CN102085258B - 一种用于防治乳腺增生的霜剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于防治乳腺增生的霜剂及其制备方法。该霜剂的有效成分的原料为玫瑰花、丁香、元胡、王不留行、透骨草、大黄、麝香和冰片。本发明首先通过乙醇溶液抽提玫瑰花、丁香、元胡、王不留行、透骨草和大黄，抽提液除去乙醇，得到滤液；药渣用水煎煮，得到煎煮液；将滤液和煎煮液合并，浓缩，得到药物浸膏；将该药物浸膏与基质混合均匀，再加入冰片和麝香，即可得到本发明所述的用于防治乳腺增生的霜剂。该霜剂组方配伍精当，具有疏肝解郁，行气活血，散结止痛的作用；能明显控制乳腺增生，能降低和调节血液中的雌激素和孕酮的含量，下调乳腺增生组织AP-2α、C-erbB-2的表达，从而达到治疗乳腺增生、预防乳腺癌的目的。
Description
技术领域
本发明特别涉及一种用于防治乳腺增生的霜剂及其制备方法，属于中医药领域。
背景技术
乳腺增生病(Hyperplasia of Mammary Gland，HMG)是最常见的乳腺疾病，以乳房疼痛和肿块为主要临床表现，并且随着月经周期或情绪波动呈现周期性变化，其特点是程长，进展缓慢，易复发，并且重度乳腺增生、非典型性乳腺增生时易于发生癌变，患乳腺癌的机率高出正常健康妇女2倍。乳腺增生病可发生在青春期开始以后的任何年龄阶段的妇女，是女性最常见的乳房疾病，其发病率占乳腺疾病的首位。近些年来该病发病率呈逐年上升的趋势，年龄也越来越低龄化。据调查约有70％～80％的女性都有不同程度的乳腺增生，多见于25～45岁的女性。该病已严重影响女性身心健康。
现代医学认为乳腺增生病与女性激素平衡失调导致乳腺增生和复旧过程紊乱有关。目前乳腺增生病的西医治疗仍以内服激素和手术治疗为主，但手术只能切除局部病变，解除不了生成因素，其他部位仍可发生或继续生长；激素替代疗法虽可短时间内缓解临床症状，但不能从根本上调整内分泌功能，长期服用反而容易加重内分泌紊乱，并产生严重副作用和并发症，所以不能满足临床的需要。中医中药在几千年的医疗实践中对乳腺增生病积累了丰富的经验，尤其在中药外用治疗乳腺增生病方面有着独特的优势和巨大的潜力。清·吴师机《理瀹骈文》认为“外治之理，即内治之理；外治之药，亦即内治之药，所异者法耳”，“且治在外则无禁制，无窒碍，无牵掣，无粘滞”。外治方法以乳房局部经皮给药与穴位按摩相结合的方式，通过药物的透皮吸收产生一定的局部刺激和血药浓度以及通过对经络腧穴所施加的物理性、化学性刺激，利用外用中药的有效生物活性和经络腧穴本身具有的外敏性和放大性，以微小药量产生明显治疗效果，达到调节内分泌等全身治疗作用。现代临床证实，中药外治法除了能起局部作用外，还可以透过皮肤进入血液循环，发挥全身作用；皮肤角质层还具有贮存作用，有着超越一般给药方法的独特优点。由于进入体内的药物较多部分可以直接到达病变部位，因此这种给药途径具有提高疗效、减少药物进入体内剂量的优点。乳腺增生病更适合经皮给药，因乳房是体表器官，局部用药可直达病所，使经络疏通，气血通调，加速改善微循环，从而达到治疗的目的。有利于药物的吸收，也容易让患者接受，能坚持治疗。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种用于防治乳腺增生的霜剂。
本发明的另一目的还在于提供所述防治乳腺增生的霜剂的制备方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种用于防治乳腺增生的霜剂，其有效成分的原料为由玫瑰花、丁香、元胡、王不留行、透骨草、大黄、麝香和冰片按质量比(25～50)∶(25～50)∶(25～50)∶(25～50)∶(25～50)∶(25～50)∶(1～2)∶(1～10)组成；
所述用于防治乳腺增生的霜剂还包含基质，基质优选为由硬脂酸、氢氧化钾、甘油和水按质量比(4～20)∶(0.3～1.4)∶(1～5)∶(20～100)组成；
所述用于防治乳腺增生的霜剂的制备方法，包含以下步骤：
(1)制备药物浸膏：在25～50重量份玫瑰花、25～50重量份丁香、25～50重量份元胡、25～50重量份王不留行、25～50重量份透骨草和25～50重量份大黄中加入体积百分比70～80％的乙醇溶液进行抽提，接着将抽提液和药渣分离，再分别按以下步骤进行操作：
①将抽提液于80～85℃进行水浴回流，收集滤液和乙醇，乙醇回收利用；
②用水煎煮药渣，煎煮；将水煎液浓缩成膏汁，在膏汁中加入乙醇溶液进行沉淀，过滤，去除沉淀，收集滤液；
③将步骤①和②得到的滤液合并，进行浓缩，得到药物浸膏；
(2)基质的制备：
①将氢氧化钾溶解于水中，得到氢氧化钾水溶液；
②硬脂酸通过水浴加热熔融后，冷却至70～80℃时，在搅拌条件下加入甘油和预热至70～80℃的步骤(2)①制备的氢氧化钾水溶液，一直搅拌至冷凝，得到基质；
其中，基质为硬脂酸、氢氧化钾、甘油和水按质量比(4～20)∶(0.3～1.4)∶(1～5)∶(20～100)进行配比；
(3)和药：将步骤(2)得到的基质于60～70℃融化后，在不断搅拌的条件下加入药物浸膏，接着冷却至40℃以下时加入研细的1～10重量份冰片和1～2重量份麝香，混合均匀后，即得用于防治乳腺增生的霜剂。
步骤(1)中所述的乙醇溶液的用量优选为药材重量的4～8倍；
步骤(1)中所述抽提的次数优选为3次；
步骤(1)②中所述的水的用量为浸没过药渣为宜，优选为其使用体积为药渣体积的至少3倍；
步骤(1)②中所述的煎煮的次数优选为2次，每次煎煮30分钟；
步骤(1)②中所述的乙醇溶液优选为体积百分比95％的乙醇溶液；
所述的体积百分比95％的乙醇溶液的用量优选为膏汁体积的2倍；
步骤(1)②中所述的沉淀的条件优选为：将水煎液和体积百分比95％的乙醇溶液混合均匀后，静置至少24小时；
步骤(1)③中所述药物浸膏的相对密度为60℃下1.25g/ml；
步骤(3)中所述的药物浸膏和所述的基质优选按质量比1∶4进行配制。
本发明的原理：
本发明认为乳腺增生病以肾气不足、天癸不充、冲任失调为发病之本，七情过度、肝气郁滞、脾失健运、为发病之因，气滞、血瘀、痰凝为标；主要和肝，脾胃，肾，冲任相关。本发明的有效成分原料由丁香、玫瑰花、透骨草、大黄、元胡、王不留行、麝香和冰片八味药物等份组成。丁香辛、性温，入胃、脾、肾经，暖肾助阳；玫瑰花甘、微苦，性温，归肝、脾经，行气解郁，和血散瘀；元胡辛、苦，性温，归肝、脾经，理气，活血，散瘀，止痛；王不留行苦，性平，归肝、胃经，活血通经；透骨草辛、苦，性温，入肝经，活血止痛；大黄苦，性寒，归脾、胃、大肠、肝、心经，逐瘀通经；麝香辛、性温，归心、肝、脾经，活血散结、止痛消肿；冰片辛、苦，性凉，归心、脾、肺经，具有止痛、防腐作用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明所制备的用于防治乳腺增生的霜剂，其组方配伍精当，具有疏肝解郁，行气活血，散结止痛的作用；能明显控制乳腺增生，能降低和调节血液中的雌激素和孕酮的含量，下调乳腺增生组织AP-2α、C-erbB-2的表达，从而达到治疗乳腺增生、预防乳腺癌的目的。
(2)本发明所制备的用于防治乳腺增生的霜剂使用方便，见效快，治愈率高，患者易于接受，且原料廉价易得，无任何副作用。
附图说明
图1是HE染色的大鼠乳腺组织形态图，其中：
A为正常对照组；B为单纯疾病模型组；C为病症结合模型组；D为三苯氧胺软膏组；E为乳癖霜小剂量组；F为乳癖霜中剂量组；G为乳癖霜大剂量组；H为病症结合乳癖霜组；放大倍数为10×5倍。
图2是大鼠乳腺组织免疫组织化学图，其中：
A为正常对照组；B为单纯疾病模型组；C为病症结合模型组；D为三苯氧胺软膏组；E为乳癖霜小剂量组；F为乳癖霜中剂量组；G为乳癖霜大剂量组；H为病症结合乳癖霜组；放大倍数为10×40倍。
图3是AP-2α在大鼠乳腺组织病理分级中的表达图。
图4是大鼠乳腺增生组织C-erbB-2与AP-2α的散点图。
图5是通过Western blot检测大鼠乳腺组织中AP-2α表达量的图，其中：
泳道A为正常对照组；泳道B为单纯疾病模型组；泳道C为病症结合模型组；泳道D为三苯氧胺软膏组；泳道E为乳癖霜小剂量组；泳道F为乳癖霜中剂量组；泳道G为乳癖霜大剂量组；泳道H为病症结合乳癖霜组。
图6是Western blot杂交图的灰度分析柱形图，其中：△表示与正常对照组相比，P＜0.01；*表示与单纯疾病模型组相比，P＜0.05；▲表示与病症结合模型组相比，P＜0.01。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
(一)制备用于防治乳腺增生的霜剂
(1)制备药物浸膏：将50g玫瑰花、50g丁香、50g元胡、50g王不留行、50g透骨草和50g大黄中加入1.7L体积百分比为75％的乙醇溶液加热回流进行抽提1h(70～80℃)，共3次，将抽提液和药渣分离，抽提液合并，再分别按以下步骤进行操作：
①将抽提液进行水浴回流82℃，收集滤液和乙醇，乙醇回收利用；
②用水煎煮药渣，加6倍重量量水，每次煎煮30分钟；煎煮2次，合并水煎液；将水煎液浓缩成膏汁，在膏汁中加入2倍体积的体积百分比95％的乙醇溶液，混合均匀后静置24h，过滤，去除沉淀，收集滤液；
③将步骤①和②得到的滤液合并，滤液减压浓缩至相对密度为1.25g/ml(60℃)时停止浓缩，得到药物浸膏60g；
(2)基质的制备：将7g氢氧化钾溶解于500g水中，得到氢氧化钾水溶液；100g硬脂酸通过水浴加热熔融后，冷却至80℃时，在搅拌条件下加入25g甘油和预热至80℃的507g氢氧化钾水溶液，一直搅拌至冷凝，得到基质；
(3)和药：将步骤(1)得到的全部药物浸膏和240g步骤(2)得到的基质进行配制；首选，将基质加热65℃融化，在不断搅拌的条件下加入药物浸膏，冷却至40℃以下时加入研细的10g冰片和2g麝香，混合均匀后，即得用于防治乳腺增生的霜剂。此霜剂呈棕褐色，外观细腻有光泽。
(二)药物效果的检测
I、动物实验
(1)通过制备大鼠乳腺增生模型进行检测：
①造模：
A、单纯疾病模型：参照饶金才等【饶金才，李兰珍，陈云生，彭泽华，余月华.乳腺增生病动物模型的复制及病理类型[J].中国病理生理杂志，1992，8(06)：671-672.】方法在大鼠(SPF级Wistar雌性大鼠，体重194.8±12.0g，南方医科大学实验动物中心)后腿内侧肌肉注射苯甲酸雌二醇0.5mg/kg/d，连续25天，然后肌注黄体酮4mg/kg/d，连续5天，共用药30天，制造乳腺增生病动物模型。
B、病症结合模型：参照文献【王非，吴开明，常健菲，杨阳.消癖汤对肝郁型乳腺增生病大鼠性激素水平的影响[J].中医药信息，2009，26(04)：95-96.】在注射药物的同时，每天添加夹尾方式激惹大鼠，使其与其它大鼠厮打，很快激怒同笼的其它大鼠，每次30min，每天刺激1次，也是连续30d，制造乳腺增生肝郁气滞模型。
造模成功标准：造模后，肉眼观察，模型动物的乳头高度明显高于正常对照组；乳腺组织切片可见乳腺腺泡增多，腺泡腔和腺导管明显扩张。雌激素升高，孕酮下降。病症结合模型大鼠除以上表现外，还出现反应迟钝、行动迟缓，毛色枯黄、身体瘦小等肝郁表现。
②分组和用药
首先将购买来的SPF级Wistar雌性大鼠自然饲养一周以适应环境，然后将大鼠第2、3对乳房部位脱毛，称重，根据体重按随机数字表随机分为8组，每组6只，分别编号。造模及干预治疗如下：
A、正常对照组：6只，正常的SPF级Wistar雌性大鼠后腿内侧肌肉注射注射生理盐水0.1ml/d，自然饲养，不做特殊处理。
B、单纯疾病模型组：6只，按照步骤①所述造模方法进行造模，自然饲养，不做特殊处理。
C、病症结合模型组：6只，按照步骤①所述造模方法进行造模，自然饲养，不做特殊处理。
D、三苯氧胺软膏组：6只，在按照步骤①所述造模方法进行造模的基础上同时于造模大鼠乳腺部位分别涂抹三苯氧胺软膏0.1g(单纯疾病模型组)，每天1次，并按摩每只乳房1min，共30d；三苯氧胺软膏的制备：将1g他莫昔芬溶解于14ml丙二醇中，48.6g聚乙二醇4000加热熔化与36.4g聚乙二醇400混匀，搅拌加入溶解了他莫昔芬的丙二醇溶液中，搅拌至冷，4℃冰箱保存备用。
E、乳癖霜(即本实施例步骤(一)制备的用于防治乳腺增生的霜剂)小剂量组：6只，在按照步骤1)所述造模方法进行造模的同时于造模大鼠乳腺部位(单纯疾病模型组)分别外用乳癖霜0.2g，每天1次，并按摩每只乳房1min，共30d。
F、乳癖霜中剂量组：6只，在按照步骤①所述造模方法进行造模的同时于造(单纯疾病模型组)模大鼠乳腺部位分别外用乳癖霜0.4g，每天1次，并按摩每只乳房1min，共30d。
G、乳癖霜大剂量组：6只，在按照步骤①所述造模方法进行造模的同时于(单纯疾病模型组)造模大鼠乳腺部位分别外用乳癖霜0.8g，每天1次，并按摩每只乳房1min，共30d。
H、病症结合乳癖霜组：6只，在按照步骤①所述的病症结合模型的造模方法进行造模的同时于造模大鼠乳腺部位分别外用乳癖霜0.8g，每天1次，并按摩每只乳房1min，共30d。
(2)标本采取及检测项目
①大鼠的体重及乳头直径和高度的测量
从饲养大鼠的第一天起到处死大鼠的1个月期间每周测量所有大鼠体重1次，用精密游标卡尺每周测量所有大鼠第2、3对左右两个乳头直径及乳头高度1次，并观察其外观。
大鼠的体重如表1所示：
表1大鼠体重对照表
注：与正常对照组比较，△P＜0.05。
表1的统计结果表明：大鼠经苯甲酸雌二醇、黄体酮联合造模并用药干预后，无一例死亡，第二周内各组大鼠体重均有所下降，病症结合模型组和病症结合乳癖霜组下降更明显。正常对照组与其它组比较体重下降不明显。第二、三周各组大鼠体重有所增长，第四周除病症结合模型组和病症结合乳癖霜组外，其余各组都基本恢复到实验前水平，正常对照组与其它各组比较差别有统计学意义(P＜0.05)。
大鼠乳头外观为：正常对照组动物乳头仅呈小米样，柔软，直径、高度无明显变化；其它各组动物与空白对照组动物比较，乳头竖起较坚实，充血，乳头直径增大，见表2。
表2大鼠乳头高度、乳房直径的变化对照表
注：与正常对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与单纯疾病模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与病症结合模型组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。
表2的统计结果显示，与正常对照组相比，疾病模型组大鼠和病症结合模型组大鼠第2、3对乳头高度、直径明显增加(P＜0.01)。经药物干预后，呈现良好的治疗效果。各干预组与模型组比较，乳头高度，直径都有下降的趋势(P＜0.05或P＜0.01)。
②血清性激素检测
实验末将大鼠以1％戊巴比妥钠按40mg/kg经腹腔注射麻醉。将大鼠固定，从大鼠腹主动脉抽取4ml动脉血，注入5ml离心管中，在4℃下3000r/min离心15min，分离血清，送入暨南大学第一附属医院核医学科检测血清性激素(E2、P)，结果如表3所示。
表3各组大鼠血清中雌激素(E2)、孕激素(P)含量比较
注：与正常对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与单纯疾病模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与病症结合模型组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。
表3的统计结果显示：与正常对照组大鼠相比，疾病模型组大鼠和病症结合模型组大鼠血清E2含量显著增高，血清P含量明显降低。血清E2含量单纯疾病模型组与病症结合模型组比较有统计学差异(P＜0.01)，经药物干预后，各组大鼠血清E2含量降低、P含量升高(P＜0.05或P＜0.01)。但三苯氧胺软膏组血清E2含量降低到正常以下，并和正常对照组比较有统计学意义(P＜0.05)。
③脏器系数
取大鼠肝脏、脾脏、子宫，用MP200A型电子天平精密称重，并计算出脏器系数，如表4所示。脏器系数计算公式：脏器系数＝脏器质量(g)/大鼠体重(g)×100％。
表4对大鼠脏器系数的影响
注：与单纯疾病模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与病症结合模型组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。
表4统计结果显示：与正常对照组比较，疾病模型组大鼠和病症结合模型组的大鼠子宫系数和肝脏系数显著增加(P＜0.01)，脾脏系数无明显变化。经药物干预后各组大鼠子宫系数降低(P＜0.05或P＜0.01)，各组肝脏系数也有所降低，各组脾脏系数无统计学差异。
④大鼠乳腺组织形态学观察
取8个实验组大鼠的第2、3对部分乳房，用10％的福尔马林固定，梯度酒精脱水，常规石蜡包埋切片(切片厚4μm)。常规HE染色后在光镜下进行组织学观察其增生程度，结果如图1所示。
HE染色操作步骤与分析方法参照(周庚寅，组织病理学技术[M].北京大学医学出版社，第1版，2006：13)。
大鼠乳腺组织学诊断标准：参照文献(宋爱莉，任旋磊，李湘奇，杨毅，殷玉琨.乳宁霜对乳腺增生病大鼠血清性激素影响的实验研究[J].中医药学刊，2006，24(12)：2179.)根据有无乳腺增生病症及病症轻重程度分为四类：无增生、轻度增生、中度增生、重度增生。无增生：乳腺小叶不增生，腺体数量极少，腺泡不扩张，处于静止期状态；轻度增生：个别腺泡有轻度增生，无扩张，腺泡及导管内有分泌物；中度增生：乳腺小叶大部分增生，少数腺泡有轻度扩张，腺上皮增生层次增多腺泡及导管内有分泌物；重度增生：乳腺小叶大部分增生，多数腺泡有明显扩张，腺上皮增生层次增多，腺泡及导管内有较多分泌物。将光镜下各组乳腺增生程度按上述标准进行分类，结果如表5所示。
表5各组大鼠乳腺组织增生程度结果
注：经多样本比较的秩和检验(Kruskal-Wallis法，即H值检验)，x2＝151.0，P＝0.000。按a＝0.05水准，认为各组大鼠乳腺组织增生程度不同，其中单纯疾病模型组和病症结合模型组增生程度最重(平均秩＝162.5)。经两样本比较的秩和检验(Mean-Whitney Test)，正常对照组与单纯疾病模型组、病症结合模型组比较Z＝6.86，P＝0.000；三苯氧胺软膏组与单纯疾病模型组比较Z＝6.56，P＝0.000；乳癖霜小剂量组与单纯疾病模型组比较Z＝4.76，P＝0.000；乳癖霜中剂量组与单纯疾病模型组比较Z＝6.04，P＝0.000；乳癖霜大剂量组与单纯疾病模型组比较Z＝6.47，P＝0.000；病症结合乳癖霜组与病症结合模型组比较Z＝6.49，P＝0.000。
表5的统计结果显示：单纯疾病模型组和病症结合模型组的病理形态都为重度增生，与正常对照组比有非常显著差异(P＝0.000)，说明外源性激素能够很好的复制乳腺增生病模型；经药物干预后，各干预组能够显著降低乳腺增生的程度，与单纯疾病模型组或病症结合模型组比较有统计学意义(P＝0.000)。
⑤大鼠乳腺组织C-erbB-2和AP-2α蛋白表达的检测
近年来，转录因子在乳腺癌发生发展中的作用日益受到人们关注，其中转录因子激活蛋白-2(Transcrioption factor activator protein 2，AP-2)在基因表达调控、细胞分化、胚胎发育及肿瘤发生发展过程中起着极为重要的作用。目前的研究表明，许多介导细胞生长、形成、运动和细胞联络的基因，一般都具有重要的AP-2结合位点和顺式调控序列。另外，C-erbB-2作为一种原癌基因在许多肿瘤的发生发展中起到重要作用。
取8个实验组大鼠2、3对乳房，一部分用10％的福尔马林固定，梯度酒精脱水，常规石蜡包埋切片(切片厚4μm)。用免疫组化法检测大鼠乳腺组织C-erbB-2的表达。一部分存入冻存管，放入-80℃冰箱保存，用于免疫印迹法检测AP-2α蛋白的表达。具体如下：
A、免疫组化操作步骤与分析方法如下：
采用链霉菌抗生物素蛋白2过氧化酶法(st rep2tavidin peroxidme，SP)，二氨基联苯胺(diamion2 ben zidene DAB)显色。Rabbit Anti-C-cerbB-2即用型试剂购于博士德生物工程有限公司，SP试剂盒(兔)购于福州迈新生物技术开发有限公司，DAB显色试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司，操作步骤参照说明书进行，微波抗原修复。用已知阳性组织标本作阳性对照，以磷酸盐缓冲液(phosp hatebuffered saline，PBS)代替第一抗体作为阴性对照，所有切片采用一批试剂完成。
免疫组化结果判断标准参照文献(刘启兰，薄莉，杨文秀，刘辉，钟愉.乳腺癌cerbB-2蛋白免疫组织化学染色方法的改进[J].贵阳医学院学报，2010(01)：94-95+97.)：C-erbB-2阳性信号定位于细胞膜。根据最近推荐的阳性等级标准：细胞膜无阳性信号为阴性，有清晰完整的细胞膜阳性信号并在10％的细胞中出现为“+”，在20％的细胞中出现为“++”，在30％以上的细胞中出现为“+++”。结果判断时应注意先在10×物镜下进行判读；注意细胞膜完全着色的细胞比例及着色强度；胞质着色应忽略不计。结果如图2和表6、7所示。
表6C-erbB-2在各组乳腺组织中的表达
注：与正常对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与单纯疾病模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与病症结合模型组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。
表6的统计结果显示，C-erbB-2在正常对照组中无表达，复制乳腺增生模型后显著增高(P＜0.01)；经药物干预后，各组能够降低C-erbB-2在乳腺组织中的表达。
表7C-erbB-2在病理分级中的表达
表7的结果显示，将大鼠乳腺组织按病理分级统计发现：随着乳腺组织增生程度的加重，C-erbB-2蛋白的表达阳性率逐渐升高，经线性趋势检验，x2＝52.93，P＝0.000，等级相关系数＝0.531，P＝0.053。癌基因C-erbB-2蛋白的表达和大鼠乳腺增生病理分级关系密切。
B、Western Blot操作步骤与分析方法
取各实验组大鼠的第2、3对乳房，用组织匀浆器匀浆，用BestBio-贝博核蛋白提取试剂盒提取其乳腺组织细胞核内总蛋白，使各实验组核内总蛋白溶解于相同体积的BufferB中，并测定各实验组总蛋白溶液浓度。取适量相同体积(50p1)各组蛋白溶液，经电泳分离、转膜、封闭后，依次加入[AP-2α(C-18)抗体用封闭液作1∶200稀释]，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG用封闭液作1∶400稀释，TBS洗膜，ECL化学发光，胶片显影，采用FlourChem V2.0凝胶成像分析软件(美国)进行蛋白条带灰度定量分析。
AP-2α在大鼠乳腺组织病理分级中的表达，如图3所示。从图3中可以看出：随着乳腺组织增生程度的加重，AP-2α蛋白的表达水平逐渐升高，经Spearman等级相关分析，相关系数为0.904，P＝0.000。按a＝0.05水准，可以认为大鼠乳腺增生组织中AP-2α蛋白的表达水平与病理分级有显著的正相关性。
利用Leica Qwin图像分析系统对免疫组化染色切片进行分析，每张切片取五个视野，记录C-erbB-2阳性表达的面积百分比平均值，将大鼠乳腺增生组织C-erbB-2阳性表达的标本按AP-2α/β-actin的灰度值比值、C-erbB-2阳性表达的面积百分比进行Pearson相关分析。由散点图可见(图4)，大鼠乳腺增生组织C-erbB-2表达水平随着AP-2α的表达水平增加而增大且呈直线趋势。Pearson相关系数r＝0.882，P＝0.000，按a＝0.05标准，认为乳腺增生组织C-erbB-2表达水平与AP-2α表达水平呈正的直线关系。
AP-2α在各组大鼠乳腺组织中的杂交图如图5所示，将各组织中AP-2α蛋白表达的灰度值与β-actin灰度值比值分析，结果如图6所示。从图6中可以看出，单纯疾病模型组、病症结合模型组与正常对照组比较有显著性差异(P＜0.01)，AP-2α在模型大鼠乳腺增生组织中的表达水平明显高于正常对照组，经药物干预后，各干预组能够显著降低模型大鼠乳腺增生组织中的AP-2α蛋白的表达水平(P＜0.01或P＜0.05)。
II、临床实验
(1)临床资料
本组40例均为门诊患者，其中已婚34例，未婚6例，年龄最大48岁，最小20岁，以25-35岁为多，病程最短3个月，最长的7年，以6个月到2年为多。
(2)临床症状
40例均有乳房胀痛，程度不一，与情志、月经有关，可触及结块，或沙砾状、或片状、条索状、团块状，大小不等混合可见，光滑活动，边界欠清，与表皮及胸肌无粘连，中等硬度，重者胸部有紧束感，疼痛牵及肩臂，烦躁易怒，均无红肿。
(3)诊断标准
以国家中医药管理局颁布的《中医病症诊断疗效标准》中乳癖的诊断标准(ZY/T001.2-94)及2002年中华中医外科学会乳腺病专业委员会第八次会议通过的乳腺增生病诊断标准为依据。所有病例均经过乳房彩色B超检查或电脑红外线乳腺扫描，并排除合并其他乳腺疾病者；合并心、肝、肾和其他脏器严重疾病及精神病患者；妊娠或哺乳期患者。
(4)使用方法
治疗时取步骤(一)制备的霜剂适量涂抹于患侧乳房，然后用手全掌由乳房四周沿乳腺管轻轻向乳头方向推抚50～100次。后取霜剂适量摊于纱布上，贴于患处。每天1次，每四周一个疗程，共用四个疗程。
(5)疗效观察
①疗效标准：依据2002年中华中医外科学会乳腺病专业委员会第八次会议通过的疗效评价标准进行评定。计算治疗前后积分改善率，改善率＝[(治疗前总积分-治疗后总积分)/治疗前总积分]×100％。治愈：改善率≥90％。显效：改善率70％～89％。有效：改善率30％～69％。无效：改善率＜30％。
②治疗结果：本组40例，治愈28例，占70％，显效8例，占20％，有效3例，占7.5％，无效1例，占2.5％，总有效率占97.5％。
统计学方法：以上所有数据采用SPSS 13.0统计软件进行分析，计量资料以表示。先采用方差齐性检验，各组方差齐时，进行多个样本均数间的两两比较用q检验。各组方差不齐时选择Tamhane’s T2法。对于分组无序的等级资料采用完全随机设计多个样本的秩和检验，选择Kruskal-Wallis H法，用Two-Indepent Samples Tests进行组间两两比较，采用Mean-Whitney U法。对于分组变量有序，分析变量无序的资料行x2检验。两种因子间相关性的比较采用直线相关分析。按a＝0.05水准，P＜0.05表示差异有统计学意义。
实施例2
(一)制备用于防治乳腺增生的霜剂
(1)制备药物浸膏：在50g玫瑰花、50g丁香、50g元胡、50g王不留行、25g透骨草和25g大黄中加入1.4L体积百分比75％的乙醇溶液于70～80℃加热回流进行抽提，共3次，每次1h，将抽提液和药渣分离，抽提液合并，再分别按以下步骤进行操作：
①将抽提液进行水浴回流80℃，收集滤液和乙醇，乙醇回收利用；
②同实施例1步骤(一)(1)②；
③实施例1步骤(一)(1)③，得到药物浸膏50g；
(2)基质的制备：同实施例1步骤(一)(2)；
(3)和药：将步骤(1)得到的全部药物浸膏和200g步骤(2)得到的基质进行配制；首选，将基质于60℃加热融化，在不断搅拌的条件下加入药物浸膏，冷却至40℃以下时加入研细的1g冰片和2g麝香，混合均匀后，即得用于防治乳腺增生的霜剂。此霜剂呈棕褐色，外观细腻有光泽。
(二)药物效果的检测
通过制备大鼠乳腺增生模型进行检测：
(1)造模：在大鼠(SPF级Wistar雌性大鼠，体重200±20g，购广州中医药大学实验动物中心)后腿内侧肌肉注射苯甲酸雌二醇0.5mg/kg/d，连续25天，然后肌注黄体酮4mg/kg/d，连续5天，共用药30天，制造乳腺增生病动物模型。
(2)分组和用药
首先将购买来的SPF级Wistar雌性大鼠自然饲养一周以适应环境，然后将大鼠的第2、3对乳房部位脱毛，称重，根据体重按随机数字表随机分为6组，每组8只，分别编号。造模及干预治疗如下：正常对照组：8只，正常的SPF级Wistar雌性大鼠后腿内侧肌肉注射注射生理盐水0.1ml/d，自然饲养，不做特殊处理；单纯疾病模型组：8只，按照步骤(1)所述造模方法进行造模，自然饲养，不做特殊处理；三苯氧胺软膏组：8只，在按照步骤(1)所述造模方法进行造模的基础上同时于造模大鼠乳腺部位分别涂抹三苯氧胺软膏0.1g，每天1次，并按摩每只乳房1min，共30d；三苯氧胺软膏的制备：将1g他莫昔芬溶解于14ml丙二醇中，48.6g聚乙二醇4000加热熔化与36.4g聚乙二醇400混匀，搅拌加入溶解了他莫昔芬的丙二醇溶液中，搅拌至冷，4℃冰箱保存备用。乳癖霜(本实施例步骤(一)所制备的用于防治乳腺增生的霜剂)小、中、大剂量组：各8只，在按照步骤(1)所述造模方法进行造模的同时于造模大鼠乳腺部位分别外用乳癖霜0.2g(小剂量)、0.4g(中剂量)、0.8g(大剂量)每天1次，并按摩每只乳房1min，共30d。
(3)标本采取及检测项目
末次给药次日，腹主动脉取血，3000rpm、15min离心，取血清，放免法测定血清中雌二醇、孕酮含量。用游标卡尺测量大鼠第二对乳头直径的变化，每只大鼠选取第二对乳腺组织，体积百分比10％中性福尔马林固定，常规石蜡包埋，切片后4-5μm，HE染色，由病理专业人员阅片，光镜下观察组织病理学改变。
(4)大鼠乳腺组织学诊断标准：参照文献(宋爱莉，任旋磊，李湘奇，杨毅，殷玉琨.乳宁霜对乳腺增生病大鼠血清性激素影响的实验研究[J].中医药学刊，2006，24(12)：2179.)根据有无乳腺增生病症及病症轻重程度分为四类：无增生、轻度增生、中度增生、重度增生。无增生：乳腺小叶不增生，腺体数量极少，腺泡不扩张，处于静止期状态；轻度增生：个别腺泡有轻度增生，无扩张，腺泡及导管内有分泌物；中度增生：乳腺小叶大部分增生，少数腺泡有轻度扩张，腺上皮增生层次增多腺泡及导管内有分泌物；重度增生：乳腺小叶大部分增生，多数腺泡有明显扩张，腺上皮增生层次增多，腺泡及导管内有较多分泌物。
(5)实验结果：
①乳癖霜对乳腺增生模型大鼠乳头直径及雌孕激素的影响：表8的结果表明，乳癖霜可明显降低乳腺增生模型大鼠的乳头直径和降低模型大鼠血清雌二醇水平、升高血清孕酮水平。
表8乳癖霜对大鼠乳头高度、乳房直径及雌孕激素的影响
注：与正常对照组比较**P＜0.01；与模型组比较△△P＜0.01
②乳癖霜对乳腺增生模型大鼠乳腺组织形态学的影响：表9的结果表明，，乳癖霜能够显著降低乳腺增生的程度，说明乳癖霜可以有效对抗雌激素引起的大鼠乳腺增生。
表9乳癖霜对各组大鼠乳腺组织病变程度的影响
注：模型组与正常组比较z＝5.421 P＝0.000；三苯氧胺组与模型组比较z＝4.362 P＝0.000；乳癖霜小剂量组与模型组比较z＝3.522 P＝0.000；乳癖霜中剂量组与模型组比较z＝4.198 P＝0.000；乳癖霜大剂量组与模型组比较z＝4.927 P＝0.000。
实施例3
(一)制备用于防治乳腺增生的霜剂
(1)制备药物浸膏：将25g玫瑰花、25g丁香、25g元胡、25g王不留行、50g透骨草和50g大黄中加入1.1L体积百分比75％的乙醇溶液于70～80℃加热回流进行抽提，共3次，每次1h，将抽提液和药渣分离，抽提液合并，再分别按以下步骤进行操作：
①将抽提液进行水浴回流85℃，收集滤液和乙醇；
②同实施例1步骤(一)(1)②；
③同实施例1步骤(一)(1)③，得到药物浸膏40g；
(2)基质的制备：同实施例1步骤(一)(2)；
(3)和药：将步骤(1)得到的全部药物浸膏和160g步骤(2)得到的基质进行配制；首选，将基质于70℃加热融化，在不断搅拌的条件下加入药物浸膏，冷却至40℃以下时加入研细的10g冰片和1g麝香，混合均匀后，即得用于防治乳腺增生的霜剂。此霜剂呈棕褐色，外观细腻有光泽。
(二)药物效果的检测
通过制备大鼠乳腺增生模型进行检测：
(1)造模：在大鼠(SPF级Wistar雌性大鼠，体重200±20g，购南方医科大学实验动物中心)后腿内侧肌肉注射苯甲酸雌二醇0.5mg/kg/d，连续25天，然后肌注黄体酮4mg/kg/d，连续5天，共用药30天，制造乳腺增生病动物模型。
(2)分组和用药，同实施例2步骤(二)(2)。
(3)标本采取及检测项目，同实施例2步骤(二)(3)。
(4)大鼠乳腺组织学诊断标准：同实施例2步骤(二)(4)。
(5)实验结果：
①乳癖霜对乳腺增生模型大鼠乳头直径及雌孕激素的影响：表10的结果表明，乳癖霜可降低乳腺增生模型大鼠的乳头直径和降低模型大鼠血清雌二醇水平、升高血清孕酮水平。
表10乳癖霜对大鼠乳头高度、乳房直径及雌孕激素的影响
注：与正常组对照组比较**P＜0.01；与模型组比较△△P＜0.01
②乳癖霜对乳腺增生模型大鼠乳腺组织形态学的影响：表11的结果表明，乳癖霜能够降低乳腺增生的程度，说明乳癖霜可以有效对抗雌激素引起的大鼠乳腺增生。
表11乳癖霜对各组大鼠乳腺组织病变程度的影响
注：模型组与正常对照组比较z＝5.568 P＝0.000；三苯氧胺组与模型组比较z＝4.718 P＝0.000；乳癖霜小剂量组与模型组比较z＝3.754 P＝0.000；乳癖霜中剂量组与模型组比较z＝4.247 P＝0.000；乳癖霜大剂量组与三苯氧胺组比较z＝4.209 P＝0.000。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种用于防治乳腺增生的霜剂，其特征在于：所述的用于防治乳腺增生的霜剂的有效成分的原料为由玫瑰花、丁香、元胡、王不留行、透骨草、大黄、麝香和冰片按质量比25～50:25～50:25～50:25～50:25～50:25～50:1～2:1～10组成。
2.根据权利要求1所述的用于防治乳腺增生的霜剂，其特征在于：所述用于防治乳腺增生的霜剂由权利要求1所述原料和基质制成。
3.根据权利要求2所述的用于防治乳腺增生的霜剂，其特征在于：所述的基质为由硬脂酸、氢氧化钾、甘油和水按质量比4～20: 0.3～1.4: 1～5: 20～100组成。
4.权利要求3所述的用于防治乳腺增生的霜剂的制备方法，其特征在于包含以下步骤：
（1）制备药物浸膏：在25～50重量份玫瑰花、25～50重量份丁香、25～50重量份元胡、25～50重量份王不留行、25～50重量份透骨草和25～50重量份大黄中加入体积百分比70～80%的乙醇溶液进行抽提，接着将抽提液和药渣分离，再分别按以下步骤进行操作：
①将抽提液于80～85℃进行水浴回流，收集滤液和乙醇，乙醇回收利用；
②用水煎煮药渣，煎煮；将水煎液浓缩成膏汁，在膏汁中加入乙醇溶液进行沉淀，过滤，去除沉淀，收集滤液；
③将步骤①和②得到的滤液合并，进行浓缩，得到药物浸膏；
（2）基质的制备：
①将氢氧化钾溶解于水中，得到氢氧化钾水溶液；
②硬脂酸通过水浴加热熔融后，冷却至70～80℃时，在搅拌条件下加入甘油和预热至70～80℃的步骤（2）①制备的氢氧化钾水溶液，一直搅拌至冷凝，得到基质；
其中，基质为硬脂酸、氢氧化钾、甘油和水按质量比4～20: 0.3～1.4: 1～5: 20～100进行配比；
（3）和药：将步骤（2）得到的基质于60～70℃融化后，在不断搅拌的条件下加入药物浸膏，接着冷却至40℃以下时加入研细的1～10重量份冰片和1～2重量份麝香，混合均匀后，即得用于防治乳腺增生的霜剂。
5.根据权利要求4所述的用于防治乳腺增生的霜剂的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述的乙醇溶液的用量为药材重量的4～8倍；
步骤（1）中所述抽提的次数为3次。
6.根据权利要求4所述的用于防治乳腺增生的霜剂的制备方法，其特征在于：步骤（1）②中所述的水的用量为浸没过药渣；
步骤（1）②中所述的煎煮的次数为2次，每次煎煮30分钟；
步骤（1）②中所述的乙醇溶液为体积百分比95％的乙醇溶液；
步骤（1）③中所述药物浸膏的相对密度为60℃下1.25 g/ml。
7.根据权利要求6所述的用于防治乳腺增生的霜剂的制备方法，其特征在于：
所述的体积百分比95％的乙醇溶液的用量为膏汁体积的2倍；
所述的水的使用体积为药渣体积的至少3倍。
8.根据权利要求4所述的用于防治乳腺增生的霜剂的制备方法，其特征在于：步骤（1）②中所述的沉淀的条件为：将水煎液和体积百分比95％的乙醇溶液混合均匀后，静置至少24小时。
9.根据权利要求4所述的用于防治乳腺增生的霜剂的制备方法，其特征在于：步骤（3）中所述的药物浸膏和所述的基质按质量比1:4进行配制。
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