CN102159217B - 双环取代吡唑酮偶氮类衍生物的盐,及其制备方法和应用 - Google Patents

双环取代吡唑酮偶氮类衍生物的盐,及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

通式(I)所示的双环取代吡唑酮偶氮类衍生物药学上可接受的盐、其制备方法以及含有该药学上可接受盐的药物组合物、以及其作为治疗剂特别是作为血小板生成素(TPO)模拟物和血小板生成素受体激动剂的用途。通式(I)中的各取代基的定义与说明书中的定义相同。

Description

双环取代吡唑酮偶氮类衍生物的盐,及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种新的双环取代吡唑酮偶氮类衍生物药学上可接受的盐、其制备方法以及含有该药学上可接受盐的药物组合物、以及其作为治疗剂特别是作为血小板生成素(TPO)模拟物(mimetic)和血小板生成素受体激动剂的用途。
背景技术
血小板生成素(Thrombopoietin，TPO)，又称为巨核细胞生长发育因子(megakaryocyte growth and development factor，MGDF)，血小板生成刺激因子(thrombocytopoiesis stimulating factor，TSF)，c-Mpl配体(c-myeloproliferativeleukemia ligand，c-Mpl)，mpl配体，megapoietin，是一种与产生血小板有关的糖蛋白(Wendling，F.，et.al.，Biotherapy 10(4)：269-77(1998)；Kuter D.J.et al.，TheOncologist；1：98-106(1996)；Metcalf，Nature 369：519-520(1994))。
在某些情况下，TPO的活性源自TPO与TPO受体(也称MPL)的结合。TPO受体已经被成功克隆，也进行了氨基酸序列的测序(Vigon et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.，89：5640-5644(1992))。
TPO是一种332-氨基酸糖基化多肽，在调节巨核细胞生成和由骨髓巨核细胞产生血小板的过程中起着关键的作用(Kuter et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 91：11104-11108(1994)；Barley et al.，Cell 77：1117-1124(1994)；Kaushansky et al.，Nature369：568-571(1994)；Wendling et al.，Nature 369：571-574(1994)；and Sauvage et al.，Nature 369：533-538(1994))。TPO产生于肝脏但主要作用于骨髓，刺激干细胞分化成为巨核细胞以及巨核细胞的增殖，多倍体化，最重要的是进入血小板身体循环分裂。TPO在血小板减少症和大量关于增加血小板数量、大小、增加实验动物同位素参入血小板的研究中是一种主要的调节剂(Metcalf Nature 369：519-520(1994))。TPO被认为主要通过几个途径影响巨核细胞生成：(1)引起巨核细胞大小和数量的增加；(2)增加DNA内含物，多倍体的形式，巨核细胞；(3)增加巨核细胞的核内有丝分裂；(4)增加成熟的巨核细胞；(5)增加前体细胞的百分比，小乙酰胆碱酶-阳性形式的细胞，骨髓细胞。
血小板是血液凝固必需的，当它的数量非常低时，病人就有出血死亡的危险。因此，TPO已经被用于诊断和治疗多种血液疾病，如主要由血小板缺陷引起的疾病。同时，TPO可以用于治疗血小板减少症，尤其是为治疗癌症和淋巴瘤而进行的化疗、放疗和骨髓移植。
患者因血小板减少症而导致血小板水平恢复过慢是一个严重的问题，因此希望可以找到一种治疗血小板减少症的活性TPO类似物。这些多肽可以结合并活化TPO受体，但是不具备天然TPO的序列同源性。最近几年，一些小分子的活性TPO类似物被报导，包括环多胺衍生物(WO00/28987)，噻唑-2-基-苯酰胺类(WO01/07423，WO01/53267)，偶氮-芳基衍生物(WO00/35446，WO01/17349)，2-芳基-萘唑类(WO01/39773，WO01/53267)和缩氨基脲衍生物(WO01/34585)。基于细胞的体系内，所有这些分子都能活化细胞膜上的TPO受体的信号转导途径，一些类型能直接作用于TPO受体本身。这一系列中一些最优先的化合物被发现可以刺激TPO-responsive人类细胞系和低于100nM的人类骨髓培养液中的TPO的增殖和分化。
GSK公司在专利(WO-2003098992/WO-01089457)中报道血小板生成素类似物eltrombopag，并表现出了相当的活性。
本发明公开了一系列双环取代吡唑酮偶氮类衍生物药学上可接受的盐形式，是更有效TPO模拟物和TPO受体激动剂。
本申请的申请人于2009年1月4日提交的申请PCT/CN2009/000001保护了一类新型的双环取代吡唑酮偶氮类衍生物，以及其作为TPO模拟物和TPO受体激动剂的用途，其中公开的实施例1、实施例9、实施例15、实施例28、实施例43和实施例52，分别为2′-羟基-3′-[N′-(1-茚满-5-基-3-甲基-5-氧代-1，5-二氢吡唑-4-亚基)-肼基]-联苯基-3-羧酸、5-{2-羟基-3-[N′-(1-茚满-5-基-3-甲基-5-氧代-1，5-二氢吡唑-4-亚基)-肼基]-苯基}-呋喃-2-羧酸、5-(2-羟基-3-{N′-[3-甲基-5-氧代-1-(5，6，7，8-四氢萘-2-基)-1，5-二氢吡唑-4-亚基]-肼基}-苯基)-呋喃-2-羧酸、4-(2-羟基-3-{N′-[3-甲基-5-氧代-1-(5，6，7，8-四氢萘亚甲基-2-基)-1，5-二氢吡唑-4-亚基]-肼基}-苯基)-呋喃-2-羧酸、5-(3-{N′-[1-(3，3-二甲基茚满-5-基)-3-甲基-5-氧代-1，5-二氢吡唑-4-亚基]-肼基}-2-羟基苯)-呋喃-2-羧酸和4-{2-羟基-3-[N′-(1-茚满-5-基-3-甲基-5-氧代-1，5-二氢吡唑-4-亚基)-肼基]-苯}-噻吩-2-羧酸以及六个化合物的羧酸酯，试验证明其对TPO受体激动作用明显，因此将其内容整个作为本发明的参考文献。但是，国际申请PCT/CN2009/000001没有具体描述任何一个化合物的盐的形式。
本发明人发现双环取代吡唑酮偶氮类衍生物的游离酸在常规溶剂中溶解性差，不利于被制备成药用剂型，并且降低了化合物的体内生物利用度，因此迫切需要开发双环取代吡唑酮偶氮类衍生物的新形式，解决这类化合物溶解性差，药代吸收差的问题，以适合于常规制剂工艺。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供新颖的通式(I)所示的双环取代吡唑酮偶氮类衍生物药学上可接受的盐、其制备方法、包含该药学上可接受的盐的药物组合物以及其作为治疗剂特别是作为TPO模拟物和TPO受体激动剂的用途。该成盐形式具有治疗血小板减少症的优异活性，溶解度明显改善，且在动物体内的活性及其生物利用度良好，毒性低，适合于制备治疗血小板减少症的制剂。
“本发明的化合物”和“本发明的盐”可以互换使用，都是指通式(I)化合物所示的双环取代吡唑酮偶氮类衍生物药学上可接受的盐。
Figure GPA00001297548500051
其中：
Het选自苯基、呋喃基或噻吩基；
R1、R2、R3和R4各自独立地选自氢原子或烷基；
n为0、1或2；
所述的盐为碱加成盐。
进一步，本发明的化合物包括通式(IA)的化合物的盐
Figure GPA00001297548500052
其中：
Het选自苯基、呋喃基或噻吩基；
R1、R2、R3和R4各自独立地选自氢原子或烷基；
M选自金属离子、铵离子、胺类或碱性氨基酸；
m为1或2；
n为0、1或2；
所述的盐为碱加成盐。
“本发明游离酸”指通式(I)化合物所示的双环取代吡唑酮偶氮类衍生物。
所考虑的等价物——本领域普通技术人员将理解为，化合物(I)还可存在互变异构体的形式。化合物(I)的互变形式可包括但不限于由下式(II)和(III)表示的结构：
Figure GPA00001297548500061
所有这些互变形式包括在本发明范围内并固有地包括在化合物(I)定义中。
本发明中，所述的“药学上可接受的盐”是指在药学上无毒的碱加成盐。所述的盐为通式(I)化合物与合适的碱金属氢氧化物、碱性氨基酸、胺类或季铵类形成的盐，包括钠盐、锂盐、钾盐、钙盐、镁盐、精氨酸盐、赖氨酸盐、甲胺盐、二甲胺盐、三甲胺盐、乙胺盐、二乙胺盐、三乙胺盐、乙醇胺盐、哌嗪盐、二苄基乙二胺盐、葡甲胺、氨丁三醇盐、四甲基季铵盐、四乙基季铵盐或胆碱盐，优选为二乙胺盐、乙醇胺盐、胆碱盐、哌嗪盐、葡甲胺盐或氨丁三醇盐，更优选为乙醇胺盐、胆碱盐、葡甲胺盐或氨丁三醇盐，最优选为乙醇胺盐。
本发明通式(I)化合物的典型的药学上可接受的盐包括，但不限于：
Figure GPA00001297548500062
Figure GPA00001297548500081
本发明涉及通式(I)化合物药学上可接受的盐的制备方法，该方法包括：
(a)将本发明游离酸(通式(I)化合物)溶解或悬浮于有机溶剂，其中所述的有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯或四氢呋喃，优选为四氢呋喃；
(b)搅拌下加入碱，碱可以为有机碱或无机碱，例如碱金属或碱土金属氢氧化物、碱性氨基酸、胺类或季铵类；
(c)通式(I)化合物药学上可接受的盐。
其中所述的无机碱包括碱金属氢氧化物选自钠、锂、钾、钙、镁氢氧化物，所述的碱性氨基酸选自赖氨酸或精氨酸，所述的胺类选自甲胺、二甲胺、三甲胺、乙胺、二乙胺、三乙胺、乙醇胺、哌嗪、二苄基乙二胺、葡甲胺或氨丁三醇，所述的季铵类选自四甲基季铵、四乙基季铵或氢氧化胆碱，优选为二乙胺、乙醇胺、氢氧化胆碱、哌嗪、葡甲胺或氨丁三醇，更优选为乙醇胺、氢氧化胆碱、葡甲胺或氨丁三醇，最优选为乙醇胺。
优选地，步骤(b)中，游离酸与碱金属氢氧化物、碱性氨基酸、胺类或季铵类的当量比为1∶5～5∶1，优选为1∶1～1∶3，更优选为优选为1∶1～1∶2。
优选地，步骤(c)中，分离出制备的盐，包括从反应液中直接过滤出固体，将反应液减压浓缩得到固体产物粗品或用有机溶剂重结晶得到产物盐，然后干燥，如真空干燥或高温空气干燥。
上述制备过程可以在冷却、常温或者加热条件下进行，值得注意的是反应温度的选择对不同的成盐反应有一定的影响，这也是本领域技术人员技术所熟知的，本发明成盐反应温度为常温至所用溶剂的沸点，优选：0～40℃；本领域技术人员通过本领域常规的技术手段就能容易地确定具体成盐反应的最优选反应温度。
本发明涉及通式(I)所示化合物的药学上可接受的盐在制备TPO受体激动剂中的用途。
本发明涉及通式(I)所示化合物的药学上可接受的盐在制备治疗血小板减少症药物中的用途。包括联合使用治疗有效量的选自下列的药物：集落刺激因子、细胞因子、趋化因子、白细胞介素或细胞因子受体激动剂或拮抗剂、可溶的受体、受体激动剂或拮抗剂抗体或与一个或多个所述的药物具有相同的机理而起作用的肽或小分子类。
本发明涉及作为治疗血小板减少症药物的通式(I)所示化合物的药学上可接受的盐。所述药物进一步与选自下列的药物联合使用：集落刺激因子、细胞因子、趋化因子、白细胞介素或细胞因子受体激动剂或拮抗剂、可溶的受体、受体激动剂或拮抗剂抗体或与一个或多个与所述药物具有相同的作用机理的肽或小分子类物质。所述药物为口服药物剂型，或者所述药物为非肠胃药物剂型。
本发明还涉及一种治疗血小板减少症的方法，该方法包括给予需要治疗的患者有效治疗量的通式(I)所示化合物的药学上可接受的盐。所述的药学上可接受的盐进一步与选自下列的药物联合使用：集落刺激因子、细胞因子、趋化因子、白细胞介素或细胞因子受体激动剂或拮抗剂、可溶的受体、受体激动剂或拮抗剂抗体或与一个或多个与所述药物具有相同的作用机理的肽或小分子类物质。所述的药学上可接受的盐为口服药物剂型，或者所述的药学上可接受的盐为非肠胃药物剂型。
本发明涉及一种药物组合物，其包括药物有效量的通式(I)化合物药学上可接受的盐和药学上可接受的载体或稀释剂。该组合物可以进一步含有联合使用的治疗有效量的选自下列的药物：集落刺激因子、细胞因子、趋化因子、白细胞介素或细胞因子受体激动剂。该药物组合物在制备治疗血小板减少症药物的用途。所述的联合使用包括同时使用或者先后依次使用本发明所述的化合物。
本发明涉及一种制备含有有效量的通式(I)化合物及其药学上可以接受的盐和药学上可接受的载体或稀释剂的药物组合物的方法，该方法包括将通式(I)化合物与药用载体和稀释剂相结合。
在药物组合物的配制过程中，重要的是药物物质是一种可方便操作和处理的形式。不仅从获得商业上可行的制备方法的角度来说，而且从随后制备含该活性化合物的药物制剂的角度来说，这都是很重要的。
此外，在制备药物组合物的过程中，重要的是患者给药后，提供一种可靠的、可再现的和恒定的药物血浆浓度曲线。
活性成分的化学稳定性、固态稳定性和“储存寿命”同样是非常重要的因素。该药物物质乙基包含它的组合物应该优选能够有效地储存相当一段时间，而活性成分的物理化学特性(例如它的化学组成、密度、吸湿性和溶解度)没有表现出显著的变化。
此外，提供尽可能化学纯形式的药物同样是非常重要的。
本领域熟练技术人员可以理解，典型地，如果一种药物可以很容易地以稳定形式获得，例如稳定的晶型，那么可以提供如下优点：易于处理、易于制备合适的药物制剂以及具有可靠的溶解特征。
活性成分有效量是为有效无毒剂量，优选0.001～100mg/kg总体重的范围，更优选0.001～50mg/kg。当治疗需要TPO类似物治疗的患者时，优选口服或非肠胃给药包括局部、直肠、经皮、注射或持续输液。人类口服给药剂量优选包括0.05～3500mg活性成分，最优选0.5～1000mg活性成分。使用较低剂量的口服给药形式为优选。然而，在对患者安全方便时，也可以施用高剂量非肠胃给药。上述剂量涉及优选的以游离酸表示的活性成分的量。
本领域技术人员应当肯定，活性成分个体剂量的最佳给药数量及间隔视治疗疾病的性质及程度，给药剂型、途径及部位，治疗的具体患者而定，并且该最佳方案可通过常用技术确定。本领域技术人员也应当明白，最佳疗程，即既定时间内每天给予活性成分的剂量次数可经本领域技术人员使用常用的确定疗程的试验确定。
本发明的化合物可口服或非肠胃给药，可制成包括片剂、丸剂、粉剂及颗粒剂用于各种给药途径。在这些固体制剂中，活性成分至少与一种惰性稀释剂相混合。按照常规操作，口服制剂也可包括初惰性稀释剂以外的其他物质，如润滑剂、助流剂及抗氧化剂。若制成胶囊、片剂及丸剂，制剂中包括缓冲剂。片剂及丸剂还可制成持续释放剂型。
尽管也可采用乳剂的非水溶液，本发明的非肠胃给药制剂包括无菌水溶液。这些剂型也可包括佐剂，如防腐剂、润湿剂、渗透剂、缓冲剂、乳化剂及分散剂。其灭菌可采用细菌截留滤器(bacteriaretaining filter)过滤，向组合物中加入灭菌剂，照射组合物或加热组合物的方法灭菌。
本发明的盐与其游离酸相比，主要优点如下：
(1)本发明的盐在常规的溶剂，如水中、甲醇和0.1％盐酸中的溶解度明显增加，适用于常规制剂，其中乙醇胺盐在0.1％盐酸中溶解度明显改善。
(2)本发明的盐具有改善的稳定性的特性。
(3)本发明的盐具有更好的体外筛选生物活性。
(4)本发明的盐在动物体内药代动力学性质明显改善，易吸收，生物利用度高，有较好的药代动力学曲线，其中乙醇胺盐、胆碱盐、哌嗪盐、葡甲胺盐和氨丁三醇盐具有较好的药代动力学性质，优选为乙醇胺盐。
(5)本发明的盐以高收率、高纯度、快速、方便和低成本进行制备，其中乙醇胺盐、胆碱盐、二乙胺盐和哌嗪盐在工艺路线中有优势，可以直接析出晶体。
本发明的盐与其游离酸相比，其溶解度、稳定性、体外筛选活性和药代动力学等性质都明显改善，优选为二乙胺盐、乙醇胺盐、胆碱盐、哌嗪盐、葡甲胺盐和氨丁三醇盐，更优选为乙醇胺盐、胆碱盐、葡甲胺盐和氨丁三醇盐，最优选为乙醇胺盐。
发明的详细说明
除非有相反陈述，下列用在说明书和权利要求书中的术语具有下述含义。
“乙醇胺”指“2-氨基乙醇”。
“胆碱”指“(2-羟基乙基)三甲基铵”。
“葡甲胺”指“N-甲基-D-葡萄糖胺”。
“药物组合物”表示一种或多种本文所述化合物药学上可接受的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，其他组分例如生理学/药学上可接受的载体。药物组合物的目的是促进化合物对生物体的给药。
“稳定性”化学稳定性和固态稳定性。
“化学稳定性”包括标准储存条件下有可能以隔离形式或以掺合药学上可接受的载体或稀释剂后获得的制剂形式(例如以口服剂型，如片剂、胶囊等)储存本发明的化合物，具有微不足道程度的化学降解或分解。
“固态稳定性”包括标准储存条件下有可能以隔离固态形式或以掺合药学上可接受的载体或稀释剂后获得的固态剂型的形式(例如以口服剂型，如片剂、胶囊等)储存本发明的化合物，具有微不足道的固态转变(例如结晶、重结晶、固态相变、水合、脱水、溶剂化或脱溶剂化)。
“标准储存条件”的例子包括温度在-80℃至+50℃之间(优选在0℃至40℃之间，更优选在室温下，例如15℃-30℃)，压力在0.1帕至2帕之间(优选在大气压下)，相对湿度在5％至95％之间(优选10％-60％)和/或暴露于460勒克斯UV/可见光下，经历更长的时间(即大于或等于6个月)。
“非肠胃给药”包括静脉内、肌肉内、皮下、鼻腔内、直肠内、阴道内或腹膜内。通常优选口服给药。
药物的“引湿性”是指在一定温度及湿度条件下，该物质吸收水分能力或程度的特性。供试品为符合药品质量标准的固体原料药。试验结果可以作为选择适宜的药品包装和储存条件的参考。
本发明化合物的合成方法
为了完成本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
按照本申请的申请人于2009年1月4日提交的申请PCT/CN2009/000001实施例1、实施例9、实施例15、实施例28、实施例43和实施例52，所述的方法制备，因此将该内容作为参考文献。
通式(I)化合物药学上可接受的盐的制备方法，该方法包括：
(a)将本发明游离酸(通式(I)化合物)溶解或悬浮于有机溶剂中，其中所述的有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯或四氢呋喃，优选为四氢呋喃；
(b)搅拌下加入碱，碱可以为有机碱或无机碱，例如碱金属或碱土金属氢氧化物、碱性氨基酸、胺类或季铵类；
(c)得到通式(I)化合物药学上可接受的盐；
其中所述的无机碱包括碱金属氢氧化物选自钠、钾、钙、镁氢氧化物，所述的胺类或季铵类化合物选自四甲基季铵、四乙基季铵、乙醇胺、胆碱、赖氨酸、精氨酸、甲胺、二甲胺、三甲胺、乙胺、二乙胺、三乙胺、二苄基乙二胺、葡甲胺、哌嗪或氨丁三醇，优选为二乙胺、乙醇胺、氢氧化胆碱、哌嗪、葡甲胺或氨丁三醇，更优选为乙醇胺、氢氧化胆碱、葡甲胺或氨丁三醇，最优选为乙醇胺。
优选地，步骤(b)中，游离酸与碱的当量比为1∶5～5∶1，优选为1∶1～1∶3，更优选为优选为1∶1～1∶2。
优选地，步骤(c)中，包括从反应液中直接过滤出固体，将反应液减压浓缩得到固体产物粗品或用有机溶剂重结晶得到产物盐，然后干燥，如真空干燥或高温空气干燥。
上述制备过程可以在冷却、常温或者加热条件下进行，值得注意的是反应温度的选择对不同的成盐反应有一定的影响，这也是本领域技术人员技术所熟知的，本发明成盐反应温度为常温至所用溶剂的沸点，优选：0～40℃；本领域技术人员通过本领域常规的技术手段就能容易地确定具体成盐反应的最优选反应温度。
具体实施方式
以下实施例用于进一步描述本发明，但这些实施例并非限制着本发明的范围和精神实质。
实施例
化合物的结构是通过核磁共振(1H NMR)和/或质谱(MS)来确定的。
NMR的测定是用BrukerAVANCE-400核磁仪，测定溶剂为氘代甲醇(CD3OD)，氘代氯仿(CDCl3)，六氘代二甲基亚砜(DMSO-d6)，内标为四甲基硅烷(TMS)，化学位移是以10-6(ppm)作为单位给出；
MS的测定用FINNIGAN LCQAd(ESI)质谱仪(生产商：Thermo，型号：FinniganLCQ advantage MAX)；
EC50值的测定用NovoStar酶标仪(德国BMG公司)；
薄层硅胶使用烟台黄海HSGF254或青岛GF254硅胶板，薄层色谱法(TLC)使用的硅胶板采用的规格是0.15mm～0.2mm，薄层层析分离纯化产品采用的规格是0.4mm～0.5mm；
硅胶柱层析一般使用烟台黄海硅胶200～300目硅胶为载体；
HPLC测试使用安捷伦1200DAD高压液相色谱仪(Sunfire C18 150×4.6mm色谱柱)和Waters 2695-2996高压液相色谱仪(Gimini C18 150×4.6mm色谱柱)；
加压氢化反应使用Parr 3916EKX型氢化仪和清蓝QL型氢气发生器；微波反应使用CEM Discover-S 908860型微波反应器；
氢化反应通常抽真空，充入氢气，反复操作3次；
本发明的已知的起始原料可以采用或按照本领域已知的方法来合成，或可购买自ABCR GmbH&Co.KG，Acros Organics，Aldrich Chemical Company，韶远化学科技(Accela ChemBio Inc)、达瑞化学品等公司；
实施例中无特殊说明，反应均在氮气氛下进行；
氮气氛是指反应瓶连接一个约1L容积的氮气气球；
氢气氛是指反应瓶连接一个约1L容积的氢气气球；
实施例中无特殊说明，反应中的溶液是指水溶液；
TLC是指薄层色谱；
HPLC是指高效液相色谱；
HPLC测试条件：运行时间：30min柱温：30℃PDA：230nm
流动相：乙腈∶水(0.1％三氟醋酸)＝25∶75流速：1.0mL/分
色谱柱：C18，150*4.6mm Gemini
实施例1
(Z)-2′-羟基-3′-[N′-(1-茚满-5-基-3-甲基-5-氧代-1，5-二氢吡唑-4-亚基)-肼基]-联苯基 -3-羧酸二乙醇胺盐
Figure GPA00001297548500152
第一步
2-溴-6-硝基苯酚
将60mL浓硫酸稀释到186mL水中，冷却至室温后加入硝酸钠(79.2g，0.93mol)，保持25℃以下，滴加邻溴苯酚1a(60mL，0.52mol)，室温反应2小时。加入320mL乙酸乙酯溶解析出的固体，分别用水和饱和食盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥，过滤，滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法纯化所得残余物，得到2-溴-6-硝基苯酚1b(48.2g，黄色固体)。产率：42.8％。
MS m/z(ESI)：218[M+1]
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ11.18(s，1H)，8.12-8.15(m，1H)，7.89-7.91(m，1H)，6.88-7.02(m，1H)
第二步
1-溴-2-甲氧基-3-硝基苯
将2-溴-6-硝基苯酚1b(46.55g，0.214mol)溶解于500mL丙酮中，加入碳酸钾(35.36g，0.26mol)和碘甲烷(20.1mL，0.32mol)，70℃加热回流40小时。反应液减压浓缩，加入1300mL乙酸乙酯和500mL水，水相用乙酸乙酯萃取(300mL×2)，合并有机相，分别用4M盐酸和饱和碳酸氢钠溶液洗涤，用无水硫酸镁干燥，过滤，滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法纯化所得残余物，得到1-溴-2-甲氧基-3-硝基苯1c(44.59g，棕色固体)。产率：90.0％。
MS m/z(ESI)：234[M+1]
第三步
2′-甲氧基-3′-硝基联苯基-3-羧酸
将1-溴-2-甲氧基-3-硝基苯1c(23.25g，0.10mol)、3-羧基苯基硼酸(19.5g，117mmol)和四(三苯基膦)钯(8.86g，7.7mol)溶解于100mL 2M碳酸钠溶液和500mL1，4-二氧六环的混和溶剂中，105℃加热回流43小时。反应液减压浓缩，加入300mL 6M盐酸溶液和400mL乙酸乙酯，水相用乙酸乙酯萃取(200mL×2)，合并有机相，用无水硫酸镁干燥，过滤，滤液减压浓缩，得到2′-甲氧基-3′-硝基联苯基-3-羧酸1d(53.93g，浅黄色固体)。
MS m/z(ESI)：272[M-1]
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ8.11(s，1H)，8.02(d，J＝8.0Hz，1H)，7.90-7.92(m，1H)，7.82-7.84(m，1H)，7.21-7.75(m，1H)，7.63-7.67(m，1H)，7.42-7.46(m，1H)，3.45(s，3H)
第四步
2′-甲氧基-3′-氨基联苯基-3-羧酸
将2′-甲氧基-3′-硝基联苯基-3-羧酸1d(0.48g，1.74mmol)溶解于60mL乙醇中，加入0.5g钯-碳(10％)和甲酸铵(1.1g，17.4mmol)，80℃加热回流20分钟。过滤反应液，滤液减压浓缩，干燥，得到2′-甲氧基-3′-氨基联苯基-3-羧酸1e(0.42g，白色固体)。产率：93.3％。
MS m/z(ESI)：242[M-1]
第五步
3′-氨基-2′-羟基联苯基-3-羧酸氢溴酸盐
采用公知的方法(专利WO0189457)，将2′-甲氧基-3′-氨基联苯基-3-羧酸1e(2.5g，10.3mmol)溶解于100mL氢溴酸溶液(40％)中，120℃加热回流过夜。反应液减压浓缩，用硅胶柱色谱法纯化所得残余物，得到3′-氨基-2′-羟基联苯基-3-羧酸氢溴酸盐1f(2.4g，土黄色固体)，产率：88.8％。
MS m/z(ESI)：230[M+1]
第六步
5-肼基茚满
冰浴下将5-氨基茚满1g(3.59g，27.0mmol)溶解于20mL浓盐酸中，搅拌10分钟。滴加入10mL亚硝酸钠溶液(1.86g，27.0mmol)，冰浴下继续搅拌15分钟备用。
冰盐浴下将二水合氯化亚锡(24.4g，108.0mmol)溶解于10mL浓盐酸中，将备用中间体溶液加入其中，升至室温反应1.5小时。冰浴下用40％氢氧化钠溶液调pH＝9，加入400mL乙酸乙酯萃取，减压浓缩，干燥，得到5-肼基茚满1h(2.05g，红棕色固体)。产率：51.3％。
MS m/z(ESI)：149[M+1]
第七步
2-茚满-5-基-5-甲基-2，4-二氢吡唑-3-酮
将5-肼基茚满1h(2.05g，13.8mmol)溶解于50mL乙酸中，加入乙酰乙酸乙酯(1.76mL，13.8mmol)，加热至100℃过夜。反应液减压浓缩，用硅胶柱色谱法纯化所得残余物，得到2-茚满-5-基-5-甲基-2，4-二氢吡唑-3-酮1i(1.84g，黄色固体)。产率：62.3％。
MS m/z(ESI)：215[M+1]
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ7.69(s，1H)，7.60(d，J＝8.0Hz，1H)，7.24(d，J＝8.0Hz，1H)，3.44(s，2H)，2.90-2.97(m，4H)，3.21(s，3H)，2.07-2.14(m，2H)。
第八步
(Z)-2′-羟基-3′-[N′-(1-茚满-5-基-3-甲基-5-氧代-1，5-二氢吡唑-4-亚基)-肼基]-联苯基-3-羧酸
冰浴下将3′-氨基-2′-羟基联苯基-3-羧酸氢溴酸盐1f(267mg，1.16mmol)溶解于10mL1M盐酸中，滴加入10mL亚硝酸钠溶液(88mg，1.28mmol)的，再加入2-茚满-5-基-5-甲基-2，4-二氢吡唑-3-酮1i(249mg，1.16mmol)，用饱和碳酸氢钠溶液将反应液调节pH＝8，加入10mL乙醇，升至室温过夜。过滤反应液，干燥，用甲醇重结晶，得到标题产物(Z)-2′-羟基-3′-[N′-(1-茚满-5-基-3-甲基-5-羰基-1，5-二氢吡唑-4-亚基)-肼基]-联苯基-3-羧酸1j(60mg，黄色固体)。产率：11.4％。
MS m/z(ESI)：453[M-1]
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ13.76(br.s，1H)，13.03(br.s，1H)，9.66(br.s，1H)，8.13(s，1H)，7.96-7.98(d，J＝8.1Hz，1H)，7.60-7.82(m，5H)，7.28-7.30(d，J＝8.1Hz，1H)，7.13-7.17(m，2H)，2.86-2.93(m，4H)，2.34(s，3H)，2.03-2.10(m，2H)
第九步
(Z)-2′-羟基-3′-[N′-(1-茚满-5-基-3-甲基-5-氧代-1，5-二氢吡唑-4-亚基)-肼基]-联苯基-3-羧酸二乙醇胺盐
将(Z)-2′-羟基-3′-[N′-(1-茚满-5-基-3-甲基-5-羰基-1，5-二氢吡唑-4-亚基)-肼基]-联苯基-3-羧酸1j(454mg，1.0mmol)溶解于16mL四氢呋喃中，搅拌下加入乙醇胺(143mg，2.35mmol)，反应液在室温搅拌3小时。过滤，滤饼用四氢呋喃洗涤(2mL×3)，真空下干燥，得到标题产物(Z)-2′-羟基-3′-[N′-(1-茚满-5-基-3-甲基-5-羰基-1，5-二氢吡唑-4-亚基)-肼基]-联苯基-3-羧酸二乙醇胺盐1(553mg，暗红色固体)。
产率：96.0％。
MS m/z(ESI)：453[M-1]
1H NMR(400MHz，CD3OD)：δ8.13(s，1H)，7.92(d，J＝7.6Hz，1H)，7.69(m，3H)，7.61(d，J＝8.0Hz，1H)，7.45(t，J＝7.6Hz，1H)，7.25(d，J＝8.0Hz，1H)，7.17(d，J＝8.0Hz，1H)，6.98(t，J＝8.0Hz，1H)，3.65(t，J＝5.2Hz，4H)，2.95(m，4H)，2.86(t，J＝5.2Hz，4H)，2.41(s，3H)，2.12(m，2H)
实施例2
(Z)-2′-羟基-3′-[N′-(1-茚满-5-基-3-甲基-5-氧代-1，5-二氢吡唑-4-亚基)-肼基]-联苯基 -2-羧酸二(二乙胺)盐
将(Z)-2′-羟基-3′-[N′-(1-茚满-5-基-3-甲基-5-氧代-1，5-二氢吡唑-4-亚基)-肼基]-联苯基-3-羧酸1j(150mg，0.33mmol)溶于5mL四氢呋喃中，呈暗红色悬浊液，搅拌下滴加二乙胺(48mg，0.66mmol)，呈紫红色溶液，室温下反应2小时。反应液中有固体析出，过滤，滤饼用四氢呋喃洗涤(1mL×3)，得到的固体在真空下干燥，得到标题产物(Z)-2′-羟基-3′-[N′-(1-茚满-5-基-3-甲基-5-氧代-1，5-二氢吡唑-4-亚基)-肼基]-联苯基-3-羧酸二(二乙胺)盐2(132mg，红色固体)，产率：66.7％。
HPLC：99.2％
MS m/z(ESI)：452.9[M-1]
1H NMR(400MHz，CD3OD)：δ8.08(m，1H)，7.94(d，J＝7.6Hz，1H)，7.72(m，2H)，7.62(m，2H)，7.55(m，1H)，7.25(d，J＝8.4Hz，1H)，7.14(d，J＝8.4Hz，1H)，7.07(m，1H)，2.89-2.98(m，12H)，2.38(s，3H)，2.09-2.14(m，2H)，1.34(m，12H)
实施例3
(Z)-2′-羟基-3′-[N′-(1-茚满-5-基-3-甲基-5-氧代-1，5-二氢吡唑-4-亚基)-肼基]-联苯基 -3-羧酸二哌嗪盐
Figure GPA00001297548500182
将(Z)-2′-羟基-3′-[N′-(1-茚满-5-基-3-甲基-5-氧代-1，5-二氢吡唑-4-亚基)-肼基]-联苯基-3-羧酸1j(150mg，0.33mmol)溶于5mL四氢呋喃中，呈暗红色悬浊液，搅拌下加入哌嗪(57mg，0.66mmol)，呈紫红色溶液，室温下搅拌2小时。反应液中有固体析出，过滤，滤饼用四氢呋喃洗涤(1mL×3)，得到的固体在真空下干燥，得到标题产物(Z)-2′-羟基-3′-[N′-(1-茚满-5-基-3-甲基-5-氧代-1，5-二氢吡唑-4-亚基)-肼基]-联苯基-3-羧酸二哌嗪盐3(130mg，暗红色固体)，产率：62.8％。
HPLC：98.5％
MS m/z(ESI)：452.8[M-1]
1H NMR(400MHz，CD3OD)：δ8.10(s，1H)，7.92(d，J＝7.6Hz，1H)，7.68(m，3H)，7.61(m，1H)，7.43(m，1H)，7.24(d，J＝8.0Hz，1H)，7.15(m，1H)，7.00(m，1H)，2.89-2.95(m，4H)，2.84(s，16H)，2.39(s，3H)，2.09-2.12(m，2H)
实施例4
(Z)-5-(3-{N′-[1-(3，3-二甲基茚满-5-基)-3-甲基-5-氧代-1，5-二氢吡唑-4-亚基]-肼 基}-2-羟基苯)-呋喃-2-羧酸二乙醇胺盐
Figure GPA00001297548500192
第一步
1-(3，3-二甲基茚满-5-基)肼基-1，2-二羧酸二叔丁酯
将6-溴-1，1-二甲基茚满(采用公知的方法：专利WO2005066115制备而得)4a(4.32g，19.27mmol)溶解于40mL四氢呋喃中，-78℃下滴加丁基锂(15.67mL，1.6M，25.05mmol)，反应40分钟，加入偶氮二甲酸二叔丁酯(5.32g，23.12mmol)的30mL四氢呋喃溶液，-78℃下继续反应3小时。在反应液中加入5mL甲醇，升至室温，用硅胶过滤，滤液减压浓缩，用硅胶柱层析分离纯化所得残留物，得到1-(3，3-二甲基茚满-5-基)肼基-1，2-二羧酸二叔丁酯5b(2.70g，黄色固体)。产率：37.2％。
第二步
2-(3，3-二甲基茚满-5-基)-5-甲基-2，4-二氢吡唑-3-酮
将1-(3，3-二甲基茚满-5-基)肼基-1，2-二羧酸二叔丁酯4b(2.70g，7.18mmol)溶解于100mL乙酸中，加入20mL三氟乙酸，室温反应2小时，加入乙酰乙酸乙酯(0.98g，7.54mmol)，加热至100℃反应2小时。将反应液冷却至室温，减压浓缩除去乙酸，用饱和碳酸氢钠溶液中和反应液中的酸，用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，用硅胶柱色谱法纯化所得残余物，得到2-(3，3-二甲基茚满-5-基)-5-甲基-2，4-二氢吡唑-3-酮5c(1.0g，淡褐色固体)。产率：47.7％。
MS m/z(ESI)：243[M+1]
第三步
2-(2-甲氧基-3-硝基苯基)-4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂戊硼烷
将1-溴-2-甲氧基-3-硝基苯1c(67g，289mmol)、4，4，4’，4’，5，5，5’，5’-八甲基-2，2’-联-1，3，2-硼酸乙二醇酯(110g，433mmol)、四(三苯基膦)钯(11.80g，14.44mmol)和乙酸钾(71g，724mmol)溶解于600mL乙二醇二甲醚中，加热回流17小时。反应液减压浓缩，用硅胶柱层析分离纯化所得残余物，得到2-(2-甲氧基-3-硝基苯基)-4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂戊硼烷4d(50.5g，黄色晶体)。产率：61.9％。
第四步
5-(2-甲氧基-3-硝基苯基)-呋喃-2-羧酸
将2-(2-甲氧基-3-硝基苯基)-4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂戊硼烷4d(10g，35.85mmol)、5-溴-呋喃-2-羧酸(5.47g，28.66mmol)、四(三苯基膦)钯(2.07g，1.79mmol)和碳酸钠(7.60g，71.66mmol)溶解于200mL 1，4-二氧六环和30mL水的混合溶剂中，加热回流2.5小时。过滤，滤液减压浓缩，向残余物中加入150mL水，用1M盐酸酸化至pH＝3，过滤，固体用50mL正己烷和乙酸乙酯的混合溶剂(V∶V＝1/1)洗涤，干燥，得到5-(2-甲氧基-3-硝基苯基)-呋喃-2-羧酸4e(4.23g，灰白色固体)。产率：56.1％。
MS m/z(ESI)：262[M-1]
第五步
5-(3-氨基-2-甲氧基-苯基)-呋喃-2-羧酸
将5-(2-甲氧基-3-硝基苯基)-呋喃-2-羧酸4e(4.23g，16.09mmol)溶解于125mL乙酸乙酯中，再加入423mg钯-碳(10％)和甲酸铵(4.054g，64.35mmol)，加热回流3.5小时。反应液减压浓缩，用硅胶柱色谱法纯化所得残余物，得到5-(3-氨基-2-甲氧基-苯基)-呋喃-2-羧酸4f(2.79g，淡绿色固体)，产率：74.4％。
MS m/z(ESI)：232[M-1]
第六步
5-(3-氨基-2-羟基苯基)-呋喃-2-羧酸氢溴酸盐
将5-(3-氨基-2-甲氧基-苯基)-呋喃-2-羧酸4f(2.79g，11.97mmol)溶解于25mL二氯甲烷中，滴加入三溴化硼(23.9mL，2.0M)，室温反应1小时。加入5mL甲醇，减压浓缩，向残余物中加入100mL乙酸乙酯，搅拌1小时，过滤，收集固体，干燥，得到5-(3-氨基-2-羟基苯基)-呋喃-2-羧酸氢溴酸盐4g(1.24g，黄色固体)。产率：47.2％。
MS m/z(ESI)：218[M-1]
第七步
(Z)-5-(3-{N′-[1-(3，3-二甲基茚满-5-基)-3-甲基-5-氧代-1，5-二氢吡唑-4-亚基]-肼基}-2-羟基苯)-呋喃-2-羧酸
冰浴下将5-(3-氨基-2-羟基苯基)-呋喃-2-羧酸氢溴酸盐4g(333mg，1.1mmol)溶解于盐酸(3.7mL，1M)中，滴加入1.5mL亚硝酸钠溶液(85mg，1.22mmol)，反应20分钟，再加入2-(3，3-二甲基茚满-5-基)-5-甲基-2，4-二氢吡唑-3-酮5c(242mg，1.0mmol)，分批加入碳酸氢钠(1.4g，16.67mmol)和3mL乙醇，室温反应过夜。过滤，固体加入20mL水，用浓盐酸调节pH值至3～4，过滤出固体，固体干燥后经柱层析得到标题产物(Z)-5-(3-{N′-[1-(3，3-二甲基茚满-5-基)-3-甲基-5-氧代-1，5-二氢吡唑-4-亚基]-肼基}-2-羟基苯)-呋喃-2-羧酸4h(190mg，红色固体)，产率：40.3％。
MS m/z(ESI)：470.9[M-1]
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ13.74(br.s，1H)，13.15(br.s，1H)，9.99(br.s，1H)，7.71(m，3H)，7.55(d，J＝6.8Hz，1H)，7.37(d，J＝3.6Hz，1H)，7.20(m，2H)，7.15(m，1H)，2.86(t，J＝7.2Hz，2H)，2.33(s，3H)，1.92(t，J＝7.2Hz，2H)，1.26(s，6H)
第八步
(Z)-5-(3-{N′-[1-(3，3-二甲基茚满-5-基)-3-甲基-5-氧代-1，5-二氢吡唑-4-亚基]-肼基}-2-羟基苯)-呋喃-2-羧酸二乙醇胺盐
将(Z)-5-(3-{N′-[1-(3，3-二甲基茚满-5-基)-3-甲基-5-氧代-1，5-二氢吡唑-4-亚基]-肼基}-2-羟基苯)-呋喃-2-羧酸4h(2.3g，4.87mmol)溶解于20mL四氢呋喃中，搅拌下加入乙醇胺(594mg，9.75mmol)，反应液在室温搅拌1小时。过滤，滤饼用四氢呋喃洗涤(1mL×3)，真空下干燥，得到标题产物(Z)-5-(3-{N′-[1-(3，3-二甲基茚满-5-基)-3-甲基-5-氧代-1，5-二氢吡唑-4-亚基]-肼基}-2-羟基苯)-呋喃-2-羧酸二乙醇胺盐4(2.5g，黑色固体)。产率：86.4％。
MS m/z(ESI)：470.8[M-1]
1H NMR(400MHz，CD3OD)：δ7.57(m，4H)，7.19(m，1H)，7.03(d，J＝3.6Hz，1H)，6.95(d，J＝3.6Hz，1H)，6.71(t，J＝8.0Hz，1H)，3.73(t，J＝5.2Hz，4H)，2.98(m，4H)，2.88(t，J＝7.2Hz，2H)，2.36(s，3H)，1.96(t，J＝7.2Hz，2H)，1.29(s，6H)
实施例5
(Z)-5-(3-{N′-[1-(3，3-二甲基茚满-5-基)-3-甲基-5-氧代-1，5-二氢吡唑-4-亚基]-肼 基}-2-羟基苯)-呋喃--羧酸二(二乙胺)盐
Figure GPA00001297548500221
将(Z)-5-(3-{N′-[1-(3，3-二甲基茚满-5-基)-3-甲基-5-氧代-1，5-二氢吡唑-4-亚基]-肼基}-2-羟基苯)-呋喃-2-羧酸4h(150mg，0.32mmol)溶于5mL四氢呋喃中，呈暗红色悬浊液，搅拌下加入二乙胺(46mg，0.63mmol)，呈紫红色溶液，室温下搅拌过夜。将反应液在减压下浓缩，残留物通过硅胶层析进一步分离纯化(正己烷∶乙酸乙酯＝10∶1)，得到的固体在真空下干燥，得到标题产物(Z)-5-(3-{N′-[1-(3，3-二甲基茚满-5-基)-3-甲基-5-氧代-1，5-二氢吡唑-4-亚基]-肼基}-2-羟基苯)-呋喃-2-羧酸二(二乙胺)盐5(170mg，暗红色固体)。产率：86.7％。
HPLC：94.6％
MS m/z(ESI)：471.9[M-1]
1H NMR(400MHz，CD3OD)：δ7.60(m，4H)，7.19(m，1H)，7.04(m，1H)，6.87(m，2H)，2.98(q，J＝7.2Hz，8H)，2.89(t，J＝7.2Hz，2H)，2.36(s，3H)，1.96(t，J＝7.2Hz，2H)，1.27(t，J＝7.2Hz，12H)，1.25(s，6H)
实施例6
(Z)-5-(3-{N′-[1-(3，3-二甲基茚满-5-基)-3-甲基-5-氧代-1，5-二氢吡唑-4-亚基]-肼 基}-2-羟基苯)-呋喃-2-羧酸二哌嗪盐
Figure GPA00001297548500222
将(Z)-5-(3-{N′-[1-(3，3-二甲基茚满-5-基)-3-甲基-5-氧代-1，5-二氢吡唑-4-亚基]-肼基}-2-羟基苯)-呋喃-2-羧酸4h(150mg，0.32mmol)溶于5mL四氢呋喃中，呈暗红色悬浊液，搅拌下加入哌嗪(55mg，0.64mmol)，呈紫红色溶液，室温下搅拌过夜。滤饼用四氢呋喃洗涤(1mL×3)，得到的固体在真空下干燥，得到标题产物(Z)-5-(3-{N′-[1-(3，3-二甲基茚满-5-基)-3-甲基-5-氧代-1，5-二氢吡唑-4-亚基]-肼基}-2-羟基苯)-呋喃-2-羧酸二哌嗪盐6(158mg，红色固体)。产率：77.1％。
HPLC：99.28％
MS m/z(ESI)：471.8[M-1]
1H NMR(400MHz，CD3OD)：δ7.64-7.66(m，3H)，7.55(d，J＝8.0Hz，1H)，7.21(d，J＝8.0Hz，1H)，7.04(m，1H)，6.87-6.88(m，2H)，3.01(s，16H)，2.90(t，J＝7.2Hz，2H)，2.38(s，3H)，1.97(t，J＝7.2Hz，2H)，1.29(s，6H)
实施例7
(Z)-5-(2-羟基-3-{N′-[3-甲基-5-氧代-1-(5，6，7，8-四氢萘-2-基)-1，5-二氢吡唑-4-亚基]- 肼基}-苯基)-呋喃-2-羧酸二乙醇胺盐
Figure GPA00001297548500231
Figure GPA00001297548500232
第一步
2-肼基-5，6，7，8-四氢萘
冰浴下将2-氨基-5，6，7，8-四氢萘7a(3.68g，25.0mmol)溶解于20mL浓盐酸中，搅拌10分钟。滴加入10mL亚硝酸钠溶液(1.72g，25.0mmol)，冰浴下继续搅拌15分钟备用。
冰盐浴下将二水合氯化亚锡(22.6g，100mmol)溶解于10mL浓盐酸中，将备用中间体溶液加入其中，升至室温反应1.5小时。冰浴下用40％氢氧化钠溶液调pH＝9，加入400mL乙酸乙酯萃取，减压浓缩，干燥，得到2-肼基-5，6，7，8-四氢萘7b(2.19g，黄色油状液体)。产率：53.7％。
MS m/z(ESI)：163[M+1]
第二步
5-甲基-2-(5，6，7，8-四氢萘-2-基)-2，4-二氢吡唑-3-酮
将2-肼基-5，6，7，8-四氢萘7b(2.0g，12.3mmol)溶解于50mL乙酸中，再加入乙酰乙酸乙酯(1.57mL，12.3mmol)，加热至100℃过夜。反应液减压浓缩，用硅胶柱色谱法纯化所得残余物，得到5-甲基-2-(5，6，7，8-四氢萘-2-基)-2，4-二氢吡唑-3-酮7c(1.58g，无色油状液体)。产率：56.2％。
MS m/z(ESI)：457[2M+1]
1H NMR(CDCl3)：δ7.54-7.58(m，2H)，7.09(d，J＝8Hz，1H)，3.43(s，2H)，2.77-2.81(m，4H)，2.21(s，3H)，1.80-1.83(m，4H).
第三步
(Z)-5-(2-羟基-3-{N′-[3-甲基-5-氧代-1-(5，6，7，8-四氢萘-2-基)-1，5-二氢吡唑-4-亚基]-肼基}-苯基)-呋喃-2-羧酸
冰浴下将5-(3-氨基-2-羟基苯基)-呋喃-2-羧酸氢溴酸盐4g(292mg，0.98mmol)溶解于3.3mL 1M盐酸中，滴加入1.3mL亚硝酸钠溶液(74mg，1.07mmol)，搅拌20分钟，再加入5-甲基-2-(5，6，7，8-四氢萘-2-基)-2，4-二氢吡唑-3-酮7c(200mg，0.88mmol)，分批加入饱和碳酸氢钠溶液(1.226g，14.6mmol)调节pH＝8～9，用2mL乙醇淬灭气泡，升至室温反应过夜。过滤，固体用20mL水溶解，搅拌均匀，用浓盐酸调节pH＝3～4，过滤，干燥，粗品用HPLC分离纯化，得到标题产物(Z)-5-(2-羟基-3-{N′-[3-甲基-5-氧代-1-(5，6，7，8-四氢萘-2-基)-1，5-二氢吡唑-4-亚基]-肼基}-苯基)-呋喃-2-羧酸7d(160mg，红色固体)。产率：39.8％。
MS m/z(ESI)：457[M-1]
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ7.71(d，J＝8.4Hz，1H)，7.63(m，2H)，7.56(d，J＝7.6Hz，1H)，7.37(d，J＝3.2Hz，1H)，7.22(t，J＝8.0Hz，1H)，7.13(m，2H)，2.75(m，4H)，2.33(s，3H)，1.76(m，4H)
第四步
(Z)-5-(2-羟基-3-{N′-[3-甲基-5-氧代-1-(5，6，7，8-四氢-萘-2-基)-1，5-二氢吡唑-4-亚基]-肼基}-苯基)-呋喃-2-羧酸二乙醇胺盐
将(Z)-5-(2-羟基-3-{N′-[3-甲基-5-氧代-1-(5，6，7，8-四氢萘-2-基)-1，5-二氢吡唑-4-亚基]-肼基}-苯基)-呋喃-2-羧酸7d(3.3g，7.2mmol)溶于15mL四氢呋喃中，缓慢滴加乙醇胺(0.88g，13mmol)，15～20℃下搅拌1.5小时，有大量固体析出。过滤，滤饼用四氢呋喃洗涤(10mL×3)，得到的固体在真空下干燥，得到标题产物(Z)-5-(2-羟基-3-{N′-[3-甲基-5-氧代-1-(5，6，7，8-四氢萘-2-基)-1，5-二氢吡唑-4-亚基]-肼基}-苯基)-呋喃-2-羧酸二乙醇胺盐7(3g，暗红色固体)，产率：74％。
HPLC：99.3％
MS m/z(ESI)：456.8[M-1]
1H NMR(400MHz，CH3OD)：δ7.51(d，J＝8.0Hz，1H)，7.44-7.46(m，3H)，6.93-6.98(m，2H)，6.88(d，J＝3.6Hz，1H)，6.67(t，J＝8.0Hz，1H)，3.61(t，J＝5.2Hz，4H)，2.86(t，J＝5.2Hz，4H)，2.65-2.70(m，4H)，2.24(s，3H)，1.70-1.72(s，3H)
实施例8
(Z)-5-(2-羟基-3-{N′-[3-甲基-5-氧代-1-(5，6，7，8-四氢-萘-2-基)-1，5-二氢吡唑-4-亚基]- 肼基}-苯基)-呋喃-2-羧酸二胆碱盐
Figure GPA00001297548500251
将(Z)-5-(2-羟基-3-{N′-[3-甲基-5-氧代-1-(5，6，7，8-四氢萘-2-基)-1，5-二氢吡唑-4-亚基]-肼基}-苯基)-呋喃-2-羧酸7d(100mg，0.22mmol)溶于5mL四氢呋喃中，呈暗红色悬浊液，搅拌下滴加45％氢氧化胆碱甲醇溶液(45mg，0.44mmol)，呈紫红色溶液，室温下搅拌1小时。反应液中有固体析出，过滤，滤饼用四氢呋喃洗涤(1mL×3)，得到的固体在真空下干燥，得到标题产物(Z)-5-(2-羟基-3-{N′-[3-甲基-5-氧代-1-(5，6，7，8-四氢-萘-2-基)-1，5-二氢吡唑-4-亚基]-肼基}-苯基)-呋喃-2-羧酸二胆碱盐8(140mg，暗红色固体)，产率：96.6％。
HPLC：98.82％
MS m/z(ESI)：457.8[M-1]
1H NMR(400M Hz，CD3OD)：δ7.74(d，J＝8.0Hz，1H)，7.60(m，3H)，7.08(m，3H)，6.91(t，J＝8.0Hz，1H)，3.96(m，4H)，3.45(t，J＝4.8Hz，4H)，3.18(s，18H)，2.80(m，4H)，2.38(s，3H)，1.84(m，4H)
实施例9
(Z)-5-(2-羟基-3-{N′-[3-甲基-5-氧代-1-(5，6，7，8-四氢-萘-2-基)-1，5-二氢吡唑-4-亚基]- 肼基}-苯基)-呋喃-2-羧酸二(二乙胺)盐
Figure GPA00001297548500252
将(Z)-5-(2-羟基-3-{N′-[3-甲基-5-氧代-1-(5，6，7，8-四氢萘-2-基)-1，5-二氢吡唑-4-亚基]-肼基}-苯基)-呋喃-2-羧酸7d(100mg，0.22mmol)溶于5mL四氢呋喃中，呈暗红色悬浊液，搅拌下滴加二乙胺(32mg，0.44mmol)，呈紫红色溶液，室温下搅拌过夜。反应液中有固体析出，过滤，滤饼用四氢呋喃洗涤(1mL×3)，得到的固体在真空下干燥，得到标题产物(Z)-5-(2-羟基-3-{N′-[3-甲基-5-氧代-1-(5，6，7，8-四氢-萘-2-基)-1，5-二氢吡唑-4-亚基]-肼基}-苯基)-呋喃-2-羧酸二(二乙胺)盐9(77mg，暗红色固体)，产率：58.3％。
HPLC：99.1％
MS m/z(ESI)：457.9[M-1]
1H NMR(400MHz，CD3OD)：δ7.59(m，4H)，7.08(d，J＝8.0Hz，1H)，7.04(d，J＝3.6Hz，1H)，6.94(d，J＝3.6Hz，1H)，6.82(t，J＝8.0Hz，1H)，2.99(q，J＝7.2Hz，8H)，2.79(m，4H)，2.36(s，3H)，1.82(t，J＝3.2Hz，4H)，1.27(t，J＝7.2Hz，12H)
实施例10
(Z)-5-(2-羟基-3-{N′-[3-甲基-5-氧代-1-(5，6，7，8-四氢-萘-2-基)-1，5-二氢吡唑-4-亚基]- 肼基}-苯基)-呋喃-2-羧酸二葡甲胺盐
将(Z)-5-(2-羟基-3-{N′-[3-甲基-5-氧代-1-(5，6，7，8-四氢萘-2-基)-1，5-二氢吡唑-4-亚基]-肼基}-苯基)-呋喃-2-羧酸7d(100mg，0.22mmol)悬浮于5mL四氢呋喃中，呈暗红色悬浊液，搅拌下加入葡甲胺(85mg，0.44mmol)，室温下搅拌过夜。在溶液中加入4mL甲醇，减压下浓缩，得到标题产物(Z)-5-(2-羟基-3-{N′-[3-甲基-5-氧代-1-(5，6，7，8-四氢-萘-2-基)-1，5-二氢吡唑-4-亚基]-肼基}-苯基)-呋喃-2-羧酸二N-甲基葡萄糖胺盐10(168mg，暗红色固体)，产率：90.8％。
HPLC：97.7％
MS m/z(ESI)：457.8[M-1]
1H NMR(400MHz，CD3OD)：δ7.56(m，4H)，7.06(m，2H)，6.98(d，J＝3.2Hz，1H)，6.75(t，J＝7.6Hz，1H)，4.08(m，2H)，3.81(m，2H)，3.77(m，2H)，3.63(m，6H)，3.11(m，4H)，2.76(m，4H)，2.64(s，6H)，2.33(s，3H)，1.79(m，4H)
实施例11
(Z)-5-(2-羟基-3-{N′-[3-甲基-5-氧代-1-(5，6，7，8-四氢-萘-2-基)-1，5-二氢吡唑-4-亚基]- 肼基}-苯基)-呋喃-2-羧酸二哌嗪盐
Figure GPA00001297548500271
将(Z)-5-(2-羟基-3-{N′-[3-甲基-5-氧代-1-(5，6，7，8-四氢萘-2-基)-1，5-二氢吡唑-4-亚基]-肼基}-苯基)-呋喃-2-羧酸7d(100mg，0.22mmol)溶于5mL四氢呋喃中，呈暗红色悬浊液，搅拌下加入哌嗪(37mg，0.44mmol)，呈紫红色溶液，室温下搅拌2小时。反应液中有固体析出，过滤，滤饼用四氢呋喃洗涤(1mL×3)，得到的固体在真空下干燥，得到标题产物(Z)-5-(2-羟基-3-{N′-[3-甲基-5-氧代-1-(5，6，7，8-四氢-萘-2-基)-1，5-二氢吡唑-4-亚基]-肼基}-苯基)-呋喃-2-羧酸二哌嗪盐11(120mg，暗红色固体)，产率：87.6％。
HPLC：98.8％
MS m/z(ESI)：457.8[M-1]
1H NMR(400MHz，CD3OD)：δ7.59(m，4H)，7.08(d，J＝8.0Hz，1H)，7.04(d，J＝3.2Hz，1H)，6.87(d，J＝3.2Hz，1H)，6.82(t，J＝8.0Hz，1H)，3.00(s，16H)，2.78(m，4H)，2.36(s，3H)，1.81(m，4H)
实施例12
(Z)-5-(2-羟基-3-{N′-[3-甲基-5-氧代-1-(5，6，7，8-四氢-萘-2-基)-1，5-二氢吡唑-4-亚基]-肼基}-苯基)-呋喃-2-羧酸二氨丁三醇盐
将(Z)-5-(2-羟基-3-{N′-[3-甲基-5-氧代-1-(5，6，7，8-四氢萘-2-基)-1，5-二氢吡唑-4-亚基]-肼基}-苯基)-呋喃-2-羧酸7d(100mg，0.22mmol)溶于5mL四氢呋喃中，呈暗红色悬浊液，搅拌下加入氨丁三醇(53mg，0.44mmol)，呈褐色溶液，室温下搅拌过夜。反应液中有固体析出，过滤，滤饼用四氢呋喃洗涤(1mL×3)，得到的固体在真空下干燥，得到标题产物(Z)-5-(2-羟基-3-{N′-[3-甲基-5-氧代-1-(5，6，7，8-四氢-萘-2-基)-1，5-二氢吡唑-4-亚基]-肼基}-苯基)-呋喃-2-羧酸二氨丁三醇盐12(142mg，黑色固体)，产率：92.8％。
HPLC：94.0％
MS m/z(ESI)：457.8[M-1]
1H NMR(400M Hz，CD3OD)：δ7.58(m，4H)，7.05(m，2H)，6.96(d，J＝3.6Hz，1H)，6.90(t，J＝8.0Hz，1H)，3.65(s，12H)，2.76(m，4H)，2.33(s，3H)，1.80(m，4H)
实施例13
(Z)-5-(2-羟基-3-{N′-[3-甲基-5-氧代-1-(5，6，7，8-四氢-萘-2-基)-1，5-二氢吡唑-4-亚基]- 肼基}-苯基)-呋喃-2-羧酸二(二苄基乙二胺)盐
Figure GPA00001297548500281
将(Z)-5-(2-羟基-3-{N′-[3-甲基-5-氧代-1-(5，6，7，8-四氢萘-2-基)-1，5-二氢吡唑-4-亚基]-肼基}-苯基)-呋喃-2-羧酸7d(100mg，0.22mmol)溶于5mL四氢呋喃中，呈暗红色悬浊液，搅拌下加入二苄基乙二胺(104mg，0.44mmol)，呈褐色溶液，室温下搅拌2小时。在溶液中加入4mL甲醇，减压下浓缩，得到标题产物(Z)-5-(2-羟基-3-{N′-[3-甲基-5-氧代-1-(5，6，7，8-四氢-萘-2-基)-1，5-二氢吡唑-4-亚基]-肼基}-苯基)-呋喃-2-羧酸二(二苄基乙二胺)盐13(167mg，黑色固体)，产率：81.8％。
HPLC：96.8％
MS m/z(ESI)：457.8[M-1]
1H NMR(400MHz，CD3OD)：δ7.52-7.54(m，3H)，7.39(d，J＝7.2Hz，1H)，7.24-7.28(m，20H)，7.01-7.04(m，2H)，6.65-6.72(m，1H)，3.89(s，8H)，3.01(s，8H)，2.73(m，4H)，2.32(s，3H)，1.78(m，4H)
实施例14
(Z)-5-(2-羟基-3-{N′-[3-甲基-5-氧代-1-(5，6，7，8-四氢-萘-2-基)-1，5-二氢吡唑-4-亚基]- 肼基}-苯基)-呋喃-2-羧酸二钠
将(Z)-5-(2-羟基-3-{N′-[3-甲基-5-氧代-1-(5，6，7，8-四氢萘-2-基)-1，5-二氢吡唑-4-亚基]-肼基}-苯基)-呋喃-2-羧酸7d(110mg，0.24mmol)溶于4mL四氢呋喃中，呈暗红色悬浊液，搅拌下滴加1M的氢氧化钠溶液(0.4mL，0.44mmol)，室温下搅拌2小时。过滤反应液，滤液中加入4mL甲醇，减压下浓缩反应液，得到的固体用正己烷洗涤，得到标题产物(Z)-5-(2-羟基-3-{N′-[3-甲基-5-氧代-1-(5，6，7，8-四氢-萘-2-基)-1，5-二氢吡唑-4-亚基]-肼基}-苯基)-呋喃-2-羧酸二钠14(115mg，黑色固体)，产率：81.8％。
HPLC：96.8％
MS m/z(ESI)：457.8[M-1]
1H NMR(400MHz，CD3OD)：δ7.79(dd，J1＝7.6Hz，J2＝1.2Hz，1H)，7.52(m，3H)，7.18(d，J＝3.6Hz，1H)，7.05(m，2H)，6.70(m，1H)，2.78(m，4H)，2.41(s，3H)，1.82(m，4H)
实施例15
(Z)-5-(2-羟基-3-{N′-[3-甲基-5-氧代-1-(5，6，7，8-四氢-萘-2-基)-1，5-二氢吡唑-4-亚基]- 肼基}-苯基)-呋喃-2-羧酸二(L-精氨酸)盐
Figure GPA00001297548500291
将(Z)-5-(2-羟基-3-{N′-[3-甲基-5-氧代-1-(5，6，7，8-四氢萘-2-基)-1，5-二氢吡唑-4-亚基]-肼基}-苯基)-呋喃-2-羧酸7d(100mg，0.22mmol)溶于5mL 1四氢呋喃中，呈暗红色悬浊液，搅拌下加入L-精氨酸(76mg，0.44mmol)和2mL水，室温下搅拌2小时。反应液在减压下浓缩，加入5mL乙酸乙酯，有固体析出，过滤，滤饼在真空下干燥，得到标题产物(Z)-5-(2-羟基-3-{N′-[3-甲基-5-氧代-1-(5，6，7，8-四氢-萘-2-基)-1，5-二氢吡唑-4-亚基]-肼基}-苯基)-呋喃-2-羧酸二(L-精氨酸)盐15(168mg，黑色固体)，产率：95.5％。
HPLC：97.5％
MS m/z(ESI)：457.9[M-1]
1H NMR(400MHz，CD3OD)：δ7.59(m，4H)，7.06(m，2H)，6.98(d，J＝3.6Hz，1H)，6.92(t，J＝8.0Hz，1H)，3.57(t，J＝6.4Hz，2H)，3.19(m，4H)，2.78(m，4H)，2.36(s，3H)，1.83(m，8H)，1.73(m，4H)
实施例16
(Z)-5-{2-羟基-3-[N′-(1-茚满-5-基-3-甲基-5-氧代-1，5-二氢吡唑-4-亚基)-肼基]-苯基}- 呋喃-2-羧酸二乙醇胺盐
Figure GPA00001297548500301
Figure GPA00001297548500302
第一步
(Z)-5-{2-羟基-3-[N′-(1-茚满-5-基-3-甲基-5-氧代-1，5-二氢吡唑-4-亚基)-肼基]-苯基}-呋喃-2-羧酸
冰浴下将5-(3-氨基-2-羟基苯基)-呋喃-2-羧酸氢溴酸盐4g(300mg，1.0mmol)溶解于盐酸(3.4mL，1M)中，滴加入1.2mL亚硝酸钠溶液(73mg，1.05mmol)，反应10分钟，再加入2-茚满-5-基-5-甲基-2，4-二氢吡唑-3-酮1i(193mg，0.9mmol)，分批加入碳酸氢钠(1.26g，15mmol)和4.4mL乙醇，室温反应24小时。过滤，固体用20mL水溶解，冰浴下用浓盐酸调节pH＜5，过滤，干燥，得到标题产物(Z)-5-{2-羟基-3-[N′-(1-茚满-5-基-3-甲基-5-氧代-1，5-二氢吡唑-4-亚基)-肼基]-苯基}-呋喃-2-羧酸16a(287mg，黄色固体)。产率：71.8％。
MS m/z(ESI)：443[M-1]
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ13.73(br.s，1H)，9.97(br.s，1H)，7.78(s，1H)，7.70(m，2H)，7.57(m，1H)，7.36(d，J＝3.6Hz，1H)，7.29(d，J＝8.0Hz，1H)，7.22(t，J＝8.0Hz，1H)，7.15(m，1H)，2.89(m，4H)，2.32(s，3H)，2.03(m，2H)
第二步
(Z)-5-{2-羟基-3-[N′-(1-茚满-5-基-3-甲基-5-氧代-1，5-二氢吡唑-4-亚基)-肼基]-苯基}-呋喃-2-羧酸二乙醇胺盐
将(Z)-5-{2-羟基-3-[N′-(1-茚满-5-基-3-甲基-5-氧代-1，5-二氢吡唑-4-亚基)-肼基]-苯基}-呋喃-2-羧酸16a(1.825g，4.11mmol)溶解于20mL四氢呋喃中，搅拌下加入乙醇胺(501mg，8.22mmol)，反应液在室温搅拌2小时。过滤，滤饼用四氢呋喃洗涤(1mL×3)，真空下干燥，得到标题产物(Z)-5-{2-羟基-3-[N′-(1-茚满-5-基-3-甲基-5-氧代-1，5-二氢吡唑-4-亚基)-肼基]-苯基}-呋喃-2-羧酸二乙醇胺盐16(1.615g，暗红色固体)。产率：69.4％。
MS m/z(ESI)：443[M-1]
1H NMR(400MHz，CD3OD)：δ7.67(s，1H)，7.53(m，3H)，7.21(d，J＝8.0Hz，1H)，7.02(m，1H)，6.97(d，J＝3.2Hz，1H)，6.70(m，1H)，3.70(m，4H)，2.92(m，4H)，2.88(m，4H)，2.35(s，3H)，2.08(m，2H)
实施例17
(Z)-5-{2-羟基-3-[N′-(1-茚满-5-基-3-甲基-5-氧代-1，5-二氢吡唑-4-亚基)-肼基]-苯基}- 呋喃-2-羧酸二(二乙胺)盐
Figure GPA00001297548500311
将5-{2-羟基-3-[N′-(1-茚满-5-基-3-甲基-5-氧代-1，5-二氢吡唑-4-亚基)-肼基]-苯基}-呋喃-2-羧酸16a(150mg，0.38mmol)悬浮于5mL四氢呋喃中，呈暗红色悬浊液，搅拌下滴加二乙胺(49mg，0.67mmol)，呈紫红色溶液，室温下反应2小时。反应液中有固体析出，过滤，滤饼用四氢呋喃洗涤(1mL×3)，得到的固体在真空下干燥，得到标题产物(Z)-5-{2-羟基-3-[N′-(1-茚满-5-基-3-甲基-5-氧代-1，5-二氢吡唑-4-亚基)-肼基]-苯基}-呋喃-2-羧酸二(二乙胺)盐17(163mg，暗红色固体)，产率：81.9％。
HPLC：99.18％
MS m/z(ESI)：442.7[M-1]
1H NMR(400MHz，CD3OD)：δ7.71(s，1H)，7.60(m，3H)，7.24(d，J＝8.0Hz，1H)，7.04(d，J＝8.0Hz，1H)，6.95(d，J＝8.0Hz，1H)，6.82(m，1H)，3.73(m，2H)，2.95(m，8H)，2.37(s，3H)，2.13(m，2H)，1.87(m，2H)，1.28(m，12H)
实施例18
(Z)-5-{2-羟基-3-[N′-(1-茚满-5-基-3-甲基-5-氧代-1，5-二氢吡唑-4-亚基)-肼基]-苯基}- 呋喃-2-羧酸二哌嗪盐
Figure GPA00001297548500312
将(Z)-5-{2-羟基-3-[N′-(1-茚满-5-基-3-甲基-5-氧代-1，5-二氢吡唑-4-亚基)-肼基]-苯基}-呋喃-2-羧酸16a(150mg，0.38mmol)溶于5mL四氢呋喃中，呈暗红色悬浊液，搅拌下加入哌嗪(58mg，0.68mmol)，呈紫红色溶液，室温下搅拌3小时。反应液中有固体析出，过滤，滤饼用四氢呋喃洗涤(1mL×3)，得到的固体在真空下干燥，得到标题产物(Z)-5-{2-羟基-3-[N′-(1-茚满-5-基-3-甲基-5-氧代-1，5-二氢吡唑-4-亚基)-肼基]-苯基}-呋喃-2-羧酸二哌嗪盐18(185mg，暗红色固体)，产率：88.9％。
HPLC：96.52％
MS m/z(ESI)：443.2[M-1]
1H NMR(400MHz，CD3OD)：δ7.73(s，1H)，7.61-7.64(m，2H)，7.55(d，J＝8.4Hz，1H)，7.23(d，J＝8.4Hz，1H)，7.05(d，J＝8.8Hz，1H)，6.78-6.90(m，2H)，3.03(s，16H)，2.89-2.95(m，4H)，2.35(s，3H)，2.12(t，J＝7.2Hz，4H)
实施例19
(Z)-4-{2-羟基-3-[N′-(1-茚满-5-基-3-甲基-5-氧代-1，5-二氢吡唑-4-亚基)-肼基]-苯}-噻 吩-2-羧酸二乙醇胺盐
Figure GPA00001297548500321
Figure GPA00001297548500322
第一步
4-(3-硝基-2-甲氧基-苯基)-噻吩-2-羧酸
将2-(2-甲氧基-3-硝基苯基)-4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂戊硼烷4d(0.81g，2.9mmol)、4-溴-噻吩-2-羧酸(0.3g，1.45mmol)、四(三苯基膦)钯(80mg，0.073mmol)和碳酸钠(0.31g，2.9mmol)溶解于20mL 1，4-二氧六环和10mL水的混合溶剂中，加热回流0.5小时。反应液用1M盐酸调节至pH＝3，乙酸乙酯萃取(20mL×3)，合并有机相，有机相减压浓缩后柱层析得到4-(3-硝基-2-甲氧基-苯基)-噻吩-2-羧酸19a(0.54g，棕色油状液体)，直接进行下一步反应。
MS m/z(ESI)：277.6[M-1]
第二步
4-(3-氨基-2-甲氧基-苯基)-噻吩-2-羧酸
将4-(3-硝基-2-甲氧基-苯基)-噻吩-2-羧酸19a(400mg，1.45mmol)溶解于30mL乙酸乙酯中，再加入100mg钯-碳(10％)和甲酸铵(360mg，5.8mmol)，加热回流3小时。过滤反应液，减压浓缩得到4-(3-氨基-2-甲氧基-苯基)-噻吩-2-羧酸19b(410mg，棕色油状液体)，直接进行下一步反应。
MS m/z(ESI)：247.8[M-1]
第三步
4-(3-氨基-2-羟基苯基)-噻吩-2-羧酸氢溴酸盐
将4-(3-氨基-2-甲氧基-苯基)-噻吩-2-羧酸19b(360mg，1.45mmol)溶解于5mL二氯甲烷中，滴加入三溴化硼(2.8mL，5.6mmol)，室温反应4.5小时。在反应液中加入5mL甲醇，减压浓缩，向残余物中加入10mL乙酸乙酯，搅拌0.5小时，过滤，收集固体，干燥，得到4-(3-氨基-2-羟基苯基)-噻吩-2-羧酸氢溴酸盐19c(80mg，灰色固体)。产率：17.5％。
MS m/z(ESI)：236.1[M+1]
第四步
(Z)-4-{2-羟基-3-[N′-(1-茚满-5-基-3-甲基-5-氧代-1，5-二氢吡唑-4-亚基)-肼基]-苯}-噻吩-2-羧酸
冰浴下将4-(3-氨基-2-羟基苯基)-噻吩-2-羧酸氢溴酸盐19c(120mg，0.38mmol)溶解于2.7mL 1M盐酸中，滴加入0.45mL亚硝酸钠溶液(29mg，0.42mmol)，反应20分钟，再加入2-茚满-5-基-5-甲基-2，4-二氢吡唑-3-酮1i(73mg，0.34mmol)，用饱和碳酸氢钠溶液调节pH至8，加入2mL乙醇，室温反应过夜。过滤反应液，固体加入到20mL水中，再用浓盐酸调节pH＝3～4，过滤，固体中加入5mL乙酸乙酯搅拌1小时，过滤，所得固体干燥后得到标题产物(Z)-4-{2-羟基-3-[N′-(1-茚满-5-基-3-甲基-5-氧代-1，5-二氢吡唑-4-亚基)-肼基]-苯}-噻吩-2-羧酸19d(45mg，黄色固体)。产率：28.7％。
MS m/z(ESI)：458.8[M-1]
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ13.79(br.s，1H)，9.68(br.s，1H)，8.13(d，J＝1.2Hz，1H)，8.05(d，J＝1.6Hz，1H)，7.78(s，1H)，7.67(m，2H)，7.32(m，2H)，7.13(t，J＝8.0Hz，1H)，2.87(m，4H)，2.32(s，3H)，2.05(m，2H)
第五步
(Z)-4-{2-羟基-3-[N′-(1-茚满-5-基-3-甲基-5-氧代-1，5-二氢吡唑-4-亚基)-肼基]-苯}-噻吩-2-羧酸二乙醇胺盐
将(Z)-4-{2-羟基-3-[N′-(1-茚满-5-基-3-甲基-5-氧代-1，5-二氢吡唑-4-亚基)-肼基]-苯}-噻吩-2-羧酸19d(1.3g，2.83mmol)溶于40mL四氢呋喃中，呈暗红色悬浊液，搅拌下加入乙醇胺(344mg，5.65mmol)，呈紫红色溶液，室温下搅拌2小时，有大量固体析出。过滤反应液，滤饼用四氢呋喃洗涤(1mL×3)，得到的固体在真空下干燥，得到标题产物(Z)-4-{2-羟基-3-[N′-(1-茚满-5-基-3-甲基-5-氧代-1，5-二氢吡唑-4-亚基)-肼基]-苯}-噻吩-2-羧酸二乙醇胺盐19(1.513g，暗红色固体)。产率：92.0％。HPLC：98.65％
MS m/z(ESI)：458.7[M-1]
1H NMR(400MHz，CD3OD)：δ7.94(s，1H)，7.88(s，1H)，7.68(s，1H)，7.55-7.59(m，2H)，7.28-7.30(m，1H)，7.22(d，J＝8.4Hz，1H)，6.83(t，J＝8.0Hz，3H)，3.65-3.68(m，4H)，2.88-2.92(m，8H)，2.38(s，3H)，2.06-2.14(m，2H)
实施例20
(Z)-4-{2-羟基-3-[N′-(1-茚满-5-基-3-甲基-5-氧代-1，5-二氢吡唑-4-亚基)-肼基]-苯}-噻 吩-2-羧酸二(二乙胺)盐
Figure GPA00001297548500341
将(Z)-4-{2-羟基-3-[N′-(1-茚满-5-基-3-甲基-5-氧代-1，5-二氢吡唑-4-亚基)-肼基]-苯}-噻吩-2-羧酸19d(150mg，0.33mmol)溶于5mL四氢呋喃中，呈暗红色悬浊液，搅拌下滴加二乙胺(49mg，0.66mmol)，呈紫红色溶液，室温下反应2小时。反应液中有固体析出，过滤，滤饼用四氢呋喃洗涤(1mL×3)，得到的固体在真空下干燥，得到标题产物(Z)-4-{2-羟基-3-[N′-(1-茚满-5-基-3-甲基-5-氧代-1，5-二氢吡唑-4-亚基)-肼基]-苯}-噻吩-2-羧酸二(二乙胺)盐20(157mg，暗红色固体)。产率：79.3％。
HPLC：98.98％
MS m/z(ESI)：458.8[M-1]
1H NMR(400MHz，CD3OD)：δ7.81(s，1H)，7.73(s，1H)，7.68-7.70(m，2H)，7.62(d，J＝8.8Hz，1H)，7.22-7.26(m，2H)，7.06(t，J＝8.0Hz，1H)，3.03(q，J＝7.2Hz，8H)，2.90-2.97(m，4H)，2.37(s，3H)，2.07-2.15(m，2H)，1.29(t，J＝7.2Hz，12H)
实施例21
(Z)-4-{2-羟基-3-[N′-(1-茚满-5-基-3-甲基-5-氧代-1，5-二氢吡唑-4-亚基)-肼基]-苯}-噻 吩-2-羧酸二哌嗪盐
Figure GPA00001297548500351
将(Z)-4-{2-羟基-3-[N′-(1-茚满-5-基-3-甲基-5-氧代-1，5-二氢吡唑-4-亚基)-肼基]-苯}-噻吩-2-羧酸19d(150mg，0.33mmol)溶于5mL四氢呋喃中，呈暗红色悬浊液，搅拌下加入哌嗪(56mg，0.65mmol)，呈紫红色溶液，室温下搅拌2小时。反应液中有固体析出，过滤，滤饼用四氢呋喃洗涤(1mL×3)，得到的固体在真空下干燥，得到标题产物(Z)-4-{2-羟基-3-[N′-(1-茚满-5-基-3-甲基-5-氧代-1，5-二氢吡唑-4-亚基)-肼基]-苯}-噻吩-2-羧酸二哌嗪盐21(195mg，暗红色固体)。产率：94.7％。
HPLC：98.17％
MS m/z(ESI)：458.8[M-1]
1H NMR(400MHz，CD3OD)：δ7.85(s，1H)，7.75(s，1H)，7.71(s，1H)，7.62(m，2H)，7.26(m，2H)，6.95(t，1H)，2.96(m，16H)，2.91(m，4H)，2.37(s，3H)，2.11(m，2H)
实施例22
(Z)-4-(2-羟基-3-{N′-[3-甲基-5-氧代-1-(5，6，7，8-四氢-萘亚甲基-2-基)-1，5-二氢-吡唑 -4-亚基]-肼基}-苯基)-呋喃-3-羧酸二乙醇胺盐
Figure GPA00001297548500352
Figure GPA00001297548500353
第一步
4-溴-呋喃-2-羧酸
室温下，将4，5-二溴-呋喃-2-羧酸22a(5.5g，20.30mmol)和18mL氨水加入到63mL水中，加入锌粉(1.46g，22.33mmol)，加毕室温搅拌6小时。反应液用1M盐酸调节pH＝3，有大量固体析出，过滤，滤饼用正己烷洗涤(15mL×4)后干燥，得到标题产物4-溴-呋喃-2-羧酸22b(3.2g，白色固体)，产率：83.1％。
MS m/z(ESI)：188.7[M-1]
第二步
4-(3-硝基-2-甲氧基-苯基)-呋喃-2-羧酸
将2-(2-甲氧基-3-硝基苯基)-4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂戊硼烷4d(4g，14.34mmol)、4-溴-呋喃-2-羧酸22b(2.18g，11.47mmol)、四(三苯基膦)钯(829mg，0.717mmol)和碳酸钾(3.96g，28.68mmol)溶解于80mL 1，4-二氧六环和30mL水的混合溶剂中，加热回流2.5小时。反应液用1M盐酸调节至pH～3，乙酸乙酯萃取(80mL×3)，合并有机相，有机相减压浓缩后柱层析得到标题产物4-(3-硝基-2-甲氧基-苯基)-呋喃-2-羧酸22c(3.42g，棕色油状液体)。产率：90.7％。
MS m/z(ESI)：261.8[M-1]
第三步
4-(3-氨基-2-甲氧基-苯基)-呋喃-2-羧酸
将4-(3-硝基-2-甲氧基-苯基)-呋喃-2-羧酸22c(500mg，1.9mmol)溶解于15mL乙酸乙酯中，再加入100mg钯-碳和甲酸铵(429mg，7.6mmol)，加热回流3小时。过滤反应液除去钯/碳，减压浓缩得到标题产物4-(3-氨基-2-甲氧基-苯基)-呋喃-2-羧酸22d(325mg，黄色油状液体)，产率：73.4％。
MS m/z(ESI)：231.8[M-1]
第四步
4-(3-氨基-2-羟基苯基)-呋喃-2-羧酸氢溴酸盐
将4-(3-氨基-2-甲氧基-苯基)-呋喃-2-羧酸22d(325mg，1.4mmol)溶解于5mL二氯甲烷中，滴加入三溴化硼(2.8mL，5.6mmol)，室温反应4.5小时。在反应液中加入5mL甲醇，减压浓缩，向残余物中加入10mL乙酸乙酯，搅拌0.5小时，过滤，收集固体，干燥，得到标题产物4-(3-氨基-2-羟基苯基)-呋喃-2-羧酸氢溴酸盐22e(174mg，灰色固体)。产率：57.1％。
MS m/z(ESI)：217.7[M-1]
第五步
(Z)-4-(2-羟基-3-{N′-[3-甲基-5-氧代-1-(5，6，7，8-四氢萘亚甲基-2-基)-1，5-二氢吡唑-4-亚基]-肼基}-苯基)-呋喃-2-羧酸
冰浴下将4-(3-氨基-2-羟基苯基)-呋喃-2-羧酸氢溴酸22e(170mg，0.57mmol)溶解于盐酸(1.9mL，1M)中，滴加入0.7mL亚硝酸钠溶液(43mg，0.63mmol)，反应20分钟，再加入5-甲基-2-(5，6，7，8-四氢萘-2-基)-2，4-二氢吡唑-3-酮7c(116mg，0.51mmol)，用饱和碳酸氢钠溶液调节pH至8～9，加入2mL乙醇，室温反应24小时。过滤反应液，固体中加入15mL水，冰浴下用浓盐酸调节pH＝2～3，过滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤，干燥，得到标题产物(Z)-4-(2-羟基-3-{N′-[3-甲基-5-氧代-1-(5，6，7，8-四氢萘亚甲基-2-基)-1，5-二氢吡唑-4-亚基]-肼基}-苯基)-呋喃-2-羧酸22f(13mg，红色固体)。产率：5.5％。
MS m/z(ESI)：456.7M-1]
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ13.75(br.s，1H)，13.20(br.s，1H)，9.68(br.s，1H)，8.37(s，1H)，7.62-7.68(m，4H)，7.41-7.43(m，1H)，7.11-7.15(m，2H)，2.67-2.76(m，2H)，2.31(s，3H)，1.75(m，4H)
第六步
(Z)-4-(2-羟基-3-{N′-[3-甲基-5-氧代-1-(5，6，7，8-四氢-萘亚甲基-2-基)-1，5-二氢-吡唑-4-亚基]-肼基}-苯基)-呋喃-3-羧酸二乙醇胺盐
将(Z)-4-(2-羟基-3-{N′-[3-甲基-5-氧代-1-(5，6，7，8-四氢-萘亚甲基-2-基)-1，5-二氢-吡唑-4-亚基]-肼基}-苯基)-呋喃-3-羧酸22f(1.2g，2.6mmol)溶于20mL四氢呋喃中，呈暗红色悬浊液，搅拌下加入乙醇胺(399mg，6.5mmol)，呈紫红色溶液，室温下搅拌6小时，有大量固体析出。过滤反应液，滤饼用四氢呋喃洗涤(1mL×3)，得到的固体在真空下干燥，得到标题产物(Z)-4-(2-羟基-3-{N′-[3-甲基-5-氧代-1-(5，6，7，8-四氢-萘亚甲基-2-基)-1，5-二氢-吡唑-4-亚基]-肼基}-苯基)-呋喃-3-羧酸二乙醇胺盐22(1.51g，红色固体)。产率：72.8％。
HPLC：97.16％
MS m/z(ESI)：456.7[M-1]
1H NMR(400MHz，CD3OD)：δ8.20(s，1H)，7.51-7.56(m，3H)，7.31-7.35(m，2H)，7.07(d，J＝9.2Hz，1H)，6.89(t，J＝8.0Hz，1H)，3.68-3.71(m，4H)，2.90-2.95(m，4H)，2.76-2.81(m，4H)，2.39(s，3H)，1.80-1.85(m，4H)
实施例23
(Z)-5-(2-羟基-3-{N′-[3-甲基-5-氧代-1-(5，6，7，8-四氢-萘-2-基)-1，5-二氢吡唑-4-亚基]-肼基}-苯基)-呋喃-2-羧酸单胆碱盐
Figure GPA00001297548500371
将(Z)-5-(2-羟基-3-{N′-[3-甲基-5-氧代-1-(5，6，7，8-四氢-萘-2-基)-1，5-二氢吡唑-4-亚基]-肼基}-苯基)-呋喃-2-羧酸(1.1g，2.4mmol)溶解于19mL乙酸乙酯乙醇的混合溶剂(V/V＝12∶7)中，加热至40℃搅拌15分钟，呈红棕色混悬液。缓慢加入1M的胆碱甲醇溶液(2.4mL，2.4mmol)，此时固体消失，呈黑色溶液。反应液中加入1mL水，降温至35℃反应3小时，室温反应72小时，有橘黄色固体析出。过滤，乙酸乙酯(5mL×3)洗涤，滤饼干燥，得到标题产物(Z)-5-(2-羟基-3-(2-(3-甲基-5-氧代-1-(5，6，7，8-四氢萘-2-基)-1H-吡唑-4(5H)-亚基)肼基)苯基)呋喃-2-羧酸单胆碱盐(620mg，橘黄色固体)，收率：46.0％。
MS m/z(ESI)：456.7[M-1]
1H NMR(400MHz，CD3OD)：δ7.66-7.57(m，4H)，7.09-7.04(m，3H)，6.92(d，J＝3.6Hz，1H)，4.03-3.99(m，2H)，3.51-3.48(m，2H)，3.22(s，9H)，2.81-2.75(m，4H)，2.33(s，3H)，1.83-1.81(m，4H)
实施例24
片剂组合物
将乳糖、微晶纤维素、羟基乙酸淀粉钠、硬脂酸镁和实施例7化合物按照下表1的比例掺合。然后将混合物压制成片剂。
表1
Figure GPA00001297548500381
实施例25
可注射的肠胃给药组合物
可注射给药的实施例7制剂的制备方法为，将5.0mg化合物于1.0mL生理盐水中搅拌。
测试例：
溶解度测试
按照常规溶解度测定方法，测试实施例化合物和其盐在三种不同的系统中测定其溶解度：水，0.1％盐酸及甲醇中。
溶解度的特征描述：
极易溶解：系指溶质1g(mL)能在溶剂不到1mL中溶解；
易溶：系指溶质1g(mL)能在溶剂1～不到10mL中溶解；
溶解：系指溶质1g(mL)能在溶剂10～不到30mL中溶解；
略溶：系指溶质1g(mL)能在溶剂30～不到100mL中溶解；
微溶：系指溶质1g(mL)能在溶剂100～不到1000mL中溶解；
极微溶解：系指溶质1g(mL)能在溶剂1000～不到10000mL中溶解；
几乎不溶或不溶：系指溶质1g(mL)能在溶剂10000mL中不能完全溶解。
溶解度结果如下表中所示：
Figure GPA00001297548500391
试验结果表明，实施例1j、4h、7d、16a和19d化合物的盐与其相比溶解度明显增加，特别是在水中和甲醇中的溶解度明显改善，其中实施例4和7化合物，其在0.1％盐酸中也有较好的溶解度，为极微溶解，其他均为几乎不溶或不溶。
实施例1j、4h、7d、16a和19d化合物的结构如下：
Figure GPA00001297548500392
引湿性试验
测定本发明化合物在放置48小时后的引湿性。
试验步骤：
1.取干燥的具塞玻璃称量瓶(外径为50mm，高为15mm)，于试验前一天置于适宜的25℃±1℃恒温干燥器(下部放置饱和硫酸铵溶液，湿度79％)，精密称量重量(m1)；
2.取本发明待测化合物质量(约1g)，平铺于上述称量瓶中，化合物厚度一般为1mm，精密称量重量(m2)；
3.将称量瓶口敞口，并与瓶盖同置于上述恒温恒湿条件下48小时；
4.盖好称量瓶盖子，精密称定重量(m3)
Figure GPA00001297548500402
引湿性特征描述：
潮解：吸收足量水分形成液体
极具吸湿性：阴湿增重百分率不小于15％
有引湿性：引湿增重百分率小于15％但不小于2％
略有引湿性：引湿增重百分率小于2％但不小于0.2％
无或几乎无引湿性：引湿增重百分率小于0.2％
本发明化合物的引湿性测定结果如下：
  实施例编号   增重百分率   引湿性
  7   1.2％   略有引湿性
  8   13.9％   有引湿性
  10   15.7％   极具吸湿性
  12   2.71％   有引湿性
  23   8.48％   有引湿性
试验结果表明，实施例7，即化合物7d二乙醇胺盐与其他的盐相比，引湿性弱，其略有引湿性，具有吸湿稳定性，这样可以减少胶囊或片剂生产过程中潜在的与活性成分的重量变化的难题，在空气中稳定，适用于常规制剂，保存时间长。
生物学评价
测试例1本发明化合物对BAF3-TPOR细胞的增殖作用
1.材料和方法：
a.RPM1 Medium 1640，Powder，10*1L，含HEPES(Gibco Catalog no.23400021)
b.FBS胎牛血清(Gibco Catalog no.10099-141)
c.PENICILLIN STREPTOMYCIN SOL(Gibco Catalog no.15140-122)
d.Geneticin(G418)(Gibco Catalog no.11811-098)
e.recombinant mouse IL-3(chemicon Catalog no.IL015)
f.Human Thrombopoietin R Mab(TPO)(R&D Catalog no.MAB 1016)
g.DMSO(AppliChem Catalog no.A3672)
h.
Figure GPA00001297548500411
Multi Site Directed Mutagenesis Kit，10Runs(StratageneST200515)
i，Cell Counting Kit-8(同仁化学研究所Catalog no.CK04-13)
j，BAF3细胞(协和细胞库Catalog no.0095)
k.EX-EGFP-M02(FulenGen Catalog no.EX-EGFP-M02Control)
l.EX-B0010-M02(FulenGen Catalog no.EX-B0010-M02)
2.操作步骤：
(1)质粒构建：根据Entrez Gene ID：4325，Refseq：NM_005373提供的TPOR基因序列，对购买的EX-B0010-M02质粒(FulenGen)利用Multi SiteDirected Mutagenesis Kit(Stratagene)试剂盒进行2点突变。多点突变引物序列分别为：g491a：5′-gggaacttcagatcagctgggaggagccg-3′，g491a_antisense：5′-cggctcctcccagctgatctgaagttccc-3′；c965t：5′-caggaccatgctagctcccaaggcttcttct-3′，c965t_antisense：5′-agaagaagccttgggagctagcatggtcctg-3’。突变后质粒转化大肠杆菌DH5α，经Amp筛选出阳性克隆，测序鉴定突变结果正确。
(2)BAF3-TPOR细胞株构建：构建稳定高表达功能性TPO受体的BAF3细胞株。将经2点突变后的表达人TPO受体和筛选基因neomycin的EX-B0010-M02质粒25μg转染野生型BAF3细胞(1X107)，转染所用仪器为Electro SquarePorator ECM830(BTX Division of Genetronic，Inc.US)，转染条件为：250V，18ms。通过G418(Gibco，US)筛选获得BAF3-TPOR稳定细胞株。BAF3-TPOR在RPMI1640(Gibco，US)培养基，10％FB(Gibco，US)S，800ng/ml G418，5ng/mL，rmIL-3(Chemicon，US)中培养。
3.化合物筛选：
(1)离心清洗细胞：取适量细胞悬液1000rpm，离心5分钟，弃去上清，再用10mL不含IL3的细胞培养液将细胞重新悬起，1000rpm，离心5分钟，弃去上清；
(2)加入1mL不含IL3的细胞培养液将细胞吹打均匀，取适量细胞悬液稀释后计数；
(3)根据细胞计数结果制备密度为100000个/mL的细胞悬液；
(4)于96-well平板中每孔加入100μL细胞悬液，设置3个复孔，并设置空白对照组(B)，阴性对照组(N)，TPO阳性对照组(P)和待测化合物组(S)；
(5)用DMSO将待测化合物粉末配成10mM的储存液，再用RPM11640稀释成不同浓度：30μM，10μM，3μM，1μM，0.3μM，0.1μM，0.03μM，0.01μM，0.003μM，0.001μM；
(6)每孔加入10μL相应浓度的药液，阳性对照孔中加入1μLrhTPO(10μg/mL)；
(7)置于5％CO2，37℃细胞培养箱中培养24小时；
(8)每孔加入10mL CCK-8，于细胞培养箱中培养4小时；
(9)利用VICTOR3(Perkin Elmer 1420-120)仪器在450nm检测OD值。
4.结果分析计算：
(1)增值率定义：[(S-B)/(P-B)]*100％
S：样品；B：空白对照；P：阳性对照
(2)通过Origin 7.0计算EC50。
5.结果：
化合物TPO活性EC50值
  实施例   EC50值(nM)
  Eltrombopag   299
  1j   200
  1   150
  4h   32
  4   25
  5   19
  6   36
  7d   21
  7   19
  8   4.4
  9   14
  10   16
  11   21
  12   14
  13   20
  14   19
  15   16
  16a   100
  16   18
  17   55
  18   29
  19d   43
  19   37
  20   51
  21   116
  22f   42
  22   39
  23   43
试验结果表明，结果表明本发明的盐与其游离酸相比，对于BAF3-TPOR细胞有促进增殖作用，排序为：本发明的盐＞游离酸＞Eltrombopag，且本发明的盐与Eltrombopag的活性相比有明显的增加。
药代动力学测试
测试例1本发明的化合物大鼠药代动力学测试
1、试验目的
以大鼠为受试动物，应用HPLC-UV法测定了大鼠分别灌胃给予本发明化合物后不同时刻血浆中的药物浓度。研究本发明的化合物在大鼠体内的药代动力学行为，评价其药动学特征。
2、试验方案
2.1、试验药品
实施例1j、1-3、4h、4、5、6、7d、7～15、16a、16-18、19d、19、20、21、22f、22、23化合物
2.2、试验动物
健康成年SD大鼠，雌雄各半，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，动物生产许可证号：SCXK(沪)2003-0002。
2.3、仪器设备
Waters 2695-2996液相色谱系统，美国Waters公司。
2.4、药物配制
称取适量样品加1％羧甲基纤维素钠制成5mg/mL(以原形计)混悬液，临用时配制。
2.5、给药
健康成年SD大鼠，雌雄各半，平均分成23组，禁食过夜后分别灌胃给药，给药剂量均为50.0mg/kg(以原形计)，给药体积10mL/kg。
2.6、样品采集
于给药前及给药后0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，8.0，11.0，14.0，24.0，36.0，48.0小时由眼眶采血0.2mL，置于肝素化试管中，3500转离心10分钟分离血浆，于-20℃保存给药后2小时进食。
2.7、分析方法
取给药后各时刻的大鼠血浆50μL，加入内标溶液50μL，甲醇∶水(80∶20，v/v)20μL，甲醇100μL，涡旋混合3分钟，离心10分钟(13500转/分钟)，取上清液40μL进行HPLC-UV分析。
2.8、药代动力学参数计算
对受试化合物的药代动力学行为进行房室模型拟合，并计算主要药代动力学参数，其中Cmax、tmax采用实测值。
3、药代动力学参数结果
本发明的化合物的药代动力学参数如下：
Figure GPA00001297548500451
Figure GPA00001297548500461
试验结果表明，大鼠分别灌胃给予上述化合物后，本发明化合物的盐与其游离酸相比，药代动力学性质和生物利用度明显改善，其中实施例7即实施例7d化合物的乙醇胺盐的药代数据较好，有较好的药代动力学性质。
测试例2本发明的化合物比格犬药代动力学测试
1、试验目的
以比格犬为受试动物，应用HPLC-UV法测定了比格犬分别灌胃给予实施例7、8、10和12化合物后不同时刻血浆中的药物浓度。研究本发明的化合物在比格犬体内的药代动力学行为，评价其药动学特征。
2、试验方案
2.1、试验药品
实施例7、8、10和12化合物
2.2、试验动物
健康成年比格犬12只，雄性，购自苏州西山中科实验动物有限公司，动物生产许可证号：SCXK(苏)2007-0005。
2.3、仪器设备
Agilent 1100高效液相色谱系统，美国Agilent公司。
2.4、药物配制
称取适量样品加0.5％羧甲基纤维素钠制成2.5mg/mL(以原形计)混悬液，临用时配制。
2.5、给药
健康成年比格犬12只，雄性，平均分成4组，禁食过夜后分别灌胃给药，给药剂量均为5.0mg/kg(以原形计)，给药体积2mL/kg。
2.6、样品采集
各给药分别于给药前及给药后0.25，0.5，1.0，1.5，2.0，3.0，5.0，6.0，8.0，12.0，14.0，24.0，48.0小时由前肢静脉采血1.2mL，置于肝素化试管中，3500rpm离心10分钟分离血浆，-20℃保存。给药后2小时进食。
2.7、分析方法
取给药后各时刻的比格犬血浆50μL，加入内标溶液20μL，甲醇150μL，涡旋混合1分钟，离心5分钟(11000转/分钟)，取上清液于40℃空气流吹干，残留物溶于甲醇150μL，涡流混合1分钟，离心5分钟(11000转/分钟)，取50μL进行HPLC-UV分析。
2.8、药代动力学参数计算
对受试化合物的药代动力学行为进行房室模型拟合，并计算主要药代动力学参数，其中Cmax、tmax采用实测值。
Figure GPA00001297548500481
试验结果表明，四种盐的比格犬药代动力学实验结果显示，实施例7化合物在比格犬体内药代较其他盐有优势。
综上所述，本发明的盐制备简单、收率高，其中乙醇胺盐、胆碱盐、二乙胺盐和哌嗪盐，在工艺路线中有优势，可以直接析出晶体；本发明的盐与其游离酸相比，在常规溶剂中的溶解度明显增加，乙醇胺盐引湿性弱，适用于常规制剂，易于保存；本发明的盐生物活性明显增加，大鼠和比格犬药代动力学性质明显改善，有较好的药代动力学特征，特别是乙醇胺盐较其他盐有明显的优势。

Claims (21)

1.通式(I)所示化合物的药学上可接受的盐：
其中：
Het选自苯基、呋喃基或噻吩基；
R1、R2、R3和R4各自独立地选自氢原子或甲基；
n为0、1或2；
所述的盐为碱加成盐，选自钠盐、精氨酸盐、赖氨酸盐、甲胺盐、二甲胺盐、三甲胺盐、乙胺盐、二乙胺盐、三乙胺盐、乙醇胺盐、哌嗪盐、二苄基乙二胺盐、葡甲胺盐、氨丁三醇盐、四甲基季铵盐、四乙基季铵盐或胆碱盐。
2.根据权利要求1所述的药学上可接受的盐，其中所述的盐选自二乙胺盐、乙醇胺盐、胆碱盐、哌嗪盐、葡甲胺盐或氨丁三醇盐。
3.根据权利要求1所述的药学上可接受的盐，其中所述的盐选自乙醇胺盐、胆碱盐、葡甲胺盐或氨丁三醇盐。
4.根据权利要求1所述的药学上可接受的盐，其中所述的盐为乙醇胺盐。
5.根据权利要求1～4任一项所述的药学上可接受的盐，其中所述的盐选自：
Figure FSB00000839967900012
Figure FSB00000839967900021
6.一种制备如权利要求1所述的药学上可接受的盐的方法，该方法包括：
(a)将通式(I)化合物溶解或悬浮于有机溶剂中，其中所述的有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯或四氢呋喃；
(b)搅拌下加入碱，其中所述的碱选自氢氧化钠、赖氨酸、精氨酸、甲胺、二甲胺、三甲胺、乙胺、二乙胺、三乙胺、乙醇胺、哌嗪、二苄基乙二胺、葡甲胺、氨丁三醇、四甲基季铵、四乙基季铵或氢氧化胆碱；
(c)得到通式(I)化合物的药学上可接受的盐。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述的有机溶剂为四氢呋喃。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述的碱选自二乙胺、乙醇胺、氢氧化胆碱、哌嗪、葡甲胺或氨丁三醇。
9.根据权利要求6所述的方法，其中所述的碱选自乙醇胺、氢氧化胆碱、葡甲胺或氨丁三醇。
10.根据权利要求6所述的方法，其中所述的碱为乙醇胺。
11.根据权利要求6所述的方法，其中通式(I)化合物与碱的当量比为1∶5～5∶1。
12.根据权利要求6所述的方法，其中通式(I)化合物与碱的当量比为1∶1～1∶3。
13.根据权利要求6所述的方法，其中通式(I)化合物与碱的当量比为1∶1～1∶2。
14.一种药物组合物，其含有治疗有效量的如权利要求1所述的药学上可接受的盐及药学上可以接受的载体或稀释剂。
15.一种制备根据权利要求14所述的组合物的方法，所述方法包括将权利要求1所述的化合物与可药用载体或稀释剂相结合。
16.根据权利要求1所述的通式(I)所示化合物的药学上可接受的盐在制备治疗血小板减少症药物中的用途。
17.根据权利要求16所述的用途，其中所述药物为口服药物剂型。
18.根据权利要求16所述的用途，其中所述药物为非肠胃药物剂型。
19.作为治疗血小板减少症药物的根据权利要求1所述的通式(I)所示化合物的药学上可接受的盐。
20.根据权利要求19所述的药学上可接受的盐，其中所述药物为口服药物剂型。
21.根据权利要求19所述的药学上可接受的盐，其中所述药物为非肠胃药物剂型。
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