CN102167739A - 一种利用耐盐性混合模式吸附剂纯化人尿胰蛋白酶抑制剂的方法 - Google Patents
一种利用耐盐性混合模式吸附剂纯化人尿胰蛋白酶抑制剂的方法 Download PDFInfo
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Abstract
一种利用耐盐性混合模式吸附剂纯化人尿胰蛋白酶抑制剂的方法，方法步骤为：a.将人尿胰蛋白酶抑制剂粗品溶解在水中，使得过滤后电导不低于30ms/cm，将滤液pH调至2-5，接着用耐盐性混合模式吸附剂选择性吸附人尿胰蛋白酶抑制剂；b.利用pH为7-10的洗脱缓冲液对耐盐性混合模式吸附剂进行洗脱，收集人尿胰蛋白酶抑制剂的洗脱高峰；c.将收集的人尿胰蛋白酶抑制剂洗脱高峰进行冷冻干燥，即得到高纯度的人尿胰蛋白酶抑制剂。本发明的技术效果是：本发明的纯化方法具有纯化效率高，工艺步骤少，容易放大等特点，便于实现该技术的产业化应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种纯化人尿胰蛋白酶抑制剂的方法，尤其涉及一种利用耐盐性混合模式吸附剂纯化人尿胰蛋白酶抑制剂的方法。
背景技术
人尿胰蛋白酶抑制剂（Human urinary trypsin inhibitor,简称为HUTI），是一种从人尿中分离纯化的药用蛋白，对胰蛋白酶、纤溶酶、弹性蛋白酶等多种酶均具有抑制作用。1909年，Beurer等首次发现了在人尿中存在的一种对胰蛋白酶有抑制作用的蛋白，也由此命名为人尿胰蛋白酶抑制剂。直到1977年，科学家首次成功地从人尿中经分离纯化得到完整的HUTI分子。HUTI是由143个氨基酸组成的一种糖蛋白，N端和C端分别为丙氨酸和亮氨酸。HUTI分子量为37000~43000(SDS-PAGE电泳法)，等电点为2.5左右。HUTI具有抑制胰蛋白酶等多种酶的生理功能，这与HUTI自身的分子结构有关。HUTI具有多个功能结构域，其中Kunitz型结构域是其主要的活性结构域。
HUTI在临床上的应用最初是用于治疗急性胰腺炎，经过临床研究证明，HUTI对治疗胰腺炎具有良好的效果。HUTI的临床应用远不止于此，其多样的生物功能决定了其多样的临床应用价值。经研究发现：HUTI可参与细胞表达分泌调控；参与炎症反应的调控，局限炎症反应，帮助组织的修复；可改善休克时的循环状况，减少器官功能衰竭；手术时有预防细胞功能障碍和改善细胞能力代谢的作用；具有保护羊膜、抑制宫缩、防治早产和降低围产期死亡的作用；可降低肿瘤细胞的扩散能力和侵袭力，抑制肿瘤细胞的转移等。
由于HUTI在临床上的应用价值，人们一直在不断探索生产HUTI的新技术。当前，HUTI的制备工艺主要是使用阴离子交换层析法、阳离子交换层析法、疏水层析法、金属螯合层析法、凝胶层析法、亲和层析法或这几种方法得组合纯化HUTI，这些方法中有的工艺过于复杂，总收率非常低，有的则虽然工艺简单，但是具有不稳定或纯度不高等不足。因此，本领域的技术人员仍在不断地探索更好、更合理的纯化方法。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种利用耐盐性混合模式吸附剂纯化人尿胰蛋白酶抑制剂的方法，该方法适合在中高盐条件下实现对HUTI的有效吸附，通过改变流动相pH来实现HUTI的洗脱，可以避免对料液的预处理，提高纯化的效率。
本发明是这样来实现的，方法步骤为：
a.将人尿胰蛋白酶抑制剂粗品溶解在水中，使得过滤后电导不低于30ms/cm，用稀盐酸将滤液pH调至2-5，接着用耐盐性混合模式吸附剂装柱对人尿胰蛋白酶抑制剂进行静态吸附，再通过常规柱层析纯化方法洗脱并收集人尿胰蛋白酶抑制剂的洗脱高峰；
b.利用pH为7-10的洗脱缓冲液对耐盐性混合模式吸附剂进行洗脱，收集人尿胰蛋白酶抑制剂的洗脱高峰；
c.将收集的人尿胰蛋白酶抑制剂洗脱高峰进行冷冻干燥，即得到高纯度的人尿胰蛋白酶抑制剂。
所述耐盐性混合模式吸附剂的结构为为： 
耐盐性混合模式吸附剂的载体包括甲基丙烯酸聚合物、琼脂糖或纤维素。
所述耐盐性混合模式吸附剂的制备方法为：
a.活化：取甲基丙烯酸聚合物、琼脂糖或纤维素作载体，将载体与溶解于丙酮中的羰基二咪唑在30℃条件下搅拌反应，洗涤后抽干，得到活化的载体介质；
b.接臂：将活化的载体介质加入到氨基己酸溶液中30℃搅拌，进行缩合反应，得到氨基己酸-甲基丙烯酸聚合物复合物；
c.偶联：氨基己酸-载体介质复合物再与苯乙胺发生偶联反应，控制氨基己酸与苯乙胺的缩合反应，使得反应后羧基含量不低于30%，得到耐盐性混合模式吸附剂；
d. 上述氨基己酸溶液：1kg氨基己酸溶于1升 pH9.3 碳酸盐缓冲液；以上各步反应所用的试剂用量比例见下表：
| 载体基质 | 羰基二咪唑 | 氨基己酸 | 苯乙胺 |
| 1升 | 300-400克 | 800-1200克 | 12-18克 |
洗脱缓冲液为磷酸二氢钠溶液、磷酸氢二钠溶液、氢氧化钠溶液、碳酸钠溶液、碳酸氢钠溶液、氨水、铵盐溶液、氯化钠溶液的一种或若干种的混合物。
本发明的技术效果是：本发明的纯化方法具有纯化效率高，工艺步骤少，容易放大等特点，便于实现该技术的产业化应用。
具体实施方式
实施例1
（1） 耐盐性混合模式吸附层析介质的制备，步骤如下：
取1L甲基丙烯酸聚合物（Toyo-peal HW65，日本TOSOH公司产品），抽干去除防腐剂，用去离子水洗涤2-3次，抽干; 用将320克羰基二咪唑溶于1L丙酮制成羰基二咪唑（CDI）溶液，加入等体积洗好的甲基丙烯酸聚合物介质，30℃电动搅拌反应，冷却至室温；用丙酮清洗已活化的介质，再用去离子水洗涤2-3次后抽干，得到带有咪唑氨基甲酸盐活性基团的甲基丙烯酸聚合物。再加入到氨基己酸溶液（1kg氨基己酸溶于1L碳酸-碳酸钠缓冲液，pH9.3）中，30℃电动搅拌反应15h后，冷至室温，抽干，用0.5mol/L NaCl洗涤2-3次，去离子水洗涤2-3次，抽干，得到氨基己酸-甲基丙烯酸聚合物复合物，置于适量的水中；将12g的苯乙胺和16g偶联剂EDC.HCl同时加入到悬浮的胶中发生偶联反应，30℃搅拌8h后，用0.5mol/L NaCl洗涤2-3次，去离子水洗涤2-3次，抽干并保存在20%乙醇溶液中，得到目的纯化介质，即耐盐性混合模式吸附层析介质。
（2） 采用耐盐性混合模式吸附层析介质制备HUTI，步骤如下：
将HUTI粗品500g（效价为46IU/mg）按比例1:3溶解在1500ml水中，过滤后收集滤液，电导36ms/cm，用冰醋酸将滤液pH调至2-5。将（1）合成的耐盐性混合模式吸附剂填装层析柱，用pH2-5的0.2-0.4mol/L醋酸缓冲液平衡。然后将HUTI的滤液以1-2CV/h流速流过吸附剂。上样后用pH8.5，0.1 mol/L磷酸盐-0.35mol/L氯化钠缓冲液进行洗脱，收集HUTI洗脱高峰。将得到的HUTI洗脱流出液冷冻干燥24h，即得到高纯度的HUTI产品8.39g。经活性检测产品比活达4153IU/mg.p（凯氏定氮法测蛋白含量），总效价为19.3百万单位，活性回收率为83.9%。经HPLC法测定纯度为99.2%。
实施例2
（1） 耐盐性混合模式吸附层析介质的制备，步骤如下：
重复实施实例1（1），用琼脂糖（Sepharose CL 4B , GE公司产品）代替甲基丙烯酸聚合物同样操作，制得琼脂糖为载体基质的耐盐性混合模式吸附层析介质。
（2） 采用耐盐性混合模式吸附层析介质制备HUTI，步骤如下：
将HUTI粗品500g（效价为47IU/mg）按比例1:3溶解在1500ml水中，过滤后收集滤液，电导35ms/cm，用冰醋酸将滤液pH调至2-5。将（1）合成的耐盐性混合模式吸附剂填装层析柱，用pH2-5的0.2-0.4mol/L醋酸缓冲液平衡。然后将HUTI的滤液以1-2CV/h流速流过吸附剂。上样后用pH8.5，0.1 mol/L磷酸盐-0.35mol/L氯化钠缓冲液进行洗脱，收集HUTI洗脱高峰。将得到的HUTI洗脱流出液冷冻干燥24h，即得到高纯度的HUTI产品8.22g。经活性检测产品比活达4187IU/mg.p（凯氏定氮法测蛋白含量），总效价为19.6百万单位，活性回收率为83.4%。经HPLC法测定纯度为99.3%。
实施例3
（1） 耐盐性混合模式吸附层析介质的制备，步骤如下：
重复实施实例1（1），用纤维素（Cellufine GCL-2000 , 日本CHISSO公司产品）代替甲基丙烯酸聚合物同样操作，制得纤维素为载体基质的耐盐性混合模式吸附层析介质。
（2） 采用耐盐性混合模式吸附层析介质制备HUTI，步骤如下：
将HUTI粗品500g（效价为52IU/mg）按比例1:3溶解在1500ml水中，过滤后收集滤液，电导41ms/cm，用冰醋酸将滤液pH调至2-5。将（1）合成的耐盐性混合模式吸附剂填装层析柱，用pH2-5的0.2-0.4mol/L醋酸缓冲液平衡。然后将HUTI的滤液以1-2CV/h流速流过吸附剂。上样后用pH8.5，0.1 mol/L磷酸盐-0.35mol/L氯化钠缓冲液进行洗脱，收集HUTI洗脱高峰。将得到的HUTI洗脱流出液冷冻干燥24h，即得到高纯度的HUTI产品10.2g。经活性检测产品比活达4076IU/mg.p（凯氏定氮法测蛋白含量），总效价为21.1百万单位，活性回收率为81.2%。经HPLC法测定纯度为99.0%。
Claims (5)
1. 一种利用耐盐性混合模式吸附剂纯化人尿胰蛋白酶抑制剂的方法，其特征是方法步骤为：
a.将人尿胰蛋白酶抑制剂粗品溶解在水中，使得过滤后电导不低于30ms/cm，用稀盐酸将滤液pH调至2-5，接着用耐盐性混合模式吸附剂装柱对人尿胰蛋白酶抑制剂进行静态吸附，再通过常规柱层析纯化方法洗脱并收集人尿胰蛋白酶抑制剂的洗脱高峰；
b.利用pH为7-10的洗脱缓冲液对耐盐性混合模式吸附剂进行洗脱，收集人尿胰蛋白酶抑制剂的洗脱高峰；
c.将收集的人尿胰蛋白酶抑制剂洗脱高峰进行冷冻干燥，即得到高纯度的人尿胰蛋白酶抑制剂。
2.根据权利要求1所述的利用耐盐性混合模式吸附剂纯化人尿胰蛋白酶抑制剂的方法，其特征是所述耐盐性混合模式吸附剂的结构为为： 
。
3.根据权利要求1所述的利用耐盐性混合模式吸附剂纯化人尿胰蛋白酶抑制剂的方法，其特征是耐盐性混合模式吸附剂的载体包括甲基丙烯酸聚合物、琼脂糖或纤维素。
4.根据权利要求2所述的利用耐盐性混合模式吸附剂纯化人尿胰蛋白酶抑制剂的方法，其特征是所述耐盐性混合模式吸附剂的制备方法为：
a.活化：取甲基丙烯酸聚合物、琼脂糖或纤维素作载体，将载体与溶解于丙酮中的羰基二咪唑在30℃条件下搅拌反应，洗涤后抽干，得到活化的载体介质；
b.接臂：将活化的载体介质加入到氨基己酸溶液中30℃搅拌，进行缩合反应，得到氨基己酸-甲基丙烯酸聚合物复合物；
c.偶联：氨基己酸-载体介质复合物再与苯乙胺发生偶联反应，控制氨基己酸与苯乙胺的缩合反应，使得反应后羧基含量不低于30%，得到耐盐性混合模式吸附剂；
d. 上述氨基己酸溶液：1kg氨基己酸溶于1升 pH9.3 碳酸盐缓冲液；以上各步反应所用的试剂用量比例见下表：
5.根据权利要求1所述的利用耐盐性混合模式吸附剂纯化人尿胰蛋白酶抑制剂的方法，其特征是洗脱缓冲液为磷酸二氢钠溶液、磷酸氢二钠溶液、氢氧化钠溶液、碳酸钠溶液、碳酸氢钠溶液、氨水、铵盐溶液、氯化钠溶液的一种或若干种的混合物。
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