CN102153565B - 反相高效液相色谱法分离精制青蒿素、二氢青蒿酸和青蒿酸的方法 - Google Patents
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Abstract
一种反相高效液相色谱法分离精制青蒿素、二氢青蒿酸和青蒿酸的方法，主要步骤是将通过有机溶剂提取得到的青蒿粗提物以反相高效液相色谱法分离纯化，再浓缩、结晶而得到青蒿素、青蒿酸和二氢青蒿酸纯品。该方法收率高、分离效率高、分离速度快，能同时获得青蒿素、二氢青蒿酸和青蒿酸纯品，纯度达96％以上，可用于大规模工业生产制备。
Description
技术领域：
本发明涉及一种从青蒿提取物中分离精制青蒿素、青蒿酸和二氢青蒿酸的方法，具体涉及一种利用反相高效液相色谱法分离精制青蒿素、二氢青蒿酸和青蒿酸的方法。
背景技术：
据世界卫生组织最新报告，疟疾已成为流行范围最广、历史最长、危害最大的人类寄生虫传染病，长期以来一直是第三世界国家发病率和死亡率最高的病种之一。目前全球每年有3-5亿临床病例，其中有100多万死亡。随着全球气温变暖及环境破坏加剧等原因，近年疟疾的发病率呈上升趋势。传统抗疟药奎宁和周效磺胺已产生抗药性，青蒿素是我国学者首次从黄花蒿(Artemisiaannua L.)中分离得到的一种倍半萜内酯过氧化物，已被世界卫生组织认定为目前最安全、有效的抗疟药品，并被51个国家列为首选用药。进一步的药理研究证明，青蒿素及其相似物对多种人类和动物肿瘤细胞均具有毒性作用，包括乳腺癌细胞、血癌细胞、黑色素瘤细胞、肾癌细胞、中枢神经系统肿瘤细胞、肺癌细胞、前列腺癌细胞等，而对正常细胞损伤很小，并且与传统化疗药不存在交叉耐药。因此，青蒿素及其生物合成前体化合物有望被开发成高效、低毒、价廉、谱广的抗癌新药，具有广泛的应用前景，从而导致青蒿素的市场进一步扩大，青蒿素的需求量将进一步上升。目前商品化的青蒿素均是从黄花蒿中提取分离精制而成，而分离精制的方法都是采用结晶和硅胶柱层析技术，这些方法产率低、耗时、耗力，且只能获得青蒿素，而无法分离青蒿酸和二氢青蒿酸。研究业已表明，青蒿酸或二氢青蒿酸的含量远高于青蒿素，且青蒿酸和二氢青蒿酸很容易通过化学方法转化得到青蒿素。因此，目前的青蒿素提取方法，只得到少量的青蒿素，而大部分的能转化成青蒿素或自身也有高价值的化合物被丢弃，从而导致资源的极大浪费。
发明内容：
本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种反相高效液相色谱法分离精制青蒿素、青蒿酸和二氢青蒿酸的方法，该法是将黄花蒿原材料初步提取后，采用高效液相色谱法对粗提取物进行进一步分离精制。该法制率高、稳定性好，分离效果好，上样量大，可同时制备青蒿素、青蒿酸和二氢青蒿酸，产品纯度达到96％以上。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种反相高效液相色谱法分离精制青蒿素、青蒿酸和二氢青蒿酸的方法，该方法包括如下顺序的步骤：
a、于青蒿粗提物中按每4g粗提物加1mL乙腈的比例加入乙腈，重悬，真空抽滤，将滤液过0.45μm微孔滤膜；
b、将上述过滤液利用反相高效液相色谱法，在以下条件下进行分离：
色谱柱：Shimadzu PRC-ODS C18反相柱，内径20-50mm，长度250mm；
色谱条件：流动相为乙腈-水溶液，体积比为60∶40，流速15-100mL/min，检测波长192nm，柱温40℃，进样量400-2000μL；
c、将青蒿素、青蒿酸和二氢青蒿酸标准品配制成溶液，以反相高效液相色谱法在上述相同色谱条件下确定青蒿素、青蒿酸和二氢青蒿酸标准品的出峰时间(保留时间)，根据确定的出峰时间来分别收集青蒿素、青蒿酸和二氢青蒿酸馏分(见图1)，再真空浓缩至溶剂挥干得到三组分，青蒿素组分以石油醚重结晶得到青蒿素晶体，青蒿酸和二氢青蒿酸组分分别以乙酸乙酯结晶得到青蒿酸和二氢青蒿酸晶体。
上述步骤a中的青蒿粗提物是于含水率小于10％的干燥黄花蒿中按每100g干燥黄花蒿加600-1000mL石油醚的比例加入石油醚，60℃回流提取3次，每次1h，合并提取液，过滤，真空回收石油醚，得到粗提取物。
上述得到的三种晶体，可采用气相色谱法，根据青蒿素、二氢青蒿酸和青蒿酸标准品的出峰时间(保留值)来鉴定相应的晶体化合物。根据色谱峰的出峰时间(保留值)比较，就是说在相同的色谱条件下保留值一致时，认为是同一物质。气相色谱条件如下：FID检测器，HP-5.0弹性石英毛细管柱(30m×0.32mm×0.25μm)，高纯氮气(99.999％)为载气，流速3mL/min，高纯氮气40mL/min尾吹，进样口温度235℃，检测器温度285℃，分流比1∶1，进样量1μL。柱升温程序：初始温度180℃，以6℃/min升至220℃后，保持3min，以30℃/min升至280℃，保持10min。
本发明与现有技术相比，具有以下的优点：
1、实现了同时分离制备青蒿素、二氢青蒿酸以及青蒿酸。由于青蒿酸和二氢青蒿酸均能低成本地转化为青蒿素，从而大幅度提高了青蒿素生产量，并降低了生产成本。此外，青蒿酸和二氢青蒿酸本身也是具有重要药理价值的化合物，应用非常广阔。
2、上样量大，在实现完全分离的条件下，一次上样量可高达8g。
3、产品纯度达96％以上。
4、工艺稳定性好，自动化程度高。
5、分离速度快，30分钟内完成粗提物的分离。
附图说明：
图1是本发明以高效液相色谱法分离青蒿素、二氢青蒿酸和青蒿酸的在线色谱图。图中：峰1为青蒿素、峰2为二氢青蒿酸、峰3为青蒿酸。
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明作进一步地详述。
实施例1
称取黄花蒿干样100g，加入800mL石油醚，60℃回流提取3次，每次1h，合并提取液，过滤，真空回收石油醚，得4.6g粗提取物，加入1.15mL乙腈重悬，真空抽滤，将滤液过0.45μm微孔滤膜，上制备型高效液相色谱，采用如下制备色谱条件：用Shimadzu PRC-ODS，反相柱，内径20mm，长度250mm；流动相为乙腈/水(体积比为60∶40)；流速15mL/min；检测波长为192nm；柱温40℃；进样量为400μL。同时将青蒿素、青蒿酸和二氢青蒿酸标准品配制成溶液，以反相高效液相色谱法在上述相同色谱条件下确定的青蒿素、青蒿酸和二氢青蒿酸标准品的出峰时间(保留时间)，来分别收集青蒿素、二氢青蒿酸和青蒿酸馏分，浓缩，结晶得青蒿素、二氢青蒿酸和青蒿酸纯品，产品重量分别为0.56g、1.97g和1.13g，纯度分别为99.6％、98.3％和98.9％。
实施例2
称取黄花蒿干样200g，加入1.6L石油醚，60℃回流提取3次，每次1h，合并提取液，过滤，真空回收石油醚，得9.4g粗提取物，加入2.35mL乙腈重悬，真空抽滤，将滤液过0.45μm微孔滤膜，上制备型高效液相色谱，采用如下制备色谱条件：用Shimadzu PRC-ODS，反相柱，内径30mm，长度250mm；流动相为乙腈/水(体积比为60∶40)，流速40mL/min；检测波长为192nm；柱温40℃；进样量800μL。同时将青蒿素、青蒿酸和二氢青蒿酸标准品配制成溶液，以反相高效液相色谱法在上述相同色谱条件下确定的青蒿素、青蒿酸和二氢青蒿酸标准品的出峰时间(保留时间)，来分别收集青蒿素、二氢青蒿酸和青蒿酸馏分，浓缩，结晶得纯品，产品重量分别为1.20g、3.98g和2.32g，产品纯度分别为99.2％、98.5％和99.1％。
实施例3
称取黄花蒿干样500g，加入4L石油醚，60℃回流提取3次，每次1h，合并提取液，过滤，真空回收石油醚，得24.6g粗提取物，加入6.15ml乙腈重悬，真空抽滤，将滤液过0.45μm微孔滤膜，上制备型高效液相色谱柱，采用如下制备色谱条件：用Shimadzu PRC-ODS，反相柱，内径50mm，长度250mm；流动相为乙腈/水(体积比为60∶40)，流速100mL/min；检测波长为192nm；柱温40℃；进样量2mL。同时将青蒿素、青蒿酸和二氢青蒿酸标准品配制成溶液，以反相高效液相色谱法在上述相同色谱条件下确定的青蒿素、青蒿酸和二氢青蒿酸标准品的出峰时间(保留时间)，来分别收集青蒿素、二氢青蒿酸和青蒿酸馏分，浓缩，结晶得纯品，产品重量分别为2.91g、9.94g和5.71g，产品纯度分别为98.8％、96.9％和98.1％。
Claims (1)
1.一种反相高效液相色谱法分离精制青蒿素、二氢青蒿酸和青蒿酸的方法，其特征在于：该方法包括如下顺序的步骤：
a、于青蒿粗提物中按每4g粗提物加1mL乙腈的比例加入乙腈，重悬，真空抽滤，将滤液过0.45μm微孔滤膜；
上述青蒿粗提物是于含水率小于10％的干燥黄花蒿中按每100g干燥黄花蒿加600-1000mL石油醚的比例加入石油醚，60℃回流提取3次，每次1h，合并提取液，过滤，真空回收石油醚，得到；
b、将上述过滤液利用反相高效液相色谱法，在以下条件下进行分离：
色谱柱：Shimadzu PRC-ODS C18反相柱，内径20-50mm，长度250mm；色谱条件：流动相为乙腈-水溶液，体积比为60∶40，流速15-100mL/min，检测波长192nm，柱温40℃，进样量400-2000μL；
c、根据青蒿素、青蒿酸和二氢青蒿酸标准品配制的溶液以反相高效液相色谱法在上述相同色谱条件下确定的组分出峰时间，分别收集青蒿素、青蒿酸和二氢青蒿酸馏分，再真空浓缩至溶剂挥干得到三组分，青蒿素组分以石油醚重结晶得到青蒿素晶体，青蒿酸和二氢青蒿酸组分分别以乙酸乙酯结晶得到青蒿酸和二氢青蒿酸晶体。
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