CN101921182B - 一种植物中提取纯化5-O-甲基-myo-肌醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明阐述了一种提取纯化5-O-甲基-myo-肌醇的新方法，具有路线短，成本低，操作简便，效率高等优点。适于大规模工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种用溶剂回流法提取并纯化植物中5-O-甲基-myo-肌醇的方法。
发明背景
早期研究表明：5-O-甲基-myo-肌醇能显著降低糖尿病模型高血糖、抑制肝糖原分解和葡萄糖的吸收、降低血脂、改善自由基代谢和保护胰岛β细胞，但不降低正常小鼠血糖；而且其毒性极低。(梁敬钰，等，CN1488344A)是一个很有价值的抗糖尿病药物。
5-O-甲基-myo-肌醇(5-O-methy-myo-inositol，sequoyitol，5-O-甲基-myo-肌醇，结构见图1)是中肌醇的甲基衍生物。前期研究所得5-O-甲基-myo-肌醇多是从红豆杉属植物中发现的，由于红豆杉植物资源的有限，使得大规模研究和开发5-O-甲基-myo-肌醇受到了限制。进一步的研究发现5-O-甲基-myo-肌醇广泛存在于多种植物中，尤其是在蕨类等植物中的存在，大大地丰富了药用资源的来源，在原料成本上可以大大降低下来，使得大量使用和开发成为药物制剂的工业化生产成为可能。
由于植物来源的原料中存在大量极性较大的杂质，这些杂质具有较强的水溶性，现有的柱层析等分离方法对这些植物提取物中进行5-O-甲基-myo-肌醇的分离纯化工艺路线长，成本高，难度大，效率低，如前述几个专利中描述的工艺过程含以下步骤：提取→萃取→过分离柱(填料为大孔树脂、活性炭、聚酰胺等)→重结晶。采用这样的提取工艺，操作路线长，效率低，成本高，不利于大规模工业化生产。(梁敬钰等，CN1488344A；孙明杰等，CN1706369)
因此寻找路线短，效率高，成本低并且能大规模生产的新的分离纯化5-O-甲基-myo-肌醇方法就成为该化合物是否能够进行商业化生产和药物开发的关键因素。
发明内容
本发明的目的是提供一种路线简洁，易操作，效率高，成本低的分离纯化5-O-甲基-myo-肌醇的方法。
本发明的目的可以通过以下工艺路线达到：
1.植物(原料)干品粉碎至粒径至少30目；
2.用提取溶媒对原料进行提取；提取溶媒组成为水与低级醇或丙酮、乙腈组成，溶媒中水比例为：10％～40％；原料与提取溶媒的比例：原料∶溶媒＝1∶3～6(kg/L)，优选为4～5(kg/L)；提取液在80℃条件下挥去溶媒得提取浸膏；
3.提取浸膏分别用石油醚和乙酸乙酯(或丙酮或乙醇)等有机溶剂进行提取，浸膏与有机溶剂的比例：浸膏∶有机溶剂＝1∶2～8(kg/L)，优选为3～5(kg/L)；所用溶剂各提取二次；
4.步骤3中的提取液过滤，滤渣用水与低级醇、丙酮、乙酸乙酯等有机溶剂中的任何一种组成的溶媒在70℃～100℃条件下进行热回流提取，溶媒中水含量为5％～30％，优选为10％～20％；滤渣与溶媒的比例：滤渣∶溶媒＝1∶2～20(kg/L)，优选为5～10(kg/L)；热回流提取次数2～3次；提取液50℃～80℃热滤，合并滤液，滤液冷存，5℃以下，析晶；
5.过滤后得结晶，烘干，结晶为5-O-甲基-myo-肌醇粗品；
6.重复步骤4和5可使5-O-甲基-myo-肌醇粗品含量达99％以上。
所述的低级醇为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇，提取效率及毒性综合考虑一般选用乙醇。
上述植物可以是肾蕨属植物，如肾蕨(Nephrolepis auriculata(L.)Trimen)、双齿肾蕨(N.biseroata(Sw.)Schott.)、高大肾蕨(N.exaltata(Sw.)Schott.)、毛叶肾蕨(N.hirsutula(Forst.)Presl)、迷你肾蕨(N.cordifolia)、波士顿肾蕨(N.exaltata cv.Bostoniensis)等。
上述植物也可以是蓼科植物，如甜荞(Fagopylrum esculentumMoench.)、苦荞[F.tatarium(L.)Gaertn.]、翅荞(F.emarginatumMitissner)、米荞(Fagopyrum sp.)等。
上述植物也可以是红豆杉科植物，如曼地亚红豆杉(Taxusmedia)、或太平洋红豆杉(Taxus brevifolia Nutt.)、加拿大红豆杉(Taxus Canadensis)、欧洲短叶红豆杉(Taxus baccata)等。
上述植物也可以是豆科植物，如大豆(Glycine max(Linn.)Merr.)、宽叶蔓豆(原变种)(Glycine gracilis Skv.Var.gracilis)、澎湖大豆(Glycine clandestine Wendl.)、狭页白花野大豆(Glycine soja Sieb.etZucc.var.albiflora f.angustifolia P.Y.Fu et Y.A.Chen)、烟豆(Glycinetabacina Benth.)、宽叶蔓豆(Glycine gracilis Skv.)、豆(Glycine soja Sieb.et.Zucc.)、埃及三叶草(Trifolium alexandrinum Linn.)等。
上述植物也可以是银杏属，如来自于银杏(原栽培变种)(Ginkgobiloba Linn.cv.Biloba)、银杏(Ginkgo biloba Linn.)鸭尾银杏(Ginkgobiloba Linn.cv.Yaweiyinxing)、无心银杏(Ginkgo biloba Linn.cv.Wuxinyinxing)、棉花果(Ginkgo biloba Linn.cv.Mianhuaguo.)等。
步骤5、6中所述的5-O-甲基-myo-肌醇含量是通过HPLC-ELSD方法测量所得。
为进一步理解本发明，以下将结合实例对本发明做出详细的，非限制性的说明：
实施例一肾蕨中的5-O-甲基-myo-肌醇提取纯化
取原料肾蕨(Nephrolepis auriculata(L.)Trimen)10kg，用粉碎机粉碎成粒度为30目，75％乙醇水溶液分三次对原料热回流提取，提取温度为90℃，三次用量分别为50L、40L、30L；提取时间分别为2h，2h，1.5h；合并提取液，浓缩成浆状溶液，采用旋转蒸发仪减压浓缩至干；用3L石油醚对浸膏热回流提取，提取温度为80℃，提取二次，过滤，滤渣用3L乙酸乙酯热回流，提取温度为80℃，提取二次，过滤，滤渣用3L 90％乙醇水溶液进行热回流提取，提取温度为90℃，提取三次，合并提取液，提取液5℃以下静置，析晶，烘干晶体；5-O-甲基-myo-肌醇粗晶用90％乙醇水溶液热回流提取，提取液5℃以下静置，析晶，反复二次，可得5-O-甲基-myo-肌醇精品含量烘干称量得10.8g(98.5％)。
含量测定见实施例六。
实施例二肾蕨中的5-O-甲基-myo-肌醇提取纯化
取原料双齿肾蕨(N.biseroata(Sw.)Schott.)10kg，用粉碎机粉碎成粒度为30目，80％丙酮水溶液分三次对原料热回流提取，提取温度为90℃，三次用量分别为50L、40L、30L；提取时间分别为2h，2h，1.5h；合并提取液，浓缩成浆状溶液，采用旋转蒸发仪减压浓缩至干；用3L石油醚对浸膏热回流提取，提取温度为80℃，提取二次，过滤，滤渣用3L乙醇热回流，提取温度为80℃，提取二次，过滤，滤渣用3L 80％丙酮水溶液进行热回流提取，提取温度为90℃，提取三次，合并提取液，提取液5℃以下静置，析晶，5-O-甲基-myo-肌醇粗晶用80％丙酮水溶液热回流提取，提取液5℃以下静置，析晶，反复二次，可得5-O-甲基-myo-肌醇精品含量烘干称量得11.2g(99.5％)。
含量测定见实施例六。
实施例三荞麦中的5-O-甲基-myo-肌醇提取纯化
取原料苦荞[F.tatarium(L.)Gaertn.]10kg，用粉碎机粉碎成粒度为30目，90％乙酸乙酯水溶液分三次对原料热回流提取，提取温度为90℃，三次用量分别为50L、40L、30L；提取时间分别为2h，2h，1.5h；合并提取液，浓缩成浆状溶液，采用旋转蒸发仪减压浓缩至干；用3L石油醚对浸膏热回流提取，提取温度为80℃，提取二次，过滤，滤渣用3L丙酮热回流，提取温度为80℃，提取二次，过滤，滤渣用3L 90％乙酸乙酯水溶液进行热回流提取，提取温度为90℃，提取三次，合并提取液，提取液5℃以下静置，析晶，5-O-甲基-myo-肌醇粗晶用90％乙酸乙酯水溶液热回流提取，提取液5℃以下静置，析晶，反复二次，可得5-O-甲基-myo-肌醇精品含量烘干称量得1.20g(98.9％)。
含量测定见实施例六。
实施例四豆中的5-O-甲基-myo-肌醇提取纯化
取原料澎湖大豆(Glycine clandestine Wendl.)种子10kg，用粉碎机粉碎成粒度为30目，75％乙腈水溶液分三次对原料热回流提取，提取温度为90℃，三次用量分别为50L、40L、30L；提取时间分别为2h，2h，1.5h；合并提取液，浓缩成浆状溶液，采用旋转蒸发仪减压浓缩至干；用3L石油醚对浸膏热回流提取，提取温度为80℃，提取二次，过滤，滤渣用3L乙醇热回流，提取温度为80℃，提取二次，过滤，滤渣用3L 90％乙腈水溶液进行热回流提取，提取温度为90℃，提取三次，合并提取液，提取液5℃以下静置，析晶，5-O-甲基-myo-肌醇粗晶用90％乙腈水溶液热回流提取，提取液5℃以下静置，析晶，反复二次，可得5-O-甲基-myo-肌醇精品含量烘干称量得0.3125g(99.2％)。
含量测定见实施例六。
实施例五多种植物的5-O-甲基-myo-肌醇提取纯化
取植物原料如下表所列，干燥植物药材原料1kg干燥植物药材原料用粉碎机粉碎成粒度为30目，75％乙腈水溶液分三次对原料热回流提取，提取温度为80～100℃，三次用量分别为50～90L、40～60L、30L；提取时间分别为2～3h，2h，1.5h；合并提取液，浓缩成浆状溶液，采用旋转蒸发仪减压浓缩至干；用2～5L石油醚对浸膏热回流提取，提取温度为80℃，提取二次，过滤，滤渣用3L乙醇热回流，提取温度为80℃，提取二次，过滤，滤渣用3L 90％乙腈水溶液进行热回流提取，提取温度为90℃，提取三次，合并提取液，提取液5℃以下静置，析晶，5-O-甲基-myo-肌醇粗晶用90％乙腈水溶液热回流提取，提取液5℃以下静置，析晶，反复二次，可得5-O-甲基-myo-肌醇精品含量烘干称量，并计算得率。
含量测定见实施例六。
表1：几种植物提取5-O-甲基-myo-肌醇得率
实施例六5-O-甲基-myo-肌醇的含量测定方法
1.对照品溶液配制：精密称取对照品(sigma公司提供)0.01g于10ml容量瓶，用流动相75％乙腈水溶液超声溶解定容至刻度，摇匀得对照品溶液，过孔径为0.45μm的微孔滤膜，取续滤液即得。
2.样品溶液配制：精密称取样品(前面所述实施例所得)0.01g于10ml容量瓶，用流动相75％乙腈水溶液超声溶解定容至刻度，摇匀得对照品溶液，过孔径为0.45μm的微孔滤膜，取续滤液即得。
3.色谱条件：色谱柱：Agilent zorbax NH2(4.6×250mm，5μm)；流动相：乙腈∶水＝75∶25；流动相流速：1.0ml/min；检测器：SEDEX 75蒸发光散射检测器，漂移管温度：40℃；gain(6)，Bar(3.5)；进样体积：10ul；柱温：30℃；色谱图见(图2，3)，出峰时间在7～8分钟左右。
4.计算方法：以进样量的对数值(x)为横坐标，以峰面积的对数值(y)为纵坐标，绘制标准曲线，当进样量在2.0μg～40μg之间时，进样量对数值与峰面积对数值有良好的线性关系，线性方程为y＝1.2119x+20.594(γ＝0.9996)。
5.采用实施例1～5所获得的样品，进行检测，5-O-甲基-myo-肌醇进样量在2.0μg～40μg的范围里线性(r＝0.9996)良好，平均回收率为99.51％，RSD值为2.28％(n＝9)，本方法操作简便，重现性好，结果准确；结果见表1。
附图说明：
图1为5-O-甲基-myo-肌醇结构图
图2为对照品色谱图
图3为样品色谱峰图
Claims (7)
1.一种提取并纯化5-O-甲基-myo-肌醇的方法，具体实施步骤如下所述：
(1)植物干品粉碎至粒径至少30目；
(2)用提取溶媒对原料进行提取，提取溶媒组成为水与低级醇或丙酮、乙腈中的任何一种组成，溶媒中水比例为：10％～40％；原料与提取溶媒的比例：原料：溶媒=1：4～5kg／L；提取液在80℃条件下挥去溶媒得提取浸膏；
(3)提取浸膏分别用石油醚和乙酸乙酯或丙酮或乙醇三者中的任何一种有机溶剂进行提取，浸膏与有机溶剂的比例：浸膏：有机溶剂=1：3～5kg／L；所用溶剂各提取二次；
(4)步骤3中的提取液过滤，滤渣用水与低级醇、丙酮、乙酸乙酯有机溶剂中的任何一种组成的溶媒在70℃～100℃条件下进行热回流提取，溶媒中水含量为10％～20％；滤渣与溶媒的比例：滤渣：溶媒=1：5～10kg／L；热回流提取次数2～3次；提取液50℃～80℃热滤，合并滤液，滤液冷存，5℃以下，析晶；
(5)过滤后得结晶，烘干，结晶为5-O-甲基-myo-肌醇粗品；
(6)重复步骤4和5可使5-O-甲基-myo-肌醇粗品含量达98％以上。
2.根据权利要求1所述的一种提取并纯化5-O-甲基-myo-肌醇的方法，所述的低级醇为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇。
3.根据权利要求1所述的一种提取并纯化5-O-甲基-myo-肌醇的方法，植物选自双齿肾蕨、高大肾蕨、毛叶肾蕨(N.hirsutula(Forst.)Presl)。
4.根据权利要求1所述的一种提取并纯化5-O-甲基-myo-肌醇的方法，植物选自甜荞(Fagopylrum esculentum Moench)、苦荞[F.tatarium(L.)Gaertn.]。
5.根据权利要求1所述的一种提取并纯化5-O-甲基-myo-肌醇的方法，植物选自曼地亚红豆杉(Taxus media)。
6.根据权利要求1所述的一种提取并纯化5-O-甲基-myo-肌醇的方法，植物选自澎湖大豆(Glycine clandestine Wendl.)、狭页白花野大豆、烟豆(Glycine tabacina Benth.)、宽叶蔓豆(Glycine gracilis Skv.)。
7.根据权利要求1所述的一种提取并纯化5-O-甲基-myo-肌醇的方法，植物选自银杏(Ginkgo biloba Linn.)、鸭尾银杏(Ginkgo biloba Linn.cv.Yaweiyinxing)、无心银杏(Ginkgo biloba Linn.cv.Wuxinyinxing)、棉花果(Ginkgo biloba Linn.cv.Mianhuaguo.)。
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