CN109996806B - 高效价的多黏菌素e2甲磺酸钠 - Google Patents

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Abstract

提供一种高效价的多黏菌素E 2甲磺酸钠，其制备方法以及在制备治疗革兰氏阴性菌感染的药物中的用途。

Description

高效价的多黏菌素E2甲磺酸钠
技术领域
本发明属于医药领域，涉及效价不低于600μg/mg的多黏菌素E2甲磺酸钠、其制备方法以及在制备治疗革兰氏阴性菌感染的药物中的用途。
背景技术
多黏菌素E(colistin)是一种由多种组分组成的多肽类抗生素，主要由E1和E2组成(或称为A或B)。在20世纪50年代，多黏菌素E就应用于临床，主要用于革兰氏阴性菌引起的感染，特别是由多重耐药铜绿假单孢菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌等引起感染的治疗。临床使用的多黏菌素E类产品有两种，一种是口服或局部使用的硫酸多黏菌素E(也称硫酸黏菌素)，另一种是供注射用的多黏菌素E甲磺酸钠(Colistimethate Sodium)。这两种药物均是多组分药物，在硫酸多黏菌素E中，含有E1、E2、E3等至少5种组分(参见欧洲药典7.0)，同样在多黏菌素E甲磺酸钠中也至少含有对应的多黏菌素E1甲磺酸钠、多黏菌素E2甲磺酸钠等5种组份，然而，不同的组分可能会带来药效学、药代动力学和毒理学的差异，为了保证多黏菌素E产品的批间质量稳定性，需制备单一组分的多黏菌素E组合物。
中国专利申请CN102190710A公开了一种多黏菌素E2组合物，其中多黏菌素E2的结构如式I所示，实施例4公开了多黏菌素E2甲磺酸钠组合物的制备，所述组合物的效价为560μg/mg，尽管其效价高于市售产品，但经测定，所述组合物中修饰产物种类较多，较难保证产品的批间质量稳定性。
Figure GPA0000267262370000021
中国专利申请CN104918951A公开了一种含有至少3个氨基被甲磺酸钠基双修饰的组合物，其中实施例2公开了10修饰的多黏菌素E2甲磺酸钠的制备，其相比于CMS对照物一般具有较低的活性。
因此，仍需提供高效价且产品批间质量稳定的多黏菌素E2甲磺酸钠。
发明内容
本发明一方面提供一种多黏菌素E2甲磺酸钠，其效价不低于600μg/mg。
在一些优选实施方案中，其效价不低于620μg/mg。
在一些更优选的实施方案中，其效价不低于640μg/mg。
在一些特别优选的实施方案中，其效价不低于660μg/mg。
在一些实施方案中，本发明的多黏菌素E2甲磺酸钠包含修饰产物，其中修饰指，多黏菌素E2结构中，Dbu的γ氨基被甲磺酸钠基(-CH2SO3Na)或甲醇基(-CH2OH)取代。优选的，Dbu的γ氨基被甲磺酸钠基(-CH2SO3Na)取代。
在本发明的一些优选实施方案中，本发明的多黏菌素E2甲磺酸钠包含4修饰产物，即多黏菌素E2结构中，Dbu的γ氨基被4个甲磺酸钠基(-CH2SO3Na)取代，其中，在HPLC图谱中以面积归一化法计，4修饰产物占25％-50％。进一步优选的，4修饰产物占30％-43％。
在本发明的一些优选实施方案中，本发明的多黏菌素E2甲磺酸钠包含6修饰产物，即多黏菌素E2结构中，Dbu的γ氨基被6个甲磺酸钠基(-CH2SO3Na)取代，其中，在HPLC图谱中以面积归一化法计，6修饰产物占35％-65％。进一步优选的，6修饰产物占45％-55％。
在本发明的一些优选实施方案中，本发明的多黏菌素E2甲磺酸钠包含8修饰产物，即多黏菌素E2结构中，Dbu的γ氨基被8个甲磺酸钠基(-CH2SO3Na)取代，其中，在HPLC图谱中以面积归一化法计，8修饰产物占5％-22％。进一步优选的，8修饰产物占7％-17％。
在本发明的一些更优选的实施方案中，本发明的多黏菌素E2甲磺酸钠包含4修饰产物、6修饰产物，即多黏菌素E2结构中，Dbu的γ氨基被4个甲磺酸钠基(-CH2SO3Na)或6个甲磺酸钠基(-CH2SO3Na)取代，其中在HPLC图谱中以面积归一化法计，4修饰产物占25％-50％，6修饰产物占35％-65％。进一步优选的，4修饰产物占30％-43％，6修饰产物占45％-55％。
在本发明的一些更优选的实施方案中，本发明的多黏菌素E2甲磺酸钠包含4修饰产物、8修饰产物，即多黏菌素E2结构中，Dbu的γ氨基被4个甲磺酸钠基(-CH2SO3Na)或8个甲磺酸钠基(-CH2SO3Na)取代，其中在HPLC图谱中以面积归一化法计，4修饰产物占25％-50％，8修饰产物占5％-22％。进一步优选的，4修饰产物占30％-43％，8修饰产物占7％-17％。
在本发明的一些更优选的实施方案中，本发明的多黏菌素E2甲磺酸钠包含4修饰产物、6修饰产物、8修饰产物，即多黏菌素E2结构中，Dbu的γ氨基被4个甲磺酸钠基(-CH2SO3Na)、6个甲磺酸钠基(-CH2SO3Na)或8个甲磺酸钠基(-CH2SO3Na)取代，其中在HPLC图谱中以面积归一化法计，4修饰产物占25％-50％，6修饰产物占35％-65％，8修饰产物占5％-22％。进一步优选的，4修饰产物占30％-43％，6修饰产物占45％-55％，8修饰产物占7％-17％。
本发明再一方面提供一种制备效价不低于600μg/mg的多黏菌素E2甲磺酸钠的方法，包括：
(1)以硫酸多黏菌素E为原料，通过层析纯化得到纯度≥96％的硫酸多黏菌素E2；
(2)将步骤(1)得到的硫酸多黏菌素E2与甲醛溶液反应，其中硫酸多黏菌素E2与甲醛的摩尔比为1∶10-20；
(3)向步骤(2)的反应产物中加入亚硫酸氢钠溶液，继续反应，其中硫酸多黏菌素E2与亚硫酸氢钠的摩尔比为1∶10-20；
(4)通过超滤的方式纯化步骤(3)的反应液，超滤膜的截留分子量在1000-4000之间，向得到的超滤截留液中加入不超过超滤截留液5倍体积的水，再进行超滤，再向得到的超滤截留液中加入不超过超滤截留液5倍体积的水，如此反复多次，当电导率降至2.0mS/cm-3.0mS/cm时停止超滤；
(5)将步骤(4)所得的超滤截留液进行冷冻干燥，得到多黏菌素E2甲磺酸钠。
在一些实施方案中，多黏菌素E2甲磺酸钠的效价不低于620μg/mg；优选不低于640μg/mg；更优选不低于660μg/mg。
在一些实施方案中，步骤(1)中，使用反相层析进行纯化，层析填料选自反相硅胶基质(例如C18填料)或反相聚合物层析介质(例如以聚苯乙烯/二乙烯苯或聚丙烯酸酯为骨架的反相聚合物层析介质，优选为陶氏化学公司出品的Amberchrom XT30或者苏州纳微生物科技有限公司生产的NM-100)；层析的流动相选自乙醇的硫酸稀溶液或乙醇的盐酸稀溶液，pH控制在2.0-3.0；洗脱方式选自等度分段洗脱或梯度洗脱，优选为等度分段洗脱。
在一些实施方案中，步骤(2)中，硫酸多黏菌素E2与甲醛的摩尔比优选为1∶12-18。
在一些实施方案中，步骤(2)中，控制反应温度在20-25℃。
在一些实施方案中，步骤(2)中，控制pH在6.5-7.5。
在一些实施方案中，步骤(2)中，控制反应时间在1.5-2.5小时，优选为2小时。
在一些实施方案中，步骤(3)中，硫酸多黏菌素E2与亚硫酸氢钠的摩尔比优选为1∶12-18。
在一些实施方案中，步骤(3)中，控制pH在6.8-7.2。
在一些实施方案中，步骤(3)中，控制反应时间在15-20小时，优选为18小时。
在一些实施方案中，步骤(4)中的超滤膜的截留分子量优选为1000-3000。
在一些实施方案中，步骤(4)中，优选向超滤截留液中加入超滤截留液3-5倍体积的水，更优选向超滤截留液中加入超滤截留液3.5-4.5倍体积的水，特别优选向超滤截留液中加入超滤截留液4倍体积的水。
在一些实施方案中，步骤(4)中，控制超滤时的温度在20-25℃。
在一些实施方案中，步骤(4)中，优选电导率降至2.2mS/cm-2.8mS/cm时停止超滤，更优选电导率降至2.4mS/cm-2.6mS/cm时停止超滤，特别优选电导率降至2.5mS/cm时停止超滤。
本发明再一方面提供多黏菌素E2甲磺酸钠在制备治疗革兰氏阴性菌感染的药物中的用途。优选的，所述革兰氏阴性菌选自大肠杆菌、铜绿假单孢菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌或NDM-1细菌。
例如，本发明的多黏菌素E2甲磺酸钠可用于治疗敏感革兰阴性杆菌引起的急性或慢性感染，特别是针对碳青霉烯类抗生素耐药的肺炎克雷伯菌等肠杆菌科细菌(carbapenem resistant Enterobacteriaceae，CRE)和铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌等引起的肺部感染、尿路感染、消化道感染或血液感染等，包括但不限于败血症、肺炎、膀胱炎、肾炎等。
本发明的制备方法，通过制备高纯度的硫酸多黏菌素E2，以及在超滤过程中保证超滤截留液中多黏菌素E2甲磺酸钠高浓度(即超滤截留液中加入不超过超滤截留液5倍体积的水进行超滤)，出乎意料地得到了高效价(不低于600μg/mg)且修饰产物稳定的的多黏菌素E2甲磺酸钠，在保证产品高效的同时也保证了产品的批间质量稳定，有利于保证临床疗效的一致性和用药安全性。
附图说明
图1：实施例1制备的硫酸多黏菌素E2的HPLC图谱。
图2：实施例3制备的多黏菌素E2甲磺酸钠HPLC图谱。
图3：实施例4制备的多黏菌素E2甲磺酸钠HPLC图谱。
图4：实施例5制备的多黏菌素E2甲磺酸钠HPLC图谱。
图5：实施例6制备的多黏菌素E2甲磺酸钠HPLC图谱。
具体实施方式
下面用具体实施例来进一步说明本发明的内容，但并不以任何方式意味着对本发明进行限制。
实施例1 多黏菌素E2甲磺酸钠的制备
(1)纯化硫酸多黏菌素E2
称取工业级硫酸多黏菌素E(购自绿康生化股份有限公司)适量，加水溶解，制成每1ml含120mg的溶液，上色谱柱分离，色谱条件如下：
层析填料：聚苯乙烯/二乙烯苯为骨架的反相微球，型号为XT-30，产自美国陶氏(DOW)化学有限公司
柱规格：50×250mm，
柱体积(CV)：491ml
流速：20.0ml/min
上样量：300ml
洗脱条件：先用含3％乙醇的硫酸稀溶液(用0.05mol/L硫酸调溶液的pH值为2.4)洗脱5CV，再用含8％乙醇的硫酸稀溶液(用0.05mol/L硫酸调溶液的pH值为2.4)洗脱30CV，最后用含60％乙醇的硫酸稀溶液(用0.05mol/L硫酸调溶液的pH值为2.4)洗脱5CV。
收集：50ml/管。
收集样品的分析及处理：用分析型HPLC分析(分析条件参照硫酸多黏菌素E的欧洲药典7.0)，将纯度大于96％的收集液合并，用2mol/L氢氧化钠溶液调溶液的pH值为5.0后并于55℃下减压蒸馏浓缩后得到浓缩液140ml，其中含有5.6g硫酸多黏菌素E2，其HPLC图谱参见图1。
多黏菌素E2甲磺酸钠的制备
将步骤(1)得到的140ml硫酸多黏菌素E2浓缩液于25℃水浴10min后加入甲醛溶液4.4ml，用2.5mol/L NaOH调节pH使其维持在6.5-7.5之间，搅拌2h后加入40％NaHSO3溶液16ml，用2.5mol/L NaOH调节pH至7.0，水浴控制温度于25℃下反应18h。将反应液用截留分子量为3000Da的超滤膜(MILLIPORE公司)进行脱盐处理，待超滤截留液的总体积剩余约50ml时补加去离子水到200ml，在超滤过程中控制料液温度在20-25℃之间，截留液的pH维持在6.5-7.5之间，环境温度控制在20-25℃，再按照同样的方式补加去离子水到200ml进行多次超滤，截留液的电导率降至2.5mS/cm左右时停止超滤。将脱盐后的多黏菌素E2甲磺酸钠溶液进行冷冻干燥，得6.3g多黏菌素E2甲磺酸钠。
实施例2 多黏菌素E2甲磺酸钠修饰度分析
通过LC-MS对实施例1制备的多黏菌素E2甲磺酸钠进行修饰度分析。
(1)LC-MS检测方法
HPLC条件如下：
仪器：Shimadzu UFLC XR(LC-20AD XR泵；SIL-20AC XR自动进样器；CTO-20AC柱温箱；SPD-M20A检测器)
色谱柱：Waters Atlantis T3(150mm×4.6mm，3μm)620#
流动相：A相：10mM甲酸铵-乙腈(95∶5)
B相：10mM甲酸铵-乙腈(50∶50)
线性梯度洗脱，洗脱程序如下表：
Figure GPA0000267262370000051
流速：1.0ml/min
柱温：30℃
检测波长：210nm
质谱条件如下：
仪器：AB SCIEX Triple TOF 4600
离子源：DuoSprayTM Ion Source(ESI)
参数：
离子化方式：负离子
气帘气CUR(Curtain Gas)：35psi
雾化气GS1(Gas 1)：60psi
辅助加热气GS2(Gas 2)：60psi
喷雾电压ISVF(IonSpray Voltage Floating)：-4500V
雾化温度TEM(Temperature)：550℃
碰撞能量CE(Collision Energy)：35V
碰撞能量范围CES(Collision Energy Spread)：15V
去簇电压DP(Declustering Potential)：80V
扫描范围(Mass Range)：m/z 100-2000
(2)LC-MS分析结果
在质谱数据解析公式中：1155为多黏菌素E2的分子量，82为H2SO3的分子量，12为C的分子量。
表1多黏菌素E2甲磺酸钠LC-MS分析结果及数据解析
Figure GPA0000267262370000052
Figure GPA0000267262370000061
即，1.8min、2.5min、3.0min、3.4min、4.7min得到的多黏菌素E2甲磺酸钠为8修饰产物；
8.8min、9.1min、11.0min、11.4min、11.9min、13.0min、13.7min、15.1min得到的多黏菌素E2甲磺酸钠为6修饰产物；18.2min、19.6min、23.7min、24.7min、25.7min、26.5min、28.9min、30.0min得到的多黏菌素E2甲磺酸钠为4修饰产物。
经面积归一化法测定，8修饰产物占8.7％、6修饰产物占46.0％，4修饰产物占42.7％。
实施例3 多黏菌素E2甲磺酸钠的制备
参照实施例1步骤(1)的方法纯化硫酸多黏菌素E2，得到浓缩液140ml，其中含有5.6g硫酸多黏菌素E2。
将步骤(1)得到的140ml硫酸多黏菌素E2浓缩液于25℃水浴10min后加入甲醛溶液4.4ml，用2.5mol/L NaOH调节pH使其维持在至6.5-7.5之间，搅拌2h后加入40％NaHSO3溶液16ml，用2.5mol/L NaOH调节pH至7.0，水浴控制温度于25℃下反应18h。将反应液用截留分子量为3000Da的超滤膜(MILLIPORE公司)进行脱盐处理，待超滤截留液的总体积剩余约50ml时补加去离子水到220ml，在超滤过程中控制料液温度在20-25℃之间，截留液的pH维持在至6.5-7.5之间，环境温度控制在20-25℃，再按照同样的方式补加去离子水到220ml进行多次超滤，截留液的电导率降至2.5mS/cm左右时停止超滤。将脱盐后的多黏菌素E2甲磺酸钠溶液进行冷冻干燥，得6.3g多黏菌素E2甲磺酸钠。
采用下述HPLC对实施例3制备的多黏菌素E2甲磺酸钠进行修饰度分析。
HPLC条件如下：
色谱柱：XSELECT CSH C18(4.6×250mm；5μm)
流动相：A相：甲酸铵溶液(称取甲酸铵3.15g，加水溶解并定容至1L。)
B相：乙腈
线性梯度洗脱，洗脱程序如下表：
Figure GPA0000267262370000071
流速：0.8ml/min
柱温：30℃
检测波长：230nm
所得HPLC图谱参见图2，保留时间在10-20min得到色谱峰为多黏菌素E2甲磺酸钠的8修饰产物；22-50min得到色谱峰为多黏菌素E2甲磺酸钠的6修饰产物；51-65min得到色谱峰为多黏菌素E2甲磺酸钠的4修饰产物。
经面积归一化法测定，8修饰产物占7.9％、6修饰产物占50.8％，4修饰产物占41.3％。
实施例4 多黏菌素E2甲磺酸钠的制备
参照实施例1步骤(1)的方法纯化硫酸多黏菌素E2，得到浓缩液140ml，其中含有5.6g硫酸多黏菌素E2。
将步骤(1)得到的140ml硫酸多黏菌素E2浓缩液于25℃水浴10min后加入甲醛溶液4.4ml，用2.5mol/L NaOH调节pH使其维持在至6.5-7.5之间，搅拌2h后加入40％NaHSO3溶液16ml，用2.5mol/L NaOH调节pH至7.0，水浴控制温度于25℃下反应18h。将反应液用截留分子量为3000Da的超滤膜(MILLIPORE公司)进行脱盐处理，待超滤截留液的总体积剩余约50ml时补加去离子水到180ml，在超滤过程中控制料液温度在20-25℃之间，截留液的pH维持在至6.5-7.5之间，环境温度控制在20-25℃，再按照同样的方式补加去离子水到180ml进行多次超滤，截留液的电导率降至2.5mS/cm左右时停止超滤。将脱盐后的多黏菌素E2甲磺酸钠溶液进行冷冻干燥，得6.3g多黏菌素E2甲磺酸钠。
采用HPLC对实施例4制备的多黏菌素E2甲磺酸钠进行修饰度分析。
HPLC条件同实施例3。
所得HPLC图谱参见图3，保留时间在10-20min得到色谱峰为多黏菌素E2甲磺酸钠的8修饰产物；22-50min得到色谱峰为多黏菌素E2甲磺酸钠的6修饰产物；51-65min得到色谱峰为多黏菌素E2甲磺酸钠的4修饰产物。
经面积归一化法测定，8修饰产物占15.2％、6修饰产物占54.6％，4修饰产物占30.2％。
实施例5 多黏菌素E2甲磺酸钠的制备
参照实施例1步骤(1)的方法纯化硫酸多黏菌素E2，得到浓缩液140ml，其中含有5.6g硫酸多黏菌素E2。
将步骤(1)得到的140ml硫酸多黏菌素E2浓缩液于25℃水浴10min后加入甲醛溶液4.4ml，用2.5mol/L NaOH调节pH使其维持在6.5-7.5之间，搅拌2h后加入40％NaHSO3溶液16ml，用2.5mol/L NaOH调节pH至7.0，水浴控制温度于25℃下反应18h。将反应液用截留分子量为1000Da的超滤膜(MILLIPORE公司)进行脱盐处理，待超滤截留液的总体积剩余约50ml时补加去离子水到240ml，在超滤过程中控制料液温度在20-25℃之间，截留液的pH维持在至6.5-7.5之间，环境温度控制在20-25℃，再按照同样的方式补加去离子水到240ml进行多次超滤，截留液的电导率降至2.5mS/cm左右时停止超滤。将脱盐后的多黏菌素E2甲磺酸钠溶液进行冷冻干燥，得6.3g多黏菌素E2甲磺酸钠。
采用HPLC对实施例5制备的多黏菌素E2甲磺酸钠进行修饰度分析。
HPLC条件同实施例3。
所得HPLC图谱参见图4，保留时间在10-20min得到色谱峰为多黏菌素E2甲磺酸钠的8修饰产物；22-50min得到色谱峰为多黏菌素E2甲磺酸钠的6修饰产物；51-65min得到色谱峰为多黏菌素E2甲磺酸钠的4修饰产物。
经面积归一化法测定，8修饰产物占13.3％、6修饰产物占54.9％，4修饰产物占31.7％。
实施例6 多黏菌素E2甲磺酸钠的制备
参照实施例1步骤(1)的方法纯化硫酸多黏菌素E2，得到浓缩液140ml，其中含有5.6g硫酸多黏菌素E2。
将步骤(1)得到的140ml硫酸多黏菌素E2浓缩液于25℃水浴10min后加入甲醛溶液4.4ml，用2.5mol/L NaOH调节pH使其维持在6.5-7.5之间，搅拌2h后加入40％NaHSO3溶液16ml，用2.5mol/L NaOH调节pH至7.0，水浴控制温度于25℃下反应18h。将反应液用截留分子量为1000Da的超滤膜(MILLIPORE公司)进行脱盐处理，待超滤截留液的总体积剩余约50ml时补加去离子水到190ml，在超滤过程中控制料液温度在20-25℃之间，截留液的pH维持在6.5-7.5之间，环境温度控制在20-25℃，再按照同样的方式补加去离子水到190ml进行多次超滤，截留液的电导率降至2.5mS/cm左右时停止超滤。将脱盐后的多黏菌素E2甲磺酸钠溶液进行冷冻干燥，得6.3g多黏菌素E2甲磺酸钠。
采用HPLC对实施例6制备的多黏菌素E2甲磺酸钠进行修饰度分析。
HPLC条件同实施例3。
所得HPLC图谱参见图5，保留时间在10-20min得到色谱峰为多黏菌素E2甲磺酸钠的8修饰产物；22-50min得到色谱峰为多黏菌素E2甲磺酸钠的6修饰产物；51-65min得到色谱峰为多黏菌素E2甲磺酸钠的4修饰产物。
经面积归一化法测定，8修饰产物占8.3％、6修饰产物占50.8％，4修饰产物占40.9％。
实施例7 抗菌活性测定
采用美国药典公布的多黏菌素E甲磺酸钠效价测定方法，以多黏菌素E甲磺酸钠的美国药典标准品(批号：H3J047，效价为420μg/mg)作为对照，分别对实施例1、3-6制备的多黏菌素E2甲磺酸钠和参比制剂(美国JHP制药公司，批号：762042)进行活性测定，具体结果参见下表。
多黏菌素E甲磺酸钠效价测定结果
样品名称 效价(μg/mg)
实施例1制备的多黏菌素E<sub>2</sub>甲磺酸钠 685
实施例3制备的多黏菌素E<sub>2</sub>甲磺酸钠 710
实施例4制备的多黏菌素E<sub>2</sub>甲磺酸钠 697
实施例5制备的多黏菌素E<sub>2</sub>甲磺酸钠 689
实施例6制备的多黏菌素E<sub>2</sub>甲磺酸钠 708
参比制剂 428
另以大肠杆菌和铜绿假单孢菌为指示菌，比较这些多黏菌素E甲磺酸钠的抗菌活性差异，具体结果参见下表。
多黏菌素E甲磺酸钠MIC(μg/mL)测定结果
样品名称 大肠杆菌(ATCC8739) 铜绿假单孢菌(ATCC9027)
实施例1制备的多黏菌素E<sub>2</sub>甲磺酸钠 2 2
实施例3制备的多黏菌素E<sub>2</sub>甲磺酸钠 2 2
实施例4制备的多黏菌素E<sub>2</sub>甲磺酸钠 2 2
实施例5制备的多黏菌素E<sub>2</sub>甲磺酸钠 2 2
实施例6制备的多黏菌素E<sub>2</sub>甲磺酸钠 2 2
参比制剂 4 4
实施例8 毒性测定
取SD大鼠20只，分为多黏菌素E2甲磺酸钠组(5雌5雄)、参比制剂组(5雌5雄)，设不同的剂量，静脉推注，每天1次，连续7天，比较动物的死亡率。试验结果参见下表。
多黏菌素E甲磺酸钠对大鼠急性毒性(死亡率)比较结果
Figure GPA0000267262370000091
参比制剂和多黏菌素E2甲磺酸钠给药后的毒性症状为：瘫软无力，耳朵、四肢、嘴巴红肿。死亡前全身瘫软无力，呼吸微弱。死亡后，全身水肿。解剖：未见明显的脏器异常。毒性反应的严重性与给药浓度相关，浓度越高越严重。
给药后参比制剂组动物较同剂量下多黏菌素E2甲磺酸钠组动物的反应严重。相同给药剂量下多黏菌素E2甲磺酸钠组动物死亡率较参比制剂组低，而且参比制剂有两个剂量组(80、40mg/kg)，在给药2次或3次的情况下动物就出现了死亡，同剂量下的多黏菌素E2甲磺酸钠在给药4次后仍未出现死亡或少量死亡。
总之，相同给药条件下多黏菌素E2甲磺酸钠的毒性作用显著弱于参比制剂。

Claims (1)

1.制备多黏菌素E2甲磺酸钠的方法，所述多黏菌素E2甲磺酸钠包含4修饰产物、6修饰产物、8修饰产物，所述4修饰产物是指在多黏菌素E2结构中Dbu的γ氨基被4个甲磺酸钠基取代，所述6修饰产物是指在多黏菌素E2结构中Dbu的γ氨基被6个甲磺酸钠基取代，所述8修饰产物是指在多黏菌素E2结构中Dbu的γ氨基被8个甲磺酸钠基取代，其中在HPLC图谱中以面积归一化法计，4修饰产物占30％-43％，6修饰产物占45％-55％，8修饰产物占7％-17％，并且，所述多黏菌素E2甲磺酸钠的效价为不低于660μg/mg，所述方法包括：
(1)以硫酸多黏菌素E为原料，通过层析纯化得到纯度≥96％的硫酸多黏菌素E2；
(2)将步骤(1)得到的硫酸多黏菌素E2与甲醛溶液反应，其中硫酸多黏菌素E2与甲醛的摩尔比为1:10-20，控制反应时间为2小时；
(3)向步骤(2)的反应产物中加入亚硫酸氢钠溶液，继续反应，其中硫酸多黏菌素E2与亚硫酸氢钠的摩尔比为1:10-20，控制反应时间为18小时；
(4)通过超滤的方式纯化步骤(3)的反应液，超滤膜的截留分子量在1000-4000之间，向得到的超滤截留液中加入超滤截留液3.4倍体积的水，再进行超滤，再向得到的超滤截留液中加入超滤截留液3.4倍体积的水，如此反复多次，当电导率降至2.5mS/cm时停止超滤；
(5)将步骤(4)所得的超滤截留液进行冷冻干燥，得到多黏菌素E2甲磺酸钠。
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