CN101970100A - 用于分离对映体混合物的新型手性选择物及固定相 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及结构(I)的α-未被取代的β-氨基酸衍生物在分离物质混合物、优选手性物质混合物、更优选对映体、特别是选自β-氨基酸及其衍生物、α-氨基酸和α-羟基酸中的物质的对映体的方法中作为手性选择物的用途，其中，n＝1-5、优选n＝1或n＝2，R1＝(C1-C4)-烷基、(C6-C10)-芳基、(C7-C13)-芳烷基、(C7-C10)-杂芳烷基、吡啶基、羟甲基、CH(OH)CH3、CH2CONH2、CH2COOH、(CH2)2CONH2、(CH2)2COOH、(CH2)4NH2、(CH2)2SCH3或(CH2)3NHC(NH)NH2；并且当X是共价地连接至载体材料的连接基时，R2＝3，5-二硝基苯甲酰基或萘基，或者当X＝OH时，R2＝CH2CHR3R4，其中R3＝H或OH且R4＝(C1-C20)-烷基、(C6-C10)-芳基或(C7-C13)-芳烷基，本发明还涉及所述选择物在生产手性固定相中的用途。本发明进一步涉及出自上述选择物的手性固定相及其生产方法，还涉及对物质混合物、优选手性物质混合物、更优选对映体，特别是选自β-氨基酸及其衍生物、α-氨基酸和α-羟基酸中的物质的对映体进行色谱分离的方法。

Description

用于分离对映体混合物的新型手性选择物及固定相
技术领域
本发明涉及α-未被取代的β-氨基酸尤其是其衍生物作为手性选择物用于分离物质混合物、优选手性物质的混合物、更优选对映体混合物、特别是选自β-氨基酸及其衍生物、α-氨基酸和α-羟基酸中的物质的对映体的用途，本发明还涉及包含α-未被取代的β-氨基酸尤其是其衍生物作为中心手性物质的手性固定相(CSP)、它们的合成、以及利用这些固定相分离物质混合物、优选手性物质的混合物、更优选对映体混合物、特别是选自β-氨基酸及其衍生物、α-氨基酸和α-羟基酸中的物质的对映体混合物的方法。
背景技术
对用于化学和药物用途的对映体纯物质和活性成分的增长的需要已经导致大量立体选择性分离技术的发展，特别是在色谱领域，其可以以分析级使用，用于控制对映体纯度并抑制外消旋过程、用于药物质量控制和用于药物代谢动力学研究，或者以制备级使用，以提供对映体纯的化合物。
与非对映体相反，对映体在非手性的环境中具有完全相同的化学及物理特性。因此，色谱对映体分离可以用间接法来进行，即，使分析物与手性衍生化试剂反应以生成非对映体混合物，该混合物与对映体混合物不同，其可以在非手性相材料上分离；或者通过所谓的使用能结合进移动或固定相的手性选择物的直接法来进行。此时，分离性能取决于分析物和选择物之间通过非共价相互作用形成的非对映体络合物的不同稳定性。
在对映体分离的领域中，已经发现了直接法和间接法，以各种各样的色谱和电泳的方法，例如气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(也称为高压液相色谱法，HPLC)、薄层色谱法(TLC)、超-和亚临界液体色谱法(SLC)、毛细管电色谱法(CEC)和毛细管电泳法(CE)(Gübitz and Schmid(Eds.)，Methods in Molecular Biology，Vol.243：Chiral Separations：Methods and Protocols，Humana Press Inc：Totowa，NJ：2004；Gübitz und Schmid，Biopharm.Drug Dispos.2001，22，291-336)。
分析物的衍生化意味着至少一个加入反应步骤，其会导致生成不希望的副产物和分解产物并导致(部分)消旋化。此外，在分析物中必须存在用于衍生化的合适的官能团，并且手性衍生试剂必须可以以高对映体纯度获得(Gübitz and Schmid，Biopharm.Drug Dispos.2001，22，291-336)，这就是为什么现在更优选非衍生的直接色谱法或电泳法。
虽然就操作而言，将手性选择物加入到色谱或电泳体系的流动相中是用于对映体分离的简单方法，但其费用非常高且并非在任何场合都可行。
使用其中手性选择物共价健合或吸附到载体材料上的手性固定相的直接色谱方法就操作而言是很方便的，并且-假定手性相材料有足够的分离性能-也适用于制备级。具体地说，在手性固定相领域中，一方面，手性选择物使得手性化合物的两种对映体可有效地分离，但另一方面，要求其具有足够的可变性以使其可应用于宽范围的化合物。
直接法的一种改型是配体交换方法(LE)，其是基于在金属离子、手性选择物与分析物之间形成的三重混合的络合物，手性选择物与分析物二者在金属离子上都起配位体的作用。成功分离的关键在于混合络合物与分析物的(R)和(S)对映体之间不同的稳定常数。配体交换原则已经在上述的许多方法中成功地用于对映体分离：首先，在毛细管电泳中将手性选择物加入到电解液中，其次，在经典的柱色谱法、高效液相色谱法、薄层色谱法和毛细管电色谱法中使用手性固定相，在这些情况下手性选择物可共价健合或吸附到载体材料上。
然而，因为手性分离至今还不能预期，所以寻找有效和快速的手性固定和流动相的适当组合仍然是对色谱法的一大挑战(Subramanian，Practical Approach to Chiral Separations by Liquid Chromatography，Wiley-VCH：Weinheim 1994；Gübitz and Schmid(Eds.)，Methods in Molecular Biology，Vol243：Chiral Separations：Methods and Protocols，Humana Press Inc：Totowa，NJ：2004；Francotte，GIT Labor-Fachzeitschrift 5/2006，452-455)，而且深入的研究已经导致新的和改善的相材料(
Figure BPA00001216758000021
and Lindner，In：Separation Methods in Drug Synthesis and Purification，Valkó(Ed.)，Elsevier：Amsterdam2000，337-437)。按照Armstrong等人报导(Anal.Chem.2001，73，557A-561A)，早在2001年，仅用于高效液相色谱，就有超过100种基于不同选择物的手性固定相可以通过商业获得。每家厂商都提供综合利用手册，其中有品种繁多的各种各样的分离情况，例如对于脂肪族的、芳香族的、脂环族的或杂环的手性胺、酒精、氨基醇或α-氨基酸及其衍生物，在特定产品的方法中几乎都专门列出。这种大量能够通过商业获得的手性固定相，首先表明这些分离方法有巨大的意义并且人们对其有兴趣，但应当说明，迄今为止，影响手性固定相直接色谱和电泳法利用的一大弊病在于：通常来说，要获得高效的分离，需要一系列(昂贵的)手性固定相，即使是结构上密切相关的单元的情况下。
因此，内部研究以及文献数据表明，迄今为止，对于手性色谱法，需要大量能用于气相色谱法(GC)或液相色谱法(例如HPLC)的固定相，例如β-氨基酸及其衍生物。例如，现有技术已经公开，纤维素氨基甲酸酯相、多糖衍生物、冠醚(Berkecz et al.，J.Chromatogr.A，2006，1125，138-143；Hyun et al.，J.Sep.Sci.2005，28，421-427)、配体交换相(Hyun et al.，J.Sep.Sci.2003，26，1615-1622；Hyun et al.，Biomed.Chromatogr.2003，17，292-296)或大环糖肽相(Sztojkov-Ivanov et al.，Chromatographia 2006，64，89-94；Illisz et al.，J.Sep.Sci.2006，29，1305-1321以及其中引用的文献；D’Acquarica et al.，Tetrahedron：Asymmetry 2000，11，2375-2385)。
近几年，由于具有独特的药理学的性质，β-氨基酸已经作为关键组分结合进大量的拟肽物和其他生理活性物质(Kuhl et al.，Amino Acids 2005，29，89-100)。与此有关的是对用于检测合成单元和最终产物的对映体纯度的分析方法的高涨需要，具体地说，也在于存在显著过量的旋光对映体的情况下检测一种对映体痕量的痕量测定需求(Juaristi and Soloshonok，Enantioselective Synthesis of β-Amino Acids，Wiley-VCH：New York 2005)。
发明内容
本发明的目的是提供新的手性选择物，基于该手性选择物，能提供用于分离物质混合物、优选手性物质的混合物、更优选对映体混合物、特别是选自β-氨基酸及其衍生物、α-氨基酸和α-羟基酸中的物质的对映体的新手性相，这使得可以用色谱法、特别是借助于高效液相色谱法在分析和预备级上高效且基本上非常通用地分离手性化合物的对映体对。
如今已经发现，十分令人惊讶地，在分离物质混合物、优选手性物质的混合物、更优选对映体混合物、特别是β-氨基酸及其衍生物中，α-未被取代的β-氨基酸衍生物是柔性的且是具有非常高选择性的手性选择物。可以使用本发明的选择物进行对映体分离的其他物质种类是，例如，α-氨基酸和α-羟基酸。因此，本发明的一个独特的优势在于包含基于α-未被取代的β-氨基酸衍生物的手性相可令人惊讶地普遍应用于大量物质种类的色谱分离。
因此，本发明提供结构(I)的手性选择物的用途
Figure BPA00001216758000041
其中，n＝1-5，优选n＝1或n＝2，R1＝(C1-C4)-烷基、(C6-C10)-芳基、(C7-C13)-芳烷基、(C7-C10)-杂芳烷基、吡啶基、羟甲基、CH(OH)CH3、CH2CONH2、CH2COOH、(CH2)2CONH2、(CH2)2COOH、(CH2)4NH2、(CH2)2SCH3或(CH2)3NHC(NH)NH2；
并且当所述手性选择物通过连接基(linker)X共价地连接至载体材料时，R2＝3，5-二硝基苯甲酰基或萘基
或者当X＝OH时，R2＝CH2CHR3R4，其中R3＝H或OH且R4＝(C1-C20)-烷基、(C6-C10)-芳基或(C7-C13)-芳烷基。
根据本发明，对于C3碳原子(β-碳原子)，所述手性选择物主要以一种绝对构型存在，而对于可能存在于侧链的立构中心，则不必主要以一种绝对构型存在。
在本发明的范围内，(C1-C4)-烷基表示具有1-4个饱和碳原子且可以有任何希望的支链的基团，优选甲基、异丙基、异丁基和仲丁基。
在本发明的范围内，(C6-C10)-芳基表示具有6-10个碳原子的芳基，优选苯基和1-和2-萘基基团，其可被其他基团或官能团，特别是氟、氯、溴、甲基和/或三氟甲基基团、和羟基和/或氰基单-、低-、多-或全取代。
在本发明的范围内，(C7-C13)-芳烷基优选表示通过亚甲基键合到分子的(C6-C10)-芳基，且进一步优选苯乙基和二苯甲基。
在本发明的范围内，(C7-C10)-杂芳烷基优选表示通过亚甲基键合到分子的吡啶基或吲哚基。
在本发明的范围内，萘基优选表示1-萘基或2-萘基，其可以有键合的其他的取代基。
优选R1＝苯基；在特别优选的实施方案中，R1＝苯基且n＝1或n＝2。此外，优选R4＝苯基。
本发明进一步提供通过结构(I)描述的手性选择物在制备用于对物质混合物、优选手性物质混合物、更优选对映体混合物、特别是选自β-氨基酸及其衍生物、α-氨基酸和α-羟基酸中的物质的对映体进行色谱分离方法中的固定相的用途，并且所述手性选择物可共价地键合到或吸附到基于硅胶或整块料(monolith)的载体材料上。
结构(I)表示的手性选择物和基于该手性选择物手性固定相适于在对物质混合物、优选手性物质混合物、更优选对映体混合物、特别是选自β-氨基酸及其衍生物、α-氨基酸和α-羟基酸中的物质的对映体进行色谱分离的方法中作为选择物。所述样品包括对映体混合物，还可包含将被除去的其他化合物，例如副产物和/或杂质。本发明范围内的色谱方法包括薄层色谱法(TLC)、毛细管电色谱法(CEC)，并更优选高效液相色谱(HPLC)。本发明范围内的其他色谱方法是微晶片上的微高效液相色谱(μ-HPLC)和毛细管电色谱法(CEC)(所谓的微流体芯片技术)。本发明的独特优势在于所述手性选择物使得可以制备在各种条件下都很稳定并且可在普通的相模式(NP)、或在极性-有机模式(PO)和反相模式(RP)下使用的固定相。本发明的进一步优势为由于手性选择物的高选择性，手性选择物允许对映体的微量痕量测定。
进一步优选的色谱方法为配体交换模式，其中流动相含有带正电荷的金属离子，优选二价金属离子，特别是铜(II)离子(Davankov，J.Chromatogr.1971，60，280-283)。在配体交换模式中，优选结构(I)的手性选择物的吸附体，其中，X＝OH且R2＝CH2CHR3R4，其中R3＝H或OH且R4＝(C1-C20)-烷基、(C6-C10)-芳基或(C7-C13)-芳烷基。
本发明进一步提供一种用于对物质混合物、优选手性物质混合物、更优选对映体混合物、特别是选自β-氨基酸及其衍生物、α-氨基酸和α-羟基酸中的物质的对映体进行色谱分离方法中的手性固定相，其包括载体材料和手性选择物，其特征在于所述手性选择物是如下结构的α-未被取代的β-氨基酸衍生物：
Figure BPA00001216758000061
其中n＝1-5，优选n＝1或n＝2，R1＝(C1-C4)-烷基、(C6-C10)-芳基、(C7-C13)-芳烷基、(C7-C10)-杂芳烷基、吡啶基、羟甲基、CH(OH)CH3、CH2CONH2、CH2COOH、(CH2)2CONH2、(CH2)2COOH、(CH2)4-NH2、(CH2)2-SCH3或(CH2)3NHC(NH)NH2，R2＝3，5-二硝基苯甲酰基或萘基，且X是手性选择物共价连接到载体材料上的连接基。
根据本发明，对于C3碳原子(β-碳原子)，所述手性选择物主要以一种绝对构型存在。
优选地，R1＝苯基；在一个实施方案中，特别优选R1＝苯基且n＝1或n＝2。
连接基X优选是具有伯氨基的氨烷基连接基，更优选是氨丙基连接基，所述选择物作为酰胺通过连接基键合到载体材料上。所述实施方案如结构(IIa)所示：
Figure BPA00001216758000062
在本发明的范围内优选的载体材料是基于硅胶或整块料的材料。
本发明进一步提供一种用于制备含有结构(II)或(IIa)的手性选择物的手性固定相，包括以下步骤：(ia)用适于酰化的3，5-二硝基苯甲酰衍生物优选为3，5-二硝基苯甲酰氯对α-未被取代的-β-氨基酸或相应的β-氨基酸酯进行酰化(R2＝3，5-二硝基苯甲酰基)，或(ib)合成α-未被取代的N-萘基化的β-氨基酸或相应的β-氨基酸酯(R2＝萘基)(ii)任选地，水解所述酯官能团，(iii)任选地，偶合其他的α-未被取代的-β-氨基酸单元，(iv)使所述手性选择物通过共价，任选地通过连接基，接合至载体材料上。通式结构(II)和(IIa)的化合物可以通过以下方法制备，例如，通过用适于酰化的3，5-二硝基苯甲酰衍生物优选为3，5-二硝基苯甲酰氯对相应的β-氨基酸或相应的β-氨基酸酯进行酰化(R2＝3，5-二硝基苯甲酰基)(类似于制备包括那些基于β-氨基酸的手性相的方法，Pirkle等人报告(J.Chromatogr.1980，192，143-158))。主要以一种对映体形式存在的α-未被取代的N-萘基化的β-氨基酸或相应的β-氨基酸酯(R2＝萘基)的合成，可以是例如，由相应的β-氨基酸和萘酚通过经典的布赫尔反应来合成(Pirkle和Pochapsky报导了用于制备具有高对映体纯度的N-(2-萘基)-2-氨基酸及酸酯的类似方法(J.Org.Chem.1986，51，102-105))。要求所述β-氨基酸与重复的β-氨基酸单元(n＞1)形成选择物，这可以通过，例如，溶液中经典的缩氨酸合成路线来实现。对于其细节以及其他合成法，可参考关于缩氨酸合成的相关已知文献(如Houben-Weyl，Methoden der organischen Chemie[Methods of Organic Chemistry]，Volume 15/1and 15/2；M.Bodanszky，Principles of Peptide Synthesis，Springer Verlag 1984)。
此外，本发明提供一种使用由结构(II)或(IIa)描述的手性选择物或基于其的手性固定相对物质混合物、优选手性物质混合物、更优选对映体、特别是选自β-氨基酸及其衍生物、α-氨基酸和α-羟基酸中的物质的对映体进行色谱分离的方法，包括：(i)使待分离的物质混合物的溶液与含有载体材料和结构(II)或(IIa)的手性选择物的手性固定相接触，(ii)使用流动相，基于物质混合物中各个成分与固定相之间的不同相互作用来分离各个成分，(iii)任选地，收集流动相的馏分并从其中分离经色谱纯化的物质。此方法还适于对映体特别是α-和β-氨基酸对映体的微量痕量检测。优选液相色谱法，特别是HPLC法。其可以，例如，在不加入金属离子的情况下通过正常相模式(NP)、极性-有机模式(PO)或反相模式(RP)来进行。
此外，本发明提供一种用于对物质混合物、优选手性物质混合物、更优选对映体、特别是选自β-氨基酸及其衍生物、α-氨基酸和α-羟基酸中的物质的对映体进行色谱分离的手性固定相，包括：载体材料和手性选择物，其特征在于所述手性选择物是如下结构的α-未被取代的-β-氨基酸衍生物
Figure BPA00001216758000071
其中R1＝(C1-C4)-烷基、(C6-C10)-芳基、(C7-C13)-芳烷基、(C7-C10)-杂芳烷基、吡啶基、羟甲基、CH(OH)CH3、CH2CONH2、CH2COOH、(CH2)2CONH2、(CH2)2COOH、(CH2)4-NH2、(CH2)2-SCH3或(CH2)3NHC(NH)NH2，R3＝H或OH和R4＝(C1-C20)-烷基、(C6-C10)-芳基或(C7-C13)-芳烷基。
根据本发明，对于C3碳原子(β-碳原子)，所述手性选择物主要以一种绝对构型存在，而在2′位置上可能存在的立构中心则不必主要以一种绝对构型存在。
优先R1＝苯基。
在本发明的范围内，R4优选为被短链取代的苯基，更优选未被取代的苯基，或具有1-20个碳原子、优选具有4-18个碳原子、更优选具有6-16个碳原子、特别是具有10-12个碳原子的直链或支链化的烷基，且更优选为正癸基。在特别优选的具体实施方式中，R1＝苯基且R4＝正癸基。
式(III)的手性选择物可应用于合适的载体材料，优选通过所谓的动态覆盖吸附到反相材料(RP材料)优选基于硅胶或整块料上。优选的RP材料是，例如，RP-2、RP-4、RP-5、RP-6、RP-8、RP-12以及特别是RP-18。
本发明进一步提供一种用于制备含有结构(III)的手性选择物的手性固定相的方法，包括以下步骤：制备如权利要求15-22任一项的手性固定相方法用的N-烷基化的氨基酸包括以下步骤：(i)制备N-烷基化的氨基酸，(ii)使N-烷基化的氨基酸吸附至载体材料上。
通式结构(III)的化合物可以通过以下方法制备，例如，用等摩尔量的强碱例如甲醇钠使适当的环氧化合物与特定的β-氨基酸反应(Busker et al.，DE3 143 726A1)。这会导致2′碳原子的外消旋化构型。制备结构(III)的手性选择物的另一种方法是用n-烷基溴使适当的β-氨基酸N-烷基化(例如，根据Davankov et al.，Chromatographia 1980，13，677-685)。
此外，优选一种使用由结构(III)描述的手性选择物或基于其的手性固定相，在分析级、半制备级或制备级上色谱分离物质混合物、优选手性物质混合物、更优选对映体混合物、特别是选自β-氨基酸及其衍生物、α-氨基酸和α-羟基酸中的物质的对映体的方法，特别是在加入金属离子优选二价金属离子且更优选铜(II)离子的配体交换模式(LE)中。这种方法包括：(i)使待分离的物质混合物的溶液与含有结构(III)的手性选择物的手性固定相接触，(ii)基于物质混合物中各个成分与手性选择物之间的不同相互作用，使用含有二价过渡金属离子且优选铜(II)离子的流动相来分离该物质混合物中的各个成分，(iii)就制备或半制备液相色谱应用而言，任选地，收集流动相的馏分并从其中分离经色谱纯化的物质。此方法还适于对映体优选是α-和β-氨基酸对映体的微量痕量检测。
在本文的范围内，色谱分离是指在固定相上分离物质混合物、优选手性物质混合物、更优选对映体混合物、特别是选自β-氨基酸及其衍生物、α-氨基酸和α-羟基酸中的物质的对映体，该过程或者是指不进行所分离物质的后续分离的仅以分析为目的的过程、或者是指为了半制备或制备目的而进行后续的从色谱系统的成分和存在于样品中的其他物质中分离被分离的物质的过程。
在本发明的范围内，“主要以一种绝对构型”是指一种光学活性的旋光对映体形式超过50％、优选至少90％、尤其至少95％，且更优选对映体纯的形式。
如已经提到过的，现有技术中公开了大量的手性选择物以及基于这些手性选择物的固定相。例如，为了通过高效液相色谱分离β-氨基酸及其衍生物，迄今为止，已经使用了基于冠醚、β-氨基酸衍生物或大环糖肽的手性选择物。表1中对比了现有技术中用于分离对映体β-氨基酸的各种已知色谱方法，根据本发明的教导可以得到结果。分离柱的特性以通常方式通过负载系数k1和k2、分离系数α和分离度(resolution)Rs表示-例如，在Meyer，Praxis der Hochdruckflüssigkeits-chromatographie [High-Pressure Liquid Chromatography in Practice]，Wiley-VCH Weinheim 2004中描述的方法。准确的色谱分析条件可以从具体的原始文献中获得。
表1：通式结构H2N-CHR1-CH2-CO2H的β-氨基酸的对映体混合物在手性固定相上的色谱分离
Figure BPA00001216758000101
a本发明；bn.s.＝未指定
*其他参数：比较文献/本发明实施例：流速1ml/min，30℃
[1]Sztojkov-Ivanov et al.，Chromatographia 2006，64，89-94.
[2]Hyun et al.，J.Sep.Sci.2003，26，1615-1622.
[3]Péter et al.，J.Chromatogr.A 2001，926，229-238.
[4]D’Acquarica et al.，Tetrahedron：Asymmetry 2000，11，2375-2385.
[5]Hyun et al.，J.Sep.Sci.2002，25，648-652.
[6]Berkecz et al.，J.Chromatogr.A 2006，1125，138-143.
[7]Madhavan，Chromatographia 2007，66，243-246.
从表1可以明显看出，在以分离系数α和对映体分离度Rs为特征的分离性能方面、特别是在半制备和制备应用方面，本发明的选择物及基于该选择物的固定相与现有技术已知的选择物相比，非常有优势。此外，它们显示出普遍的适用性；这也参考了表2-4显示的结果。
现有技术中也公开了基于α-氨基酸的手性选择物，并与结构(II)描述的选择物有一定的相似性(Welch，J.Chromatogr.A 1994，3-26)。然而，其中描述的手性选择物无一是α-未被取代的β-氨基酸衍生物。而且，甚至在现有技术中不同的出处都指出，与手性识别有关的官能团之间有相对较大的距离和选择物较高的构象灵活性(与α-氨基酸或与α-取代的β-氨基酸相比，由于本发明选择物中额外的亚甲基，会出现这种情况)，在分离性能上具有副作用(特别参见，Pirkle and McCune，J.Chromatogr.1988，441，311；Wang et al.，Anal.Chem.2000，72，5459-5465；Welch，J.Chromatogr.A 1994，3-26)。
附图说明
图1表示使用实施例1的手性固定相时不同β-氨基酸衍生物光学异构体的色谱分离度。
图2表示使用实施例2的手性固定相时不同β-氨基酸衍生物光学异构体的色谱分离度。
图3表示使用实施例3的手性固定相时不同α-和β-氨基酸及α-羟基酸的光学异构体的色谱分离度。
图4表示实施例2的手性固定相在确定对映体纯度中特别是微量痕量检测领域中的应用。上边的色谱图表示使用实施例2的手性固定相时(R)-和(S)-3-叔丁氧羰基氨基-3-苯基丙酸消旋混合物的色谱分离度。中间的色谱图表示在此相上的纯(S)-3-叔丁氧羰基氨基-3-苯基丙酸的色谱。下边的色谱图表示加入1％的(R)-3-叔丁氧羰基氨基-3-苯基丙酸的(S)-3-叔丁氧羰基氨基-3-苯基丙酸的分离度。
具体实施方式
实施例
以下实施例用于详细阐述本发明，但不以任何方式对其产生限制。
实施例1
(S)-3(3，5-二硝基苯甲酰氨基)-3-苯丙酸共价连接至氨丙基功能化的硅胶基体(氨基相)的手性固定相的制备
(1)(S)-3-(3，5-二硝基苯甲酰氨基)-3-苯丙酸的合成
将16g(S)-3-氨基-3-苯丙酸((S)-β-苯丙氨酸)与80ml 5％的氢氧化钠水溶液混合，并通过加入50％的氢氧化钠水溶液将所得溶液的pH值调节至11-12。加入20ml四氢呋喃后，将反应混合物冷却至10℃，在60分钟的时间内加入23.1g二硝基苯甲酰氯在60ml四氢呋喃中的溶液，并将反应混合物再搅拌60分钟。通过蒸馏除去有机相，残留的水相用甲基叔丁酯萃取两次。将水相与200ml乙酸乙酯混合并通过加入4N的盐酸将pH调节至1-2。分离各个相，有机相用200ml饱和氯化钠溶液洗涤。在45℃和p＝150mbar下蒸馏出溶剂之后，将残余物置于300ml环己烷中。滤出产物并在40℃干燥。所述产物通过制备高效液相色谱在反相材料上(例如Kromasil RP-18，粒径10μm)在乙腈/水/三氟乙酸的溶剂混合物中进一步纯化。产量：8.0g，HPLC纯度99.8面积％；元素分析：53.4％C，3.6％H，12.7％N；1H NMR(DMSO)δ(ppm)：2.85(dd，1H)，2.96(dd，1H)，5.48(m，1H)，7.26(t，1H)，7.35(t，2H)，7.44(d，2H)，8.96(t，1H)，9.07(d，2H)，9.58(d，1H)，13.30(s，1H，CO2H)。
(2)(S)-3-(3，5-二硝基苯甲酰氨基)-3-苯丙酸连接至氨丙基功能化的硅胶相(氨基相)
将4.1g氨基相(YMC-凝胶氨基NH12SO5，粒径5μm)悬浮在4g(S)-3(3，5-二硝基苯甲酰氨基)-3-苯丙酸于200ml四氢呋喃的溶液中，并在搅拌下将反应混合物与3.2g N-乙氧羰基-2-乙氧基-1，2-二氢喹啉(EEDQ)混合。室温下8h后，将相材料滤出，分别用50ml甲醇和乙醚洗涤并干燥。产量：4.6g所要求的载体材料，元素分析：10.6％C，1.2％H和2.4％N；相当于0.4mmol/g的覆盖率。
通过平衡-密度法在300bar下填充250×5mm的HPLC柱(参见Meyer，Praxis der Hochdruckflüssigkeitschromatographie，Wiley-VCH：Weinheim2004)。
应用实施例1
实施例1制备的分离柱适用于多种β-氨基酸或β-氨基酸衍生物(表2)在HPLC条件下的色谱分离。图1表示使用实施例1的分离柱时不同β-氨基酸衍生物的光学异构体的色谱分离度(chromatographic resolution)。
表2
Figure BPA00001216758000141
流动相A：异己烷/乙醇/三氟乙酸(800+200+1，v/v/v)
流动相B：异己烷/甲基叔丁酯/乙醇/三氟乙酸(800+150+50+1，v/v/v/v)
*其他参数：流速1ml/min，温度30℃
实施例2：
(S)-3-[(S)-3-(3，5-二硝基苯甲酰氨基)-3-苯丙酰胺]-3-苯丙酸(3-(3，5-二硝基苯甲酰基)-(S)-β-苯丙氨酰-(S)-β-苯丙氨酸)共价连接至氨丙基功能化的硅胶基体(氨基相)的手性固定相的制备
(1)(S)-3-[(S)-3-(3，5-二硝基苯甲酰基)-3-苯丙酰胺]-3-苯丙酸(3-(3，5-二硝基苯甲酰基)-(S)-β-苯丙氨酰-(S)-β-苯丙氨酸)的合成
a.(S)-3-(3，5-二硝基苯甲酰氨基)-3-苯丙酸乙酯的合成
将11.49g(S)-3-苯丙酸乙酯盐酸盐悬浮在100ml四氢呋喃中并在冰浴中冷却至0-10℃。加入14ml三乙胺后，在搅拌和冷却下30分钟内加入11.52g 3，5-二硝基苯甲酰氯于40ml四氢呋喃中的溶液。移去冷却浴，并将反应混合物再搅拌120分钟，在此过程中，其升至室温。过滤反应混合物，滤液浓缩至干燥(产物部分1)。将滤饼-由盐酸三乙胺和其他产物组成-置于100ml乙酸乙酯中并在35℃消化20分钟。过滤悬浮物，弃去滤饼。在40℃将滤液减压浓缩至干燥(产物部分2)。合并上述产物部分。产量：16.4g；HPLC纯度＞97面积％。为了进一步纯化，室温下将粗品在400ml水中消化2h然后过滤。湿产量为15.4g。HPLC纯度为99.8面积％。产物进一步反应而无需进一步纯化。
b.水解成(S)-3-(3，5-二硝基苯甲酰氨基)-3-苯丙酸
将从反应a获得的15.4g(S)-3-(3，5-二硝基苯甲酰氨基)-3-苯丙酸乙酯溶于100ml四氢呋喃中，并将获得的溶液与50ml水混合。强烈搅拌下，将稍微混浊的反应混合物加热至45℃，用32％氢氧化钠水溶液将pH调节至13-13.5并在反应过程中保持恒定。反应终止后(HPLC检测＞99面积％的转化率)，通过加入6N盐酸将溶液的pH调节至7-8，然后在减压下蒸馏出有机溶剂。用水将水溶液稀释至350ml，并在强烈搅拌下用6N盐酸将pH调节至1-2。抽滤出沉淀产物并用水洗两次。在40℃减压干燥后，测得产量13.67g。HPLC纯度为99.8面积％。
c.2，5-二氧吡咯烷-1-基(S)-3-(3，5-二硝基苯甲酰氨基)-3-苯丙酸酯(3-(3，5-二硝基苯甲酰基)-(S)-β-苯丙氨酸2，5-二氧吡咯烷-1-基酯)
将12g来自反应b)的(S)-3-(3，5-二硝基苯甲酰氨基)-3-苯丙酸溶解于120ml四氢呋喃中并与3.92g N-羟基-琥珀酰亚胺混合。在0-5℃冰浴中冷却，往反应混合物中分批加入7.1g二环己基碳化二亚胺。加入结束后，将混合物置于冰浴中并进一步搅拌直到溶液达到室温。反应结束后(HPLC检测＞95面积％的转化率)，将沉淀的二环己基脲过滤并用四氢呋喃洗澡。减压下浓缩滤液，并将残余物消化在250ml 2-丙醇中回流2h。抽滤出产物，用2-丙醇洗涤并在50℃减压干燥。产量为13.87g；HPLC纯度98.8面积％
d.转化成(S)-3-[(S)-3-(3，5-二硝基苯甲酰氨基)-3-苯丙酰胺]-3-苯丙酸(3-(3，5-二硝基苯甲酰基)-(S)-β-苯丙氨酰基-(S)-β-苯丙氨酸)
将5.65g(S)-3-氨基-3-苯丙酸悬浮在70ml水中，通过加入氢氧化钠溶液将悬浮液的pH调节至10.5-11，并加入70ml四氢呋喃。在冰浴下将混合物冷却至0-5℃并在搅拌下15分钟内分批加入13g(S)-3-(3，5-二硝基苯甲酰氨基)-3-苯丙酸2，5-二氧吡咯烷-1-酯。加入结束后，通过加入氢氧化钠溶液将反应混合物的pH保持在9-9.5。在达到恒定的pH具有基本上完全的转化率时(HPLC检测；＜0.5面积％的反应物)，用水将溶液稀释至800ml的体积，通过加入4N的盐酸使得pH为1.5-2并进一步搅拌混合物30分钟。抽滤出固体，用水洗并在50℃下减压干燥。将干燥的固体在40℃下在250ml四氢呋喃中消化20分钟，冷却悬浮液并抽滤出固体(产物部分1)。在40℃水浴下将母液浓缩至约70-80ml的体积，将得到的悬浮液冷却至室温，并抽滤出固体(产物部分2)。合并上述产物部分并在50℃减压干燥。产量为11.1g；HPLC纯度＞99.5面积％；1H NMR(DMSO)δ(ppm)：2.64(d，2H)，2.77(m，2H)，5.15(m，1H)，5.52(m，1H)，7.10-7.20(m，5H)，7.25(t，1H)，7.31(t，2H)，7.39(d，2H)，8.44(d，1H)，8.95(m，1H)，9.01(m，2H)，9.53(d，1H)，12.17(s，1H，CO2H)。
(2)(S)-3-[(S)-3-(3，5-二硝基苯甲酰氨基)-3-苯丙酰胺]-3-苯丙酸共价连接至氨丙基功能化的硅胶相(氨基相)
将5g氨基相(YMC-凝胶氨基NH12SO5，粒径5μm)悬浮在4.7g(S)-3-[(S)-3-(3，5-二硝基苯甲酰氨基)-3-苯丙酰胺]-3-苯丙酸于1L四氢呋喃的溶液中，并在搅拌下将反应混合物与4g N-乙氧羰基-2-乙氧基-1，2-二氢喹啉(EEDQ)混合。室温下24h后，将相材料滤出，分别用100ml甲醇和乙醚洗涤然后干燥。元素分析：12.44％C，1.36％H和2.76％N；相当于0.312mmol/g的覆盖率。
通过平衡-密度法在300bar下填充250x 5mm的HPLC柱(参见Meyer，Praxis der Hochdruckflüssigkeitschromatographie，Wiley-VCH：Weinheim2004)。
应用实施例2
实施例2制备的分离柱也适用于在HPLC条件的多种β-氨基酸或β-氨基酸衍生物-在某些情况下，与单体相比具有更高的选择性。这是由于通过二肽选择物对不同的分析物具有更强的手性识别。
表3总结了结果。图2表示使用实施例2的分离柱时不同β-氨基酸衍生物的光学异构体的色谱分离度。
表3
Figure BPA00001216758000171
流动相A：异己烷/2-丙醇/三氟乙酸(900+100+1，v/v/v)
流动相B：乙腈/水/乙酸(700+300+1，v/v/v)
流动相C：异己烷/乙醇/三氟乙酸(750+250+1，v/v/v)
*其他：流速1ml/min，温度30℃。
实施例3
具有含有(3S)-3-(2-(R，S)-羟基十二烷基氨基-3-苯丙酸的RP载体材料的动态涂层的手性固定相的制备
(1)(3S)-3-(2-(R，S)-羟基十二烷基氨基-3-苯丙酸的制备
将27.01g甲醇钠和82.6g(S)-3-氨基-3-苯丙酸溶解在800ml甲醇中。加入92g 1，2-环氧十二烷后，将溶液在室温下搅拌20h。随后，用甲醇盐酸将溶液的pH调节至pH 6，并滤去结晶出来的氯化钠。蒸馏出甲醇后，残留油状残余物，其在与700ml丙酮搅拌的过程中结晶。这生成153.4g无色结晶。1H NMR(DMSO)δ(ppm)：0.85(t，3H)，1.13-1.31(m，18H)，2.28/2.60/2.70/2.86(m，2H)，3.02(m，1H)，3.34(m，1H)，3.66-3.78(m，1H)，4.57(m，1H)，5.20/5.29(s，br.，1H，OH)，7.42(m，3H)，7.60(m，2H)，9.40(s，br.，2H，NH2 +)，12.56(s，1H，CO2H)
(2)RP18载体材料的动态涂层
将1g(3S)-3-(2-(R，S)-羟基十二烷基氨基-3-苯丙酸溶解在50ml甲醇(选择物溶液)中，并且用甲醇清洗将要被覆盖的固定相(Kromasil C18，柱长250mm，内柱径4.6mm)。随后，在1ml/min的流速循环下将选择物溶液泵送经过柱3h。在4ml/min流速下甲醇清洗步骤之后，在室温下和1ml/min流速下将饱和的醋酸铜(II)甲醇溶液泵送经过所述柱约30分钟。据此，已经制备完成用于色谱用途的分离柱。
应用实施例3
实施例3修饰的分离柱适于在配体交换模式下多种β-氨基酸及其衍生物，以及α-氨基酸和α-羟基酸的对映体分离。
表4总结了结果。图3表示使用实施例2的分离柱时不同β-氨基酸的光学异构体的色谱分离度。
表4
Figure BPA00001216758000191
流动相：0.1mM醋酸铜(II)溶液/甲醇(900+100，v/v)，
流速：1ml/min，温度：30℃。

Claims (26)

1.结构(I)的α-未被取代的β-氨基酸衍生物的用途，其作为手性选择物用于分离物质混合物、优选手性物质混合物、更优选对映体、特别是选自β-氨基酸及其衍生物、α-氨基酸和α-羟基酸中的物质的对映体的方法中
Figure FPA00001216757900011
其中，n＝1-5，优选n＝1或n＝2，
R1＝(C1-C4)-烷基、(C6-C10)-芳基、(C7-C13)-芳烷基、(C7-C10)-杂芳烷基、吡啶基、羟甲基、CH(OH)CH3、CH2CONH2、CH2COOH、(CH2)2CONH2、(CH2)2COOH、(CH2)4NH2、(CH2)2SCH3或(CH2)3NHC(NH)NH2；
并且当X是共价地连接至载体材料的连接基时，R2＝3，5-二硝基苯甲酰基或萘基，
或者当X＝OH时，R2＝CH2CHR3R4，其中R3＝H或OH且R4＝(C1-C20)-烷基、(C6-C10)-芳基或(C7-C13)-芳烷基。
2.如权利要求1所述的β-氨基酸衍生物的用途，其特征在于，对于C3碳原子(β-碳原子)，所述手性选择物主要以一种绝对构型存在。
3.如权利要求1或2所述的β-氨基酸衍生物的用途，其特征在于，R1＝苯基。
4.如权利要求1-3中任一项所述的β-氨基酸衍生物的用途，其特征在于，R4＝(C8-C18)-烷基，优选(C6-C16)-烷基，特别是(C10-C12)-烷基，且更优选R4＝正癸基。
5.如权利要求1-3中任一项所述的β-氨基酸衍生物的用途，其特征在于，R4＝苯基且n＝1。
6.如权利要求1-5中任一项所述的β-氨基酸衍生物的用途，其用于制备对物质混合物、优选手性物质混合物、更优选对映体、特别是选自β-氨基酸及其衍生物、α-氨基酸和α-羟基酸中的物质的对映体进行色谱分离的方法中的固定相，其特征在于，所述手性选择物共价键合到或吸附到基于硅胶或整块料的载体材料上。
7.手性固定相，其用于对物质混合物、优选手性物质混合物、更优选对映体、特别是选自β-氨基酸及其衍生物、α-氨基酸和α-羟基酸中的物质的对映体进行色谱分离，所述手性固定相包括载体材料和手性选择物，其特征在于所述手性选择物是结构(II)的α-未被取代的β-氨基酸衍生物
Figure FPA00001216757900021
其中n＝1-5，优选n＝1或n＝2，R1＝(C1-C4)-烷基、(C6-C10)-芳基、(C7-C13)-芳烷基、(C7-C10)-杂芳烷基、吡啶基、羟甲基、CH(OH)CH3、CH2CONH2、CH2COOH、(CH2)2CONH2、(CH2)2COOH、(CH2)4-NH2、(CH2)2-SCH3或(CH2)3NHC(NH)NH2，R2＝3，5-二硝基苯甲酰基或萘基，并且X是共价连接到载体材料上的连接基。
8.如权利要求7所述的手性固定相，其特征在于，对于C3碳原子(β-碳原子)，所述手性选择物主要以一种绝对构型存在。
9.如权利要求7或8所述的手性固定相，其特征在于，R1＝苯基。
10.如权利要求7-9任一项所述的手性固定相，其特征在于，X是氨烷基连接基，优选是氨丙基连接基，并且所述手性选择物作为酰胺键合到所述载体材料上。
11.如权利要求7-10任一项所述的手性固定相，其特征在于，所述载体材料是硅胶相或整块料相。
12.一种制备如权利要求7-11任一项所述的手性固定相的方法，包括以下步骤：
(ia)用适于酰化的3，5-二硝基苯甲酰衍生物、优选3，5-二硝基苯甲酰氯对α-未被取代的-β-氨基酸或相应的β-氨基酸酯进行酰化(R2＝3，5-二硝基苯甲酰基)，或
(ib)合成α-未被取代的N-萘基化的β-氨基酸或相应的β-氨基酸酯(R2＝萘基)
(ii)任选地，水解所述酯官能团，
(iii)任选地，偶合其他的α-未被取代的-β-氨基酸单元，
(iv)使所述手性选择物以共价方式，任选地，通过连接基连接至载体材料上。
13.一种对物质混合物、优选手性物质混合物、更优选对映体、特别是选自β-氨基酸及其衍生物、α-氨基酸和α-羟基酸中的物质的对映体进行色谱分离的方法，包括以下步骤：
(i)使待分离的所述物质混合物的溶液与权利要求7-11任一项所述的手性固定相接触，
(ii)使用流动相，基于所述物质混合物中各个成分与固定相之间的不同相互作用来分离各个成分，
(iii)任选地，收集所述流动相的馏分并从其中分离经色谱纯化的物质。
14.如权利要求13所述的方法，其用于对映体特别是α-和β-氨基酸对映体的微量痕量检测。
15.如权利要求13或14所述的方法，其特征在于，所述方法是液相色谱方法，优选HPLC方法。
16.手性固定相，其用于对物质混合物、优选手性物质混合物、更优选对映体、特别是选自β-氨基酸及其衍生物、α-氨基酸和α-羟基酸中的物质的对映体进行色谱分离，所述手性固定相包括载体材料和手性选择物，其特征在于所述手性选择物是结构(III)的α-未被取代的-β-氨基酸衍生物
Figure FPA00001216757900041
其中R1＝(C1-C4)-烷基、(C6-C10)-芳基、(C7-C13)-芳烷基、(C7-C10)-杂芳烷基、吡啶基、羟甲基、CH(OH)CH3、CH2CONH2、CH2COOH、(CH2)2CONH2、(CH2)2COOH、(CH2)4-NH2、(CH2)2-SCH3或(CH2)3NHC(NH)NH2和R3＝H或OH和R4＝(C1-C20)-烷基、(C6-C10)-芳基或(C7-C13)-芳烷基。
17.如权利要求16所述的手性固定相，其特征在于，对于C3碳原子(β-碳原子)，所述手性选择物主要以一种绝对构型存在，而在2′位置上潜在的立构中心则不必主要以一种绝对构型存在。
18.如权利要求16或17所述的手性固定相，其特征在于，R1＝苯基。
19.如权利要求16-18任一项所述的手性固定相，其特征在于，R4＝(C4-C18)-烷基，优选(C6-C16)-烷基，特别是(C10-C12)-烷基，且更优选R4＝正癸基。
20.如权利要求16-18任一项所述的手性固定相，其特征在于，R4＝苯基。
21.如权利要求16-20任一项所述的手性固定相，其特征在于，所述手性选择物吸附接合至基于硅胶或整块料的载体材料上。
22.如权利要求21所述的手性固定相，其特征在于，所述载体材料是反相材料。
23.如权利要求22所述的手性固定相，其特征在于，所述载体材料选自RP-2、RP-4、RP-5、RP-6、RP-8、RP-12相，并且特别是RP-18相。
24.制备如权利要求16-23任一项所述的手性固定相的方法，包括以下步骤：
(i)制备N-烷基化的氨基酸，
(ii)使所述N-烷基化的氨基酸吸附至载体材料上。
25.一种对物质混合物、优选手性物质混合物、更优选对映体、特别是选自β-氨基酸及其衍生物、α-氨基酸和α-羟基酸中的物质的对映体进行色谱分离的方法，包括以下步骤：
(i)使待分离的所述物质混合物的溶液与权利要求16-23任一项所述的含有手性选择物的手性固定相接触，
(ii)使用含有二价过渡金属离子且优选铜(II)离子的流动相，基于所述物质混合物中各个成分与所述手性选择物之间的不同相互作用，来分离所述物质混合物中的各个成分，
(iii)任选地，收集所述流动相的馏分并从其中分离经色谱纯化的物质。
26.如权利要求25所述的方法，其用于对映体特别是α-和β-氨基酸对映体的微量痕量检测。
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