-12cv。

其中步骤(c)中乙醇的硫酸溶液，溶液的pH值控制在1.0-5.0，优选pH值控制在2.0-3.0。优选使用含乙醇15-45％的硫酸稀溶液洗脱，更优选使用含乙醇20-40％的硫酸稀溶液洗涤。优选洗涤8-12cv，更优选10-15cv。

步骤(d)中膜分离技术使用的膜指纳滤膜，其截流分子量在200-1000，优选截流分子量在400-800的纳滤膜。本发明所使用的纳滤膜可以是有机材料膜，如有机纤维素膜、聚砜膜和聚乙烯醇膜等，也可以是各种无机材料膜，如陶瓷膜、黏土膜和金属膜等，优选使用纤维素膜和聚砜膜。

步骤(e)中所说的常规干燥技术为生化产品常用的干燥技术如喷雾干燥、真空干燥及低温冷冻干燥等。

步骤(f)中所述的“现有技术”是指已经公开的由起始原料多黏菌素E硫酸盐制备多黏菌素E甲磺酸钠的所有公知技术。例如申请号为200810020478.5的中国发明专利所公开的技术内容。

本发明另一个目的在于提供了多粘菌素E组合物在制备治疗革兰氏阴性菌感染药物中的用途。所述的革兰氏阴性菌优选绿脓杆菌(P.aeruginosa)和鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)。

相比于欧洲药典中对多粘菌素E质量控制得标准，本发明得多粘菌素E组合物各个组分的含量进行了进一步的控制，这样的含量控制给组合物的制药性质例如稳定性带来了有益的影响。该组合物在活性和不良反应方面例如毒性等方面明显优于现有得欧洲药典标准的产品。

此外本发明还提供了多粘菌素E甲磺酸钠组合物的分析方法，该方法保证了多粘菌素E甲磺酸钠的质量控制的进行。

具体实施方式

下面用具体实施例来进一步说明本发明的内容，但并不以任何方式意味着对本发明进行限制。

实施例1：硫酸多黏菌素E的制备

称取工业级硫酸多黏菌素E适量，加水溶解，制成每1ml含100mg的溶液，上色谱柱分离，色谱条件如下：

层析填料：聚苯乙烯/二乙烯苯为骨架并键合苯基，型号为NM-100，产自苏州纳微生物科技有限公司

柱规格：45×400mm，

柱体积(CV)：635.9ml

流速：30.0ml/min

上样量：500ml

洗脱条件：

洗涤流动相：先用含8％乙醇的硫酸稀溶液(用0.05mol/L硫酸调溶液的pH值为2.4。)洗涤5CV。

洗脱液：再用含30％乙醇的硫酸稀溶液(用0.05mol/L硫酸调溶液的pH值为2.4。)洗脱10cv。收集洗脱液，减压蒸馏除去乙醇后，真空干燥得到33克硫酸多黏菌素E。

实施例2：硫酸多黏菌素E的制备

称取工业级硫酸多黏菌素E适量，加水溶解，制成每1ml含150mg的溶液，上色谱柱分离，色谱条件如下：

色谱柱：C₁₈ SunFire Prep OBD(10μm)；19×150mm，购自美国WATERS公司

柱体积(CV)：42.5ml

流速：10.0ml/min

上样量：50ml

洗脱条件：

洗涤流动相：先用含6％乙醇的硫酸稀溶液(用0.05mol/L硫酸调溶液的pH值为2.0。)洗涤12CV。

洗脱液：再用含20％乙醇的硫酸稀溶液(用0.05mol/L硫酸调溶液的pH值为2.0。)洗脱12cv。收集洗脱液，减压蒸馏除去乙醇后，真空干燥得到2.8克硫酸多黏菌素E。

实施例3：硫酸多黏菌素E的制备

称取工业级硫酸多黏菌素E适量，加水溶解，制成每1ml含120mg的溶液，上色谱柱分离，色谱条件如下：

层析填料：聚苯乙烯/二乙烯苯为骨架并键合苯基，型号为NM-100，产自苏州纳微生物科技有限公司

柱规格：25×200cm，

柱体积(CV)：98.13L

流速：200.0ml/min

上样量：100L

洗脱条件：

洗涤流动相：先用含5％乙醇的硫酸稀溶液(用0.05mol/L硫酸调溶液的pH值为3.0。)洗涤15CV。

洗脱液：再用含40％乙醇的硫酸稀溶液(用0.05mo l/L硫酸调溶液的pH值为3.0。)洗脱15cv。收集洗脱液，减压蒸馏除去乙醇后，真空干燥得到7.2公斤硫酸多黏菌素E。

实施例4：多黏菌素E甲磺酸钠的制备

称取10.0g实施例1方法制备得到的硫酸多黏菌素E，加水溶解并定容至50ml，然后加甲醛溶液6.2ml，搅拌并用10mol/L NaOH溶液调节pH至7.0，维持反应30min后，向其中加入40％的亚硫酸氢钠溶液28ml，然后再用NaOH溶液调节pH至7，并在搅拌下反应10h后停止反应。取此反应液，用截流分子量为3000的超滤膜(为美国MILLIPORE公司的产品，为醋酸纤维素膜)超滤至约20ml，然后加水至约100ml，再超滤浓缩至20ml，如此反复5次，得超滤截留液约15ml。在整个反应和超滤期间控制温度在20～25℃。取超滤截留液，用低温冷冻干燥法，进行样品的干燥，得到多黏菌素E甲磺酸钠样品7.5g。

实施例5：多黏菌素E甲磺酸钠的制备

称取1.0g实施例2方法制备得到的硫酸多黏菌素E，加水溶解并定容至5ml，然后加甲醛溶液0.5ml，搅拌并用1mol/L NaOH溶液调节pH至7.0，维持反应30mi n后，向其中加入40％的亚硫酸氢钠溶液2ml，然后再用NaOH溶液调节pH至7，并在搅拌下反应10h后停止反应。取此反应液，用截流分子量为3000的超滤膜(为美国MILLIPORE公司的产品，为醋酸纤维素膜)超滤至约3ml，然后加水至约20ml，再超滤浓缩至3ml，如此反复5次，得超滤截留液约5ml。在整个反应和超滤期间控制温度在20～25℃。取超滤截留液，用低温冷冻干燥法，进行样品的干燥，得到多黏菌素E甲磺酸钠样品0.8g。

实施例6：多黏菌素E甲磺酸钠的制备

称取100g实施例3方法得到的硫酸多黏菌素E，加水溶解并定容至500ml，然后加甲醛溶液50ml，搅拌并用10mol/L NaOH溶液调节pH至7.0，维持反应30min后，向其中加入40％的亚硫酸氢钠溶液200ml，然后再用NaOH溶液调节pH至7，并在搅拌下反应10h后停止反应。取此反应液，用截流分子量为3000的超滤膜(为美国MILLIPORE公司的产品，为醋酸纤维素膜)超滤至约50ml，然后加水至约500ml，再超滤浓缩至50ml，如此反复5次，得超滤截留液约50ml。在整个反应和超滤期间控制温度在20～25℃。取超滤截留液，用低温冷冻干燥法，进行样品的干燥，得到多黏菌素E甲磺酸钠样品63g。

实施例7：多黏菌素E甲磺酸钠的测定

将实施例4、5和6制备得到的样品，按照如下方法测其含量组成：

称取多黏菌素E甲磺酸钠适量，加水溶解，制成每1ml含5mg的溶液。取此溶液5ml，用0.5mol/L的硫酸溶液调节pH值为2.0，然后加水稀释，并定容至10ml，制成2.5mg/ml的溶液。取此溶液于玻璃安瓿中，熔封后置于120℃烤箱中，放置30min。在此条件下，多粘菌素E甲磺酸钠完全转变为多粘菌素E。取出样品、放凉，用HPLC法测定多黏菌素E的含量，再用多黏菌素E的含量来代表多粘菌素E甲磺酸钠的含量。

多黏菌素E甲磺酸钠组分及有关物质测定的试验结果

样品来源	E2(％)	E3(％)	E1-I(％)	E1(％)	E1-7MOA(％)	总含量(％)
							实施例4样品	17.3.	0.9	1.1	69.0	1.8	90.1
实施例5样品	18.8	1.0	1.8	72.4	2.1	96.1
							实施例6样品	16.2	1.0	2.1	66.5	1.8	87.6

实施例8：多黏菌素E甲磺酸钠的稳定性考察

高温实验：

将实施例4-6的多黏菌素E甲磺酸钠样品置于60℃恒温烘箱内，放置10天，分别于第5天和第10天取样，进行活性检测，样品活性无明显变化，均保持在430-450ug/mg。

将实施例4-6的多黏菌素E甲磺酸钠样品置于照度维持在4500±500Lx的光照箱中，放置10天，分别于第5天和第10天取样检测，进行活性检测，样品活性无明显变化，均保持在430-450ug/mg。

加速试验

将实施例4的多黏菌素E甲磺酸钠样品置于40℃、相对湿度75％±5％的恒温恒湿培养箱中，于规定时间点取样检测，并与初始(0月)测定结果进行比较。

1/2/3/6个月取样测定结果活性均无明显变化；含量比较趋势变化如下：

测试点	0月	1月	2月	3月	6月
						含量	101.2	100.8	101.6	103.8	102.2

长期试验结果

将实施例4的多黏菌素E甲磺酸钠样品置于25℃、相对湿度60％±10％的恒温恒湿培养箱中，于3、6、9、12和18个月时间点取样检测活性，并与初始(0月)结果进行比较。比较结果，活性均无明显变化。含量比较趋势变化如下：

测试点	0月	3月	6月	9月	12月	18
							含量	101.2	103.4	102.5	100.2	103.1	104.2

实施例9：多黏菌素E对大鼠毒性

1.实验材料

1.1药品与试剂：

氯化钠注射液：500ml:4.5g，南京正大天晴制药有限公司，1003022；

多粘菌素E：实施例3制备得到的硫酸多粘菌素E样品，用生理盐水溶解和稀释，调节PH中性，在制备后的30min内使用完。

1.2实验动物：

SD大鼠：雄性，180-200g，上海必凯西普尔实验动物有限公司，SCXK(沪)2008-0016。

1.3仪器：全自动生化分析仪：欧霸XL-300；天平：QE-400；

2.实验方法：

选用180-220g雄性大鼠随机分成4组，每组6只：正常对照组、多粘菌素E(SC 75mg/kg×2/d)、多粘菌素E(SC 32.5mg/kg×2/d)、多粘菌素E(SC 20mg/kg×2/d)。按10ml/kg皮下给药，一日两次，药品溶液为现配现用，对照组给予空白制剂。连续2天，取血，麻醉处死后取肾，常规固定后作病理检查，组织学形态按照下列方案进行评分：

0分：无可见异常。

1分：近端曲小管囊下近端部分的刷状缘有最低程度的损害。

2分：近端曲小管近端部分的刷状缘和细胞有明显的损害。一些远端曲小管有早期的退化。

3分：近端曲小管的近端部分管型。在近端曲小管的两端部分有一些细胞呈碘酸西佛氏染色阳性的颗粒。在一些远端曲小管有明显的细胞退化。

4分：如同3，但是变化部分也涉及到近端曲小管的两端。

5分：近端曲小管近端部分和远端曲小管几乎完全或者完全退化。近端曲小管的远端部分有相当大的损害。

6分：皮质完全退化。

3.实验结果：

综合肾脏病理检查及生化指标结果提示：多粘菌素E在150mg/kg剂量下皮下注射时对大鼠肾脏有明显毒性，65mg/kg时对大鼠肾脏的毒性较小，40mg/kg时无明显毒性。各剂量下多粘菌素E对肝脏无明显毒性。

表1对血液生化的影响

*P＜0.05，**P＜0.01 VS空白对照组

表2对动物死亡率及肾脏病理的影响

Claims (10)

1.一种多粘菌素E组合物，该组合物中，多黏菌素E₁、E₂、E₃、E_1-1和E_1-7MOA的总含量大于等于80％，优选大于等于85％，更优选大于等于90％，最优选大于等于94％。

2.权利要求1所述的组合物，其中，多黏菌素E₃、E_1-1和E_1-7MOA的含量单个均不高于10％，优选不高于8％，更优选不高于5％。

3.权利要求1所述的组合物，其中多黏菌素E₁与E₂的含量之和不得低于75％，优选不低于80％，更优选不低于85％。

4.权利要求1-3任一所述的组合物，其中多粘菌素E优选为硫酸多粘菌素E或多粘菌素E甲磺酸钠，更优选为多粘菌素E甲磺酸钠。

5.权利要求1-3任一所述组合物的制备方法，包括如下步骤：(a)将硫酸多粘菌素E溶解，上样于反相层析介质；(b)用含1-10％乙醇的硫酸稀溶液洗涤3-20CV；(c)再用含15-50％乙醇的硫酸稀溶液，洗脱5-30CV，收集并合并洗脱液；(d)取上步骤(c)中合并的洗脱液，去除硫酸和/或有机溶剂；(e)干燥，即得硫酸多黏菌素E组合物；(f)如需要，制备成为多黏菌素E甲磺酸钠组合物或其它衍生物。

6.权利要求5所述的方法，特征在于步骤(a)硫酸多粘菌素E溶解后浓度可以为1-20％，优选为10-15％。

7.权利要求5或6的方法，特征在于步骤(b)中乙醇的硫酸溶液，溶液的pH值控制在1.0-5.0，优选pH值控制在2.0-3.0。优选使用含乙醇3-8％的硫酸稀溶液洗涤，更优选使用含乙醇5-6％的硫酸稀溶液洗涤。

8.权利要求5、6或7所述的方法，特征在于步骤(c)中乙醇的硫酸溶液，溶液的pH值控制在1.0-5.0，优选pH值控制在2.0-3.0。优选使用含乙醇15-45％的硫酸稀溶液洗脱，更优选使用含乙醇20-40％的硫酸稀溶液洗涤。

9.权利要求5-8任一所述的方法，特征在于步骤(d)中膜分离技术使用的膜指纳滤膜，其截流分子量在200-1000，优选截流分子量在400-800的纳滤膜。

10.权利要求1-3所述的多粘菌素E组合物在制备治疗革兰氏阴性菌感染药物中的用途，所述的革兰氏阴性菌优选绿脓杆菌和鲍氏不动杆菌。