CN102172518A - 一种新型手性色谱柱固定相及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于手性固定相领域，涉及一种以氨基酸衍生物为手性选择剂的母体，通过化学键合的方法将氨基酸衍生物修饰到载体表面的手性色谱柱固定相。所述手性固定相由手性选单体和载体构成，所述手性单体的结构通式为：

；式中，m为1～17的任意整数；n是1～10的任意整数；R为氨基酸侧链基团，所述载体为硅胶。由于本发明采用键合的方法将以氨基酸为母体的手性选择剂修饰在载体表面，使得手性选择剂与载体之间的结合力好，得到的手性色谱柱固定相固定相化学性质稳定，使用方便，分离效果高，不拖尾，柱效高。

Description

一种新型手性色谱柱固定相及其制备方法

技术领域

本发明属于手性固定相领域，涉及一种以氨基酸衍生物为手性选择剂的母体，通过化学键合的方法将氨基酸衍生物修饰到载体表面的手性色谱柱固定相。

背景技术

手性是人类赖以生存的自然界的本质属性之一。生命现象中的化学过程都是在高度不对称的环境中进行的。生物大分子如蛋白质、多糖、核酸等，都有手征性，它们在生物体内造成手性环境。除细菌等意外的蛋白质都是由左旋的L-氨基酸组成；多糖和核酸中的糖则是右旋的D-构型。

目前市场上出售的西药有半数左右含有手性中心，这其中大约有一半是以外消旋体的形式出售的，到20世纪80年代以后人们才逐渐认识到手性在药物中的重要性。这一方面是由于类似氯霉素和反应停这样的例子不断增加，另一方面则是由于进入20世纪80年代后在手性化合物的合成以及分析分离方面有了一些突破性的进展。服用单一手性对映体的药物可减少剂量和代谢负担，减少与其它药物的相互作用，提高活性并降低由某对映体引起的可能的副作用。对制药企业而言，生产手性药物可以节省资源，减少废物排放，降低对环境的污染。近几年来单一对映体药每年均以10﹪以上的速度增加，手性拆分已成为热门的研究课题。

手性色谱柱（Chiral HPLC Columns）是由具有光学活性的单体，固定在硅胶或其它聚合物上制成手性固定相（Chiral Stationary Phases）。通过引入手性环境使对映异构体间呈现物理特征的差异，从而达到光学异构体拆分的目的。要实现手性识别，手性化合物分子与手性固定相之间至少存在三种相互作用。这种相互作用包括氢键、偶级-偶级作用、π-π作用、静电作用、疏水作用或空间作用。手性分离效果是多种相互作用共同作用的结果。这些相互作用通过影响包埋复合物的形成，特殊位点与分析物的键合等而改变手性分离结果。由于这种作用力较微弱，因此需要仔细调节、优化流动相和温度以达到最佳分离效果。

现有技术中，专利号为99117305.8的中国专利公开了一种手性配体交换色谱固定相及其制备方法，具体是以L-苯丙氨酸为原料，制备一类新型手性选择子2-（2-羟基-3-烷氧基）丙基-（S）-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸，再将其涂渍于反相色谱键合固定相上，可实现对氨基酸样品的直接拆分；该技术方案的不足之处在于分离所需时间较长，后流出组分拖尾较严重，相对于键合性固定相来说，涂敷型固定相容易流失，限制了它的使用寿命。

申请号为200410021198.8的中国发明申请公开说明书公开了一种化学键合手性固定相及制备方法具体方法是使用糖肽类大环抗菌素-去甲万古霉素作为手性选择剂，通过化学键合的方法将其键合于载体上，可对多种不同类型的手性药物实现分离，其不足之处在于柱效不高，固定相稳定性不好。

发明内容

本发明的发明目的是提供一种新型手性色谱柱固定相及其制备方法，采用键合的方法将手性选择剂修饰在载体表面，使得手性选择剂与载体之间的结合力好，得到的手性色谱柱固定相化学性质稳定，使用方便，分离效果高，柱效高。

为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：一种手性固定相，由手性单体和载体构成；其中，所述手性单体的结构通式为：

；式中，m为1～17的任意整数；n是1～10的任意整数；R为氨基酸侧链基团，所述载体为硅胶。

上述技术方案中，优选地，m为13～17的任意整数，n为3～6的任意整数，所述氨基酸选自：L-缬氨酸、D-缬氨酸、L-丙氨酸、D-丙氨酸、L-苯丙氨酸、D-苯丙氨酸、L-异亮氨酸或D-异亮氨酸；所述硅胶为色谱用球形或无定形硅胶，所述硅胶的粒径为4～6μm，孔径为80～120埃。

制备上述手性色谱固定相的制备方法包括以下步骤：按照质量比，手性单体∶酸处理的硅胶=1∶2～20，将手性单体溶于甲苯中，然后加入酸处理的硅胶；在惰性气体保护下回流分水反应1～50小时，然后洗涤干燥后得到手性固定相。

上述技术方案中，手性单体的制备方法包括以下步骤：

1）将Z-氨基酸与烷基胺通过缩合反应形成酰胺键，然后脱去苄氧基，得到中间产物：

；所述Z-氨基酸中的保护基团为苄氧基，所述氨基酸为L-缬氨酸、D-缬氨酸、L-丙氨酸、D-丙氨酸、L-苯丙氨酸、D-苯丙氨酸、L-异亮氨酸或D-异亮氨酸；所述烷基胺为十四胺、十五胺、十六胺、十七胺或十八胺；

2）按照摩尔比，步骤1）所得中间产物与偶联硅氧烷=1∶1～1.2，将中间产物的二氯甲烷溶液加入偶联硅氧烷的二氯甲烷溶液，在室温下反应10～24小时，过滤后得到手性单体；

所述偶联硅氧烷为3-异氰基丙基三乙氧基硅烷、4-异氰基丁基三乙氧基硅烷、5-异氰基戊基三乙氧基硅烷或6-异氰基己基三乙氧基硅烷。

上述技术方案中，所述酸处理的硅胶的制备方法包括以下步骤：

将硅胶加入36~38wt%浓盐酸，加热回流2～12h，降温后过滤，水洗固体至pH=6～8，依次用丙酮和乙醚冲洗固体，抽干后得到酸处理的硅胶，备用；所述硅胶为色谱用球形或无定形硅胶，优选地，所述粒径为4～6μm，孔径为80～120埃。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

1．由于本发明采用键合的方法将以氨基酸为母体的手性选择剂修饰在载体表面，使得手性选择剂与载体之间的结合力好，得到的手性色谱柱固定相化学性质稳定，使用方便，分离效果好，柱效高。

2．本发明合成步骤少，反应条件温和，方法简单易行，成本低。

附图说明

图1是实施例五中对目标外消旋化合物A的拆分效果图；

图2是实施例五中对目标外消旋化合物B的拆分效果图；

图3是实施例五中对目标外消旋化合物C的拆分效果图；

图4是实施例五中对目标外消旋化合物D的拆分效果图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

实施例一：

1.载体的前处理：取1.0g硅胶球，加入圆底烧瓶，再加入适量的浓盐酸，加热回流2h，降温，过滤，水洗固体至pH=7，依次用丙酮和乙醚冲洗固体，抽干备用。

2. L-ValCONH(CH₂)₁₇CH₃合成：

1）Z-L-ValCOOH的合成

冰水浴下0.5 mol的L-ValCOOH与0.5mol的苄氧酰氯和0.5mol NaOH反应12小时后，经萃取、酸化、除水、重结晶，干燥后得到Z-L-ValCOOH。

2）Z-L-ValCONH(CH₂)₁₇CH₃的合成

称取0.2mol的Z-L-ValCOOH在三颈瓶中，加入500mL的乙酸乙酯加热搅拌溶解。加入0.2mol的DCC，搅拌1小时后加入0.2mol的三乙胺，称取0.2mol的十八胺溶解于100ml氯仿，加入到混合液中，冰浴搅拌2小时。室温下搅拌1小时，45℃下搅拌50小时，60℃下搅拌3小时。加入0.2mol醋酸，搅拌1小时后趁热过滤。滤液旋转蒸发得到的产品用正丙醇重结晶。

3）L-ValCONH(CH₂)₁₇CH₃的合成

250ml的三颈瓶中加入0.1mol Z-L-ValCONH(CH₂)₁₇CH₃，加热溶解，加入少量用乙醇稀释的Pd/C，加热溶解，当冷却后没有析出时，停止反应，抽滤除去Pd/C，滤液浓缩干后，用THF和石油醚重结晶，得到产品。

4）L-Val手性单体的合成

氮气保护条件下向反应瓶中加入0.1mol L-ValCONH(CH₂)₁₇CH₃，然后加入100ml四氢呋喃，加热溶解，冷却到室温后没有析出。加入用四氢呋喃稀释的0.1mol 3-异氰基丙基三乙氧基硅烷。室温下反应过夜，过滤得到L-Val手性单体。

3. L-Val手性固定相的制备：取100 mg L-Val手性单体样品于单颈瓶中，加入之前处理的硅胶球1.5g和100mL甲苯，加热回流分水12小时后过滤，用丙酮、乙醚依次冲洗固体。抽干固体。用标准匀浆填充法将所得到的手性固定相装入3mm×250mmHPLC柱中。

实施例二：

1.载体的前处理：取1.0g硅胶球，加入圆底烧瓶，再加入适量的浓盐酸，加热回流2h，降温，过滤，水洗固体至pH=7，依次用丙酮和乙醚冲洗固体，抽干备用。

2. D-ValCONH(CH₂)₁₇CH₃合成

1）Z-D-ValCOOH的合成

冰水浴下0.5 mol的D-ValCOOH与0.5mol的苄氧酰氯和0.5mol NaOH反应12小时后，经萃取、酸化、除水、重结晶，干燥后得到Z-D-ValCOOH。

2）Z-D-ValCONH(CH₂)₁₇CH₃的合成

称取0.2mol的Z-D-ValCOOH在三颈瓶中，500mL的乙酸乙酯加热搅拌溶解。加入0.2mol的DCC，搅拌1小时后加入0.2mol的三乙胺，称取0.2mol的十八胺溶解于100ml氯仿，加入到混合液中，冰浴搅拌2小时。室温下搅拌1小时，45℃下搅拌50小时，60℃下搅拌3小时。加入0.2mol醋酸，搅拌1小时后趁热过滤。滤液旋转蒸发得到的产品用正丙醇重结晶。

3）D-ValCONH(CH₂)₁₇CH₃的合成

250ml的三颈瓶中加入0.1mol Z-D-ValCONH(CH₂)₁₇CH₃，加热溶解，加入少量用乙醇稀释的Pd/C，加热溶解，当冷却后没有析出时，停止反应，抽滤除去Pd/C，滤液浓缩干后，用THF和石油醚重结晶，得到产品。

4）D-Val手性单体的合成

氮气保护条件下向反应瓶中加入0.1mol D-ValCONH(CH₂)₁₇CH₃，然后加入100ml四氢呋喃，加热溶解，冷却到室温后没有析出。加入用四氢呋喃稀释的0.1mol 3-异氰基丙基三乙氧基硅烷。室温下反应过夜，滤去溶剂得到产物。

3. D-Val手性固定相的制备：取100mg D-Val手性单体样品于单颈瓶中，加入之前处理的硅胶球1.5g和100mL甲苯，加热回流分水12小时后过滤，用丙酮、乙醚依次冲洗固体。抽干固体。用标准匀浆填充法将所得到的手性固定相装入3mm×250mmHPLC柱中。

实施例三：

1.载体的前处理：取1.0g硅胶球，加入圆底烧瓶，再加入适量的浓盐酸，加热回流2h,降温，过滤，水洗固体至pH=7，依次用丙酮和乙醚冲洗固体，之后抽干。

2. L-PheCONH(CH₂)₁₇CH₃合成

1）Z-L-PheCOOH的合成

冰水浴下0.5 mol的L-PheCOOH与0.5mol的苄氧酰氯和0.5mol NaOH反应12小时后，经萃取、酸化、除水、重结晶，干燥后得到Z-L-PheCOOH。

2）Z-L-PheCONH(CH₂)₁₇CH₃的合成

称取0.2mol的Z-D-PheCOOH在三颈瓶中，500mL的乙酸乙酯加热搅拌溶解。加入0.2mol的DCC，搅拌1小时，后加入0.2mol的三乙胺，称取0.2mol的十八胺溶解于100ml氯仿加入到混合液中，冰浴搅拌2小时。室温下搅拌1小时，45℃下搅拌50小时，60℃下搅拌3小时。加入0.2mol醋酸，搅拌1小时。热过滤。滤液旋转蒸发得到的产品用正丙醇溶解，冷却重结晶，抽滤。

3）L-PheCONH(CH₂)₁₇CH₃的合成

250ml的三颈瓶中加入0.1mol上一步的产物，加热溶解，加入少量用乙醇稀释的Pd/C，加热溶解，当冷却后没有析出时，停止反应，抽滤Pd/C，滤液浓缩干后，用THF和石油醚重结晶，得到产品，干燥。

4）L-Phe手性单体的合成

氮气保护条件下向反应瓶中加入0.1mol步骤3)的产物，然后加入100ml除过水的四氢呋喃，加热溶解，冷却到室温后没有析出。加入用四氢呋喃稀释的0.1mol 3-异氰基丙基三乙氧基硅烷。反应在室温下过夜，滤去溶液得到产品。

3. 手性固定相的制备：取100mg单体样品于单颈瓶中，加入之前处理的硅胶球1.5g，加入100mL甲苯，加热回流分水12小时。过滤，之后用丙酮乙醚依次冲洗固体。

实施例四：

1.载体的前处理：取1.0g硅胶球，加入圆底烧瓶，再加入适量的浓盐酸，加热回流2h,降温，过滤，水洗固体至pH=7，依次用丙酮和乙醚冲洗固体，之后抽干。

2. D-PheCONH(CH₂)₁₇CH₃合成

1）Z-D-PheCOOH的合成

冰水浴下在含有1.0L去离子水的的三颈瓶中加入0.5mol的NaOH，搅拌溶解，再加入0.5mol的D-PheCOOH，搅拌全溶后，同时滴加0.5mol的苄氧酰氯和0.5mol NaOH的50mL去离子水溶液，滴加完毕后，室温搅拌12小时。用乙醚萃取，在萃取出的水相中加入浓盐酸，调节pH值为酸性，乙酸乙酯萃取，水洗至中性，分出的有机相用无水Na₂SO₄干燥，滤去硫酸钠，旋转蒸发除去乙酸乙酯，之后用CCl₄及石油醚进行重结晶，产品干燥。

2）Z-D-PheCOOH与十八烷基胺反应

称取0.2mol的Z-D-PheCOOH在三颈瓶中，500mL的乙酸乙酯加热搅拌溶解。加入0.2mol的DCC，搅拌1小时，后加入0.2mol的三乙胺，称取0.2mol的烷基胺溶解于100ml氯仿加入到混合液中，冰浴搅拌2小时。室温下搅拌1小时，45℃下搅拌50小时，60℃下搅拌3小时。加入0.2mol醋酸，搅拌1小时。热过滤。滤液旋转蒸发得到的产品用正丙醇溶解，冷却重结晶，抽滤。

3）脱去苄氧基保护

250ml的三颈瓶中加入0.1mol上一步的产物，加热溶解，加入少量用乙醇稀释的Pd/C，加热溶解，当冷却后没有析出时，停止反应，抽滤Pd/C，滤液浓缩干后，用THF和石油醚重结晶，得到产品，干燥。

4）手性单体的合成

氮气保护下向反应瓶中加入0.1mol脱保护的产物，然后加入100ml除过水的四氢呋喃，加热溶解，冷却到室温后没有析出。加入用四氢呋喃稀释的0.1mol 3-异氰基丙基三乙氧基硅烷。反应在室温下过夜，滤去溶液得到产物。

3. 手性固定相的制备：取100mg单体样品于单颈瓶中，加入之前处理的硅胶球1.5g，加入100mL甲苯，加热回流分水12小时。过滤，之后用丙酮乙醚依次冲洗固体。

实施例五

按照现有技术，采用实施例一所得手性柱对四种目标外消旋化合物分离物的拆分，得四张效果图，请参见图1～4；所述四种外消旋化合物分别为：

A：

、B：、C：

 和D：

。

实施例六

1）Z-氨基酸的合成（该产品已经商品化，可以购买得到，为保证纯度自制）：

冰水浴下0.1～10 mol的氨基酸与0.1～10mol的苄氧酰氯和0.1～10mol NaOH反应5～20小时后，经萃取、酸化、除水、重结晶，干燥后得到Z-氨基酸。

本步骤中所涉及的氨基酸为L-缬氨酸、D-缬氨酸、L-丙氨酸、D-丙氨酸、L-苯丙氨酸、D-苯丙氨酸、L-异亮氨酸、D-异亮氨酸等。

2）Z-氨基酸与烷基胺反应：

称取0.1～10mol的Z-氨基酸在三颈瓶中，加入100～1000mL的乙酸乙酯加热搅拌溶解，加入0.1～10mol的DCC，搅拌1～5小时后加入0.1～10mol的三乙胺，称取0.1～10mol的烷基胺溶解于50～500ml氯仿加入到混合液中，冰浴搅拌1～10小时，室温下搅拌1～10小时，45℃下搅拌1～50小时，60℃下搅拌1～50小时。加入0.1～10mol醋酸，搅拌1～10小时。热过滤。滤液旋转蒸发得到的产品用正丙醇溶解，冷却重结晶，抽滤。

本步骤中所涉及的烷基胺为十四胺、十五胺、十六胺、十七胺、十八胺等。

3）脱去苄氧基保护（参照现有技术）：

250ml的三颈瓶中加入0.1～10mol步骤2）的产物，加入乙醇溶解，加入少量用乙醇稀释的Pd/C，通入H₂反应，当溶液冷却后没有固体析出时，停止反应，抽滤除去Pd/C，滤液浓缩干后，用THF和石油醚重结晶，得到产品。

4）手性单体的合成

氮气保护下向反应瓶中加入0.1mol～10mol步骤3）的产物，然后加入10～1000ml二氯甲烷，加热溶解，冷却到室温后没有析出。加入用二氯甲烷稀释的0.1～10mol 偶联硅氧烷。室温反应10-24小时，滤去滤液，得到产物。

本步骤中偶联硅氧烷为3-异氰基丙基三乙氧基硅烷，4-异氰基丁基三乙氧基硅烷，5-异氰基戊基三乙氧基硅烷，6-异氰基己基三乙氧基硅烷等。

Claims (6)

1.一种手性固定相，由手性选单体和载体构成；其特征在于，所述手性单体的结构通式为：

；式中，m为1～17的任意整数；n是1～10的任意整数；R为氨基酸侧链基团，所述载体为硅胶。

2.根据权利要求1所述手性固定相，其特征在于，m为13～17的任意整数，n为3～6的任意整数。

3.根据权利要求1所述手性固定相，其特征在于，所述氨基酸选自：L-缬氨酸、D-缬氨酸、L-丙氨酸、D-丙氨酸、L-苯丙氨酸、D-苯丙氨酸、L-异亮氨酸或D-异亮氨酸。

4.根据权利要求1所述手性固定相，其特征在于，所述硅胶为色谱用球形或无定形硅胶,所述硅胶的粒径为4～6μm，孔径为80～120埃。

5.一种手性色谱固定相的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：按照质量比，手性单体∶酸处理的硅胶=1∶2～20，将手性单体溶于甲苯中，然后加入酸处理的硅胶；在惰性气体保护下回流分水反应1～50小时，然后洗涤干燥后得到手性固定相。

6.根据权利要求5所述制备方法，其特征在于，手性单体的制备方法包括以下步骤：

1）将Z-氨基酸与烷基胺通过缩合反应形成酰胺键，然后脱去苄氧基，得到中间产物：

；所述Z-氨基酸中的保护基团为苄氧基，所述氨基酸为L-缬氨酸、D-缬氨酸、L-丙氨酸、D-丙氨酸、L-苯丙氨酸、D-苯丙氨酸、L-异亮氨酸或D-异亮氨酸；所述烷基胺为十四胺、十五胺、十六胺、十七胺或十八胺；

2）按照摩尔比，步骤1）所得中间产物与偶联硅氧烷=1∶1～1.2，将中间产物的二氯甲烷溶液加入偶联硅氧烷的二氯甲烷溶液，在室温下反应10～24小时，过滤后得到手性单体。

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