CN102124117B

CN102124117B - 使用木糖利用发酵单胞菌属的木糖醇合成突变体的乙醇生产

Info

Publication number: CN102124117B
Application number: CN200780035804.3A
Authority: CN
Inventors: P·V·维塔宁; C·M·麦卡钦; M·安普塔奇; P·G·凯米; M·张; Y·-C·仇
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co; Alliance for Sustainable Energy LLC
Current assignee: Alliance for Sustainable Energy LLC; EIDP Inc
Priority date: 2006-09-28
Filing date: 2007-09-28
Publication date: 2014-01-01
Anticipated expiration: 2027-09-28
Also published as: US20080187973A1; US7741084B2; CA2659443A1; DE602007005823D1; CN102124117A; WO2008051348A2; JP2010504756A; BRPI0715285A2; JP5185940B2; WO2008051348A3; EP2066797B1; EP2066797A2

Abstract

发现使用具有葡萄糖-果糖氧化还原酶基因的遗传修饰的木糖利用发酵单胞菌属菌株的乙醇生产由于极大减少的木糖醇生产而得到改善，所述木糖醇是在发酵期间合成的木糖代谢的有害副产物。

Description

使用木糖利用发酵单胞菌属的木糖醇合成突变体的乙醇生产

本申请要求于2006年9月28日提交的美国临时申请号60/847856的利益，所述申请为了所有目的整体引入作为其部分。

政府权利的声明

本发明在由能源部(Department of Energy)授予的合同号04-03-CA-70224和DE-FC36-03GO13146下的美国政府支持下进行。政府在本发明中具有一定权利。

发明领域

本发明涉及微生物学和基因工程领域。更具体而言，发现使用木糖利用发酵单胞菌属(Zymomonas)菌株的乙醇生产由于木糖醇极大减少的生产而得到改善，所述菌株具有葡萄糖-果糖氧化还原酶基因的遗传修饰，所述木糖醇是在发酵期间合成的木糖代谢的有害副产物。

发明背景

经由微生物的乙醇生产提供了关于矿物燃料的代用能源且因此是本研究的重要领域。运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)是在葡萄糖、果糖和蔗糖上生长的细菌产乙醇生物(ethanologen)，经由Entner-Douderoff途径将这些糖代谢成CO₂和乙醇。尽管野生型菌株不能使用木糖作为碳源，但已人工改造了能够在这种糖上生长的运动发酵单胞菌的重组菌株(US 5514583，US 5712133，WO 95/28476，Feldmann等人(1992)Appl Microbiol Biotechnol 38：354-361，Zhang等人(1995)Science 267：240-243)。木糖是在水解的木素纤维素材料中的主要戊糖，并且因此可以提供大量可用的、低成本碳底物用于在发酵中使用。运动发酵单胞菌已人工改造用于表达木糖代谢所需的4种酶：1)木糖异构酶，其催化木糖至木酮糖的转化；2)木酮糖激酶，其使木酮糖磷酸化以形成木酮糖5-磷酸；3)转酮醇酶；和4)转醛醇酶(US 5514583，US 6566107；Zhang等人(1995)Science 267：240-243)。通过这4种酶和细胞的正常代谢机器的组合作用，将3个木糖分子转化成2个葡萄糖6-磷酸分子和1个甘油醛3-磷酸分子，其随后在该途径的葡萄糖侧转化成乙醇和CO₂(参见图1)。

尽管在人工改造运动发酵单胞菌菌株用于木糖代谢中已取得成功，但该菌株不如在葡萄糖上一样好地在木糖上生长且生产乙醇。引起在木糖上差的生长的一个因素是作为木糖代谢的副产物的木糖醇生产(Feldmann等人同上；Kim等人(2000)Applied and EnvironmentalMicrobiology 66：186-193)。木糖醇通过木酮糖激酶进行磷酸化以生产木糖醇5-磷酸，其在细胞中积聚且抑制细菌生长。木糖醇合成还减少乙醇的产量，因为运动发酵单胞菌的木糖利用重组菌株不能将木糖醇转化成乙醇。此外，木糖醇是木糖异构酶的有力抑制剂(Smith等人(1991)Biochem J.277：255-261)，其催化人工改造的木糖代谢途径中的木糖利用的第一个步骤。关于显示木糖醇合成和作用的图解参见图2。

负责体内木糖醇合成的生理学途径和酶仍未被确定。然而，已证实当来自野生型运动发酵单胞菌的无细胞提取物补充有NADPH时，它们能够使木糖还原成木糖醇(Feldmann等人，同上)，并且这个反应由NADPH依赖性醛糖还原酶催化。还已显示无NADPH补充的，运动发酵单胞菌的无细胞提取物能够将少量木糖转化成木糖醇，并且当也向反应混合物中添加纯化的木糖异构酶时，在这些条件下的木糖醇生产增加3-4倍(Danielson，2001，University of Colorado Masters Thesis)。因为木糖异构酶能够将木糖转化成木酮糖，所以后一实验的明确暗示是运动发酵单胞菌酶葡萄糖-果糖氧化还原酶(GFOR)可以使用木糖作为电子供体和木酮糖作为电子受体以产生木糖醇，如在下文将更详细地讨论的。因此，基于体外实验在运动发酵单胞菌中存在关于木糖醇生产的至少2种途径，但它们在生理条件下有助于木糖醇形成的程度有待确定。

对于高水平的乙醇生产，运动发酵单胞菌在高浓度的可发酵的碳源中生长，这可以导致渗透压休克。当野生型菌株被转移至包含＞200g/L葡萄糖或果糖或＞360g/L蔗糖的液体培养基时，渗透压休克自身表现为在生长开始前的长滞后期(Loos等人(1994)J Bacteriol 176：7688-7693)。此外，当野生型菌株被转移至高浓度的这些糖时，向生长培养基添加山梨糖醇缩短滞后期(Wiegert等人(1996)Arch Microbiol 166：32-41，Loos等人同上)。

还已显示，当野生型运动发酵单胞菌在葡萄糖和果糖的浓缩混合物(Loos等人同上)中或者蔗糖的浓缩溶液(Wiegert等人同上，Loos等人同上)中生长时，周质酶葡萄糖-果糖氧化还原酶(GFOR)在渗透平衡中起重要作用。简言之，如图解I中所示，GFOR与其紧密结合的辅因子在经典乒乓Bi(Ping Pong Bi)机制中催化葡萄糖至葡糖酸内酯的氧化和果糖至山梨糖醇的后续还原。在周质间隙中产生的山梨糖醇被逆着浓度梯度转运到细胞内，在其中它积聚至高水平，因为它不被进一步代谢。细胞内高浓度的山梨糖醇消除了跨越质膜的渗透压力差且恢复渗透平衡。

不能产生山梨糖醇的野生型运动发酵单胞菌的自发突变体显示，当它在低浓度的蔗糖上生长时(＜150g/L)，生产比野生细胞更高水平的乙醇，但这种菌株不能在高浓度的蔗糖上生长(Kirk和Doelle(1993)Biotechnol.Letters 15：985-990)。这种突变体随后显示缺乏葡萄糖-果糖氧化还原酶(GFOR)的表达，这解释了它不能将任何蔗糖衍生的果糖转化成不希望有的副产物山梨糖醇(Wiegert等人同上)。还已显示山梨糖醇缺陷突变体在高浓度的蔗糖中的生长可以通过向生长培养基添加山梨糖醇得到恢复(Wiegert等人，同上)。因此当运动发酵单胞菌在葡萄糖和果糖的浓缩混合物中或者高浓度的蔗糖中生长时，GFOR通过合成山梨糖醇在渗透平衡中起关键作用，所述蔗糖通过宿主细胞的转化酶水解成葡萄糖和果糖。

图解I

CN1600850(A)公开了具有灭活的GFOR基因的运动发酵单胞菌的非木糖利用突变株，以及使用这种菌株的乙醇生产。当葡萄糖、果糖或蔗糖是碳源时，使用这种菌株的山梨糖醇生产的缺乏导致更高水平的乙醇。

减少或消除运动发酵单胞菌的人工改造的木糖利用菌株中葡萄糖-果糖氧化还原酶活性的作用未知，所述菌株在木糖和葡萄糖的混合物上生长(在不存在任何添加的蔗糖或果糖的情况下)。

待解决的问题是使用在包含木糖的培养基上生长的木糖利用运动发酵单胞菌菌株如何在发酵中生产增加量的乙醇。申请人已通过下述解决了该问题，确定关于在体内木糖醇生产的本质途径且通过基因失活消除负责其形成的酶活性，从而生成了可以用于改善的乙醇生产的运动发酵单胞菌菌株。

发明概述

本发明涉及使用发酵单胞菌属菌株用于乙醇生产的方法，当在木糖的存在下生长时，所述菌株具有减少的木糖醇生产和增加的乙醇生产。申请人已发现在木糖代谢运动发酵单胞菌中的木糖醇生产主要由葡萄糖-果糖氧化还原酶(GFOR)介导。构建不表达GFOR的遗传修饰菌株(GFOR敲除突变体)，且发现其当在包含木糖的糖混合物上生长时生产减少量的木糖醇。当在山梨糖醇的存在下在高糖混合物中生长时，GFOR敲除突变体还比表达GFOR的亲本菌株消耗更多的木糖且生产更高浓度的乙醇。此外，乙醇产量(消耗的每克糖生产的乙醇量)对于GFOR敲除菌株明显更高。

因此，本发明提供了用于生产乙醇的方法，其包括，

a)提供能够利用木糖以生产乙醇的重组发酵单胞菌属菌株，所述菌株包含减少葡萄糖-果糖氧化还原酶活性的至少一种遗传修饰，和

b)在包含木糖的培养基中培养(a)的菌株，由此将木糖转变成乙醇。

上述方法提供了相对于不含至少一种遗传修饰的重组发酵单胞菌属菌株，木糖至乙醇改善的转化，所述遗传修饰减少葡萄糖-果糖氧化还原酶活性。

相对于不含至少一种遗传修饰的重组发酵单胞菌属菌株，该方法具体改善木糖转化成乙醇的参数比率、滴度或产量中的一种或多种，所述遗传修饰减少葡萄糖-果糖氧化还原酶活性。

在本发明的一个方面，与不含至少一种遗传修饰的发酵单胞菌属菌株相比较，本文描述的方法在上文(a)的菌株生产减少量的木糖醇或无木糖醇方面改善，所述遗传修饰减少葡萄糖-果糖氧化还原酶活性。

附图简述、生物保藏和序列描述

根据形成本申请的部分的下列详细描述、图和伴随的序列描述，可以更充分地理解本发明。

图1显示已用于人工改造运动发酵单胞菌用于木糖利用的4种酶(有方框的)和使用木糖用于乙醇生产的生物化学途径的图解。

图2显示人工改造的木糖途径的前2个步骤(有方框的)、木糖醇合成、木糖醇5-磷酸形成(有毒的死端式中间物)和经由木糖醇抑制木糖异构酶的图解。

图3显示关于转酮醇酶(A)、转醛醇酶(B)、木糖异构酶(C)和木酮糖激酶(xyulokinase)(D)的酶测定的策略。

图4显示pMODPgaptaltktCm的质粒图。

图5显示pMODPgapxylABCm的质粒图。

图6显示在用PgapxylAB转化的T2C、T3C、T4C和T5C系中木糖异构酶(XI)和木酮糖激酶(XK)活性的图表。

图7显示在用PgapxylAB转化的T2C、T3C、T4C和T5C系中转醛醇酶(transaldolse)(TAL)和转酮醇酶(TKT)活性的图表。

图8显示所选择的适应的木糖利用菌株菌落的理论乙醇产量％和木糖利用％的图表。

图9显示在含5％葡萄糖的RM(RMG)中生长50代前和后适应的木糖利用菌株在含5％木糖的RM(丰富培养基)(RMX5％)上在70小时时的生长图表。

图10显示与对照8b相比较，关于所选择的菌株ZW658在RM+10％葡萄糖(RMG10％)(A，B)和RM+8％木糖(RMX8％)(C，D)中的生长、葡萄糖或木糖利用、以及乙醇和木糖醇生产的图表。

图11显示与对照8b相比较，关于所选择的菌株ZW658在不含乙酸盐(A，B)或含0.6％乙酸盐(C，D)的RM+10％葡萄糖和8％木糖中的生长、葡萄糖和木糖利用、以及乙醇和木糖醇生产的图表。

图12显示在用于GFOR基因的插入失活的自杀构建体的构建期间制备的质粒的图和最终产物：GFORSp-9WW。

图13显示用于构建木糖异构酶表达质粒pZB188/Kan-XylA制备的质粒的图，和用于这种构建体的大肠杆菌(E.coli)木糖异构酶表达盒(有方框的)的图解。

图14显示在木糖异构酶表达的存在和不存在下，通过含和不含GFOR基因失活的ZW1菌株的木糖醇和木糖生产的图表。

图15显示在97g/L总木糖+葡萄糖上生长的，不含(A)和含(B)GFOR基因失活的木糖利用运动发酵单胞菌菌株的生长、葡萄糖和木糖利用以及乙醇生产的图表。

图16显示在188g/L总木糖+葡萄糖上生长的，不含(A)和含(B)GFOR基因失活的木糖利用运动发酵单胞菌菌株的生长、葡萄糖和木糖利用以及乙醇生产的图表。

图17显示在不同浓度的山梨糖醇的存在下，含GFOR基因失活的木糖利用运动发酵单胞菌菌株的生长图表。

图18显示在174g/L总木糖+葡萄糖中在乙酸盐的不存在(A，B)和存在(C，D)下，不含(A，C)和含(B，D)GFOR基因失活的木糖利用运动发酵单胞菌菌株的木糖利用、乙醇生产和木糖醇生产的图表。

图19显示在203g/L总木糖+葡萄糖中在乙酸盐的不存在(A，B)和存在(C，D)下，不含(A，C)和含(B，D)GFOR基因失活的木糖利用运动发酵单胞菌菌株的木糖利用、乙醇生产和木糖醇生产的图表。

图20显示在含另外的碳酸氢钾(bicarbarbonate potassium)用于增加的缓冲能力的203g/L总木糖+葡萄糖中在乙酸盐的不存在(A，B)和存在(C，D)下，不含(A，C)和含(B，D)GFOR基因失活的木糖利用运动发酵单胞菌菌株的木糖利用、乙醇生产和木糖醇生产的图表。

图21显示在pH受控的发酵运行中在189g/L总木糖+葡萄糖中在乙酸盐的存在下，含GFOR基因失活的木糖利用运动发酵单胞菌菌株的木糖和葡萄糖利用、乙醇生产和木糖醇生产的图表。

图22显示可以在运动发酵单胞菌中复制的Cre表达载体，pZB188/Kan和pZB188/kan-Cre的质粒图。

图23A显示ZW801-4和ZW800在含乙酸盐的高葡萄糖+木糖中在pH受控条件下的生长的比较。图23B显示与ZW800相比较，关于ZW801-4的葡萄糖和木糖利用以及乙醇生产的图表。

图24显示在ZW801-4中翻译的突变序列与野生型GFOR蛋白质的比对。

根据构成本申请的部分的下列详细描述和伴随的序列描述，可以更充分地理解本发明。

下述序列符合37 C.F.R.1.821-1.825(“Requirements for PatentApplications Containing Nucleotide Sequences and/or Amino AcidSequence Disclosures-the Sequence Rules”)，且与EPO和PCT的世界知识产权组织(World Intellectual Property Organization)(WIPO)标准ST.25(1998)和序列表要求一致(Administrative Instructions的规则5.2和49.5(a-bis)以及部分208和附录C)。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和形式遵守37 C.F.R.§1.822中描述的规则。

序列表在光盘上并此提供。包含序列表的光盘的内容遵照37 CFR1.52(e)在此引入作为参考。光盘一式两份提交且彼此相同。盘标记为“Copy 1-Sequence Listing”和“Copy 2 Sequence listing”。盘包含下述文件：CL3662 seq list.ST25。

SEQ ID NOs：1和2是用于扩增包含来自pZB4的甘油醛3-磷酸脱氢酶基因启动子(P_gap)的DNA片段的引物的核苷酸序列。

SEQ ID NOs：3和4是用于扩增包含来自pZB4的tal编码区的DNA片段的引物的核苷酸序列。

SEQ ID NOs：5和6是用于扩增包含来自P_gap和tal片段的P_gaptal的DNA片段的引物的核苷酸序列。

SEQ ID NOs：7和8是用于扩增包含来自pZB186的loxP::Cm的DNA片段的引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：9是关于pMODP_gaptaltktCm质粒的全核苷酸序列。

SEQ ID NOs：10和11是用于扩增在接受pMODP_gaptaltktCm的转化体中包含tal和tkt编码区的3kb DNA片段的引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：12是关于pMODP_gapxylABCm质粒的全核苷酸序列。

SEQ ID NOs：13和14是用于扩增来自含pMODP_gapxylABCm的T2C、T3C、T4C和T5C整合体的1.6kb PgapxylA DNA片段的引物的核苷酸序列。

SEQ ID NOs：15和16是用于扩增来自含pMODP_gapxylABCm的T2C、T3C、T4C和T5C整合体的1.3kb xylB DNA片段的引物的核苷酸序列。

SEQ ID NOs：17和18是用于扩增来自运动发酵单胞菌W1基因组DNA的2268bp DNA frag的引物的核苷酸序列，所述DNA frag包含pgm基因的3′末端的部分、ldh基因和adhl基因的5′末端的部分。

SEQ ID NOs：19和20是用于扩增来自pACYC184的四环素抗性盒的引物的核苷酸序列。

SEQ ID NOs：21和22是用于生成loxP位点的寡核苷酸序列。

SEQ ID NOs：23和24是用于生成loxP位点的寡核苷酸序列。

SEQ ID NOs：25和26是用于扩增来自pHP15578的Spec^r盒的引物的核苷酸序列。

SEQ ID NOs：27和28是用于扩增来自ZW1基因组DNA的3’GFOR侧翼DNA的引物的核苷酸序列。

SEQ ID NOs：29和30是用于扩增来自ZW1基因组DNA的5’GFOR侧翼DNA的引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：31是pGFORSp-9WW质粒的核苷酸序列。

SEQ ID NOs：32和33是用于扩增来自pET-24a的Kan^r盒的引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：34是衍生自pZB4的大肠杆菌xylA表达盒的核苷酸序列。

SEQ ID NOs：35和36是用于扩增Cre表达盒的引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：37是ZW801-4中破坏的GFOR编码区的全核苷酸序列(从原始起始密码子到原始终止密码子)，SEQ ID NO：38是野生型GFOR编码区的全核苷酸序列(从原始起始密码子到原始终止密码子)。

申请人根据国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约(Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit ofMicro-organisms for the Purposes of Patent Procedure)的条款在美国典型培养物保藏中心(ATCC)10801 University Boulevard，Manassas，VA20110-2209进行下述生物保藏：

详述

本发明描述了使用具有减少的GFOR酶活性的经遗传修饰的木糖利用发酵单胞菌属菌株用于从发酵生产乙醇的方法。该方法中使用的木糖利用重组发酵单胞菌属被用葡萄糖-果糖氧化还原酶(GFOR)基因中的至少一种修饰进一步人工改造，从而使得活性酶的表达得到减少或消除。申请人显示GFOR酶活性的消除导致在木糖代谢期间减少的木糖醇生产和增强的乙醇生产。由新发酵单胞菌属菌株产生的乙醇可以用作关于矿物燃料的代用能源。

下述缩写和定义将用于解释说明书和权利要求书。

“葡萄糖-果糖氧化还原酶”被缩写为GFOR。

RM是丰富培养基。

RMG5％是RM+5％葡萄糖。

RMG10％是RM+10％葡萄糖。

RMX8％是RM+8％木糖。

RMX2％是RM+2％木糖。

RMX5％是RM+5％木糖。

RMGX10％8％是RM+10％葡萄糖和8％木糖。

RMGX5％8％是RM+5％葡萄糖和8％木糖。

“基因”指表达特定蛋白质的核酸片段，包括在编码序列前(5′非编码序列)和后(3′非编码序列)的调节序列。“天然基因”或“野生型基因”指如在自然界中与其自身的调节序列一起发现的基因。“嵌合基因”指并非天然基因的任何基因，包含在自然界中未一起发现的调节和编码序列。因此，嵌合基因可以包含衍生自不同来源的调节序列和编码序列，或衍生自相同来源但以不同于自然界中发现的那种的方式排列的调节序列和编码序列。“内源基因”指在生物的基因组中处于其天然位置中的天然基因。“外来”基因指在宿主生物中通常未发现但通过基因转移引入宿主生物内的基因。外来基因可以包含插入非天然生物内的天然基因或嵌合基因。

术语“遗传构建体”指编码用于表达一种或多种特定蛋白质的核酸片段。在基因构建体中，基因在性质中可以是天然的、嵌合的或外来的。一般地遗传构建体将包含“编码序列”。“编码序列”指编码特定氨基酸序列的DNA序列。

“启动子”或“起始控制区”指能够控制编码序列或功能RNA表达的DNA序列。一般而言，编码序列位于启动子序列的3′。启动子可以整体衍生自天然基因，或由衍生自在自然界中发现的不同启动子的不同元件组成，或甚至包含合成DNA区段。本领域技术人员理解不同启动子可以指导基因在不同组织或细胞类型中、或在不同发育阶段、或响应不同环境条件的表达。引起基因在大多数细胞类型中在大多数时间表达的启动子通常称为“组成型启动子”。

如本文所使用的，术语“表达”指衍生自基因的有义(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积聚。表达还可以指mRNA翻译成多肽。“反义抑制”指能够抑制靶蛋白的表达的反义RNA转录物的生产。“超表达”指在转基因生物中超过正常或非转化生物的生产水平的基因产物的生产。“共抑制”指能够抑制相同或基本上相似的外来或内源基因表达的有义RNA转录物的生产(U.S.5,231,020)。

如本文所使用的，术语“信使RNA(mRNA)”指不含内含子且能够由细胞翻译成蛋白质的RNA。

如本文所使用的，术语“非功能性基因”指不像在其中基因是内源的野生型菌株一样正常表达所编码的蛋白质的基因。非功能性基因的表达可以在任何水平上进行破坏，例如转录、RNA加工或翻译。非功能性基因通常具有所编码的蛋白质的很少表达或无表达。然而，它还可以编码具有比野生型蛋白质低的酶活性的经修饰的蛋白质。

如本文所使用的，术语“转化”指核酸片段转移到宿主生物内，从而导致遗传上稳定的遗传。经转移的核酸可以是维持在宿主细胞中的质粒的形式，或一些经转移的核酸可以整合到宿主细胞的基因组内。包含经转化的核酸片段的宿主生物被称为“转基因”或“重组”或“经转化的”生物。

如本文所使用的，术语“质粒”和“载体”指通常携带基因的染色体外元件，所述基因并非细胞的中心代谢的部分，且通常为环状双链DNA分子的形式。此种元件可以是自主复制序列，基因组整合序列，噬菌体或核苷酸序列，线性或环状，单链或双链DNA或RNA，衍生自任何来源，其中许多核苷酸序列已连接或重组成独特的构建体，其能够将关于所选择的基因产物的启动子片段和DNA序列连同合适的3′非翻译序列引入细胞内。

术语“可操作地连接”指核酸序列在单个核酸片段上的结合，从而使得一种的功能受另一种的影响。例如，当启动子序列能够影响编码序列的表达时(即，编码序列在启动子的转录控制下)，所述启动子与那种编码序列可操作地连接。编码序列可以以有义或反义方向与调节序列可操作地连接。

术语“选择标记”意指鉴定因子，通常是抗生素或化学抗性基因，其能够基于标记基因的作用进行选择，即对于抗生素的抗性，其中所述作用用于追踪目的核酸的遗传和/或鉴定已遗传目的核酸的细胞或生物。

术语“基本上消除的”木糖醇生产和“基本上无”副产物木糖醇指其中使用一般的实验室分析检测出的木糖醇的量接近于零的情况。

术语“高浓度的混合糖”指培养基中导致抑制GFOR突变木糖利用运动发酵单胞菌的生长的总糖浓度。这一般超过约100g/L，尽管确切浓度可能依赖于培养基中的其他组分而变。

术语“可发酵糖”指在发酵过程中可以由微生物用作碳源的寡糖和单糖。

术语“木素纤维素的”指包含木素和纤维素的组合物。木素纤维素材料还可以包含半纤维素。

术语“纤维素的”指包含纤维素和另外组分包括半纤维素的组合物。

术语“糖化作用”指来自多糖的可发酵糖的生产。

术语“预处理的生物质”意指在糖化作用前已实施预处理的生物质。

“生物质”指任何纤维素或木素纤维素材料且包括这样的材料，其包含纤维素且任选进一步包含半纤维素、木素、淀粉、寡糖和/或单糖。生物质还可以包含另外组分，例如蛋白质和/或脂质。生物质可以衍生自单一来源，或生物质可以包含衍生自超过一种来源的混合物；例如，生物质可以包含玉米穗轴和玉米秸秆的混合物，或草和叶的混合物。生物质包括但不限于生物能农作物、农业废物、城市固体废物、工业固体废物、来自纸制造的淤渣、院子废物、木材和林业废物。生物质的例子包括但不限于玉米粒，玉米穗轴，农作物残渣例如玉米壳，玉米秸秆，草，小麦，小麦秸秆，大麦，大麦秸秆，干草，稻草，柳枝稷，废纸，甘蔗渣，高粱，大豆，得自谷粒、树、枝、根、叶、木片、锯屑、灌木和矮树丛的碾磨的组分，蔬菜，水果，花和牲畜粪。

“生物质水解产物”指起因于生物质的糖化作用的产物。生物质还可以在糖化作用前进行预处理。

本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域众所周知的且由下述参考文献进行描述：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版；Cold Spring HarborLaboratory：Cold Spring Harbor，New York，1989(下文为“Maniatis”)；以及Silhavy，T.J.，Bennan，M.L.和Enquist，L.W.Experiments with GeneFusions；Cold Spring Harbor Laboratory：Cold Spring Harbor，New York，1984；和Ausubel，F.M.等人，In Current Protocols in Molecular Biology，由Greene Publishing and Wiley-Interscience，1987出版。

本发明涉及使用木糖利用发酵单胞菌属的GFOR突变体用于从包含木糖的培养基生产乙醇的方法。具有减少的GFOR酶活性的木糖利用发酵单胞菌属的人工改造菌株具有增强的乙醇生产。关于经由木糖利用运动发酵单胞菌改善乙醇生产的挑战是减少或消除木糖醇的合成，其(a)代表无价值添加的碳槽(sink)；(b)抑制木糖利用的第一个步骤；和(c)磷酸化为抑制细菌生长的有毒的死端式中间物。申请人已发现内源酶GFOR主要负责体内木糖醇合成，并且通过减少或消除GFOR酶活性，改善来自木糖的乙醇生产(比率、产量和滴度)。

木糖利用发酵单胞菌属宿主菌株

能够利用木糖作为碳源的发酵单胞菌属的任何菌株都可以用作用于制备在本方法中使用的菌株的宿主。已人工改造用于木糖发酵成乙醇的运动发酵单胞菌的菌株是特别有用的。内源基因可以提供代谢途径的部分，或可以通过任何已知的基因操作技术加以改变，以提供具有对于木糖代谢有用的酶活性的蛋白质。例如，内源转酮醇酶可以补充在生成木糖利用途径中其他引入的酶活性。一般地4种基因已引入运动发酵单胞菌内用于表达涉及木糖代谢的4种酶(图1)，如US 5514583中描述的，所述专利在本文中引入作为参考。这些包括编码木糖异构酶(其催化木糖至木酮糖的转化)和木酮糖激酶(其使木酮糖磷酸化以形成木酮糖5-磷酸)的基因。此外，转酮醇酶和转醛醇酶，戊糖磷酸途径的2种酶，将木酮糖5-磷酸转化成中间物，所述中间物使戊糖代谢与糖酵解Entner-Douderoff途径偶联，从而允许木糖至乙醇的代谢。编码这些酶的DNA序列可以得自能够代谢木糖的众多微生物中的任何一种，例如肠细菌，以及一些酵母和真菌。关于编码区的来源包括黄单胞菌属(Xanthomonas)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、埃希氏菌属(Escherichia)、红细菌属(Rhodobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、醋杆菌属(Acetobacter)、葡糖杆菌属(Gluconobacter)、根瘤菌属(Rhizobium)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、沙门氏菌属(Salmonella)、假单胞菌属(Pseudomonads)和发酵单胞菌属(Zymomonas)。特别有用的是大肠杆菌的编码区。

编码DNA序列与在运动发酵单胞菌细胞中表达的启动子可操作地连接，所述启动子例如运动发酵单胞菌甘油醛3-磷酸脱氢酶的启动子(GAP启动子)，和运动发酵单胞菌烯醇化酶的启动子(ENO启动子)。编码区可以单独由启动子进行表达，或者2个或更多编码区可以在操纵子中进行连接由相同启动子表达。所得到的嵌合基因可以引入发酵单胞菌属内且在质粒上维持，或使用例如同源重组、位点定向整合或随机整合而整合到基因组内。特别有用的木糖利用菌株包括CP4(pZB5)(US5514583)，ATCC31821/pZB5(US 6566107)，8b(US 20030162271；Mohagheghi等人，(2004)Biotechnol.Lett.25；321-325)和ZW658(本文描述的；保藏的，ATTCC#PTA-7858)。

另外人工改造以利用并非其天然使用的除木糖外的糖的发酵单胞菌属菌株可以在本方法中使用。例子是如US 5843760中描述的经人工改造用于阿拉伯糖利用的运动发酵单胞菌的菌株，所述专利引入本文作为参考。

经由GFOR的木糖醇合成的发现

经由运动发酵单胞菌的木糖利用菌株的不希望有的副产物木糖醇的合成减少了乙醇的产量，且导致木糖醇5-磷酸的形成，所述木糖醇5-磷酸是抑制细菌生长的有毒的化合物(参见图2)。此外，木糖醇是木糖异构酶的有力抑制剂，所述木糖异构酶是用于木糖利用的人工改造途径中的第一种酶，并且所述木糖醇的合成减少了细胞代谢木糖的能力。尽管体外实验已确定存在关于运动发酵单胞菌中的木糖醇形成的至少2种途径(Feldmann等人同上，Danielson等人同上)，但申请人已发现生理学产生的大多数木糖醇是GFOR酶活性的结果。申请人已发现由在包含木糖的培养基上生长的利用木糖的运动发酵单胞菌菌株(或野生型运动发酵单胞菌的木酮糖合成衍生物)合成的木糖醇的量在不存在GFOR酶活性的情况下极大地减少。申请人还发现木糖至木酮糖的转化是关于体内GFOR介导的木糖醇生产的必要条件，并且这种反应仅可在表达木糖异构酶的运动发酵单胞菌菌株中发生。因此提出经人工改造以在木糖上生长的运动发酵单胞菌菌株中木糖醇的主要生理学来源经由反应之一或两者由GFOR合成，所述反应在图解II和III中描述。

图解II

图解III

注意到在2种方案中木酮糖充当关于GFOR的专性电子受体，并且和导致山梨糖醇生产的与果糖的已知反应形成对比，这种化合物还原成木糖醇(图解I)。尽管GFOR对于葡萄糖和果糖是相当特异的，但已显示它可以使用其他糖作为电子供体和电子受体，虽然相当弱(Zachariou和Scopes(1986)Journal of Bacteriology 167：863-869)。因此，当木糖和果糖与纯化的蛋白质温育时，观察到山梨糖醇生产，但和与葡萄糖的对照反应相比较，存在GFOR酶活性中约12倍的减少。在相同文章中显示木酮糖可以代替果糖作为电子受体，并且这种反应产生木糖醇，如图解III中所示。然而，使用底物的这种组合，存在GFOR酶活性中约14倍的减少。除了这些观察外，还已显示，当纯化的木糖异构酶加入反应混合物中以提供木酮糖的来源时(Danielson同上)，由野生型运动发酵单胞菌制备的无细胞提取物能够由木糖产生木糖醇，因此证实GFOR还可以催化在图解II中描述的反应。然而，这些GFOR介导的反应是否在活细胞中发生，并且如果它们在活细胞中发生的话，那么它们有助于体内木糖醇形成的程度在申请人的发现前仍有待确定。相同的不确定性与也存在于野生型运动发酵单胞菌无细胞提取物中的NADPH依赖性醛糖还原酶活性有关，其能够直接将木糖转化成木糖醇(Feldmann等人同上)。事实上，上文指出的用无细胞提取物的实验无一提供关于GFOR和NADPH依赖性醛糖还原酶对在方法相关条件下体外木糖醇形成的相对贡献的任何了解，更不用说在体内了。因此，GFOR主要负责运动发酵单胞菌菌株中的木糖醇生产的申请人的发现是令人惊讶的且由现有技术不能预料，所述运动发酵单胞菌菌株经人工改造以在生理条件下在包含木糖的培养基中在木糖上生长。

改变GFOR基因表达

在本方法中使用的木糖利用发酵单胞菌属菌株被这样人工改造，从而使得存在GFOR编码基因减少的表达或无表达，从而使得木糖醇合成得到减少。由本领域技术人员已知用于减少功能酶的存在的任何遗传修饰方法都可以用于改变GFOR表达。方法包括但不限于编码GFOR的整个基因或基因的部分的缺失，将DNA片段插入GFOR基因(在启动子或编码区中)内，从而使得蛋白质不表达或以较低水平表达，将突变引入GFOR编码区内，所述突变添加终止密码子或移码，从而使得功能蛋白质不表达，以及将一种或多种突变引入GFOR编码区内以改变氨基酸，从而使得表达无功能或较低酶促活性的蛋白质。此外，GFOR表达可以通过反义RNA或干扰RNA的表达进行阻断，并且可以引入导致共抑制的构建体。所有这些方法都可以由本领域技术人员利用编码GFOR的已知序列(SEQ ID NO：38)容易地实践。在全基因组序列中对于运动发酵单胞菌而言，GFOR编码序列周围的DNA序列在一些修饰程序中也是有用的，并且是可用的(GenBank登记#AE008692)。

如本文实施例3和5中示例的，用于生成遗传修饰的GFOR菌株的特别合适的方法是使用由GFOR侧翼DNA序列介导的同源重组，所述DNA序列限制(bounding)壮观霉素抗性基因或其他选择标记，导致选择标记插入GFOR编码区中，从而使得功能GFOR酶不表达。此外，选择标记可以由位点特异性重组位点限定范围，从而使得在相应的位点特异性重组酶的表达后，抗性基因从GFOR基因切除而不使后者再活化。位点特异性重组留下破坏GFOR酶的表达的重组位点。可以构建同源重组载体，以还在选择标记的切除后在GFOR基因中留下缺失，如本领域技术人员众所周知的。

优选完全消除GFOR的表达，然而，具有极大减少的GFOR表达的重组发酵单胞菌属菌株的使用也是本方法的实施方案。在这种情况下，非功能性GFOR基因指不以正常方式起作用，从而使得存在低于正常水平的GFOR酶。一些基因失活方法可以导致一些残留的低水平表达，例如共抑制。在本文中，经修饰的GFOR菌株指具有减少的或无GFOR酶活性的遗传修饰的菌株。

经由GFOR修饰的菌株的生长和乙醇生产

在本方法中使用的GFOR修饰的木糖利用发酵单胞菌属菌株在包含木糖的培养基中在其他糖的不存在或存在下(“混合糖”)生长。混合糖包括除木糖外的至少一种另外的糖。可以包括可以提供用于发酵单胞菌属细胞的代谢的能源的任何糖，或存在于包含木糖的混合物中存在的任何糖。希望在由生物质糖化作用生产的糖上生长GFOR修饰的木糖利用运动发酵单胞菌细胞。一般地生物质进行预处理，例如如专利申请WO2004/081185以及在共同拥有和共同未决的美国申请60/670437中描述的，并且然后用糖化作用酶进行处理，如Lynd，L.R.，等人(Microbiol.Mol.Biol.Rev.(2002)66：506-577)中综述的。生物质糖化作用产生一般可以包括木糖与葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、甘露糖和/或阿拉伯糖的混合物的糖。优选的是包括木糖和葡萄糖的混合糖组合物，其中可能存在另外的糖。

不同糖的比率在混合物中可以改变，其中木糖一般为糖的总量的至少约10％。优选地木糖为约40％-约60％。果糖存在于由一些生物质例如甘蔗渣的糖化作用生产的糖中，并且可以代替部分木糖或葡萄糖，从而使得木糖仍为糖混合物的至少约10％。此外，阿拉伯糖衍生自半纤维素，且因此是衍生自包含半纤维素的糖化生物质的混合糖的一般组分。

在其中木糖醇不能由木糖利用运动发酵单胞菌菌株(其并非GFOR修饰的菌株)生产的发酵条件下，GFOR修饰的木糖利用运动发酵单胞菌菌株生长且生产可与非GFOR修饰的菌株比较的乙醇。例如，在低糖培养基中，例如在具有葡萄糖与木糖5∶4比率的约100g/L混合糖下，GFOR修饰的木糖利用运动发酵单胞菌细胞类似于非GFOR修饰的菌株运行。

对于最大的乙醇生产和发酵效率，希望在包含高水平的糖(包括木糖)的培养基中生长木糖利用产乙醇生物。混合糖可以在本方法中在用于GFOR修饰的木糖利用运动发酵单胞菌菌株生长的培养基中以高浓度使用。这允许生物质糖化作用糖的直接使用，或以小稀度使用，由此减少发酵体积，这对于商业规模乙醇生产是需要的。使用高糖浓度，从而使得可以生产更大浓度的乙醇。发酵培养基中的混合糖浓度一般为至少约120g/L且最高达约300g/L。特别有用的是约150g/L-约235g/L的高浓度的混合糖。

在生产乙醇所需的高浓度混合糖条件下，山梨糖醇包括在用于GFOR修饰的木糖利用运动发酵单胞菌的发酵培养基中。申请人惊讶地发现给高混合糖培养基中添加山梨糖醇允许GFOR修饰的木糖利用运动发酵单胞菌的良好生长，反之不包括山梨糖醇，GFOR修饰的木糖利用运动发酵单胞菌显示很少的或无生长。这与GFOR生产菌株形成鲜明对比，所述GFOR生产菌株在12-36小时的滞后期后能够适应不含山梨糖醇添加的浓缩糖混合物。在缺乏果糖或蔗糖(作为果糖的来源)的培养基中，未预料到GFOR可以合成山梨糖醇或在渗透适应中起作用。在生长培养基中不存在果糖，图解I中所示的用于山梨糖醇合成的GFOR的已知反应不能进行。具有正常的GFOR酶活性的木糖利用运动发酵单胞菌菌株在葡萄糖和木糖的浓缩混合物(mizture)中生长的能力，尽管具有长滞后期，暗示经由GFOR的山梨糖醇合成不是渗透适应所需的，因为无果糖GFOR不能预期合成山梨糖醇。因此，消除GFOR酶活性未预期对缺乏果糖的生长培养基中的山梨糖醇生产水平具有作用，并且关于GFOR修饰的木糖利用运动发酵单胞菌菌株在葡萄糖和木糖的浓缩混合物中生长的山梨糖醇需求完全是未预料到的。

山梨糖醇(D-山梨糖醇和/或L-山梨糖醇)可以以约0.5mM-200mM的浓度存在于培养基中。培养基中更合适的终浓度为约2mM-100mM的浓度，其中5mM-20mM的浓度是优选的。甘露糖醇可以在培养基中代替山梨糖醇，或与山梨糖醇组合使用。发现山梨糖醇具有与在共同拥有和共同未决的美国申请#60/847997中山梨糖醇的那些类似的作用，所述专利引入本文作为参考。此外，发现半乳糖醇和/或核糖醇可以代替山梨糖醇和/或甘露糖醇或与山梨糖醇和/或甘露糖醇组合使用。山梨糖醇、甘露糖醇、半乳糖醇、核糖醇或其组合全都以与对于山梨糖醇描述的相同浓度使用。在其中木糖醇可以由木糖利用运动发酵单胞菌菌株(其并非GFOR修饰的菌株)生产的发酵条件下，例如在高糖培养基中在抑制剂例如乙酸盐的存在或不存在下，在本方法中使用的GFOR修饰的木糖利用运动发酵单胞菌菌株胜过非GFOR修饰的菌株。申请人发现消耗的木糖的总量和最终的乙醇滴度对于GFOR修饰的菌株都大于非修饰的菌株。此外，无木糖醇在方法相关条件下在发酵中经由GFOR修饰的木糖利用运动发酵单胞菌生产，尽管小量可以由非GFOR机制在某些情况下合成，如本文实施例6中所示。

木糖利用和乙醇生产中的改善在不同发酵条件下有变化。在其中更高水平的木糖醇由GFOR非修饰的木糖利用运动发酵单胞菌菌株生产的条件下，木糖醇合成的缺乏导致GFOR突变的更大作用。例如，当抑制剂例如乙酸盐存在于培养基中时，更大量的木糖醇由GFOR非修饰的菌株生产。这种木糖醇生产由GFOR突变完全消除，从而允许木糖利用和乙醇生产中比在其中在不含GFOR突变时将已生产少量木糖醇的条件下更大的增加。因为乙酸盐一般存在于处理的纤维素生物质中，所以对于乙酸盐减少的敏感性在产乙醇生物中是希望的，所述产乙醇生物生长在衍生自处理的纤维素生物质的碳源上。因此，当生物质水解产物用于发酵中时，使用GFOR修饰的木糖利用运动发酵单胞菌菌株发酵是特别有利的。

用于乙醇生产的发酵

对于乙醇的生产，使重组GFOR修饰的木糖利用运动发酵单胞菌与包含混合糖(包括木糖)的培养基接触。当混合糖浓度如此高从而使得生长被抑制时，培养基包括山梨糖醇、甘露糖醇或其混合物。半乳糖醇或核糖醇可以代替山梨糖醇或甘露糖醇或者与山梨糖醇或甘露糖醇组合。运动发酵单胞菌在其中发生发酵且生产乙醇的培养基中生长。发酵无补充的空气、氧或其他气体而运行(这可以包括诸如厌氧、微好氧或微需氧发酵的条件)，进行至少约24小时，并且可以运行30个或更多小时。达到最大乙醇生产的时限是可变的，这依赖于发酵条件。一般地，如果抑制剂存在于培养基中，那么需要更长的发酵时间段。发酵可以在约30℃-约37℃的温度、约4.5-约7.5pH下运行。

在本方法中，GFOR修饰的木糖利用运动发酵单胞菌可以在包含混合糖(包括木糖)的培养基中在实验室规模发酵罐中，以及在其中生产商业量的乙醇的按比例扩大发酵中生长。当需要乙醇的商业生产时，可以应用多种培养方法。例如，来自GFOR修饰的木糖利用运动发酵单胞菌的大规模生产可以由分批和连续培养方法来生产。传统的分批培养法是封闭系统，其中培养基的组成在培养开始时设定且在培养过程期间不实施人工改变。因此，在培养过程开始时，用所需生物接种培养基且不向系统添加任何事物而允许生长或代谢活性发生。然而，一般地，“分批”培养是关于碳源添加的分批，且经常在控制因素例如pH和氧浓度上进行尝试。在分批系统中，系统的代谢物和生物质组成不断地改变直至培养结束时。在分批培养中，细胞适度通过静止的滞后期至高生长对数期，且最终至其中生长速率减少或暂停的稳定期。如果未经处理，那么稳定期中的细胞将最后死亡。对数期中的细胞经常负责一些系统中的最终产物或中间物的大量生产。稳定或指数后期生产可以在其他系统中获得。

关于标准分批系统的变化是补料分批系统。补料分批培养方法在本方法中也是合适的且包含一般的分批系统，除了底物随着培养进行以增量添加外。当分解代谢物阻遏易于抑制细胞的代谢时，并且希望在培养基中具有有限量的底物时，补料分批系统是有用的。补料分批系统中的实际底物浓度的测量是困难的，且因此基于可测量因素例如pH和废气例如CO₂的分压的改变进行评估。分批和补料分批培养法是本领域常见和众所周知的，且例子可以在Biotechnology：A Textbook of Industrial Microbiology，Crueger，Crueger，and Brock，第二版(1989)SinauerAssociates，Inc.，Sunderland，MA，或Deshpande，Mukund V.，Appl.Biochem.Biotechnol.，36，227，(1992)中找到，所述文献引入本文作为参考。

乙醇的商业生产还可以用连续培养来完成。连续培养是其中确定成分培养基连续加入生物反应器且同时去除等量条件培养基用于加工的开放系统。连续培养一般使细胞维持在其中细胞主要处于对数期生长的恒定的高液相密度。可替代地，连续培养可以用固定化细胞进行实践，其中连续添加碳和营养物，且从细胞群中连续去除有价值的产物、副产物或废产物。细胞固定可以使用由天然和/或合成材料组成的广泛范围的固体支持体来进行，如本领域技术人员已知的。

连续或半连续培养允许调节影响细胞生长或最终产物浓度的一种因素或任何数目的因素。例如，一种方法将使限制营养物例如碳源或氮水平维持在固定比率且允许所有其他参数适中。在其他系统中，影响生长的许多因素可以连续改变，同时由培养基浊度测量的细胞浓度保持恒定。连续系统努力维持稳态生长条件，且因此由于培养基被排出的细胞丧失必须针对培养中的细胞生长速率进行平衡。调节营养物和生长因子用于连续培养过程的方法以及用于使产物形成的速率最大化的技术是工业微生物学领域中众所周知的，并且多种方法由Brock，同上详细描述。

特别适合于乙醇生产的是如下的发酵方式。所需的GFOR修饰的木糖利用运动发酵单胞菌菌株在摇瓶中在半复合培养基中于约30℃-约37℃生长，伴随在定规摇床中约150rpm的振荡，且随后转移至包含类似培养基的10L种子发酵罐。种子培养物在种子发酵罐中厌氧地生长直至OD₆₀₀为3-6，那时它转移至其中发酵参数对于乙醇生产最优化的生产发酵罐。从种子罐转移到生产罐的一般接种物体积为约2％-约20％v/v。一般的发酵培养基包含基本培养基组分，例如磷酸钾(1.0-10.0g/l)、硫酸铵(0-2.0g/l)、硫酸镁(0-5.0g/l)、复合氮源例如酵母提取物或基于大豆的产物(0-10g/l)。约5mM山梨糖醇或甘露糖醇的终浓度存在于培养基中。提供碳源的包括木糖和至少一种另外的糖例如葡萄糖(或蔗糖)的混合糖，在最初分批的碳源(50-200g/l)耗尽后连续加入发酵容器中，以使乙醇比率和滴度达到最大。碳源进料速度进行动态调整以确保培养物不积聚过量葡萄糖，这可以导致毒性副产物例如乙酸的积累。为了使由利用的底物生产的乙醇产量达到最大，生物质生长受最初分批或在发酵过程中进料的磷酸盐的量限制。发酵使用苛性碱溶液(例如氢氧化铵、氢氧化钾或氢氧化钠)和硫酸或磷酸控制在pH5.0-6.0。发酵罐的温度控制在30℃-35℃。为了使发泡降到最低，需要时将消泡剂(任何类别-基于硅氧烷的、基于有机的等)加入容器中。可以任选使用关于其在菌株中存在抗生素抗性标记的抗生素例如卡那霉素，以使污染降到最低。

上文描述的任何组条件以及另外地本领域技术人员众所周知的这些条件中的变化，是用于经由木糖利用重组发酵单胞菌属菌株的乙醇生产的合适条件。

实施例

本发明在下述实施例中进一步得到限定。应当理解这些实施例在指出本发明的优选实施方案的同时，仅为了举例说明而给出。根据上文讨论和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不背离其精神和范围的情况下，可以制备本发明的各种改变和修饰，以使其适应各种用途和条件。

一般方法

本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域众所周知的且由下述参考文献描述：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold SpringHarbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY(1989)(下文为“Maniatis”)；和Silhavy，T.J.，Bennan，M.L.和Enquist，L.W.，Experiments with Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory：ColdSpring Harbor，NY(1984)；以及Ausubel，F.M.等人，CurrentProtocols in Molecular Biology，由Greene Publishing Assoc.andWiley-Interscience，Hoboken，NJ(1987)出版。

缩写的含义如下：“kb”意指千碱基，“bp”意指碱基对，“nt”意指核苷酸，“hr”意指小时，“min”意指分钟，“sec”意指秒，“d”意指天，“L”意指升，“ml”意指毫升，“μL”意指微升，“μg”意指微克，“ng”意指纳克，“mM”意指毫摩尔的，“μM”意指微摩尔的，“nm”意指纳米，“μmol”意指微摩尔，“pmol”意指皮摩尔，“Cm”意指氯霉素，“Cm^r”意指氯霉素抗性的，“Cm^s”意指氯霉素敏感的，“Sp^r”壮观霉素抗性的，“Sp^s”意指壮观霉素敏感的，“XI”是木糖异构酶，“XK”是木酮糖激酶，“TAL”是转醛醇酶，“TKT”是转酮醇酶，“EFT”意指过去的发酵时间，“RM”意指包含10g/L酵母提取物加2g/L KH₂PO₄的丰富培养基，“MM”意指包含10g/L酵母提取物、5g/L胰蛋白胨、2.5g/L(NH₄)₂SO₄和0.2g/L KH₂PO₄的交配培养基(mating medium)。

用于酶促测定的发酵单胞菌属的无细胞提取物的制备

细胞在50ml RM+2％葡萄糖中于30℃过夜生长至1.0-1.2的OD₆₀₀。细胞通过在4500rpm下于4℃离心10分钟进行收获。弃去上清液并且用25ml冰冷的超声处理缓冲液(10mM Tris，pH 7.6，10mMMgCl₂)洗涤细胞沉淀，随后在4500rpm下离心10分钟。将沉淀重悬浮于2.0-2.5ml超声处理缓冲液加1mM二硫苏糖醇中。使500μl等分试样在eppendorf离心机中于4℃离心1分钟。弃去大多数上清液，留下～10-20μl以避免沉淀干燥。将细胞冷冻且贮藏于-80℃直至测定。在测定前，使细胞解冻且用500μl超声处理缓冲液加1mM二硫苏糖醇重悬浮。使混合物以62％工作循环和2的输出控制使用Branson超声波仪450超声处理2x，进行45秒，使样品在超声处理之间冷却～3-5分钟。使样品在Beckman微量离心机(microfuge)中于4℃以14,000rpm离心60分钟。将上清液转移至新管且维持于4℃。Pierce BCA测定用于测定蛋白质浓度。

转酮醇酶(TKT)测定通常首先进行，因为这种酶比其他的更不稳定。TKT测定的图解显示于图3A中。

在微量培养板测定中，将20μl无细胞提取物于反应混合物中于30℃加入每个孔中，所述反应混合物包括下述终浓度的组分：0.37mMNADP，50mM TrisHCl pH 7.5，8.4mM Mg Cl₂，0.1mM TPP((氯化硫胺素焦磷酸)，0.6mM E4P(赤鲜糖-4-磷酸)，4mM BHP(β羟基丙酮酸)，4U/ml PGI(磷酸葡糖异构酶)和4 U/ml G6PD(葡糖6-磷酸脱氢酶)。A₃₄₀在板阅读仪(plate reader)上阅读3-5分钟。TKT活性如下计算：

1单位对应于30℃ 1μmol D-果糖-6-磷酸的形成/分钟。

U(μmole/分钟)＝斜率(dA₃₄₀/分钟)*反应体积(μL)/6220/0.55cm

(NADP→NADPH的摩尔是在1cm杯中的6220 A₃₄₀/摩尔/L)

(微量培养板中200μl/孔的光程长度＝0.55cm)

比活性(μmole/分钟-mg)＝μmole/分钟/蛋白质浓度(mg)

转醛醇酶(TAL)测定的基础显示于图3B中。

在微量培养板测定中，将20μl无细胞提取物在反应混合物中于30℃加入每个孔中，所述反应混合物包括下述终浓度的组分：0.38mMNADH，87mM硫代乙醇胺(thiethanolamine)，17mM EDTA，33mMF6P(果糖-6-磷酸)，1.2mM E4P(赤鲜糖-4-磷酸)，2.0U/ml GDH(甘油-3-磷酸脱氢酶)和20U/ml TPI(丙糖磷酸异构酶)。使板温育5分钟，然后A₃₄₀读取3-5分钟。TAL活性计算如下：

1单位对应于30℃ 1μmol D-甘油醛的形成/分钟。

U(μmole/分钟)＝斜率(dA₃₄₀/分钟)*反应体积(μL)/6220/0.55cm

(NADH→NAD的摩尔是在1cm杯中的6220 A₃₄₀/摩尔/L)

(微量培养板中200μl/孔的光程长度＝0.55cm)

比活性(μmole/分钟-mg)＝μmole/分钟/蛋白质

木糖异构酶(XI)测定的基础显示于图3C中。

在微量培养板测定中，将20μl无细胞提取物在反应混合物中于30℃加入每个孔中，所述反应混合物包括下述终浓度的组分：0.256mMNADH、50mM木糖、10mM MgSO₄、10mM硫代乙醇胺(thiethanolamine)和1U/ml SDH(山梨糖醇脱氢酶)。A₃₄₀在板阅读仪上阅读3-5分钟。XI活性如下计算：

1单位XI对应于30℃ 1μmole D-木酮糖的形成/分钟。

U(μmole/分钟)＝斜率(dA₃₄₀/分钟)*反应体积(μL)/6220/0.55cm

(NADHP→NAD的摩尔是在1cm杯中的6220 A₃₄₀/摩尔/L)

(微量培养板中200μl/孔的光程长度＝0.55cm)

比活性(μmole/分钟-mg)＝μmole/分钟/蛋白质浓度(mg)

木酮糖激酶(XK)测定的基础显示于图3D中。

在微量培养板测定中，将20μl无细胞提取物在反应混合物中于30℃加入每个孔中，所述反应混合物包括下述终浓度的组分：0.2mMNADH，50mM Tris HCl pH 7.5，2.0mm MgCl₂-6H₂O，2.0M ATP 0.2MPEP(磷酸烯醇丙酮酸)，8.5mM D-木酮糖，5U/ml PK(丙酮酸激酶)和5U/ml LDH(乳酸脱氢酶(dehydrognase))。A₃₄₀在板阅读仪上阅读3-5分钟。XI活性如下计算：

1单位对应于30℃ 1μmole D-木酮糖至D-木酮糖-5-磷酸的形成/分钟。

U(μmole/分钟)＝斜率(dA₃₄₀/分钟)*反应体积(μL)/6220/0.55cm

(NADH→NAD的摩尔是在1cm杯中的6220 A₃₄₀/摩尔/L)

(微量培养板中200μl/孔的光程长度＝0.55cm)

比活性(μmole/分钟-mg)＝μmole/分钟/蛋白质浓度(mg)

HPLC法

该分析用Agilent 1100系列HPLC和用于LC 3D的AgilentChemStation软件来完成。柱是具有BioRad Micro-Guard CartridgeCation-H(125-0129)的BioRad Aminex HPX-87H(HPLC Organic AnalysisColumn 125-0140)。操作条件是：

流动 0.6mL/分钟

溶剂 0.01N H₂SO₄

停止时间 25分钟

注射体积 5μl

自动采样器 Temp Control10℃或4℃

柱温 55℃

检测器折射率(Refractive Index)(40℃)

具有外部标准校正曲线

实施例1

ZW658，木糖发酵运动发酵单胞菌菌株的构建

ZW658通过下述进行构建：经由顺序转座事件将2个操纵子——P_gapxylAB和P_gaptaltkt整合到ZW1(ATCC#31821)的基因组内，所述操纵子包含编码木糖异构酶、木酮糖激酶、转醛醇酶和转酮醇酶的4种木糖利用基因，并且随后在包含木糖的选择培养基上适应。先前，如美国专利申请20030162271中所述，构建称为8b的木糖发酵运动发酵单胞菌菌株，其通过经由同源重组和转座子法的组合将2个操纵子P_gapxylAxylB和P_enotaltkt连同选择抗生素标记整合到运动发酵单胞菌5C的基因组内，随后为适应和NTG诱变实现。在ZW658的制备中，与位点特异性同源重组相反，使用转座(Epicentre’s EZ::Tn体外转座系统)，因为这种方法提供了整合位点的多重选择和相对高插入频率的优点。排列编码木糖利用酶的4种基因且作为2个分开的操纵子P_gapxylAB和P_gap taltkt进行克隆用于整合。使侧面为2个P1噬菌体Cre-重组酶识别序列(loxP)的抗生素抗性标记——氯霉素抗性(Cm^r)基因与每个操纵子附着用于整合体的选择。2个操纵子的整合以2步、顺次方式来完成：P_gaptaltkt随后为P_gapxylAB。Cm抗性选择在2个整合事件中使用，因为它通过在质粒上表达Cre重组酶随后为在每次整合后质粒的处理(curing)来去除。这个过程允许使用相同的抗生素标记用于选择多次。更重要地，它允许引入的抗生素标记的去除用于操纵子的整合的选择。这个过程消除抗生素抗性基因对用于商业使用的发酵菌株的负面影响。

用于转座的pMODP _gap taltktCm的构建

如美国专利申请20030162271(其中的实施例9)中所述，通过BglII/XbaI消化从pUCtaltkt(美国专利申请20030162271)中分离包含来自大肠杆菌的转酮醇酶(tkt)编码区的2.2kb DNA片段，且克隆到用BamHI/XbaI消化的pMOD(Epicentre Biotechnologies，Madison，WI)载体内，从而导致pMODtkt。命名为P_gaptal的PCR片段如下通过使运动发酵单胞菌gap(P_gap；甘油醛-3-磷酸脱氢酶)基因的启动子区与大肠杆菌转醛醇酶(tal)的编码区融合来产生。从pZB4扩增P_gap片段，其的构建描述于US 5514583(实施例3)中，其中使用具有SEQ ID NOs：1和2的引物。pZB4包含P_gap-xylA/xylB操纵子和P_ENO-tal/tkt操纵子。使用具有SEQ ID NOs：3和4的引物从pZB4扩增tal编码区片段。使用P_gap和tal片段作为模板使用具有SEQ ID NOs：5和6的引物扩增P_gaptal片段。用XbaI消化这种片段且克隆到质粒pMODtkt内，tkt编码区的上游。loxP::Cm片段通过PCR使用Cmlox(F，sfi)和Cmlox(R，sfi)引物(SEQ ID NOs：7和8)和pZB186作为模板来产生。pZB186是天然运动发酵单胞菌质粒和pACYC184的组合，描述于US514583(实施例3)和Zhang等人((1995)Science 267：240-243)中。最后，将loxP::CmPCR片段插入包含P_gaptaltkt的质粒的SfiI位点中以形成整合质粒pMODP_gaptaltktCm(图4)。在这个质粒中，将P_gaptaltkt loxP::Cm片段插入pMOD载体中的2个镶嵌末端(转座酶结合位点)之间。关于pMODP_gaptaltktCm质粒的全核苷酸序列作为SEQ ID NO：9给出。

pMODP _gap taltktCm在ZW1中的转座和转化

质粒pMOD是基于pUC的载体，且因此是发酵单胞菌属中的非复制载体。质粒pMODP_gaptaltktCm在Mg²⁺的存在下在室温下用转座酶处理1小时，且用于通过电穿孔转化ZW1细胞(使用设为200ohms、25μF和16kV/cm的BioRad Gene Pulser)。使电穿孔的细胞在交配培养基(MM)中于30℃温育6小时，所述交配培养基由10g/L酵母提取物、5g/L胰蛋白胨、2.5g/L(NH₄)₂SO₄、0.2g/L K₂HPO₄)组成，补充有50g/L葡萄糖和1mM MgSO₄。将转化混合物铺平板在琼脂板上，所述琼脂板包含溶于补充有50g/L葡萄糖和120μg/mL氯霉素的MM的15g/L细菌培养用琼脂，且于30℃进行厌氧温育。转化体在约2天后可见。转化/转座频率为约3x10¹/μg DNA。

获得总共39Cm^r转化体菌落。挑出21个菌落且通过PCR和酶促活性测定进行进一步分析。使用引物SEQ ID NOs：10和11的PCR证实转化体中包含tal和tkt编码区的3kb DNA片段的存在。用来自21个整合体菌落的质粒DNA的往回转化在大肠杆菌中未产生往回转化体，从而暗示tal和tkt被整合在ZW1的基因组内。这些整合体使用对于微量培养板修饰的规程(一般方法)就转醛醇酶和转酮醇酶活性进行测试。Pierce BCA蛋白质测定用于测定蛋白质浓度。转化体在包含2％(w/v)葡萄糖的补充有120μg/ml氯霉素)的RM培养基中在50ml圆锥离心管中于30℃长大。对照菌株8b和ZW1同样长大(RM加2％葡萄糖用于ZW1)用于酶促测定。当OD₆₀₀达到1.0时收获细胞。将细胞洗涤1次且重悬浮于超声处理缓冲液中(10mM Tris-HCl、pH 7.6和10mMMgCl₂)。如美国专利申请20030162271中所述进行酶促测定。单位作为μmole/分钟-mg给出。所有样品除了一个以外都具有转醛醇酶和转酮醇酶活性。

使用tkt探针对用PstI消化的所选择的整合体的基因组和质粒DNA进行DNA杂交。ZW1 DNA不与tkt探针杂交。共同的1.5kb条带在所有整合体基因组DNA样品中可见，这是在tkt中的PstI位点和tal中的PstI位点之间的预期的DNA片段。第二个可见的高分子量(6kb或更大)条带在独立的系T2、T3、T4和T5之间是独特的，指出在每个系中分开的基因组整合位点。有趣的是，T5的质粒和基因组DNA都与tkt探针杂交，指出可能P_gaptaltkt也在天然质粒上被整合在T5中。选择这4种菌株(T2、T3、T4和T5)用于进一步Cre处理以去除Cm^r标记。

Cre处理以去除来自taltkt整合体的Cm ^r 标记

为了去除来自染色体的Cm^r标记，用pZB188/Spec-Cre转化T2、T3、T4和T5。这种质粒是发酵单胞菌属-大肠杆菌穿梭载体pZB188[Zhang等人(1995)Science 267：240-243；US 5514583]的衍生物，其包含关于Cre重组酶的表达盒。pZB188/Spec-Cre等同于实施例10中描述的Cre表达载体(pZB188/Kan-Cre)，除了它具有壮观霉素抗性基因代替卡那霉素抗性基因外。转化体在补充有2％葡萄糖和200μg/ml壮观霉素的MM琼脂板上进行选择)。将Sp^r抗性菌落挑到补充有2％葡萄糖和200μg/ml壮观霉素的RM琼脂板以及补充有2％葡萄糖和120μg/ml Cm的RM琼脂板上。挑取的菌落百分之百是Cm^s，指出Cm^r经由Cre的高效率切除。将Sp^rCm^s转化体于37℃培养在RM加2％葡萄糖中，进行2-5次每天转移以处理pZB188aadACreF。在每次转移时，将细胞稀释且铺平板在RM加2％葡萄糖琼脂板上，用于挑到含或不含200μg/mL Sp的相同培养基的另外板上。Sp^s菌落通过PCR进行分析以证实pZB188aadACreF的丢失。将整合体的质粒处理后代命名为T2C、T3C、T4C和T5C。为了检查这些转座整合体是否是稳定的，使这4种菌株在RM加2％葡萄糖中生长，且随后转移至10ml相同培养基且在一式两份的试管中于37℃生长。每天转移细胞进行10天，或约100代。将菌落稀释且在第1次和第10次转移后铺平板在RMG板上用于菌落分离。来自每种菌株的每次转移的12个菌落通过菌落PCR就P_gaptaltkt的存在测试是阳性的，所述菌落PCR使用5’P_gap和3’tkt引物(SEQ ID NOs 1和11)。转醛醇酶和转酮醇酶活性在第1次和第10次转移后也就分离物进行测量(如一般方法中所述)。所有4种整合体在非选择培养基上100代后具有类似水平的TAL和TKT活性，暗示这些整合体是遗传上稳定的。

用于转座的pMODP _gap xylABCm的构建

下一步是将P_gapxylABloxP::Cm操纵子进一步整合到ZW1::P_gaptaltkt整合体(T2C、T3C、T4C和T5C)内。基于质粒pMODP_gaptaltktCm(图4)来构建整合质粒pMODP_gapxylABCm(图5)。P_gaptaltktDNA片段通过SacI/SfiI消化来去除。包含SacI、NotI和SfiI限制位点的衔接片段通过连接而引入。随后将从pZB4(US 5514583)中分离的P_gapxylAB的NotI片段克隆到衔接子的NotI位点内。木糖异构酶(XI)由xylA编码，且木酮糖激酶(XK)由xylB编码。关于pMODP_gapxylABCm质粒的全核苷酸序列作为SEQ ID NO：12给出。

pMODP _gap xylABCm在T2C、T3C、T4C和T5C中的转座和转化

使用与P_gaptaltktCm的整合类似的方法，用由转座酶处理的pMODP_gapxylABCm(上文描述的)转化/转座T2C、T3C、T4C和T5C。在Cm选择后的2次转化/转座实验中获得6种整合体(T3CCmX1、T3CCmX2、T3CCmX3、T4CCmX1、T5CCmX1、T5CCmX2)。全都通过PCR就xylAB的存在加以证实，所述PCR使用2组引物：SEQ ID NOs：13和14，以及SEQ ID NOs：15和16，除了T2CcmX1和T2CcmX6外，对于其使用引物SEQ ID NOs：13和14未检测出PCR片段。

整合体包括2个PCR阴性系就XI、XK、TAL和TKT活性进行测定(一般方法)。图6和7中所示的结果指出6种xylAB整合体T3CCmX1、T3CCmX2、T3CCmX3、T4CCmX1、T5CCmX1和T5CCmX2全都具有XI、XK、TAL和TKT活性。与阴性亲本对照相比较新获得XI和XK活性(图6)。TAL和TKT活性维持与亲本对照一样。所有结果都指出蛋白质得到制备且是有功能的。酶活性水平有变化，其中TI和XK活性类似于用相同质粒转化/转座的ZW1整合体的那些。XI、XK、TAL和TKT的活性水平低于菌株8b中的那些。

xylAB操纵子的整合通过DNA杂交加以证实。6个系的基因组和质粒DNA用SphI进行消化且与洋地黄毒苷(digoxenin)标记的xylB探针杂交。由xylB中的SphI位点和pMOD载体上的邻近克隆位点中的另一个SphI位点产生的约3kb的共同条带存在于所有基因组DNA样品中，且此外，基因组DNA样品中的较高分子量杂交条带指出染色体中存在关于P_gapxylAB操纵子的4个整合位点。T3CCmX1和T3CCmX2看起来具有相同的整合位点，T3CCmX3和T4CCmX1可能具有相同的整合位点，并且T5CCmX1和T5CCmX2各自具有分开的整合位点。用PstI消化相同DNA随后用tkt探针的DNA杂交证实每种整合体具有与其各自亲本菌株相同的杂交模式。

木糖培养基上的ZW1::P _gap taltkt P _gap xylABCm整合体的适应

尽管存在关于木糖利用的所有4种酶促活性，但先前的观察(美国专利申请20030162271)指出整合体可能不立即在木糖上生长。在木糖上的生长可能在木糖培养基(在试管中或板上)上的延长温育后发生，称为适应的过程。

菌株如下进行适应。将ZW1::P_gaptaltktP_gapxylABCm整合体菌株接种到包含RMX(包含10g/l酵母提取物、2g/l KH₂PO₄、20g/l或2％(w/v)木糖以及RMGX(含0.025％(w/v)葡萄糖、4％(w/v)木糖的RM)的试管和板内。低水平的葡萄糖用于支持最初生长以增加在适应期间突变的机会。在培养和板中在木糖上的适应的至少5次尝试之一是成功的。于30℃厌氧温育10天后，在用T3CCmX1和T3CCmX2细胞铺平板的MMGX上分别可见17个和19个菌落。板上的菌落小且看起来不健康(透明的)。将12个菌落(4个来自T3CCmX1铺平板：T3CCmX11，T3CCmX12，T3CCmX13和T3CCmX110；8个来自T3CCmX2铺平板：T3CCmX24，T3CCmX25，T3CCmX26，T3CCmX27，T3CCmX28，T3CCmX29，T3CCmX211和T3CCmX212)接种到RMGCm120中，且转移到3ml RMX内用于进一步适应，以获得能够在木糖上更快速生长的系。

整合体在包含3ml RMX的试管中的适应于30℃进行。在Spectronic601分光光度计中不断地监控OD₆₀₀。当生长达到对数中期时，将培养物转移到RMX的新鲜管内。这个过程对于7次转移继续。生长速率和最终ODs(非线性读数)经过转移得到改善。

在第6次转移时，将培养物划线培养在RMX板上以分离单个菌落。3种整合体在RMX划线板上生长得比其他的更快：T3CCmX13、T3CCmX26和T3CCmX27，其在下表和讨论中称为X13、X26和X27。为了筛选最佳木糖生长物(grower)，对于TX13、X26和X27各自选择4个大的(L1-4)和4个小的(S1-4)菌落且在RMX试管中生长，从而使得可以监控生长、糖利用和乙醇生产。菌落于30℃生长过夜，随后一式两份地接种OD₆₀₀＝0.05到试管中的3ml RMX内。X27在RMG中生长得比其他培养物更慢且在6.5小时后再次接种。69小时后(对于X27 62.5小时)，获取样品用于HPLC分析(一般方法)。图8将在69小时时(对于所有X27培养物62.5小时)关于培养物的平均乙醇得率(理论得率％)和木糖利用(％)制成图表。在大和小菌落之间没有显著差异。尽管在木糖上与X26相比较X27的性能更佳，但它显示出在葡萄糖上较慢的生长。因此，选择最佳表现者——X13(X13L3)和X26(X26L1)的大菌落用于在pH受控的发酵中的进一步评估。对于菌株X13L3和X26L1以及对照菌株8b，发酵在RMG(6％葡萄糖)、RMX(6％木糖)和RMGX(8％∶4％；葡萄糖∶木糖)中于37℃进行。葡萄糖经由在RMG(6％)和RMGX(8％∶4％)中生长的X13L3和X26L1的发酵相当快速地进行。与菌株8b的那种相比较，对于X13L3和X26L1在RMGX(8％∶4％)中的木糖发酵更慢。此外，对于X13L3和X26L1在长滞后后发生在RMX(6％)上于37℃的生长。从RMX(6％)发酵中回收了几种分离物——X13b，X13c和X13FL。对这些分离物连同原始菌株X13a(X13L3的分离物)和X26实施Cre处理，如这个实施例中先前描述的，以从ZW1::P_gaptaltktP_gapxylABCm菌株中去除Cm^r标记。所得到的Cre处理的、无Cm^r整合体命名为X13aC、X13bC、X13cC、X13FLC和X26C。

经由于37℃在RMX(5％)中的连续转移的整合体在木糖培养基中的适应

如先前所述，最初的ZW1::P_gaptaltktP_gapxylABCm菌株在RMX上于30℃的适应极大地改善了菌株在这些条件下的生长。然而，适应的菌株经历在RMX(6％)中于37℃生长和发酵期间的长滞后。为了进一步改善整合体用于在优选过程条件(包括较高的糖浓度和温度)下的木糖发酵，进化或适应过程在RMX(5％)中于37℃继续。进行连续转移且选择最佳生长物。在这个过程中使用的整合体包括X13aC、X13bC、X13cC、X26C和X13FLC。在被转移至RMX(5％)中于37℃用于另外5-16次转移前，这5种菌株在RMX中于30℃生长用于6次转移。在所有转移期间和之后，培养物在RMX板上进行划线且于37℃温育以分离单个菌落。大菌落在RMX板上进一步划线，且于37℃温育3-4次以纯化菌落。选择最后的大菌落用于在RMX(5％)中于37℃的生长测试。

来自在RMX(5％)培养基中于37℃的适应的菌株的评估

在用连续转移适应后分离的18个菌落最初在RMX(5％)试管中于37℃进行测试。选择12种菌株用于第二次试管评估。菌株8b包括在所有评估中用于比较。18个菌落在RMG中于37℃过夜长大，离心且将细胞于37℃静态地接种到在试管中的4ml RMX(5％)内，用于第一次评估。基于生长(OD₆₀₀，非线性)和终点HPLC结果(低残留木糖和高乙醇)，选择12种菌株用于第二次评估。

第二次评估的目的之一是测试在木糖上改善的生长的稳定性和菌株的木糖利用能力。对所有12种菌株实施稳定性研究，以察看适应的菌株在暴露于它们于37℃连续转移到其中进行50代的非选择培养基后是否是稳定的。将在RMG(5％)转移前和后的培养物接种到RMX(5％)试管中且于37℃生长用于评估。通过在Spectronic 601分光光度计中试管的直接读数来监控非线性ODs。图9中标绘了在RMG中生长50代前和后在RMX(5％)中生长第70个小时时的ODs。结果指出大多数菌株在RMG中于37℃50代后是稳定的。终点(在稳定期)上清液也通过HPLC就木糖和乙醇浓度进行分析。这些培养物中的低残留木糖和高乙醇浓度支持菌株生长且使木糖良好发酵的事实。

基于来自上文试管评估(低残留木糖、高乙醇浓度和更高的OD)的结果和用高浓度葡萄糖和/或木糖(最高达20％)以及葡萄糖和木糖的混合物与乙酸盐随后的微量滴定板生长筛选，以选择在高糖和在乙酸盐的存在下更佳的生长物，我们决定集中于菌株#26，命名为ZW658，其显示出最佳的总体性能。

实施例2

最佳改善的木糖利用菌株于37℃的发酵评估

下述实施例举例说明了改善的木糖利用运动发酵单胞菌菌株ZW658在发酵条件下的发酵性能，所述发酵条件模拟在生物质水解产物中预期的糖浓度和乙酸水平。将菌株ZW658接种到包含分别补充有10％葡萄糖(RMG10％)、8％木糖(RMX8％)、10％葡萄糖+8％木糖(RMGX10％8％)和10％葡萄糖+8％木糖+0.6％乙酸(RMGXAc10％8％0.6％)的RM培养基的发酵罐内。所有发酵在Sixfors中用300ml培养基以150rpm、pH5.5和37℃进行。使氮过夜吹扫过发酵罐中的培养基且紧在接种前停止。在发酵期间不吹扫氮。在RMG5％中的工作原种的复苏后，用RMGX(10％，4％)于37℃在摇瓶(150rpm)中制备用于发酵的接种物。菌株8b在相同条件下用作对照。如图10中所示，与8b相比较，ZW658在RMG10％上生长得更慢(A和B)，并且在RMX8％上以与8b相似的速率生长(C和D)。尽管生长速率较慢，但图10显示ZW658的乙醇得率(93％)在葡萄糖培养基中发酵结束时类似于8b的那种。在RMX8％培养基中，与8b相比较(0.44g乙醇/g糖)，乙醇得率对于ZW658更高(0.46g乙醇/g糖)。与在RMX8％中的8b相比较，ZW658生产多约4g/l的乙醇。有趣的是，ZW658不生产任何木糖醇，而8b在RMX8％中发酵结束时生产低水平的木糖醇(0.7g/l)。图11中所示的数据显示在发酵含(C、D)或不含(A、B)乙酸盐的10％葡萄糖+8％木糖方面，与8b相比较，ZW658表现得更好，由更多的葡萄糖和木糖消耗、较少的木糖醇生产和更多的乙醇生产指出。在RMG10％X8％中、在37℃和pH5.5下在发酵结束时对于2种菌株使用大部分葡萄糖，且留下大量残留的木糖，尽管ZW658使用比8b多约8g/l木糖。在发酵结束时在RMG10％X8％中在37℃和pH5.5下在ZW658中的木糖醇生产(4.9g/l)显著低于8b的那种(8.2g/l)。在乙酸盐(6g/l)的存在下，2种菌株的细胞生长显著减少，从而导致葡萄糖和木糖的弱发酵性能，尽管就更多的葡萄糖和木糖消耗、更少的木糖醇生产和更多的乙醇生产而言，ZW658显示出略微更佳的发酵性能。与RMX8％中不同，2种菌株在含或不含乙酸盐的RMG10％X8％中生产副产物木糖醇，尽管与8b相比较，由ZW658生产了较少的木糖醇。2种菌株的发酵性能概括于表1中。总之，ZW658在纯糖发酵中表现得比8b更好。如实施例1中所述，ZW658不含抗生素选择标记，这对于发酵生物在商业应用中是有价值的性质。

表1.ZW658和8b对于乙醇生产的发酵性能的概括。

CPI是细胞生产力指数：g乙醇/g细胞干重

实施例3

用于ZW1和ZW658中葡萄糖-果糖氧化还原酶(GFOR)基因的插入失活的自杀构建体的制备

用于敲除ZW1和ZW658中编码葡萄糖-果糖氧化还原酶的基因的自杀构建体(“GFORSp-9WW”)衍生自另一种自杀构建体(“pLDHSp-9WW”)，其先前用于使关于运动发酵单胞菌中的D-乳酸脱氢酶的基因插入失活，其中使用宿主介导的、双交换、同源重组和壮观霉素抗性作为选择标记。pLDHSp-9WW也衍生自先前产生的许多其他构建体。关于所有这些构建体的最初前体是质粒载体pNEB193(NEB#N3051S；New England Biolabs)。选择这种质粒是因为它可以在大肠杆菌中复制但它不能在运动发酵单胞菌中复制。涉及产生GFOR敲除构建体的所有步骤和中间物在下文以时间顺序从质粒pNEB193开始描述。

pLDH193的构建

pNEB193用SbfI和AscI进行双重消化用于插入下文描述的DNA片段。2个限制位点都是独特的且位于质粒的多克隆区域中。SbfI/AscI-线性化的pNEB193质粒DNA片段使用Qiagen’s QIAQuick纯化试剂盒(Purification Kit)(目录#28104)根据制造商的规程进行纯化。克隆到pNEB193内的DNA片段是从运动发酵单胞菌基因组DNA进行PCR扩增的2268bp片段，所述运动发酵单胞菌基因组DNA使用Qiagen’s Blood& Cell Culture Maxi Kit(目录#13362)从菌株ZW1中进行分离。用于PCR扩增这种片段的合成寡核苷酸是引物1和2：

引物1(SEQ ID NO：17)

CTACTCATTTcctgcagg

引物2(SEQ ID NO：18)

CATCTTACTggcgcgccAA

引物1(正向引物)的加下划线的碱基在编码磷酸甘油酸变位酶(pgm)的可读框的3′末端处与Genbank登记号AE008692的核苷酸1262739-1262720杂交，而小写字体对应于加入引物的5′末端的SbfI位点。引物2(反向引物)的加下划线的碱基与Genbank登记号AE008692的核苷酸1260490-1260472杂交，其紧在编码醇脱氢酶I(adhI)的可读框的上游，而小写字体对应于加入引物的5′末端的AscI位点。其为PCR扩增的靶的2268bp DNA片段因此由从SbfI位点开始且以AscI位点结束的下述元件组成：(a)pgm基因的3′末端，(b)编码D-乳酸脱氢酶的完整ldh基因，和(c)adhI基因的5′非翻译区。PCR产物用SbfI和AscI进行切割，并且将所得到的DNA片段连接到上文描述的SbfI/AscI-线性化的pNEB193载体内。连接反应混合物用于转化大肠杆菌JM110，并且将经转化的细胞铺平板在包含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基上。包含具有正确大小插入片段的质粒的氨苄青霉素抗性转化体最初通过PCR进行鉴定，其中使用重悬浮的菌落(“菌落PCR”)以及引物1和2。阳性克隆的后续证实来自质粒DNA用SbfI和AscI的限制酶切消化分析，以及通过菌落PCR用氨苄青霉素抗性转化体产生的2268bp片段的DNA序列分析。选择用于进一步操作的质粒在下文称为pLDH193。

pLDHTc139#7的构建

质粒pLDH193具有定位接近ldh可读框的中间的独特NcoI位点。这个位点用于插入赋予对于四环素的抗性的DNA片段。用于这种操作的四环素抗性盒(Tc^r-盒)通过PCR产生，其中使用质粒pACYC184(Genbank登记号X06403)作为DNA模板以及引物3和4作为PCR引物。

引物3(SEQ ID NO：19)

ACTCATTTccatg

ACTAT

引物4(SEQ ID NO：20)

ATCTCACTccat

AACTA

引物3(正向引物)的粗体加下划线的碱基紧从关于四环素抗性基因的启动子上游杂交。引物3还具有加入其5′末端的3个限制位点(NcoI、AsiSI和NotI)。NcoI位点为小写字体。AsiSI位点用细线加下划线。Not I位点为斜体小写字体。引物4(反向引物)的粗体加下划线的碱基紧从关于四环素抗性基因的终止密码子下游杂交，并且这种引物还具有加入其5′末端的3个限制位点(NcoI、FseI和PacI)。类似于上文的标记，NcoI位点为小写字体，FseI位点用细线加下划线，且PacI位点为斜体小写字体。用引物3和4产生的1448bp Tc^r-盒用NcoI进行切割，且通过制备型琼脂糖凝胶电泳进行纯化。随后将所得到的DNA片段连接到存在于质粒pLDH193的ldh可读框中的独特NcoI位点内。为了使不含插入片段的载体重新环化的可能性降到最低，在连接前用牛小肠碱性磷酸酶使NcoI消化的pNEB193去磷酸化。将连接反应混合物引入大肠杆菌(Escherichia coli)JM110内，并且将经转化的细胞铺平板在包含20μg/ml四环素的LB培养基上。包含具有正确插入片段的质粒的四环素抗性转化体通过用NcoI、AsiSI、NotI、FseI和PacI的限制酶切消化分析进行鉴定，并且Tc^r-盒的方向通过PCR分析使用合适的引物加以证实。选择用于进一步操作的质粒(pLDHTc139#7)的圆图显示于图12中。在本文未描述的实验中，这种自杀构建体用于使ZW1中的D-乳酸脱氢酶基因插入失活(即，“破坏”或“敲除”)，其中使用宿主介导的、双交换、同源重组和在四环素上的生长作为选择。

pLDHTc139#7-9WW的构建

已证实pLDHTc139#7可以用于“敲除”ZW1中的D-乳酸脱氢酶基因，下一个步骤是修饰这种构建体，从而使得它可能使用Cre重组酶在基因破坏后去除来自染色体的选择标记。为了实现这个目标，将2个野生型loxP位点(Lee和Saito，1998)加入pLDHTc139#7中，其中利用位于Tc^r-盒侧面的4个独特的限制位点，即，在5′末端处的AsiSI和NotI以及在3′末端处的PacI和FseI。在用2种酶切割构建体且纯化所得到的大DNA片段后，将第一个loxP位点插入在质粒pLDHTc139#7的AsiSI和NotI位点之间。插入这个位置内的loxP位点由在其5′末端处都磷酸化的2种合成寡核苷酸5和6(SEQ ID NOs：21和22)产生。

寡核苷酸5(SEQ ID NO：2 1)；

cgcATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATgc

寡核苷酸6(SEQ ID NO：22)：

ggccgcATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATgcgat

这些寡核苷酸彼此互补，且当一起退火时，形成在2个末端处具有单链突出端的全长双链野生型loxP位点，这允许DNA片段在pLDHTc139#7的AsiSI和NotI位点之间连接。寡核苷酸中的大写字体对应于全长野生型loxP位点，而小写字体指出用于将双链DNA片段连接到pLDHTc139#7的AsiSI和NotI位点内的核苷酸。

连接反应混合物用于转化大肠杆菌DH10B，并且将经转化的细胞铺平板在包含20μg/ml四环素的LB培养基上。包含具有正确插入pLDHTc139#7的AsiSi和NotI位点内的loxP位点的质粒的四环素抗性转化体通过限制酶切消化分析、菌落PCR和相关区域的DNA序列分析进行鉴定。选择用于进一步操作的质粒在下文称为pLDHTc139#7-9W。

接下来，在用2种酶切割质粒且纯化所得到的大载体片段后，将第二个野生型loxP位点插入pLDHTc139#7-9W中的Tc^r-盒的另一个末端处的PacI和FseI位点之间。插入这个位置内的loxP位点也由在其5′末端处都磷酸化的2种合成寡核苷酸7和8(SEQ ID NOs：23和24)产生。

寡核苷酸7(SEQ ID NO：23)：

taaATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATggccgg

寡核苷酸8(SEQ ID NO：24)：

ccATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATttaat

寡核苷酸7和8彼此互补，且当杂交时，形成在2个末端处具有单链突出端的全长、双链野生型loxP位点，这允许DNA片段在pLDHTc139#7-9W的PacI和FseI位点之间连接。寡核苷酸中的大写字体对应于全长loxP位点，而小写字体指出用于将双链DNA片段连接到pLDHTc139#7-9W的PacI和FseI位点内的核苷酸。

连接反应混合物用于转化大肠杆菌DH10B，并且将经转化的细胞铺平板在包含20μg/ml四环素的LB培养基上。包含具有正确插入pLDHTc139#7-9W的PacI和FseI位点内的野生型loxP位点的质粒的四环素抗性转化体通过限制酶切消化分析、菌落PCR和相关区域的DNA序列分析进行鉴定。选择用于进一步操作的质粒在下文称为pLDHTc139#7-9WW，并且这种构建体的圆图显示于图12中。

pLDHSp-9WW的构建

pLDHSp-9WW等同于pLDHTc139#7-9WW，但后面一种构建体中的四环素抗性盒用赋予对于壮观霉素的抗性的DNA片段(即Spec^r-盒)置换。后者通过PCR使用质粒pHP15578(Cahoon等人，2003)作为模板以及引物9和10来产生。pHP15578包含关于Spec^r-盒的全核苷酸序列及其启动子，这基于编码3’(9)-O-核苷酸基转移酶的转座子(Tranposon)Tn7 aadA基因(Genbank登记号X03403)所公开的序列。

引物9(SEQ ID NO：25)

ATAAAAgcggccg

引物10(SEQ ID NO：26)

GGCGttaattaa

引物9(正向引物)的加下划线的碱基紧从关于Spec^r-盒的启动子上游杂交(至Genbank登记号X03043的nts 6-17)，而小写字体对应于加入引物的5′末端的NotI位点。引物10(反向引物)的加下划线的碱基从关于Spec^r-盒的终止密码子下游约130个碱基杂交(至Genbank登记号X03043的nts 1006-1019)，而小写字体对应于加入引物的5′末端的PacI位点。1040bp PCR-产生的Spec^r-盒用NotI和PacI进行双重消化，并且所得到的DNA片段通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化。质粒pLDHTc139#7-9WW也用相同的2种限制酶进行切割以去除Tc^r-盒，并且所得到的大载体片段通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化。将2个目的DNA片段连接在一起，并且使用电穿孔将转化反应混合物引入大肠杆菌DH10B内。将转化体铺平板在包含壮观霉素(200μg/ml)的LB培养基上且于37℃进行生长。包含具有正确大小插入片段的质粒的壮观霉素抗性转化体通过用NotI和PacI的限制酶切消化分析进行鉴定，并且选择用于进一步操作的质粒在下文称为pLDHSp-9WW；这种构建体的圆图显示于图12中。在本文未描述的实验中，pLDHSp-9WW用于敲除ZW1中关于D-乳酸脱氢酶的基因，其中使用对于壮观霉素的抗性作为选择标记。用自杀构建体的基因失活经由宿主介导的、双交换、同源重组(WO01/83784 A2)而发生，这导致侧面为2个野生型loxP位点的选择标记(Spec^r-盒)插入ldh可读框的中间。双交换事件通过在pLDHSp-9WW中侧接Spec^r-盒的2个DNA片段靶向ldh基因。这些片段之一(在下文称为5’ldh侧翼DNA)紧在Spec^r-盒上游且位于SbfI和AsiSI位点之间。这种～1100bp DNA片段的核苷酸序列等同于编码pgm基因的3′末端和ldh可读框的约前半部分的ZW1染色体DNA。另一个DNA片段(在下文称为3′ldh侧翼DNA)位于Spec^r-盒的相反末端处FseI和AscI位点之间。3’ldh侧翼DNA(它也是～1100bp)的核苷酸序列等同于编码ldh基因的另一半和adhI基因的部分5′非翻译区的染色体DNA。当5′和3’ldh侧翼DNA片段都与其染色体配对物相互作用且经历同源重组时，双交换事件发生。这种现象基本上是不可逆的且完全由宿主的酶促机制介导，通过将Spec^r-盒插入可读框的中间来使染色体ldh基因失活。因为构建体不能在运动发酵单胞菌中复制，从而使得其成为自杀构建体，所以用pLDHSp-9WW产生稳定的壮观霉素抗性菌落的唯一方法(除以极低频率发生的自发性药物抗性突变体外)是通过同源重组的双交换事件。重要的是指出通过双交换事件被插入染色体内的Spec^r-盒仍夹在自杀构建体中存在的2个野生型loxP位点之间。由于这种排列，通过使用实施例10中描述的Cre表达载体无需使其再活化，就易于去除来自D-乳酸脱氢酶基因的选择标记。

pGFORSp-9WW的构建

如下所述在2步程序中将pLDHSp-9WW转化成用于运动发酵单胞菌葡萄糖-果糖氧化还原酶(GFOR)的基因失活的自杀构建体。第一个步骤是去除3′ldh侧翼DNA且用类似的DNA片段将其置换，所述类似的DNA片段将使质粒构建体靶向编码GFOR的染色体基因。后面的DNA片段(在下文称为3′GFOR侧翼DNA)通过PCR使用ZW1基因组DNA作为模板以及引物11和12作为PCR引物来产生。

引物11(SEQ ID NO：27)

CTACTCATggccggcc

引物12(SEQ ID NO：28)

CATCTTACTggcgcgcc

引物11(正向引物)的加下划线的碱基与约在GFOR可读框中间的Genbank登记号AE008692的核苷酸684324-684305杂交，而小写字体对应于加入引物的5′末端的FseI位点。引物12(反向引物)的加下划线的碱基与位于GFOR终止密码子下游～625bp的Genbank登记号AE008692的核苷酸683124-683143杂交，而小写字体对应于加入引物的5′末端的AscI位点。1234bp PCR片段用FseI和AscI进行切割。pLDHSp-9WW也用相同的限制酶进行切割以去除3’ldh侧翼DNA，并且由这次操作产生的大载体片段通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化。随后将PCR产生的3′GFOR侧翼DNA连接在上文描述的凝胶纯化的大载体片段的FseI和AscI位点之间，并且将连接反应混合物的等分试样电穿孔到大肠杆菌DH10B内。将经转化的细胞铺平板在包含200μg/ml壮观霉素的LB培养基上，且使板于37℃进行温育。包含具有正确插入片段的质粒的壮观霉素抗性转化体通过菌落PCR以及用FseI和AscI的限制酶切消化分析进行鉴定，并且选择用于进一步操作的质粒在下文称为pLDH/GFORSp-9WW。

下一个步骤是去除来自pLDH/GFORSp-9WW的5’ldh侧翼DNA，且用5’GFOR侧翼DNA将其置换，因此双交换事件可以在选择用于破坏GFOR可读框的染色体靶上发生。5’GFOR侧翼DNA片段通过PCR使用ZW1基因组DNA作为模板以及引物13和14作为PCR引物来产生。

引物13(SEQ ID NO：29)：

CTACTCATatgcat

引物14(SEQ ID NO：30)：

CATCTTACTgcgat

引物13(正向引物)的加下划线的碱基与位于GFOR起始密码子上游约520bp的Genbank登记号AE008692的核苷酸685584-685564杂交，而小写字体对应于加入引物的5′末端的NsiI位点。引物14(反向引物)的加下划线的碱基与Genbank登记号AE008692的核苷酸684396-684415杂交，所述核苷酸接近GFOR可读框的中间且紧在关于引物11的结合位点上游，而小写字体对应于加入引物的5′末端的AsiSI位点。1217bpPCR产物用NsiI和AsiSI进行切割，且pLDH/GFORSp-9WW用SbfI和AsiSI进行双重消化以去除5’ldh侧翼DNA；由后面的操作产生的大载体片段通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化。随后将PCR产生的5′GFOR侧翼DNA连接在上文描述的凝胶纯化的大载体片段的SbfI和AsiSI位点之间，并且将连接反应混合物的等分试样电穿孔到大肠杆菌SCS110(其是dcm^-和dam^-的)内，以获得非甲基化的质粒DNA用于ZW1和ZW658的后续转化，这在下文实施例5和7中详细描述。注意到使用非甲基化的质粒DNA用于转化衍生自ZM4的运动发酵单胞菌菌株对于成功是至关重要的，因为从野生型大肠杆菌菌株如DH10B中分离出的甲基化的质粒DNA由宿主的限制/修饰系统容易地破坏(US 6566107 B1中描述的)。进一步指出NsiI和SbfI具有相容的粘性末端，但当它们连接在一起时，2个位点都被破坏。将转化体铺平板在包含100μg/ml壮观霉素的LB培养基上，且使板于37℃进行温育。包含具有正确插入片段的质粒的壮观霉素抗性转化体通过菌落PCR和限制酶切消化分析进行鉴定。用于敲除ZW1和ZW658中的GFOR基因的这种所得到的自杀构建体在下文称为pGFORSp-9WW。这种质粒的圆图显示于图12中，并且它的全核苷酸序列公开于SEQ ID NO：31中。重要的是指出这种自杀构建体和运动发酵单胞菌染色体之间的双交换事件导致侧面为2个野生型loxP位点的Spec^r-盒的插入，类似于上文对于pLDH-Spec-9WW描述的情况。

实施例4

用于运动发酵单胞菌的大肠杆菌木糖异构酶表达载体的产生

如下所述使用大肠杆菌/运动发酵单胞菌穿梭载体(pZB188)作为原材料来产生用于在运动发酵单胞菌中表达大肠杆菌木糖异构酶的质粒构建体(pZB188/Kan-XylA)(图13)。pZB188的构建中涉及的步骤公开于US 5,514,583中。简言之，这种7008bp质粒能够在大肠杆菌和运动发酵单胞菌中复制，因为它具有2个不同的复制起点，每个细菌物种一个。pZB188还包含赋予对于四环素的抗性的DNA片段(即Tc^r-盒)。pZB188/Kan-XylA的构建中的第一个步骤是去除来自pZB188的Tc^r-盒，且用赋予对于卡那霉素的抗性的DNA片段(即Kan^r-盒)将其置换。为了切除来自pZB188的Tc^r-盒，用XbaI和BssHII切割质粒且通过琼脂糖凝胶电泳纯化所得到的大载体片段。通过PCR使用质粒pET-24a(Novagen)作为模板以及用于PCR扩增的引物15和16来产生Kan^r-盒。pET-24a包含关于Kan^r基因的完整可读框及其结合的启动子。

引物15(SEQ ID NO：32)：

GCtctaga

引物16(SEQ ID NO：33)：

ACATTGgcgcgc

引物15(正向引物)的加下划线的碱基从pET-24a中关于Kan^r基因的起始密码子上游约160bp杂交，而小写字体对应于加入引物的5′末端的XbaI位点。引物16(反向引物)的加下划线的碱基在关于Kan^r基因的可读框的另一个末端处杂交且包括终止密码子，而小写字体对应于加入引物的5′末端的BssHII位点。991bp PCR产生的Kan^r-盒用XbaI和BsshII进行切割，且通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化。

随后在标准连接反应中将所得到的DNA片段插入上文描述的pZB188 DNA片段的XbaI和BssHII位点之间。使用电穿孔将转化反应混合物引入大肠杆菌DH10B内，并且将细胞铺平板在包含卡那霉素(50μg/ml)的LB培养基上；生长处于37℃。从卡那霉素抗性转化体之一中分离出质粒DNA，并且所得到的构建体在下文称为pZB188/Kan；这种穿梭载体的圆图显示于图13中。

在下一个步骤中，在用2种酶切割pZB188/Kan后，将大肠杆菌木糖异构酶表达盒插入pZB188/Kan的NcoI和AclI位点之间，并且通过琼脂糖凝胶电泳纯化大载体片段。在用NcoI和ClaI切割质粒pZB4后，充当大肠杆菌木糖异构酶表达盒的～2Kbp DNA片段衍生自质粒pZB4，并且通过琼脂糖凝胶电泳纯化相关的DNA片段。质粒pZB4在US5514583中详细描述，并且大肠杆菌表达盒P_gapXylA(SEQ ID NO：34)的示意图示显示于图13的加框图中。

NcoI和ClaI位点分别位于大肠杆菌木糖异构酶表达盒的5′和3′末端处。如US 5514583中所述，这种片段包含强、组成型运动发酵单胞菌甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAP)启动子，其与编码木糖异构酶的大肠杆菌xylA基因的完整可读框先前融合。它还包含紧在木糖异构酶终止密码子后的小茎-环区。大肠杆菌木糖异构酶表达盒在标准连接反应中插入pZB188/Kan的NcoI和AclI位点之间。注意到ClaI和AclI产生相容的“粘性末端”，但当它们连接在一起时，2个位点都被破坏。随后将连接反应混合物电穿孔到大肠杆菌SSC110(dcm^-，dam^-)内，以获得非甲基化的质粒DNA用于运动发酵单胞菌的随后转化，如下文在实施例6中所述，并且将经转化的细胞铺平板在包含卡那霉素(50μg/ml)的LB培养基上；生长处于37℃。具有含正确大小插入片段的质粒的卡那霉素抗性转化体通过限制酶切消化分析和菌落PCR进行鉴定。用于在运动发酵单胞菌中表达大肠杆菌木糖异构酶的质粒在下文称为“pZB188/Kan-XylA”；这种构建体的圆图显示于图13中。

实施例5

ZW1 GFOR敲除突变体的产生

为了消除ZW1(ZW658最初衍生自其的野生型菌株)中的GFOR酶活性，使用在实施例3中详细描述的自杀构建体pGFORSp-9WW。使用电穿孔将非复制质粒DNA引入细菌宿主内，基本上如US 5514583中所述。简言之，50-μl转化反应包含溶于10％(v/v)甘油中的～10¹⁰细胞/ml和～0.9μg从大肠杆菌SSC110中分离出的非甲基化的质粒DNA，如实施例3中所述。对照反应相同地进行处理，但不接受任何质粒DNA。关于电穿孔仪(electroporator)的设置为16kv/cm，200Ω和25μF，并且杯的缝隙宽度为0.1cm。电穿孔后，转化反应用1.0ml MMG培养基(50g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物、5g/L胰蛋白胨、2.5g/L of(NH₄)₂SO₄、0.2g/L K₂HPO₄和1mM MgSO₄)进行稀释，并且允许细胞于30℃恢复～5小时。细胞随后通过在室温下离心(13,000Xg，5分钟)收获在无菌1.5-ml微量离心机管中，并且小心地取出上清液。将细胞沉淀重悬浮于150μl液体MMG培养基中，并且将细胞悬浮液的50-和100-μl等分试样铺平板在包含1.5％琼脂和200μg/ml壮观霉素的MMG培养基上。板在厌氧室中于30℃进行温育，并且在2-3天后在实验板上出现50-150个菌落。在这时在对照板上没有状观霉素抗性菌落，尽管在另外48小时温育时间段后出现少数菌落。选择起因于用GFOR敲除构建体转化的状观霉素抗性菌落中的2个用于如下所述的进一步操作。

用运动发酵单胞菌和类似于pGFORSp-9WW的自杀构建体的先前实验已揭示，染色体和质粒DNA之间的最初相互作用是在2个靶向基因座之一处的单交换事件，并且那个单交换事件最终产生双交换事件。至双交换事件的过渡通常在液体培养基中几次连续转移后非常快速地发生，所述液体培养基包含关于自杀构建体的选择剂。为了促进关于起因于GFOR敲除构建体的2种所选择的ZW1转化体的双交换事件，将细胞接种到包含100g/L葡萄糖和200μg/ml壮观霉素的10ml RM培养基(10g/L酵母提取物和2g/L of KH₂PO₄)内。2种培养物都在30℃的24小时温育时间段后达到稳定期。接下来，第一次传递(1^st-pass)培养物的10μl-等分试样用于接种10ml的相同生长培养基，并且这两种培养物在30℃24小时后也达到稳定期。最后，将第二次传递培养物的10μl-等分试样接种到10ml的相同生长培养基内，且允许生长在30℃进行另外24小时。在液体培养基中最后一次转移后，将第三次传递培养物的等分试样进行稀释，且铺平板到包含壮观霉素(200μg/ml)的MMG培养基上以获得单个菌落，并且使板于30℃在厌氧条件下温育48小时。

双交换事件已的确发生的证实得自使用3对不同引物的菌落PCR实验。只有当自杀构建体中的5′GFOR侧翼DNA已经历与其染色体配对物的单交换事件时，第一对PCR引物才可产生正确大小的DNA片段。类似地，只有当自杀构建体中的3′GFOR侧翼DNA已经历与其染色体配对物的单交换事件时，第二对PCR引物才可产生正确大小的DNA片段。最后，只有当双交换事件已发生且另外排除单和双交换事件的混合群体的可能性时，第三对PCR引物才可产生正确大小的DNA片段。用于这种分析的2个壮观霉素抗性菌落衍生自来自用自杀构建体的ZW1电穿孔反应的2种不同的最初转化体，其在液体培养基中转移3次且如上所述铺平板以获得单个菌落，并且关于这个实验的对照是亲本菌株ZW1。因为2种转化体用3组不同的PCR引物都产生阳性结果，所以仅选择它们中的一种用于进一步的分析。这种菌株(ZW1 GFOR敲除突变体)在下文称为ZW1-ΔGFOR。

实施例6

葡萄糖-果糖氧化还原酶可以是在生理条件下木糖醇形成的主要贡献者

ZW1 GFOR敲除突变(ZW1-ΔGFOR)用于测试下述假设：在运动发酵单胞菌的木糖利用、重组菌株中的木糖醇形成至少部分由周质酶GFOR，或也具有酶促活性的它的较大分子量胞质前体介导(Loos等人，同上)。如实施例2中所示(图11)，木糖醇是木糖利用菌株8b和ZW658的主要副产物，但仅当木糖存在于生长培养基中时形成。尽管运动发酵单胞菌的野生型菌株如CP4具有可以将木糖直接还原成木糖醇的NADPH依赖性醛糖还原酶(Feldmann等人，同上)，但可以设想当生长培养基包含木糖或葡萄糖和木糖的混合物时，GFOR也可以有助于体内木糖醇形成，如图解II和II中所示。然而，为了这些反应中的任一发生，该酶将需要接近木酮糖，因为这种化合物是用于GFOR介导的木糖醇生产的专性电子受体，如体外GFOR酶表征测定所示(Zachariou和Scopes，同上)。在被人工改造用于在木糖上生长的运动发酵单胞菌菌株中，将是木糖醇合成所必需的木酮糖将由木糖异构酶产生，所述木糖异构酶催化木糖代谢的第一个步骤(图1)且在野生型菌株如ZW1中不存在。

为了测试当木糖和葡萄糖都存在于生长培养基中时，GFOR可以产生木糖醇的可能性，将实施例4中描述的大肠杆菌木糖异构酶表达载体(pZB188/Kan-XylA)引入ZW1和ZW1-ΔGFOR内。策略是在不能在这些糖的任一上生长的2种菌株中提供从木糖到木酮糖的途径，且测定GFOR是否能够产生木糖醇。用于转化的电穿孔程序基本上如实施例5中所述，但在回收时间段后将经转化的细胞铺平板在包含300μg/ml卡那霉素的MMG培养基上。作为关于这个实验的对照，ZW1和ZW1-ΔGFOR也用pZB188/Kan(图1 3)进行转化，其等同于pZB188/Kan-XylA但缺乏大肠杆菌木糖异构酶表达盒。具有pZB188/Kan-XylA或对照质粒的卡那霉素抗性菌落通过菌落PCR进行鉴定，并且随机选择来自每次转化反应的代表性菌落用于图14中所示的实验。这4种具有质粒的菌株在下文称为ZW1(pZB188/Kan)、ZW1(pZB188/Kan-XylA)、ZW1-ΔGFOR(pZB188/Kan)和ZW1-ΔGFOR(pZB188/Kan-XylA)。

使过夜培养物于30℃在15-ml加盖试管中在5ml 60g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物、10g/L KH₂PO₄、2g/L(NH₄)₂SO₄、1g/L MgSO₂(7H₂O)和300μg/ml卡那霉素中生长。随后将这些过夜培养物的等分试样用于接种20ml培养物(在50-ml加盖试管中)，所述培养物包含相同的生长培养基，含或不含20g/L木糖。生长于30℃伴随轻轻搅动，并且最初OD₆₀₀值为～0.1。生长0、24、48和120小时后，取出培养物的1.0-ml等分试样用于HPLC分析，其中使用配备折射率检测器的HP 1100(Hewlett-Packard，Palo Alto，CA)，以测定发酵液中存在的木糖、木酮糖和木糖醇的浓度。在HPLC分析前，通过离心取出细胞且使上清液通过0.22μm乙酸纤维素Spin-X离心管过滤器(Costar，catalog number8160)进行过滤以去除小颗粒。使化合物在Aminex HPX-87H柱(Bio-Rad)上分开，所述柱于55℃在等度条件下运行，使用0.6ml/分钟的流速和0.01 N H₂SO₄作为流动相。已知浓度的真实标准用于定量目的峰且所有结果以g/L表达。

结果显示当ZW1(pZB188/Kan)——具有“空”载体的对照菌株在葡萄糖和木糖的存在下生长时，在120小时温育时间段后在生长培养基中仅积聚了小量木糖醇(图14A)。用这种菌株观察到的最大量的木糖醇是＜0.5g/L。相比之下，当ZW1(pZB188/Kan)在相同浓度的葡萄糖但省略木糖下生长时，没有形成木糖醇，并且这对于其他3种菌株也是真实的。因此，在图1 4中仅显示了在葡萄糖和木糖的存在下进行的实验。引人注意的是，大肠杆菌木糖异构酶在ZW1中的表达极大地增加了发酵液中出现的木糖醇的量，并且到120小时时ZW1(pZB188/Kan-XylA)已产生了为ZW1(pZB188/Kan)的5倍的这种化合物(图14B)。如预期的，木糖异构酶在ZW1中的表达还导致木酮糖的产生，因为木糖异构酶催化木糖至木酮糖的异构化。注意到在这个实验中加入生长培养基中的约16％的总木糖转化成木酮糖或木糖醇。还注意到在这2种化合物之间存在明显的前体/产物关系(当木糖醇增加时，木酮糖减少)，与当葡萄糖和木糖都存在于生长培养基中时，GFOR在生理条件下能够将木酮糖转化成木糖醇的假设一致。

与ZW1相似，在不存在木糖异构酶表达载体的情况下极少的木糖醇由ZW1-ΔGFOR产生(图14C)。在这些条件下形成的少量木糖醇可以来自NADPH依赖性醛糖还原酶，如由Feldmann等人提出的(1992同上)。引人注意的是，当木糖异构酶在ZW1 GFOR敲除突变体中表达时，未产生另外的木糖醇(图14D)，与用ZW1(pZB188/Kan-XylA)获得的结果形成对比。相反，ZW1-ΔGFOR(pZB188/Kan-XylA)产生大量木酮糖，并且形成的这种化合物的量非常类似于由相应的ZW1菌株(即ZW1(pZB188/Kan-XylA))产生的木酮糖和木糖醇的总量。这些实验清楚地证实当GFOR接近木酮糖时，该酶可以相当大地有助于体内木糖醇形成，这当然是关于在葡萄糖和木糖的混合物中生长的运动发酵单胞菌的木糖利用、重组菌株的情况。这些结果进一步指出当运动发酵单胞菌的重组菌株在包含木糖的培养基中生长时，NADPH依赖性醛糖还原酶在木糖醇生产中起较小的作用，与来自文献的预期相反(Feldmann等人，同上；Kim等人，同上)。

实施例7

ZW658 GFOR敲除突变体的产生和这种菌株不生产功能性GFOR酶的证实

使用自杀构建体pGFORSp-9WW(实施例3中描述的)使ZW658中编码GFOR的基因插入失活，所述GFOR当葡萄糖和木糖都可用时，在生理条件下可以有助于运动发酵单胞菌中的木糖醇形成，如在实施例6中所示。这个程序中的所有步骤等同于实施例5中关于ZW1 GFOR敲除突变体描述的那些，包括用3组PCR引物证实双交换事件。选择用于下文描述的后续实验的ZW658敲除突变体命名为ZW800。

为了证实ZW800不产生可以由葡萄糖和果糖产生山梨糖醇的酶，这是由GFOR催化的生理反应，进行下述实验。使ZW800和亲本菌株ZW658的1.5ml培养物在10-ml加盖试管中在液体培养基中于30℃生长至早期稳定期，所述液体培养基包含75g/L葡萄糖、25g/L木糖、10g/L酵母提取物、2g/L KH₂PO₄和1g/L MgSO₄。当培养物达到OD₆₀₀～5.5时，通过离心收获细胞并且小心地取出上清液且弃去。接下来，将细胞沉淀重悬浮于具有下述组成的5ml新鲜生长培养基中：110g/L葡萄糖、110g/L果糖、10g/L酵母提取物、2g/L KH₂PO₄、1g/L MgSO₄和4g/LKHCO₃。上文所有步骤都在无菌条件下进行，并且在使细胞重悬浮前用浓磷酸将生长培养基的初始pH调整至5.8。所得到的培养物随后于30℃伴随轻轻搅动(150rpm)生长，并且在表2中所示的时间，取出样品用于发酵液的HPLC分析，其中使用实施例6中描述的相同程序。关于这个实验的目的峰是葡萄糖、果糖、山梨糖醇和乙醇，并且已知量的真实标准用于计算在细胞通过离心取出后它们在发酵液中的浓度；所有浓度在表2中以g/L表达。

表2 ZW658和ZW800中的山梨糖醇生产-体内测量。

菌株	小时	葡萄糖	果糖	山梨糖醇	乙醇
						ZW658	0	110	110	0	0
ZW658	23	5.99	61.43	45.99	49.36
						ZW658	47	1.55	21.98	45.89	69.04
ZW800	0	110	110	0	0
						ZW800	23	0	60.44	0	73.85
ZW800	47	0	6.79	10.21	96.21

如表2中所示，在23小时后ZW658培养物消耗了几乎所有葡萄糖和约一半果糖，且产生可比较量的山梨糖醇和乙醇作为主要产物；在第一个时间点期间关于后面2种化合物的值分别是45.99g/L和49.36g/L。因此，超过40％的最初果糖经由ZW658培养物中的GFOR转化成山梨糖醇。显著对比之下，在23小时温育时间段后在来自ZW800培养物的发酵液中未检测出山梨糖醇，并且相反葡萄糖和果糖在量上几乎都转化成乙醇，这非常接近0.51克乙醇/克消化的糖的理论值。注意到在另外24小时生长后在ZW658培养物中山梨糖醇的量中没有进一步增加。这是预期的，因为几乎所有葡萄糖都被较早地耗尽并且对于与果糖的GFOR反应不存在电子供体。有趣的是，在47小时时间点在ZW800培养物的发酵液中发现少量山梨糖醇(10.21g/L)，并且这可能已由NADPH依赖性醛糖还原酶(Feldmann等人，同上)或仍有待阐明的一些其他酶产生。然而，上文结果提供了插入ZW800的GFOR可读框中间的Spec^r-盒在很大程度上(如果未完全的话)取消GFOR酶活性的证据。

关于这个结论的进一步支持来自用由ZW1、ZW658和ZW800制备的无细胞提取物的体外实验。目的是测定在不存在其他添加的底物或辅因子的情况下ZW658是否可以将木糖转化成木糖醇，并且察看由于GFOR失活ZW800是否已丧失执行这种反应的能力。存在关于用运动发酵单胞菌无细胞提取物进行GFOR介导的木糖醇生产的3个要求：1)能够减少GFOR的紧密结合的辅因子的糖电子供体如葡萄糖或木糖，2)木酮糖作为电子受体，因为它是酶实际还原成木糖醇的化合物，和3)功能性GFOR酶。如果木酮糖未加入反应混合物中，那么无细胞提取物必须还包含木糖异构酶以将木糖转化成木酮糖。

无细胞提取物由在250-ml摇瓶中于33℃生长的100-ml培养物制备，所述摇瓶包含10g/L酵母提取物、2g/L KH₂PO₄和50g/L葡萄糖。细胞通过离心在2-3的OD₆₀₀时进行收获，并且用冰冷的50mM Tris-HCl(pH 7.0)、1.0mM MgCl₂、1mM二硫苏糖醇洗涤2次。将最后的沉淀重悬浮于1.0ml相同缓冲液中，并且细胞通过超声处理进行破坏。在细胞碎片通过离心(16,000xg，60分钟)于4℃去除后，无细胞提取物立即就木糖醇生产如下所述进行测定。500-μl反应在聚丙烯微量离心机管中进行并且包含下述终浓度的组分：50mM Tris-HCl(pH 7.0)、1.0mMMgCl₂、1mM二硫苏糖醇、66mM木糖和0.32-0.35mg无细胞提取物蛋白质；蛋白质浓度通过BCA蛋白质测定(Pierce)进行测定，其中使用牛血清清蛋白作为标准。于40℃15小时温育时间段后，反应用30mM新戊酸的终浓度进行终止，并且等分试样通过HPLC进行分析，其中使用由0.01N硫酸作为流动相的SH1011柱(Showdex)。柱温维持于50℃且流速为1.0ml/分钟。关于这个实验的对照不接受无细胞提取物，但在其他方面同样地进行处理。

如表3中所示，当ZW1无细胞提取物加入反应混合物中时，在15小时温育时间段期间木糖不转化成木酮糖或木糖醇。如已指出的，这种结果是预期的，因为ZW1是不表达大肠杆菌木糖异构酶的野生型菌株，与ZW658和ZW800形成对比。相比之下，当使用ZW658无细胞提取物时，产生显著量的木酮糖和木糖醇，因为它包含这2种化合物形成所必需的2种酶。注意到在这种情况下差不多8％的最初66mM木糖用于木糖醇生产，因为当木糖是加入反应混合物中的唯一GFOR底物时，对于产生的每分子木糖醇消耗2分子木糖。最后且最重要的是，ZW800无细胞提取物仅能将木糖转化成木酮糖，因为尽管它包含木糖异构酶活性，但它缺乏GFOR酶活性。这些结果提供了ZW800不产生功能性GFOR酶的另外证据，且进一步证实这种蛋白质能够使用木糖作为电子供体以使木酮糖还原成木糖醇，如先前用由纯化的木糖异构酶掺加的野生型无细胞提取物显示的(Danielson同上)。

表3.GFOR介导的来自木糖的木糖醇生产也需要木酮糖-体外测量

无细胞提取物	木酮糖(mM)	木糖醇(mM)
			无	0	0
ZW1	0	0
			ZW658	9.45	2.6
ZW800	10.63	0

实施例8

山梨糖醇是关于ZW800在葡萄糖和木糖的浓缩混合物中生长所需的

测试了关于在葡萄糖和木糖的浓缩混合物中经由ZW800的乙醇生产的发酵性能。实验在pH受控的发酵罐中进行，其中使用以97g/L或188g/L总糖的～5∶4的固定葡萄糖与木糖比。

ZW658和ZW800的种子培养物在摇瓶中于37℃在液体培养基中生长，所述液体培养基包含75g/L葡萄糖、25g/L木糖、10g/L酵母提取物、10g/L KH₂PO₄、2g/L(NH₄)₂SO₄和1g/L MgSO₄；初始pH用4NKOH调整至5.5。当OD₆₀₀达到～5.0时，种子培养物的50-ml等分试样用于接种包含450ml生长培养基的1升发酵罐(

B-DCU系统，Sartorius BBI System Inc.，Bethlehem，Pennsylvania，USA)。最终的500-ml培养物包含5g/L酵母提取物、2g/L KH₂PO₄、2g/L(NH₄)₂SO₄、1g/L MgSO₄和低浓度的糖(54g/L葡萄糖、43g/L木糖)或高浓度的糖(104g/L葡萄糖、84g/L木糖)。生长处于33℃且pH通过自动添加4 NKOH维持在5.5。混合速度设为150rpm。在各个时间，取出等分试样用于发酵液的HPLC分析，其中使用实施例6中描述相同的程序和条件。关于这个实验的目的化合物是葡萄糖、木糖和乙醇，并且已知浓度的真实标准用于定量层析谱上的峰。细胞生长还通过用设为600nm的光密度的分光光度计跟踪浊度中的变化进行监控，并且标绘所得到的OD₆₀₀值。

如图15中所示，当发酵罐包含低浓度的糖(54g/L葡萄糖、43g/L木糖)时，GFOR失活对生长、糖消耗或乙醇滴度没有作用。然而，如图16中所见，当总糖浓度增加约2倍时，观察到发酵性能中的巨大差异。当ZW658从葡萄糖和木糖的稀释混合物转变成超过～180g/L总糖的相同糖的浓缩混合物时，ZW658经历了约30小时的滞后时间段，这对于运动发酵单胞菌的木糖利用重组菌株是一般的。在滞后时间段后，细胞开始生长且消耗培养基中的所有葡萄糖和约75％的木糖，因此导致～73g/L的最终乙醇滴度(图16A)。相比之下，ZW800培养物即使在130小时温育时间段后也未从滞后时间段恢复(图16B)，并且这个结果在2次分开的场合获得。

因为如图15中所示ZW800在葡萄糖和木糖的稀释混合物中生长良好，所以看起来可能这种菌株不能在高糖混合物中恢复以某种方式与渗透胁迫相关。事实上，当野生型运动发酵单胞菌转移至葡萄糖和果糖的浓缩混合物或高浓度的蔗糖时，GFOR通过产生山梨糖醇在维持渗透平衡中起关键作用，所述蔗糖也通过转化酶的作用产生葡萄糖和果糖(Loos等人，同上)。在周质间隙中由GFOR产生的山梨糖醇被逆着浓度梯度转运到细胞内，在其中它积聚至高水平，因为它未被进一步代谢。这消除了跨越质膜的渗透压力差且恢复渗透平衡(Wiegert等人，同上)。然而，关于GFOR介导的山梨糖醇生产的必要条件是葡萄糖和果糖的同时存在，并且这种反应在缺乏果糖的生长培养基中应不发生。然而，因为山梨糖醇是GFOR的生理学重要的产物，并且这种酶在ZW800中是无活性的，所以在下文描述的实验中测试给葡萄糖和木糖的浓缩混合物添加山梨糖醇的作用。

在高糖混合物中～70小时后(时间点由图16中的垂直箭标指定)，从发酵罐中取出停止的ZW800培养物的5份4.5-ml等分试样且转移至15-ml加盖试管。4个管随后补充有0-20mM山梨糖醇(终浓度)，并且在所有情况下培养物的总体积用去离子水调整至5.0ml；用于这个实验的山梨糖醇母液也在水中补足。为了控制当添加水和山梨糖醇时关于生长培养基的10％稀释，向第5种培养物中不加入任何事物。所有培养物随后于33℃伴随轻轻搅动(200rpm)温育，且分光光度地监控生长。如图17中所示，当山梨糖醇加入生长培养基时，细胞几乎立即开始生长，即使用测试的最低浓度(5mM)。当未添加山梨糖醇但培养物用水稀释10％时，也观察到生长的一些刺激，所述稀释使总糖浓度从188g/L减至169g/L。然而，山梨糖醇对生长的刺激作用比稀释的作用大得多。

ZW800生长经由山梨糖醇的拯救是完全未预料到的，因为ZW658从滞后时间段恢复且在葡萄糖和木糖的浓缩混合物中生长良好，无果糖的已知来源。因为后面的化合物是关于GFOR介导的山梨糖醇生产的专性电子受体，所以GFOR可以合成山梨糖醇或在包含高浓度的葡萄糖和木糖的培养基中在渗透平衡中起作用不是显而易见的。因此，不存在山梨糖醇可能是关于ZW658或ZW800在葡萄糖和木糖的浓缩混合物中生长的重要因子的指示。

实施例9

在方法相关条件下GFOR失活改善来自木糖的乙醇生产

ZW658和ZW800在葡萄糖和木糖的浓缩混合物中在方法相关条件下的发酵性能以并行方式进行比较，以测定GFOR失活是有利的还是有害的代谢人工改造策略。因为在这些实验中使用高浓度的葡萄糖和木糖，所以向培养基中加入山梨糖醇以允许ZW800的生长。在本文未描述的实验中，还发现山梨糖醇消除关于ZW658的滞后时间段。因此，生长培养基的山梨糖醇补充提供了在方法相关条件下比较这两种菌株的理想方法。

ZW658和ZW800在6种不同条件下使用总糖的2种浓度进行比较，在乙酸盐的存在和不存在下，并且对于更浓缩的糖混合物，检查2种不同的缓冲能力。这些实验用于30℃在50-ml试管中伴随轻轻搅动(150rpm)生长的20-ml培养物来进行。pH不受控制，但在用种子培养物接种前用浓磷酸将生长培养基的初始pH调整至5.8。基础生长培养基包含10g/L酵母提取物、2g/L KH₂PO₄、1g/L MgSO₄、5mM山梨糖醇和4g/L(图18和19)或8g/L(图20)KHCO₃。上文和下文给出的所有值都是种子培养物加入后的终浓度。KHCO₃用于增加生长培养基的缓冲能力，以使在细菌生长期间通常发生的pH中的下跌降到最低。关于所有这些实验的碳源是以总糖的2种不同浓度的葡萄糖和木糖的混合物，其接近这2种糖在预处理的玉米秸秆水解产物中的比。葡萄糖和木糖的初始浓度分别为92g/L和82g/L(图18)或107g/L和96g/L(图19和20)。当指示时，还存在6g/L乙酸盐(预处理的玉米秸秆水解产物中存在的抑制剂)。种子培养物于30℃在液体培养基中生长至～5.0的OD₆₀₀，所述液体培养基包含75g/L葡萄糖、25g/L木糖、10g/L酵母提取物、2g/LKH₂PO₄、1g/L MgSO₄，并且1/10的体积用于接种实验培养物。在各个时间，如先前在实施例6中所述，取出等分试样用于发酵液的HPLC分析。关于这个实验的目的化合物是葡萄糖、木糖、乙醇和木糖醇，并且所有值以g/L报告。因为事实上所有葡萄糖都在获取第一个时间点前被消耗，所以关于这种糖的值在图中未标绘。

根据图18-20中所示的实验，清楚的是如通过2个不同标准判断的，ZW800在测试的所有条件下都胜过ZW658：(a)在实验的过程中消耗的木糖的总量，和(b)达到的最大乙醇滴度。根据这个数据还显而易见的是，当遇到最困难的条件时(即在所有葡萄糖都被耗尽且乙醇浓度开始接近有毒水平后)，GFOR失活的有利作用很大程度上在发酵的后期过程中发生。事实上，当抑制浓度的乙酸盐存在于生长培养基中时，这构成另外的应激，观察到2种菌株之间最显著的差异。对于3组实验条件在乙酸盐的存在下关于ZW800的乙醇滴度中的平均增加是10.2％，其值为4.4％-13.7％。在所有3种实验中在不存在乙酸盐的情况下，ZW800也产生比ZW658更多的乙醇，其中在这种情况下的平均增加为3.2％。如预期的，ZW658将相当大量的木糖转化成不希望有的副产物木糖醇，并且当条件最困难时(即在发酵的后期过程中和当乙酸盐存在于生长培养基中时)，观察到这种化合物的最高水平。例如，在图18-20中所示的含乙酸盐的实验中，ZW658将消耗的8.1％、8.3％和9.9％的总木糖转化成木糖醇。相比之下，在测试的任何一种条件下在ZW800培养物中未发现木糖醇。这些结果清楚地显示在方法相关条件下，特别是在抑制浓度的乙酸盐的存在下，GFOR失活对于木糖代谢用于乙醇生产是有利的。图18和19中所示的试管实验进行2次且获得基本上相同的结果。

使用pH受控的发酵罐进行在含乙酸盐的葡萄糖和木糖的浓缩混合物中用ZW800和ZW658的另一个并行实验。由运动发酵单胞菌生产的代谢的副产物例如有机酸和二氧化碳可以降低生长培养基的pH，这增加了乙酸与乙酸盐的比，并且已知质子化的种类是实际上抑制细菌生长的化合物(Kim等人，(2000)Applied Biochemistry and Biotechnology，84-86：357-370)。因此，pH控制是大规模发酵中非常重要的，因为pH从5.8到5.0的下跌将导致乙酸浓度中约5倍的增加。

关于ZW800和ZW658的种子培养物在摇瓶中于37℃在液体培养基中生长，所述液体培养基包含75g/L葡萄糖、25g/L木糖、10g/L酵母提取物、10g/L KH₂PO₄、2g/L(NH₄)₂SO₄和1g/L MgSO₄；初始pH用4 N KOH调整至5.5。当OD₆₀₀达到～5.0时，种子培养物的50-ml等分试样用于接种包含450ml生长培养基的1升发酵罐(

B-DCU系统，Sartorius BBI System Inc.，Bethlehem，Pennsylvania，USA)。最终的500-ml培养物包含92g/L葡萄糖、97g/L木糖、10g/L酵母提取物、2g/L KH₂PO₄、10mM山梨糖醇和7.2g/L乙酸盐。生长处于33℃且pH通过自动添加4 N KOH维持在5.5；混合速度为150rpm。在各个时间，取出等分试样用于发酵液的HPLC分析，其中使用实施例6中描述相同的程序。关于这个实验的目的化合物是葡萄糖、木糖、乙醇和木糖醇，并且还监控细胞生长(OD₆₀₀)。图21显示对于用ZW800培养物运行的发酵罐关于这些参数的全部时间过程，并且表4概括了对于2种菌株关于木糖、乙醇和木糖醇的终点值。

表4.在用ZW800和ZW658的pH受控的发酵罐中关于木糖、乙醇和木糖醇的终点值。

	ZW658	ZW800
			乙醇(g/L)	65.95	72.31
消耗的木糖(g/L)	60.71	69.14
			木糖醇(g/L)	3.92	0
乙醇得率(g乙醇/g糖)	0.43	0.45

类似于用乙酸盐的试管结果(图18-20)，在pH受控的发酵罐中ZW800消耗比ZW658多14％的木糖且产生比ZW658多9.6％的乙醇(图21)。关于ZW800的乙醇得率也高～5％，因为这种菌株不产生任何可检测的木糖醇。相比之下，在关于ZW658的发酵液中木糖醇的终浓度为3.92g/L，这表示在实验过程中消耗的～6.5％的总木糖。这些实验提供了GFOR失活通过消除木糖醇形成而改善来自木糖的乙醇生产的另外的证据。如已指出的，不希望有的副产物木糖醇以至少2种不同途径干扰木糖代谢且抑制细菌生长，这导致较低水平的ATP。因此，当GFOR产生木糖醇时，它减少运动发酵单胞菌应付所有其他能量消耗应激的能力，所述所有其他能量消耗应激是运动发酵单胞菌在来自木素纤维素原种的乙醇生产过程中通常遇到的。因为与ZW658形成对比，ZW800未与木糖醇相关应激斗争，所以在发酵的后期过程中，当遇到最高水平的应激时，它消耗更多的木糖，产生更多的ATP且产生更多的乙醇。

实施例10

去除来自ZW800的选择标记和所得到的菌株ZW801-4的表征

Cre表达构建体pZB188-Kan/Cre的产生

如实施例3中所述，插入ZW800中的GFOR可读框内的Spec^r-盒夹在2个野生型loxP位点之间。这种排列使得通过使用Cre重组酶易于去除来自染色体的选择标记(Sternberg和Hamilton(1981)J.Mol.Biol.150：467-486；Lee和Saito，同上；Trinh等人(2000)Journal of ImmunologicalMethods 244(2)：185-193)。然而，为了达到这点，首先必须产生可以在运动发酵单胞菌中复制的Cre表达载体(图22)。关于Cre表达载体的前体是pZB188/Kan，其在实施例4中详细描述。简言之，pZB188/Kan是可以在大肠杆菌和运动发酵单胞菌中复制的穿梭载体，因为它具有用于2个细菌物种的复制起点。它还包含赋予对于卡那霉素的抗性的DNA片段(即Kan^r-盒)。pZB188/Kan用NcoI和NotI进行双重消化，并且大载体片段通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化。下一个步骤是产生Cre表达盒，并且这通过PCR使用引物17和18来完成。用于扩增Cre表达盒的DNA模板是包含关于噬菌体PI Cre重组酶的包括其启动子的全长基因的质粒(Sternberg等人(1 986)J.Mol.Biol.187(2)：197-212))。

引物17(SEQ ID NO：35)

CTACTCATccatgg

引物18(SEQ ID NO：36)

CATCTTACTgcggccg

引物17(正向引物)的加下划线的碱基与位于Cre起始密码子上游～200bp的Genbank登记号X03453序列的nt 286-307杂交，而小写字体对应于加入引物的5′末端的NcoI位点。引物18(反向引物)的加下划线的碱基在Cre可读框的另一个末端处与Genbank登记号X03453序列的nt 1523-1503结合，而小写字体指出加入这种引物的5′末端的NotI位点。1238bp PCR产物用NcoI和NotI进行双重消化，并且所得到的DNA片段包含关于Cre重组酶的完全可读框及其推定的启动子(Sternberg等人，1986同上)，通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化。随后在标准连接反应中将Cre表达盒插入上文描述的pZB188/Kan DNA片段的NcoI和NotI位点之间。将连接反应混合物的等分试样电穿孔到大肠杆菌DH10B内，并且将经转化的细胞铺平板在包含卡那霉素(50μg/ml)的LB培养基上；生长处于37℃。从卡那霉素抗性转化体之一中分离出质粒DNA，并且随后将这种制剂引入大肠杆菌JM110(dcm^-，dam^-)内，以获得非甲基化的质粒DNA用于运动发酵单胞菌的后续转化(参见下文)。Cre表达载体pZB188/Kan-Cre的质粒图显示于图22中。

Cre处理以去除来自ZW800的染色体的选择标记和Cre表达载体的处理

噬菌体P1(Cre)的Cre重组酶能够识别特定的34-bp DNA序列——“loxP位点”，其包含位于8-bp不对称核心侧面的2个13-bp反向重复序列(Sternberg和Hamilton，1981同上；Lee和Saito，同上；Trinh等人同上)。Cre还能够切除位于2个相同的loxP位点之间的任何间插DNA片段，并且这种切除反应是非常快速的。为了去除来自GFOR可读框的Spec^r-盒，将Cre表达载体(pZB188/Kan-Cre)引入ZW800内。转化规程基本上如实施例5中所述，但在回收时间段后将细胞铺平板在包含350mg/ml卡那霉素的MMG培养基上，所述卡那霉素是关于Cre表达载体的选择剂。从这个过程回收的最初转化体不再对壮观霉素有抗性，因为通过Cre从染色体中去除的Spec^r-盒是不能在运动发酵单胞菌中复制的DNA的环状碎片。在厌氧条件下于30℃48小时温育时间段后，对2种Kan^r/Spec^s最初转化体实施Cre质粒处理过程。尽管pZB188/Kan-Cre可以在运动发酵单胞菌中复制，但通过使细胞在不包含卡那霉素的培养基中生长相对易于处理这种质粒。为了在本发明中处理Cre表达载体，细胞在升高的温度下(37℃)在不包含卡那霉素的液体MMG培养基中生长；每24-36小时将细胞转移至具有相同组成的新鲜生长培养基。已发生至少50代后，在MMG板上分离出单个菌落，并且随机选择来自2种原始最初转化体的5个菌落用于进一表征。如预期的，这些菌落无一能够在包含卡那霉素(350μg/ml)或壮观霉素(200μg/ml)的MMG板上生长。尽管不能在卡那霉素上生长是质粒处理过程成功的良好指示，但这个结论通过菌落PCR使用与Cre表达盒杂交的引物加以证实。基于这些实验，选择3种Cre处理的、质粒处理的ZW800衍生物用于进一步表征，并且这些菌株在下文称为ZW801-4、ZW801-5和ZW801-6。

为了察看这些菌株在葡萄糖和木糖的浓缩混合物中在抑制浓度的乙酸盐的存在下如何良好地表现，进行摇瓶实验。ZW658和ZW800也包括在这个分析中。使种子培养物于30℃在液体培养基中生长至～3.0的OD₆₀₀，所述液体培养基包含75g/L葡萄糖、25g/L木糖、10g/L酵母提取物、2g/L KH₂PO₄、1g/L MgSO₄，并且10％接种物用于15-ml实验培养。后者在50-ml试管中于30℃伴随轻轻搅动(150rpm)生长。生长培养基包含10g/L酵母提取物、2g/L KH₂PO₄、1g/L MgSO₄、5mM山梨糖醇、40mM KHCO₃、95g/L葡萄糖、90g/L木糖和7.7g/L乙酸盐；并且用浓磷酸将初始pH调整至5.8。在各个时间，如先前在实施例6中所述，取出培养物的等分试样用于发酵液的HPLC分析。用于这个实验的目的化合物是葡萄糖、木糖、乙醇和木糖醇，并且所有值都以g/L报告。

如表5中所示，ZW658产生66.35g/L的乙醇且留下40.6g/L的残留木糖。ZW658还产生3.19g/L不希望有的副产物木糖醇，因为它具有功能性GFOR酶。类似于先前在其他并行实验中观察到的那种，ZW800消耗比ZW658多17％的木糖且产生多6.2％的乙醇，并且它不产生任何可检测的木糖醇。尽管用ZW801-4和ZW801-6获得略微更佳的结果，但这些差异可能在实验误差内且在统计学上不显著。在这个实验中观察到的ZW801-5相对弱的表现是不理解的且未进一步研究。基于这些结果，选择菌株ZW801-4用于进一步的分析。

表5.在高糖+乙酸盐中用ZW658、ZW800、ZW801-4、ZW801-4和ZW801-5的摇瓶实验

菌株	小时	葡萄糖	木糖	木糖醇	乙醇
						ZW658	0	95.7	89.3	0	3.2
ZW658	15.5	27.75	80.93	0	37.39
						ZW658	38	0	42.71	1.85	66.53
ZW658	62	0	40.6	3.19	66.35
						ZW800	0	95.7	89.3	0	3.2
ZW800	15.5	30.64	81.36	0	36.05
						ZW800	38	0	37.29	0	69.82
ZW800	62	0	32.34	0	70.47
						ZW801-4	0	95.7	89.3	0	3.2
ZW801-4	15.5	28.04	80.82	0	37.75
						ZW801-4	38	0	36.13	0	70.54
ZW801-4	62	0	30.28	0	71.25
						ZW801-5	0	95.7	89.3	0	3.2
ZW801-5	15.5	55.61	85.62	0	21.86
						ZW801-5	38	0	46.83	0	64.92
ZW801-5	62	0	39.54	0	66.19
						ZW801-6	0	95.7	89.3	0	3.2
ZW801-6	15.5	32.34	82.02	0	34.89
						ZW801-6	38	0	36.39	0	70.64
ZW801-6	62	0	29.55	0	71.74

为了证实来自摇瓶实验的暗示ZW801-4至少与ZW800一样表现良好的结果，在pH受控的条件下比较这2种菌株。使种子培养物于30℃在包含75g/L葡萄糖、25g/L木糖、10g/L酵母提取物、2g/L KH₂PO₄、1g/L MgSO₄的培养基中生长。当OD₆₀₀达到～4.6时，种子培养物的17-ml等分试样用于接种包含153ml生长培养基的pH受控的生物反应器。最终的170ml培养物包含105g/L葡萄糖、100g/L木糖、10g/L酵母提取物、2g/L KH₂PO₄、1g/L MgSO₄、5mM山梨糖醇和7.2g/L乙酸盐。生长处于33℃且pH通过自动添加4N KOH维持在5.5；混合速度为～150rpm。在各个时间，如上所述从生物反应器中取出培养物的等分试样用于发酵液的HPLC分析，且还监控OD₆₀₀。在这些实验条件下，关于ZW800和ZW801-4的生长曲线几乎是可以重叠的(图23A)。关于葡萄糖和木糖消耗的时间过程也实际上是相同的，并且2种菌株以相似动力学产生相同量的乙醇(图23B)。此外，这些菌株无一生产任何可检测的木糖醇。基于这些观察，我们得出结论为从GFOR可读框去除Spec^r-盒不恢复或部分恢复GFOR酶活性，并且这种操作不会不利地影响发酵性能。尽管ZW800和ZW801-4都比具有功能性GFOR酶的亲本菌株(ZW658)表现得更好，但用于商业应用的优选菌株是ZW801-4，因为它不包含赋予对于抗生素的抗性的外来基因。

来自ZW801-4的基因组DNA的序列分析提供了正确的Cre切除事件实际上已发生的明确证据。ZW801-4中破坏的GFOR可读框的全核苷酸序列(从原始起始密码子到原始终止密码子)在SEQ ID NO：37中给出，并且图24显示翻译的突变序列与野生型GFOR蛋白质的比对；后者由Genbank登记号AE008692的nt 683751-685052的反向互补物编码。如预期的，Spec^r-盒的Cre切除在GFOR可读框的中间留下单个野生型loxP位点，并且这种插入事件导致过早截短蛋白质的框内终止密码子；“lox疤”的位置由灰色突出显示的残基指出。由于自杀构建体的设计，突变核苷酸序列在相同位置中也失去～72bp的原始野生型GFOR核苷酸序列。

序列表

<110>E.I.du Pont de Nemours and Company

Viitanen，Paul

Emptage，Mark

Caimi，Perry

Li，Xu

McCutchen，Carol

<120>使用木糖利用发酵单胞菌属的木糖醇合成突变体的乙醇生产

<130>CL3604

<160>38

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>1

cagtctagag gccgcctagg ccgttcgatc aacaacccga atcc 44

<210>2

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>2

caatttgtcc gtcatgttta ttctcctaac 30

<210>3

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>3

gttaggagaa taaacatgac ggacaaattg 30

<210>4

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>4

ccagatcgtc tagattacag cagatcgcc 29

<210>5

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>5

cagtctagag gccgcctagg ccgttcgatc aacaacccga atcc 44

<210>6

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>6

ccagatcgtc tagattacag cagatcgcc 29

<210>7

<211>73

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>7

cagggccgcc taggccataa cttcgtatag catacattat acgaagttat cctgtgacgg 60

aagatcactt cgc 73

<210>8

<211>71

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>8

cagggcctag gcggccataa cttcgtataa tgtatgctat acgaagttat cctgaaccga 60

cgaccgggtc g 71

<210>9

<211>6882

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>质粒pMODPgaptaltktCm

<400>9

cggccataac ttcgtataat gtatgctata cgaagttatc ctgaaccgac gaccgggtcg 60

aatttgcttt cgaatttctg ccattcatcc gcttattatc acttattcag gcgtagcacc 120

aggcgtttaa gggcaccaat aactgcctta aaaaaattac gccccgccct gccactcatc 180

gcagtactgt tgtaattcat taagcattct gccgacatgg aagccatcac agacggcatg 240

atgaacctga atcgccagcg gcatcagcac cttgtcgcct tgcgtataat atttgcccat 300

ggtgaaaacg ggggcgaaga agttgtccat attggccacg tttaaatcaa aactggtgaa 360

actcacccag ggattggctg agacgaaaaa catattctca ataaaccctt tagggaaata 420

ggccaggttt tcaccgtaac acgccacatc ttgcgaatat atgtgtagaa actgccggaa 480

atcgtcgtgg tattcactcc agagcgatga aaacgtttca gtttgctcat ggaaaacggt 540

gtaacaaggg tgaacactat cccatatcac cagctcaccg tctttcattg ccatacggaa 600

ttccggatga gcattcatca ggcgggcaag aatgtgaata aaggccggat aaaacttgtg 660

cttatttttc tttacggtct ttaaaaaggc cgtaatatcc agctgaacgg tctggttata 720

ggtacattga gcaactgact gaaatgcctc aaaatgttct ttacgatgcc attgggatat 780

atcaacggtg gtatatccag tgattttttt ctccatttta gcttccttag ctcctgaaaa 840

tctcgataac tcaaaaaata cgcccggtag tgatcttatt tcattatggt gaaagttgga 900

acctcttacg tgccgatcaa cgtctcattt tcgccaaaag ttggcccagg gcttcccggt 960

atcaacaggg acaccaggat ttatttattc tgcgaagtga tcttccgtca caggataact 1020

tcgtataatg tatgctatac gaagttatgg cctaggcggc ctctagagtc gacctgcagg 1080

catgcaagct tcagggttga gatgtgtata agagacagct gcattaatga atcggccaac 1140

gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc 1200

tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt 1260

tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg 1320

ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg 1380

agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat 1440

accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta 1500

ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct 1560

gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc 1620

ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa 1680

gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg 1740

taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaaggacag 1800

tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt 1860

gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta 1920

cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc 1980

agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca 2040

cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa 2100

cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat 2160

ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct 2220

taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt 2280

tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat 2340

ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta 2400

atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg 2460

gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt 2520

tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg 2580

cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg 2640

taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc 2700

ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa 2760

ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac 2820

cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt 2880

ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg 2940

gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa 3000

gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata 3060

aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc taagaaacca 3120

ttattatcat gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac gagtcgcgcg tttcggtgat 3180

gacggtgaaa acctctgaca catgcagctc ccggagacgg tcacagcttg tctgtaagcg 3240

gatgccggga gcagacaagc ccgtcagggc gcgtcagcgg gtgttggcgg gtgtcggggc 3300

tggcttaact atgcggcatc agagcagatt gtactgagag tgcaccatat gcggtgtgaa 3360

ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcaggc gccattcgcc attcaggctg 3420

cgcaactgtt gggaagggcg atcggtgcgg gcctcttcgc tattacgcca gctgtctctt 3480

atacacatct caaccatcat cgatgaattc gagctcggta cccggggatc tgcgcaaacg 3540

gacattatca aggtaataaa aaaggtcgcc gaagcgacct tttttacccg aaatgctaat 3600

tacagcagtt cttttgcttt cgcaacaacg ttatcaacag tgaagccgaa ctcttcaaac 3660

agcagctctg ccggagcaga ttcaccgaag gtggtcatac cgacgatagc accgttcagg 3720

ccaacatact tgtaccagta gtcagcaata cccgcttcta cagcaacgcg tgcagtaacc 3780

gctttcggca gtacggattc acggtaagca gcatcctgct tgtcaaatgc gtcggtagac 3840

gacatggaca ccacgcgcgc tttcacgcct tcggcagtca gtttttcgta ggcagcaaca 3900

gccagttcaa cttctgaacc ggtagcgatg aaaatcagtt ccggctgacc ggcgcagtct 3960

ttcagcacat aaccaccgcg cgcgatgttt gccagttgct cttcagttcg ttcctgctgc 4020

gccaggttct gacgggagag gatcagtgcg gtcgggccgt cctgacgctc aacaccgtat 4080

ttccacgcga ccgcggattc aacctggtca cacggacgcc atgtagacat gttcggggtt 4140

acgcgcagag aagcgacctg ctcaaccggc tggtgagtcg gcccgtcttc gcccagaccg 4200

atggagtcgt gggtgtaaac catcacctga cgctgtttca tcagcgcagc catacgtacg 4260

gcgttacgtg cgtattccac gaacatcagg aaggtggagg tgtacggcag gaagccaccg 4320

tgcagggaga taccgttagc aatcgcggtc ataccgaact cgcgaacacc gtagtggatg 4380

tagttacccg cagcatcttc gttgattgct ttagaaccag accacagggt caggttagac 4440

ggcgccaggt cagcagaacc gccgaggaat tccggcaaca gcggaccgaa cgcttcgata 4500

gcattctgag acgctttacg gctggcgatt ttcgccggat tagcctgcag tttagcgatg 4560

aactctttcg ctttagcgtc gaagtcagac ggcatttcgc ctttcatacg gcgggtaaat 4620

tcagcggctt cctgcggata agctttcgcg taagcagcga atttctcgtt ccatgcggat 4680

tctttcgcct ggcctgcttc tttcgcatcc cactgagcat agatttcaga cgggatttcg 4740

aacggcgcat atttccagcc cagttgttcg cgggtcaggg caatttcagc gtcgcccagc 4800

ggcgcaccgt gggagtcgtg ggtaccggct ttgttcgggg aaccgaaacc gatgatggtt 4860

ttgcacatca gcagggaagg tttgtcagtc actgcgcgcg cttcttctac tgcgcgtttg 4920

atagatgccg cgtcatgacc gtcgatgtcg cgaataacgt gccagccgta agcttcgaaa 4980

cgcattgcgg tgtcgtcggt gaaccagcct tcaacgtgac catcgataga aataccgttg 5040

tcatcgtaga atgcaatcag tttacccagc ttcagcgtac ccgccagaga gcaaacttcg 5100

tgggagatgc cttccatcat gcagccgtcg cccatgaagg cgtaggtgta gtggtcgaca 5160

atgtcgtggc ccggacggtt aaactgcgcc gccagcgttt tttctgcaat cgccataccg 5220

actgcgttgg caataccctg acccagcgga ccggtggtgg tttccacacc cagcggtgta 5280

accccacttt ccgggtgacc cggagtttta gagtgcagct gacggaagtt tttcagttct 5340

tccatcggca gatcgtaacc ggtgaggtgc agcaggctgt agatcagcat ggagccgtgg 5400

ccgttggaca gcacgaagcg gtcacggtca gcccaggacg gattctgcgg gttgtgtttc 5460

aggaaatcac gccacaggac ttcggcaatg tcagccatac ccataggggc ccccgggtga 5520

ccggatttgg ctttctgtac tgcgtccatg ctcagcgcac gaatagcatt ggcaagctct 5580

ttacgtgagg acattttgac tccagatcgt ctagattaca gcagatcgcc gatcattttt 5640

tccagttttt cctggtcaat agcaaactta cggatacctt ccgccagttt atctactgcc 5700

attggatcct ggttgtgctg ccacaggaac tcggactcag tgatacgcgc cggacgcgct 5760

ttcacttcgc cggtgtaaga cagtttacgt tcgatagccc cttcgctctc cgccagctct 5820

ttcagcagtg ccggtgcgat ggtcagacgg tcgcagcctg ccagttccag aatttcgccg 5880

atgttacgga agcttgcgcc cataaccacg gtttcataac cgtgctcttt gtagtactgg 5940

tagatttcag atacagaaac cacgcccgga tcttctgccg gagcgtactc tttcttatcg 6000

gtattcgctt tgtaccagtc aagaatacgg ccaacaaacg gcgagatcag gaacacgccc 6060

gcttccgcac aagcacgagc ctgagcgaag gagaacagca gggtcaggtt acagttgatg 6120

ccttcttttt ccagctgttc tgcagcacgg ataccctgcc aggtagaagc cagtttgatc 6180

agaatacgat cgttgctaat accagcatcg ttgtagagtt tgatcaggcg ttttgctttc 6240

gcaattgacg cttcggtgtc ataggaaaga cgcgcatcaa cttcagttga gatacggccc 6300

ggaaccagtt tcaggatttc cagaccaata tttactgcca gtttgtcggt cgcgtccacg 6360

atctgctgcg cgcgatcgtt gctctgctgt ttcgcccagg cgacagcatc atcaatcaac 6420

ttacggtatt ccggaatctg cgctgcgtta agaatgagag aagggttggt tgtggcatcc 6480

tgcggttgat acagcttcat tgccgcgatg tccccagtgt cggccactac ggtggtgtac 6540

tgacgaaggg aggtcaattt gtccgtcatg tttattctcc taacttatta agtagctatt 6600

atattccata gctatttttt aacgtgccga cttaccggcg atcgcggcca acaccttgtt 6660

cgtgatgccg actgcggtca agccgaaatg agcatataga tcattcgccg gggccgatgc 6720

accaaaaaca tcaataccat aacgaagacc atttattcca gtataccgtt cccagccaat 6780

tgtcgtccct gcttcgatcg aaacgcgtaa aattgtcgat tgaggctgat cgggcaaaac 6840

atcattacga taggattcgg gttgttgatc gaacggcctagg 6882

<210>10

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>10

atgacggaca aattgacc 18

<210>11

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>11

agatctgcgc aaacggacat tatcaagg 28

<210>12

<211>7996

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>质粒pMODPgapxylABCm

<400>12

ggccgcggcc taggcggcca taacttcgta taatgtatgc tatacgaagt tatcctgaac 60

cgacgaccgg gtcgaatttg ctttcgaatt tctgccattc atccgcttat tatcacttat 120

tcaggcgtag caccaggcgt ttaagggcac caataactgc cttaaaaaaa ttacgccccg 180

ccctgccact catcgcagta ctgttgtaat tcattaagca ttctgccgac atggaagcca 240

tcacagacgg catgatgaac ctgaatcgcc agcggcatca gcaccttgtc gccttgcgta 300

taatatttgc ccatggtgaa aacgggggcg aagaagttgt ccatattggc cacgtttaaa 360

tcaaaactgg tgaaactcac ccagggattg gctgagacga aaaacatatt ctcaataaac 420

cctttaggga aataggccag gttttcaccg taacacgcca catcttgcga atatatgtgt 480

agaaactgcc ggaaatcgtc gtggtattca ctccagagcg atgaaaacgt ttcagtttgc 540

tcatggaaaa cggtgtaaca agggtgaaca ctatcccata tcaccagctc accgtctttc 600

attgccatac ggaattccgg atgagcattc atcaggcggg caagaatgtg aataaaggcc 660

ggataaaact tgtgcttatt tttctttacg gtctttaaaa aggccgtaat atccagctga 720

acggtctggt tataggtaca ttgagcaact gactgaaatg cctcaaaatg ttctttacga 780

tgccattggg atatatcaac ggtggtatat ccagtgattt ttttctccat tttagcttcc 840

ttagctcctg aaaatctcga taactcaaaa aatacgcccg gtagtgatct tatttcatta 900

tggtgaaagt tggaacctct tacgtgccga tcaacgtctc attttcgcca aaagttggcc 960

cagggcttcc cggtatcaac agggacacca ggatttattt attctgcgaa gtgatcttcc 1020

gtcacaggat aacttcgtat aatgtatgct atacgaagtt atggcctagg cggcctctag 1080

agtcgacctg caggcatgca agcttcaggg ttgagatgtg tataagagac agctgcatta 1140

atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc 1200

gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa 1260

ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa 1320

aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct 1380

ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac 1440

aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc 1500

gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc 1560

tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg 1620

tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga 1680

gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag 1740

cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta 1800

cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag 1860

agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg 1920

caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac 1980

ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc 2040

aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag 2100

tatatatgag taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc 2160

agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac 2220

gatacgggag ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc 2280

accggctcca gatttatcag caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg 2340

tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag 2400

tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc 2460

acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac 2520

atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag 2580

aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca gcactgcata attctcttac 2640

tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg 2700

agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc 2760

gccacatagc agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact 2820

ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg 2880

atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa 2940

tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga atactcatac tcttcctttt 3000

tcaatattat tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg 3060

tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga 3120

cgtctaagaa accattatta tcatgacatt aacctataaa aataggcgta tcacgagtcg 3180

cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca gctcccggag acggtcacag 3240

cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca gggcgcgtca gcgggtgttg 3300

gcgggtgtcg gggctggctt aactatgcgg catcagagca gattgtactg agagtgcacc 3360

atatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa ataccgcatc aggcgccatt 3420

cgccattcag gctgcgcaac tgttgggaag ggcgatcggt gcgggcctct tcgctattac 3480

gccagctgtc tcttatacac atctcaacca tcatcgatga attcgagctc gcggccgcgt 3540

tcgatcaaca acccgaatcc tatcgtaatg atgttttgcc cgatcagcct caatcgacaa 3600

ttttacgcgt ttcgatcgaa gcagggacga caattggctg ggaacggtat actggaataa 3660

atggtcttcg ttatggtatt gatgtttttg gtgcatcggc cccggcgaat gatctatatg 3720

ctcatttcgg cttgaccgca gtcggcatca cgaacaaggt gttggccgcg atcgccggta 3780

agtcggcacg ttaaaaaata gctatggaat ataatagcta cttaataagt taggagaata 3840

aacatgcaag cctattttga ccagctcgat cgcgttcgtt atgaaggctc aaaatcctca 3900

aacccgttag cattccgtca ctacaatccc gacgaactgg tgttgggtaa gcgtatggaa 3960

gagcacttgc gttttgccgc ctgctactgg cacaccttct gctggaacgg ggcggatatg 4020

tttggtgtgg gggcgtttaa tcgtccgtgg cagcagcctg gtgaggcact ggcgttggcg 4080

aagcgtaaag cagatgtcgc atttgagttt ttccacaagt tacatgtgcc attttattgc 4140

ttccacgatg tggatgtttc ccctgagggc gcgtcgttaa aagagtacat caataatttt 4200

gcgcaaatgg ttgatgtcct ggcaggcaag caagaagaga gcggcgtgaa gctgctgtgg 4260

ggaacggcca actgctttac aaaccctcgc tacggcgcgg gtgcggcgac gaacccagat 4320

cctgaagtct tcagctgggc ggcaacgcaa gttgttacag cgatggaagc aacccataaa 4380

ttgggcggtg aaaactatgt cctgtggggc ggtcgtgaag gttacgaaac gctgttaaat 4440

accgacttgc gtcaggagcg tgaacaactg ggccgcttta tgcagatggt ggttgagcat 4500

aaacataaaa tcggtttcca gggcacgttg cttatcgaac cgaaaccgca agaaccgacc 4560

aaacatcaat atgattacga tgccgcgacg gtctatggct tcctgaaaca gtttggtctg 4620

gaaaaagaga ttaaactgaa cattgaagct aaccacgcga cgctggcagg tcactctttc 4680

catcatgaaa tagccaccgc cattgcgctt ggcctgttcg gttctgtcga cgccaaccgt 4740

ggcgatgcgc aactgggctg ggacaccgac cagttcccga acagtgtgga agagaatgcg 4800

ctggtgatgt atgaaattct caaagcaggc ggtttcacca ccggtggtct gaacttcgat 4860

gccaaagtac gtcgtcaaag tactgataaa tatgatctgt tttacggtca tatcggcgcg 4920

atggatacga tggcactggc gctgaaaatt gcagcgcgca tgattgaaga tggcgagctg 4980

gataaacgca tcgcgcagcg ttattccggc tggaatagcg aattgggcca gcaaatcctg 5040

aaaggccaaa tgtcactggc agatttagcc aaatatgctc aggaacatca tttgtctccg 5100

gtgcatcaga gtggtcgcca ggaacaactg gaaaatctgg taaaccatta tctgttcgac 5160

aaataacggc taactgtgca gtccgttggc ccggttatcg gtagcgatac cgggcatttt 5220

tttaaggaac gatcgatatg tatatcggga tagatcttgg cacctcgggc gtaaaagtta 5280

ttttgctcaa cgagcagggt gaggtggttg ctgcgcaaac ggaaaagctg accgtttcgc 5340

gcccgcatcc actctggtcg gaacaagacc cggaacagtg gtggcaggca actgatcgcg 5400

caatgaaagc tctgggcgat cagcattctc tgcaggacgt taaagcattg ggtattgccg 5460

gccagatgca cggagcaacc ttgctggatg ctcagcaacg ggtgttacgc cctgccattt 5520

tgtggaacga cgggcgctgt gcgcaagagt gcactttgct ggaagcgcga gttccgcaat 5580

cgcgggtgat taccggcaac ctgatgatgc ccggatttac tgcgcctaaa ttgctatggg 5640

ttcagcggca tgagccggag atattccgtc aaatcgacaa agtattatta ccgaaagatt 5700

acttgcgtct gcgtatgacg ggggagtttg ccagcgatat gtctgacgca gctggcacca 5760

tgtggctgga tgtcgcaaag cgtgactgga gtgacgtcat gctgcaggct tgcgacttat 5820

ctcgtgacca gatgcccgca ttatacgaag gcagcgaaat tactggtgct ttgttacctg 5880

aagttgcgaa agcgtggggt atggcgacgg tgccagttgt cgcaggcggt ggcgacaatg 5940

cagctggtgc agttggtgtg ggaatggttg atgctaatca ggcaatgtta tcgctgggga 6000

cgtcgggggt ctattttgct gtcagcgaag ggttcttaag caagccagaa agcgccgtac 6060

atagcttttg ccatgcgcta ccgcaacgtt ggcatttaat gtctgtgatg ctgagtgcag 6120

cgtcgtgtct ggattgggcc gcgaaattaa ccggcctgag caatgtccca gctttaatcg 6180

ctgcagctca acaggctgat gaaagtgccg agccagtttg gtttctgcct tatctttccg 6240

gcgagcgtac gccacacaat aatccccagg cgaagggggt tttctttggt ttgactcatc 6300

aacatggccc caatgaactg gcgcgagcag tgctggaagg cgtgggttat gcgctggcag 6360

atggcatgga tgtcgtgcat gcctgcggta ttaaaccgca aagtgttacg ttgattgggg 6420

gcggggcgcg tagtgagtac tggcgtcaga tgctggcgga tatcagcggt cagcagctcg 6480

attaccgtac ggggggggat gtggggccag cactgggcgc agcaaggctg gcgcagatcg 6540

cggcgaatcc agagaaatcg ctcattgaat tgttgccgca actaccgtta gaacagtcgc 6600

atctaccaga tgcgcagcgt tatgccgctt atcagccacg acgagaaacg ttccgtcgcc 6660

tctatcagca acttctgcca ttaatggcgt aaacgttatc ccctgcctga ccgggtgggg 6720

gataattcac atctatatat ctcagtaatt aattaatatt tagtatgaat ttattctgaa 6780

aatcatttgt taatggcatt tttcagtttt gtctttcgtt ggttactcgt aatgtatcgc 6840

tggtagatat ggagatcgtt atgaaaacct caaagactgt ggcaaaacta ttatttgttg 6900

tcggggcgct ggtttatctg gttgggctat ggatctcatg cccattgtta agtggaaaag 6960

gctattttct tggcgtgtta atgacagcaa cttttggcaa ctatgcaagc ttgtttggtg 7020

cagtagcggt gcagaaaaat attcgtgatg ccggaataaa cccaccaaaa gaaacacagg 7080

ttacccagga agaatacagc gaataactca cgtaagcccg gtcagtccaa tgtgaccggg 7140

cttttactta actcactaat ctgtttctgt cgattcgttg taccagcata gaaagtaaca 7200

aactcgctgc caacgtcgcg caaaagatcc aaataatatc cagtattggc caatttttaa 7260

gctcaattcc ccgggtgcgc agcgcatgga taatcaaggc gtggaatccg tatataccca 7320

atgaatggcg ggagattaag ccaagtccgc gaatggtacg cgtatccagc gtgtttttaa 7380

ccagagtcaa tagcgcgatt gcgcagataa aaaccatcgg cccacagtaa agataccagg 7440

tatcggcaaa atttccgcgc cactgcaatt catataatgt cccgcgagag ataataaaaa 7500

cccccgtcgc aaacagcgcg gcgttcaccc acgacagtgc tttatgctgt gtgtccatca 7560

tccctatagc gcggcccaac atgccataca gaatgtagta aaaagtatcg ccattgatat 7620

ataagttaat tggcagccat tcaaaaccgt caattttctg cggcactgtg tttgggttag 7680

cgataatgcc aatcaccgcc attagcacca gcaacatttt tccgccgacg ttcttcacct 7740

gaatcagcgg tgaaaccaga taaatcaccg caatcgcgaa gaaaaaccac aagtggtaaa 7800

acactggctt ttgcagcagg tttttcagcg ctaactccat attgatggag gtaaacagcg 7860

caatgtagag cagtgcgatt gcgctataaa aaatcagaca taagccgata cgcaagaaat 7920

ggcgcggctg ggcgctgcgt tcgccaaaaa agagatagcc ggaaatcatg aaaaatagcg 7980

gcacgctgac acgagc 7996

<210>13

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>13

cgatcaacaa cccgaatcct atcg 24

<210>14

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>14

gccgttattt gtcgaacaga taatgg 26

<210>15

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>15

tatgggttca gcggcatgag 20

<210>16

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>16

atgggcatga gatccatagc c 21

<210>17

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>17

ctactcattt cctgcaggtg gtaactcatt gcgcgctc 38

<210>18

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>18

catcttactg gcgcgccaaa aatctgcggc tgacatac 38

<210>19

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>19

actcatttcc atggcgatcg cactatgcgg ccgcaatgta gcacctgaag tcagcc 56

<210>20

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>20

atctcactcc atggccggcc aactattaat taagaattga ttggctccaa ttcttg 56

<210>21

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>LoxP位点寡核苷酸

<400>21

cgcataactt cgtataatgt atgctatacg aagttatgc 39

<210>22

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>loxP位点寡核苷酸

<400>22

ggccgcataa cttcgtatag catacattat acgaagttat gcgat 45

<210>23

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>loxP位点寡核苷酸

<400>23

taaataactt cgtataatgt atgctatacg aagttatggc cgg 43

<210>24

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>loxP位点寡核苷酸

<400>24

ccataacttc gtatagcata cattatacga agttatttaa t 41

<210>25

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>25

ataaaagcgg ccgcagcaca ggatga 26

<210>26

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>26

ggcgttaatt aaggcaggtc agcaag 26

<210>27

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>27

ctactcatgg ccggcctcag aacgatcctg cacagc 36

<210>28

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>28

catcttactg gcgcgccgga cgaggttcat catcagg 37

<210>29

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>29

ctactcatat gcatgtccag aaaagacagc attcc 35

<210>30

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>30

catcttactg cgatcgctgc acggttcatt ggat 34

<210>31

<211>6179

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>质粒pGFORSp-9WW

<400>31

gtccagaaaa gacagcattc cttctcaata aagaaatatt attttttgtt tttgaaaaat 60

ttttccaaaa tctagaatgc tacattaaat atacaaaaat attattatac aaataaggct 120

tttaaatacc catatttttt agaatttctt tacaaagaaa catgttaaat atagatttag 180

agattaatat cagccatttt tatcaaaaat tctttttttg ttttataata ttatgctgca 240

aaactaataa aaacgccctt tcgaaattaa cgatcaccca caagaaataa ttatctgaca 300

gcgcttacca atcaattatt gccgaacgca gagtcccgta ttaggacggt caacaatcta 360

aaccgttttt cagaaaatat tgctttataa gcctcaaaac ttaaaagctg cggtatttta 420

atataccaaa attttctgga aaagccggcg aatcagataa cagttccgca caggtgagaa 480

ccacgacgga tcttctctga attgttggtt agttaagaaa gaaacaagga ttatgacgaa 540

caaaatctcg tcttcagata atctttccaa tgctgtttca gcaacggatg acaacgcttc 600

ccgtacgcca aatctgaccc gtcgcgctct cgttggtggt ggtgttggac tggccgcagc 660

tggcgcctta gccagtggtc ttcaggcagc gacgcttcct gctggtgcca gccaggttcc 720

gaccacgcct gcaggtcgcc cgatgcctta cgcgatccgc ccgatgccgg aagatcgtcg 780

tttcggttat gctatcgtcg gtctgggtaa atatgccctt aaccagattt taccgggttt 840

tgccggatgc cagcattccc gcatcgaagc tttggtcagc ggtaacgctg aaaaagctaa 900

aatcgttgcc gctgaatatg gcgtcgatcc ccgtaaaatt tatgattaca gcaacttcga 960

caagatcgct aaagatccaa aaatcgacgc tgtttacatc attttgccaa actctttgca 1020

tgctgaattt gctatccgtg ctttcaaagc cggcaagcat gttatgtgtg aaaagccgat 1080

ggcaacctct gttgctgatt gtcagcggat gatcgatgca gccaaggctg ctaataaaaa 1140

gctgatgatc ggttaccgtt gccactatga tccaatgaac cgtgcagcga tcgcataact 1200

tcgtataatg tatgctatac gaagttatgc ggccgcagca caggatgacg cctaacaatt 1260

cattcaagcc gacaccgctt cgcggcgcgg cttaattcag gagttaaaca tcatgaggga 1320

agcggtgatc gccgaagtat cgactcaact atcagaggta gttggcgtca tcgagcgcca 1380

tctcgaaccg acgttgctgg ccgtacattt gtacggctcc gcagtggatg gcggcctgaa 1440

gccacacagt gatattgatt tgctggttac ggtgactgta aggcttgatg aaacaacgcg 1500

gcgagctttg atcaacgacc ttttggaaac ttcggcttcc cctggagaga gcgagattct 1560

ccgcgctgta gaagtcacca ttgttgtgca cgacgacatc attccgtggc gttatccagc 1620

taagcgcgaa ctgcaatttg gagaatggca gcgcaatgac attcttgcag gtatcttcga 1680

gccagccacg atcgacattg atctggctat cttgctgaca aaagcaagag aacatagcgt 1740

tgccttggta ggtccagcgg cggaggaact ctttgatccg gttcctgaac aggatctatt 1800

tgaggcgcta aatgaaacct taacgctatg gaactcgccg cccgactggg ctggcgatga 1860

gcgaaatgta gtgcttacgt tgtcccgcat ttggtacagc gcagtaaccg gcaaaatcgc 1920

gccgaaggat gtcgctgccg actgggcaat ggagcgcctg ccggcccagt atcagcccgt 1980

catacttgaa gctaggcagg cttatcttgg acaagaagat cgcttggcct cgcgcgcaga 2040

tcagttggaa gaatttgttc actacgtgaa aggcgagatc accaaggtag tcggcaaata 2100

atgtctaaca attcgttcaa gccgacgccg cttcgcggcg cggcttaact caagcgttag 2160

agagctgggg aagactatgc gcgatctgtt gaaggtggtt ctaagcctcg tacttgcgat 2220

ggcatcgggg caggcacttg ctgacctgcc ttaattaaat aacttcgtat aatgtatgct 2280

atacgaagtt atggccggcc tcagaacgat cctgcacagc agtggcgtct gcgtcgtgaa 2340

ctcgccggtg gcggttcttt gatggatatc ggtatttatg gcttgaacgg tacccgttac 2400

ttgctgggtg aagaaccgat cgaagtccgt gcttacacct acagcgatcc gaatgatgaa 2460

cgtttcgttg aagtcgaaga tcgtattatt tggcagatgc gcttcagaag cggtgctctg 2520

tctcatggtg catcttctta ttcgaccacg acgacttcac gtttctcggt gcagggcgac 2580

aaagctgttc tgttgatgga tccggctacc ggatattatc agaatttgat ttctgtccag 2640

accccaggcc atgctaacca gtcgatgatg ccacagttca tcatgccagc gaacaaccag 2700

ttctctgcac agttggatca tctggctgaa gccgtcatca ataacaaacc agttcgtagc 2760

ccgggtgaag aaggtatgca ggatgtgcgc ctgattcagg ccatttatga agcagctcgt 2820

accggtcgcc ccgtcaacac ggattggggt tatgtccgtc agggtggtta ttgattctga 2880

cttaacctat ttgggttaaa cagacttatt tttcctgttt taggaaaata gttaaaaagg 2940

cgtcattggt tcttccaatg acgccttttt ttataaacaa aaaaatcctt ttgtcggttt 3000

tataaaaata cttcatattt tgataagccg tcttaaaaat ataataaatt tttataatat 3060

ttatccgatc aaaggacccc tttatgctag aagtcattat atcggcatta ctaccgatta 3120

taattacttt aatgataggt tttttcgctg gctggcgtgg tgaatttacg gcaaatcaag 3180

cctcgacctt gaataaaatg gtcttacgct atgccttacc tatgacttta ttctctggga 3240

ttttatcact tcccaaaaca cagattttat cgtcgggttc tgccgcaatt attttacttt 3300

tagccatggc tggcggctat ctaattacac ttgggatagg atattttgtc tgccagcgcc 3360

cagtgaatga atctgctctt ttagctcttt ctgttagcgc acctgcagtt ccttttgttg 3420

gcataacagt tctagggcat ttatttggca ctgccagcac gatattggtt tcaatatgta 3480

gcctgatgat gaacctcgtc cggcgcgccc ccgggtaccg agctcgaatt cactggccgt 3540

cgttttacaa cgtcgtgact gggaaaaccc tggcgttacc caacttaatc gccttgcagc 3600

acatccccct ttcgccagct ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc gcccttccca 3660

acagttgcgc agcctgaatg gcgaatggcg cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct 3720

gtgcggtatt tcacaccgca tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg atgccgcata 3780

gttaagccag ccccgacacc cgccaacacc cgctgacgcg ccctgacggg cttgtctgct 3840

cccggcatcc gcttacagac aagctgtgac cgtctccggg agctgcatgt gtcagaggtt 3900

ttcaccgtca tcaccgaaac gcgcgagacg aaagggcctc gtgatacgcc tatttttata 3960

ggttaatgtc atgataataa tggtttctta gacgtcaggt ggcacttttc ggggaaatgt 4020

gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc cgctcatgag 4080

acaataaccc tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga gtattcaaca 4140

tttccgtgtc gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt ttgctcaccc 4200

agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag tgggttacat 4260

cgaactggat ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag aacgttttcc 4320

aatgatgagc acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgta ttgacgccgg 4380

gcaagagcaa ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat gacttggttg agtactcacc 4440

agtcacagaa aagcatctta cggatggcat gacagtaaga gaattatgca gtgctgccat 4500

aaccatgagt gataacactg cggccaactt acttctgaca acgatcggag gaccgaagga 4560

gctaaccgct tttttgcaca acatggggga tcatgtaact cgccttgatc gttgggaacc 4620

ggagctgaat gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg tagcaatggc 4680

aacaacgttg cgcaaactat taactggcga actacttact ctagcttccc ggcaacaatt 4740

aatagactgg atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg cccttccggc 4800

tggctggttt attgctgata aatctggagc cggtgagcgt gggtctcgcg gtatcattgc 4860

agcactgggg ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt atctacacga cggggagtca 4920

ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat cgctgagata ggtgcctcac tgattaagca 4980

ttggtaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag attgatttaa aacttcattt 5040

ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca aaatccctta 5100

acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg 5160

agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc 5220

ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag 5280

cagagcgcag ataccaaata ctgtccttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa 5340

gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc 5400

cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc 5460

gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta 5520

caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag 5580

aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct 5640

tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga 5700

gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc 5760

ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt 5820

atcccctgat tctgtggata accgtattac cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg 5880

cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc gcccaatacg 5940

caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc agctggcacg acaggtttcc 6000

cgactggaaa gcgggcagtg agcgcaacgc aattaatgtg agttagctca ctcattaggc 6060

accccaggct ttacacttta tgcttccggc tcgtatgttg tgtggaattg tgagcggata 6120

acaatttcac acaggaaaca gctatgacca tgattacgcc aagcttgcat gcctgcagg 6179

<210>32

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>32

gctctagagc agcagattac gcgc 24

<210>33

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>33

acattggcgc gcttagaaaa actcatc 27

<210>34

<211>2014

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>来自pZB4的大肠杆菌(E.coli)xylA表达盒

<400>34

ccatggtgaa aacgggggcg aagaagttgt ccatattggc cacgtttaaa tcaaaactgg 60

tgaaactcac ccagggattg gctgagacga aaaacatatt ctcaataaac cctttaggga 120

aataggccag gttttcaccg taacacgcca catcttgcga atatatgtgt agaaactgcc 180

ggaaatcgtc gtggtattca ctccagagcg atgaaaacgt ttcagtttgc tcatggaaaa 240

cggtgtaaca agggtgaaca ctatcccata tcaccagctc accgtctttc attgccatac 300

ggaattagcg gccgcgttcg atcaacaacc cgaatcctat cgtaatgatg ttttgcccga 360

tcagcctcaa tcgacaattt tacgcgtttc gatcgaagca gggacgacaa ttggctggga 420

acggtatact ggaataaatg gtcttcgtta tggtattgat gtttttggtg catcggcccc 480

ggcgaatgat ctatatgctc atttcggctt gaccgcagtc ggcatcacga acaaggtgtt 540

ggccgcgatc gccggtaagt cggcacgtta aaaaatagct atggaatata atagctactt 600

aataagttag gagaataaac atgcaagcct attttgacca gctcgatcgc gttcgttatg 660

aaggctcaaa atcctcaaac ccgttagcat tccgtcacta caatcccgac gaactggtgt 720

tgggtaagcg tatggaagag cacttgcgtt ttgccgcctg ctactggcac accttctgct 780

ggaacggggc ggatatgttt ggtgtggggg cgtttaatcg tccgtggcag cagcctggtg 840

aggcactggc gttggcgaag cgtaaagcag atgtcgcatt tgagtttttc cacaagttac 900

atgtgccatt ttattgcttc cacgatgtgg atgtttcccc tgagggcgcg tcgttaaaag 960

agtacatcaa taattttgcg caaatggttg atgtcctggc aggcaagcaa gaagagagcg 1020

gcgtgaagct gctgtgggga acggccaact gctttacaaa ccctcgctac ggcgcgggtg 1080

cggcgacgaa cccagatcct gaagtcttca gctgggcggc aacgcaagtt gttacagcga 1140

tggaagcaac ccataaattg ggcggtgaaa actatgtcct gtggggcggt cgtgaaggtt 1200

acgaaacgct gttaaatacc gacttgcgtc aggagcgtga acaactgggc cgctttatgc 1260

agatggtggt tgagcataaa cataaaatcg gtttccaggg cacgttgctt atcgaaccga 1320

aaccgcaaga accgaccaaa catcaatatg attacgatgc cgcgacggtc tatggcttcc 1380

tgaaacagtt tggtctggaa aaagagatta aactgaacat tgaagctaac cacgcgacgc 1440

tggcaggtca ctctttccat catgaaatag ccaccgccat tgcgcttggc ctgttcggtt 1500

ctgtcgacgc caaccgtggc gatgcgcaac tgggctggga caccgaccag ttcccgaaca 1560

gtgtggaaga gaatgcgctg gtgatgtatg aaattctcaa agcaggcggt ttcaccaccg 1620

gtggtctgaa cttcgatgcc aaagtacgtc gtcaaagtac tgataaatat gatctgtttt 1680

acggtcatat cggcgcgatg gatacgatgg cactggcgct gaaaattgca gcgcgcatga 1740

ttgaagatgg cgagctggat aaacgcatcg cgcagcgtta ttccggctgg aatagcgaat 1800

tgggccagca aatcctgaaa ggccaaatgt cactggcaga tttagccaaa tatgctcagg 1860

aacatcattt gtctccggtg catcagagtg gtcgccagga acaactggaa aatctggtaa 1920

accattatct gttcgacaaa taacggctaa ctgtgcagtc cgttggcccg gttatcggta 1980

gcgataccgg gcattttttt aaggaacgat cgat 2014

<210>35

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>35

ctactcatcc atggcatctt gagcttgaga aaaacc 36

<210>36

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>36

catcttactg cggccgctta atggctaatc gccatcttc 39

<210>37

<211>1287

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>具有插入和确实的GFOR编码区

<400>37

atgacgaaca aaatctcgtc ttcagataat ctttccaatg ctgtttcagc aacggatgac 60

aacgcttccc gtacgccaaa tctgacccgt cgcgctctcg ttggtggtgg tgttggactg 120

gccgcagctg gcgccttagc cagtggtctt caggcagcga cgcttcctgc tggtgccagc 180

caggttccga ccacgcctgc aggtcgcccg atgccttacg cgatccgccc gatgccggaa 240

gatcgtcgtt tcggttatgc tatcgtcggt ctgggtaaat atgcccttaa ccagatttta 300

ccgggttttg ccggatgcca gcattcccgc atcgaagctt tggtcagcgg taacgctgaa 360

aaagctaaaa tcgttgccgc tgaatatggc gtcgatcccc gtaaaattta tgattacagc 420

aacttcgaca agatcgctaa agatccaaaa atcgacgctg tttacatcat tttgccaaac 480

tctttgcatg ctgaatttgc tatccgtgct ttcaaagccg gcaagcatgt tatgtgtgaa 540

aagccgatgg caacctctgt tgctgattgt cagcggatga tcgatgcagc caaggctgct 600

aataaaaagc tgatgatcgg ttaccgttgc cactatgatc caatgcaccg tgcagcgatc 660

gcataacttc gtataatgta tgctatacga agttatggta ctcatggccg gcctcagaac 720

gatcctgcac agcagtggcg tctgcgtcgt gaactcgccg gtggcggttc tttgatggat 780

atcggtattt atggcttgaa cggtacccgt tacttgctgg gtgaagaacc gatcgaagtc 840

cgtgcttaca cctacagcga tccgaatgat gaacgtttcg ttgaagtcga agatcgtatt 900

atttggcaga tgcgcttcag aagcggtgct ctgtctcatg gtgcatcttc ttattcgacc 960

acgacgactt cacgtttctc ggtgcagggc gacaaagctg ttctgttgat ggatccggct 1020

accggatatt atcagaattt gatttctgtc cagaccccag gccatgctaa ccagtcgatg 1080

atgccacagt tcatcatgcc agcgaacaac cagttctctg cacagttgga tcatctggct 1140

gaagccgtca tcaataacaa accagttcgt agcccgggtg aagaaggtat gcaggatgtg 1200

cgcctgattc aggccattta tgaagcagct cgtaccggtc gccccgtcaa cacggattgg 1260

ggttatgtcc gtcagggtgg ttattga 1287

<210>38

<211>1302

<212>DNA

<213>运动发酵单胞菌(z.mobilis)

<400>38

atgacgaaca aaatctcgtc ttcagataat ctttccaatg ctgtttcagc aacggatgac 60

aacgcttccc gtacgccaaa tctgacccgt cgcgctctcg ttggtggtgg tgttggactg 120

gccgcagctg gcgccttagc cagtggtctt caggcagcga cgcttcctgc tggtgccagc 180

caggttccga ccacgcctgc aggtcgcccg atgccttacg cgatccgccc gatgccggaa 240

gatcgtcgtt tcggttatgc tatcgtcggt ctgggtaaat atgcccttaa ccagatttta 300

ccgggttttg ccggatgcca gcattcccgc atcgaagctt tggtcagcgg taacgctgaa 360

aaagctaaaa tcgttgccgc tgaatatggc gtcgatcccc gtaaaattta tgattacagc 420

aacttcgaca agatcgctaa agatccaaaa atcgacgctg tttacatcat tttgccaaac 480

tctttgcatg ctgaatttgc tatccgtgct ttcaaagccg gcaagcatgt tatgtgtgaa 540

aagccgatgg caacctctgt tgctgattgt cagcggatga tcgatgcagc caaggctgct 600

aataaaaagc tgatgatcgg ttaccgttgc cactatgatc caatgaaccg tgcagcggta 660

aaattgatcc gtgaaaacca gttgggtaaa ctgggcatgg ttaccaccga caactcagac 720

gttatggatc agaacgatcc tgcacagcag tggcgtctgc gtcgtgaact cgccggtggc 780

ggttctttga tggatatcgg tatttatggc ttgaacggta cccgttactt gctgggtgaa 840

gaaccgatcg aagtccgtgc ttacacctac agcgatccga atgatgaacg tttcgttgaa 900

gtcgaagatc gtattatttg gcagatgcgc ttcagaagcg gtgctctgtc tcatggtgca 960

tcttcttatt cgaccacgac gacttcacgt ttctcggtgc agggcgacaa agctgttctg 1020

ttgatggatc cggctaccgg atattatcag aatttgattt ctgtccagac cccaggccat 1080

gctaaccagt cgatgatgcc acagttcatc atgccagcga acaaccagtt ctctgcacag 1140

ttggatcatc tggctgaagc cgtcatcaat aacaaaccag ttcgtagccc gggtgaagaa 1200

ggtatgcagg atgtgcgcct gattcaggcc atttatgaag cagctcgtac cggtcgcccc 1260

gtcaacacgg attggggtta tgtccgtcag ggtggttatt ga 1302

Claims

1.一种用于生产乙醇的方法，其包括，

b)在包含木糖的培养基中培养(a)的菌株，由此将所述木糖转化成乙醇，其中所述培养基包含选自山梨糖醇、甘露糖醇、半乳糖醇、核糖醇及其混合物的糖醇。

2.根据权利要求1的方法，其中相对于不含至少一种遗传修饰的重组发酵单胞菌属菌株，所述(a)的菌株改善木糖至乙醇的转化，所述遗传修饰减少葡萄糖-果糖氧化还原酶活性。

3.权利要求2的方法，其中相对于不含至少一种遗传修饰的重组发酵单胞菌属菌株，所述(a)的菌株改善木糖转化成乙醇的比率、滴度或产量中的一种或多种，所述遗传修饰减少葡萄糖-果糖氧化还原酶活性。

4.根据权利要求1的方法，其中与不含至少一种遗传修饰的发酵单胞菌属菌株相比较，当将木糖代谢成乙醇时，所述(a)的菌株生产减少量的木糖醇，所述遗传修饰减少葡萄糖-果糖氧化还原酶活性。

5.根据权利要求4的方法，其中当将木糖代谢成乙醇时，所述(a)的菌株基本上不生产木糖醇。

6.权利要求1的方法，其中所述培养基包含糖的混合物，所述糖包括木糖，其中所述糖的混合物的浓度是至少120g/L。

7.权利要求6的方法，其中所述糖醇的浓度是5mM-20mM。