CN101686862B - 纳米表面 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于修饰生物相容性组件的方法，其包括以下步骤：a)提供至少部分被金属氧化物覆盖的生物相容性组件；以及b)用含有草酸的水性组合物处理所述组件的至少一部分，该部分被所述金属氧化物覆盖，由此得到经修饰的金属氧化物。本发明还涉及生物相容性组件，其包含具有下述表面的基底，所述表面包含：a)微结构，其包含由平顶和/或脊分开的凹坑；以及b)叠加在所述微结构之上的初级纳米结构，所述初级纳米结构包含以波浪状构造排列的凹陷。

Description

纳米表面

发明领域

本发明涉及生物相容性组件，其具有用于植入到骨组织中的改良的性质。

背景技术

对于将矫形外科或牙科植入物，一般是金属植入物，植入到骨组织中，目前通常使用一阶段法。在该一阶段方法中，通常将第一植入部分(诸如牙科固定器)外科手术地放置在骨组织中，并且然后将愈合帽或第二植入部分(诸如基牙(abutment))在外科手术操作后与第一植入部分连接。然后允许软组织在愈合帽或第二植入部分周围愈合。当使用愈合帽时，数周或数月后不经过任何外科方法将该帽移除，而第二植入部分(诸如基牙和临时齿冠)与第一植入部分连接。该一阶段方法例如描述于L Cooper等：“A multicenter 12-month evaluation ofsingle-tooth implants restored 3 weeks after 1-stage surgery”，TheInternational Journal of Oral & Maxillofacial Implants，第16卷，第2期(2001)。

两阶段方法在某些牙科病例下仍然是优选的，其一般涉及在第一阶段将第一植入部分(诸如牙科固定器)外科手术地放置到骨组织中，在这里允许其在愈合期间(通常3个月或更长)保持空载和固定，以使得骨组织在该植入表面生长以允许该植入物与骨组织良好连接，允许覆盖植入物部位的软组织中的切口在植入物上愈合。在第二阶段，将覆盖该植入物的软组织打开，并将第二植入部分(诸如牙科基牙和/或修复齿)与第一植入物(诸如所述的固定器)连接，形成最终的植入结构。这一方法例如由等：“Osseointegrated Implants in theTreatment of the Edentulous Jaw，Experience from a 10-year period”，Almquist & Wiksell International，Stockholm，Sweden描述。

然而，不应当在愈合期间载入植入物的事实意味着该第二植入部分在愈合期间可能不与第一植入部分连接和/或使用。考虑到与这相关的不适，期望最小化上述第一阶段所需的时间或甚至在单操作(即使用一阶段方法)中完成整个植入过程。

对于某些患者，可能会认为在功能性地载入植入物前等至少3个月是较佳的，对于一阶段和两阶段方法均如此。然而，备选的应用一阶段方法是在植入后马上(立即载入)或植入后数周(早期载入)功能性地放置植入物。这些方法例如由D M Esposito，第836-837页，“Titaniumin Medicine，Material Science，Surface Science，Engineering，BiologicalResponses and Medical Application”，Springer-Verlag(2001)描述。

植入物建立植入物和骨组织间充分的稳定性和结合以使得上述公开的植入物的立即或早期载入成为可能是很关键的。还应当注意植入物的立即或早期载入可能对于骨形成是有益的。

一些用于骨植入物的金属或合金，诸如钛、锆、铪、钽、铌或其合金，能够与骨组织形成相对强的结合，可能与骨组织本身一样强的结合，并且有时候甚至更强。最值得注意的这一类金属植入材料是钛及钛的合金，它们在这一方面的特性从约1950年即已知。金属和骨组织之间的结合已被称为“骨整合”(Albrektsson T，P I，Hansson H A，J，“Osseointegrated titanium implants.Requirements for ensuring a long-lasting，direct bone anchorage in man”，Acta Orthop Scand，52：155-170(1981))。

可能注意到，与氧气接触后，钛、锆、铪、钽、铌和它们的合金立即被天然氧化物覆盖。钛植入物上的这种天然氧化物主要由二氧化钛(IV)(TiO₂)和少量的Ti₂O₃、TiO和Ti₃O₄组成。

尽管(氧化的)金属，例如钛，和骨组织之间的结合比较强，但期望增强这一结合。

目前已有若干种用于处理金属植入物以获得更好的植入物连接并因此改善骨整合的方法。这些中的一些涉及改变植入物的形态，例如通过在植入物表面产生凹凸不平以相对于未处理的表面增加表面粗糙度。据信增加的表面粗糙度提供该植入物和骨组织间更大的接触和附着面积，提供植入物和骨之间更好的机械固定和强度。本领域公知例如可通过等离子体喷涂、喷砂或酸蚀刻来提供表面粗糙度。

此外，已知成骨细胞(即，形成骨的细胞)对下伏表面的多种化学和物理性质敏感并作出反应。在植入物表面形成骨需要前体细胞分化为分泌的成骨细胞，以产生未矿化的细胞外基质(ECM)，以及随后这种基质的钙化，例如Anselme K，“Osteoblast adhesion on biomaterials”，Biomaterials 21，667-681(2000)中描述的那样。

已经常应用植入物表面化学性质的改变来达到植入物和骨组织的更佳的连接。若干种方法涉及在植入物表面应用陶瓷材料层，诸如羟基磷灰石，以改善植入物和骨的结合，因为羟基磷灰石与骨头化学地相关联。US 7,169,317(Beaty)公开了制备骨植入物表面的方法，其包括从该植入物表面移除天然氧化物，酸蚀刻或用其它方法处理得到的植入物表面，以产生基本上均匀的表面粗糙度，并沉淀分散的骨生长增强材料颗粒，诸如羟基磷灰石、骨矿物质及其上的骨形态发生蛋白。所述蚀刻和沉淀步骤优选通过应用惰性气氛在没有未反应氧的存在下进行。

然而，用包含羟基磷灰石的涂层的共同缺点是它们可能是易碎的并且可能从该植入物表面成片剥落或破裂，这是因为在骨和涂层之间形成了比该涂层和植入物之间更强的结合，这可能导致该植入物的最终失败。对于使用蛋白质涂层，有其它的方面要考虑。由于蛋白质的化学性质，具有蛋白质涂层的表面可能需要特定的消毒和储存条件，以维持其生物活性。此外，宿主组织对诸如蛋白质的生物分子的反应(例如，免疫反应)是不可预测的。US 7,169,317方法的另一缺点是需要没有氧化物的表面，考虑到在惰性气氛中工作是不方便的并且需要特殊的设备。

US 2007/01100890及相关申请US 2007/0112353和WO2007/050938(Berckmans III等)以解决陶瓷涂层和植入物之间不好的粘附的问题为目的，并公开了通过将该植入物表面暴露于含有2-甲氧乙醇溶剂和羟基磷灰石(HA)纳米晶体(例如，以胶体形式)的溶液的步骤而在粗糙化的植入物表面沉淀分散纳米粒子的方法。使HA纳米晶体沉淀以形成纳米结构，其预期提高植入物的骨整合。然而，这一方法的一个负面方面是配制含有纳米晶体的组合物需要有机溶剂，因为表面有机污染的危险性，以及若干个处理步骤应用了高级设备，这可能是不期望的。该沉淀在室温下进行，需要1至4个小时的温育时间。

已显示植入物表面的粗糙度影响细胞增殖以及还影响通过植入物周围细胞的生长因子的局部生产。体外研究人成骨细胞已显示，与较光滑的表面相比，增加了微尺度粗糙度的表面导致减少的细胞数目、较低的细胞增殖和增加的基质产量(Martin J Y等，Proliferation，differentiation，and protein synthesis of human osteoblast-like cells(MG63)cultured on previously used titanium surfaces，Clin Oral ImplantsRes，Mar 7(1)，27-37，1996)。其它研究显示表面粗糙度增强细胞分化，而减少细胞增殖(Kieswetter K，Schwartz Z，Hummert T W，Cochran D L，Simpson J，Dean D D，Boyan B D，“Surface roughness modulates thelocal production of growth factors and cytokines by osteoblast-likeMG-63 cells”，J Biomed Mater Res，9月，32(1)，55-63，1996)。增加的细胞分化暗示了可能增强的骨形成速率。

近来，细胞粘连能力的调节已从微米进展到纳米模式化(nanopatterning)技术。据信可通过纳米结构物理信号，通过刺激依赖贴壁细胞功能中的整联蛋白介导的黏着斑和细胞内信号传导而调节细胞功能(Bershadsky A，Kozlov M，和Geiger B，“Adhesion-mediatedmechanosensitivity：a time to experiment，and a time to theorize”，CurrOpin Cell Biol，18(5)，472-81，2006)。

EP 1440669B1和相关的US 2004/0153154 A1(Dinkelacker)公开了具有这样的表面的骨植入物，所述表面被整形为包含用于在细胞区域中锚定该植入物的微结构。该微结构以施加于之前粗糙化表面的覆盖层形式提供，其包含由圆形空隙分开的密集填充的圆形半球形物阵列，该微结构的大小与细胞大小大约是相同的数量级。该微结构覆盖层可例如通过溅射施加。此外，在该微结构上提供也通过溅射获得的纳米结构，其由被圆形空隙分开的圆形半球形物组成，其中该纳米结构的大小约比微结构相应大小小一个十进制数量级。然而，也存在覆盖层稳定性以及该覆盖层与植入体之间连接的完整性的潜在问题。用于产生期望表面粗糙度的另一技术公开于EP 1 449 544 A1(Wen等)，其提供了用于提供金属矫形植入物的方法，所述植入物具有微米或纳米级表面粗糙度，同时维持了该植入物的结构完整性。在这一方法中，蚀刻具有与植入物表面粘附的金属组件并由此限定了多孔表面几何学的植入物，以产生微米或纳米级表面粗糙度。例如，该金属元件是具有约40μm至若干mm大小的金属珠。然而，这一方法是非常费力的并且需要应用高级技术设备，因为通过涂层技术并随后烧结以使该元件与植入物表面及彼此融合而施加金属元件。结果，该方法也是昂贵的。

简而言之，尽管当前存在许多已有的用于改良植入物骨整合的技术，但这些方法一般都有就可操作性、费用效率和植入后生物学效果和稳定性而言的缺点。因此，本领域需要改良植入物的生产，所述植入物具有甚至进一步促进骨整合的特性。

发明简述：

本发明的一个目的是提供生物相容性组件，在将该组件植入骨组织后，其具有期望的骨组织和该组件之间的连接(attachment)率，并且与所述骨组织形成机械上很强的结合(bond)。

本发明的另一目的是提供用于生产此类生物相容性组件的方法。

通常在很大程度上覆盖钛、锆、铪、钽、铌及其合金的钝化氧化物通过阻止该金属和活组织间的任何化学反应而提供了这些金属的生物相容性。然而，通过在该氧化物结构上产生小的缺陷，金属组件的生物相容性可实际地进一步提高。本申请人发现通过用草酸处理具有金属氧化物表面的组件，得到了该组件的经修饰的表面结构，其具有用于植入到活骨内的改良的性质。

因此，一方面，本发明涉及用于修饰生物相容性组件的方法，其包括以下步骤：

a)提供至少部分被金属氧化物覆盖的生物相容性组件；以及

b)用含有草酸的水性组合物处理所述组件的至少一部分，该部分被所述金属氧化物覆盖，

由此得到经修饰的金属氧化物。

由本发明的方法得到的组件具有分层的表面构形(topography)，其包括微结构和叠加在所述微结构之上的初级纳米结构，已发现其增加了黏附至其上的骨形成细胞的活性。

美观正在变为移植学越来越重要的方面，常规的钛牙科植入物产生了对完美美学解决办法的障碍，因为常规钛氧化物表面的金属灰色光泽可以通过患者的牙龈而看到。有利地是，通过本发明方法得到的修饰的氧化物表面具有稍白的颜色，其比根据本发明处理之前的组件表面的金属灰色更淡且更暗。稍白的颜色对于牙科组件是非常理想的，因为可得到看上去自然的植入物。在经喷砂的组件中可见最佳的稍白的颜色。改变的组件颜色还可用作步骤b已完成的标志。

步骤b的组合物中草酸的浓度可以是0.001至5M，优选约1M；并且步骤b的处理时间是10至60分钟，优选20至40分钟，以及最优选约30分钟。步骤b的组合物的温度一般是约20℃至约100℃，优选60℃至90℃，且更优选约80℃。

任选地上述方法还包括步骤：

c)用第二水性组合物处理所述经修饰的氧化物的至少一部分，所述组合物包含

i)选自电离的氟和电离的氯中的至少一种材料；以及

ii)至少一种酸。

特别地，应当在钝化氧化物在所述经修饰的金属氧化物上形成之前进行步骤c。通过在步骤b获得的经修饰的氧化物被钝化氧化物覆盖之前进行步骤c，可获得具有均匀分布的次级纳米结构的表面，其促进了该组件的骨整合。因此，当在高于0℃的温度(例如室温)，在正常大气压和在含有氧气的气氛中保存该组件时，步骤b和步骤c之间的间隔优选尽可能短，以避免在该组件的表面形成钝化氧化物。在此类条件下，可以在完成步骤b后180小时或更短时间内进行步骤c，例如步骤b后72小时、36小时、24小时或1小时。优选地，在完成步骤b后30分钟或更短时间内进行步骤c，以及更优选在完成步骤b后10分钟或更短时间内进行步骤c。

所述第二水性组合物可以具有0.5至5，优选1至3，以及更优选约2的pH；并且电离的氟和/或电离的氯的浓度可以是约0.05至0.5M，优选约0.1M。步骤c的活性处理时间为10秒至60分钟，优选10秒至3分钟，并且更优选10秒至50秒。步骤c的组合物的温度一般为15至25℃，并且优选为18至23℃。

本发明的方法仅使用水性溶液，因此避免了与有机溶剂相关的问题，诸如留在该组件表面上的有机残留物。步骤c中使用的水性溶液优选包括氢氟酸。

本方法还使用简单的设备，容易进行并且是有效的。因此，根据本发明的方法是划算的并且适于工业应用。此外，处理时间有利地很短。

此外，可通过在该组件表面包括骨生长增强材料而增强该组件的骨整合。例如可通过在步骤b和/或步骤c的水性组合物中包括金属离子或其盐而得到这一表面，所述金属离子可选自钛离子、镁离子、钙离子、锂离子、锶离子或其任意组合。特别地，本发明人发现局部施与骨组织的锂或锶离子对所述骨组织中的骨形成和骨质量具有局部效果。还发现，与包含例如含有电离的钙或镁的表面氧化物层的植入物相比，包含含有和/或释放电离的锂或锶的表面氧化物的植入物提供改良的骨形成率。因此，步骤b的组合物和/或步骤c的组合物可以包含锂和/或锶或其盐。为提供用于骨整合的有利的基底，该生物相容性组件优选至少部分地由钛或钛合金组成。因此，所述金属氧化物优选包含钛氧化物。该金属氧化物可以基本上由一种钛氧化物或复数种钛氧化物的组合组成。该金属氧化物可以是钝化钛氧化物。

为给该组件提供期望的初始表面粗糙度或期望的化学性质，在步骤b之前可使该生物相容性组件经历机械和/或化学表面处理。化学处理例如可以包括清洁程序以移除不期望的物质，所述物质可能负面地影响本发明方法的结果或该组件的生物相容性。诸如喷砂的粗糙化处理可以进一步增强该组件的骨整合并且改善其生物力学性质。

另一方面，本发明涉及可通过如上所述的方法获得的组件。

本发明人已发现具有分层表面构形的表面提供了就骨整合及与骨组织生物力学相互作用而言的改良的植入物表面，其中所述的分层表面构形包含微结构以及叠加在所述微结构之上的初级纳米结构。因此，一方面，本发明涉及生物相容性组件，其包含具有下述表面的基底，其中所述表面包含：

a)微结构，其包含由平顶和/或脊分开的微凹坑(micropit)；以及

b)叠加在所述微结构之上的初级纳米结构，所述初级纳米结构包含以波浪状构造排列的凹陷(depression)。

本发明人发现上述表面促进成骨细胞分化和骨前体材料的分泌。所述微结构提供了包含孔状凹坑的内在微粗糙度，所述孔状凹坑类似细胞培养皿，其刺激细胞增殖和分化。包含微结构和初级纳米结构的表面构形可能类似活骨中发生骨再吸收部位的构形。相信本发明组件的表面构形符合存在于植入部位周围的前成骨细胞的预期，并且通过模拟由用于骨重造的破骨细胞制备的天然骨的表面，可通过根据本发明的组件迅速且很强地诱导成骨细胞活性。该微结构可具有0.5至15μm，优选1至10μm的凹坑直径；以及0.1至2.5μm，优选0.1至1μm的深度。相邻微凹坑之间的距离可以最高达10μm。初级纳米结构的凹陷具有10nm至1μm，优选10nm至600nm，以及更优选10nm至500nm的直径。深度可以是约10nm至300nm，并且一般为30nm至150nm。此外，初级纳米结构的单个凹陷的直径一般超过所述凹陷的深度。

如上所述，该初级纳米结构叠加在初级微结构之上。此外，初级纳米结构的直径和深度分别地比微结构的单个凹坑的相应尺寸小。因此，微结构的单个凹坑一般地包含多个初级纳米结构的凹陷。此外，初级纳米结构凹陷的边界一般地构成另一初级纳米结构凹陷的边界。

此外，上述表面还可包含次级纳米结构，其包含以均匀分布模式叠加在所述初级纳米结构之上且具有圆形凸出形状的分离的纳米元件。相信该次级纳米组件改善了细胞至下伏表面的锚定并进一步刺激细胞活性。

本发明生物相容性组件的次级纳米结构可以具有20至550nm，优选20至150nm的峰直径；以及5至200nm，优选5至100nm的平均峰高度。峰与峰的距离一般为10至450nm，优选40至200nm。峰密度一般为15至150峰/μm²，优选50至130峰/μm²。

在骨组织-骨植入物界面上，一般会形成组织层，其含有降低量的胶原蛋白和矿物质，并且因此具有与正常、健康组织相比降低的强度。该组织层的厚度决定了该骨-植入物界面的机械强度(Albrektsson，T等，“Ultrastructural analysis of the interface zone of titanium and goldimplants”，Advances in Biomaterials 4，167-177，1982；Albrektsson，T等，“Interface analysis of titanium and zirconium bone implants”，Biomaterials 6，97-101，1985；Albrektsson T，Hansson，H-A，“Anultrastructural characterization of the interface between bone andsputtered titanium or stainless steel surfaces”，Biomaterials 7，201-205，1986；Hansson，H-A等，“Structural aspects of the interface betweentissue and titanium implants”，Journal of Prosthetic Dentistry 50，108-113，1983；Johansson，C等，“Ultrastructural differences of the interface zonebetween bone and Ti6A14V or commercially pure titanium”，Journal ofBiomedical Engineering 11，3-8，1989；Johansson，C.等，“Qualitative，interfacial study between bone and tantalum，niobium or commerciallypure titanium”，Biomaterials 11，277-280，1990；Sennerby，L等，“Structure of the bone-titanium interface in retrieved clinical oralimplants”，Clinical Oral Implants Research 2，103-111，1991；Sennerby，L等，“Ultrastructure of the bone-titanium interface in rabbits”，Journal ofMaterials Science：Material in Medicine 3，262-271，1992；Sennerby，L等，“Early tissue response to titanium implants inserted in rabbit corticalbone，Part II：Ultrastructural observations”，Journal of Materials Science：Material in Medicine 4，494-502，1993)。包含微结构和初级纳米结构的分层表面构形提供了该组件和随后形成的骨组织之间的改良的机械相互作用，其被认为导致形成了降低强度的更薄的组织层。该次级纳米结构进一步改善了生物相容性组件和植入后周围骨组织之间的机械相互作用。因此，本发明的生物相容性组件提供了具有经改善的剪切及张力强度的骨组织-植入物界面。

此外，为了提供具有期望初始表面粗糙度或期望化学性质的组件，可使该基底进行机械和/或化学表面处理。化学处理例如可包括清洁程序。诸如喷砂的粗糙化处理可提供这样的表面结构，其中随后形成的微结构的直径和深度及初级纳米结构的直径可变性更低(即，具有更小的标准差值)。本发明组件表面匀质性的增加可能进一步提高了该组件的骨整合并改善了其生物力学性质。

该生物相容性组件基底一般地至少部分由钛或钛合金组成。优选地，该基底由钛组成。此外，次级纳米结构可包含金属氧化物，优选钛氧化物。该组件表面的匀质性(其可只由金属氧化物组成)就长期稳定性和植入后组件的完整性而言是非常有利的。此外，该组件表面结构就消毒程序和上架贮存而言是稳定的。

还可通过在组件的表面包含骨生长增强材料而进一步提高本发明组件的骨整合。此类表面例如可通过在表面包含金属离子而达到，所述金属离子例如是选自钛离子、镁离子、钙离子、锂离子、锶离子或其任意组合的那些。特别地，本发明人已发现在骨组织中局部施与的锂或锶离子对所述骨组织中的骨形成和骨质量可具有局部效果。因此，本发明组件的表面可以包含锂和/或锶或其盐。

本发明的生物相容性组件可以是牙科组件，例如植入物、固定器、基牙，或其组合，诸如整件植入物。该生物相容性组件还可以是矫形外科组件，诸如意图植入到患者股骨颈部的髋关节组件。

另一方面，本发明涉及用于将生物相容性组件植入到人体或动物体的方法，其包括步骤

i)提供上述生物相容性组件；以及

ii)将所述生物相容性组件植入到人体或动物体。

例如，可将该组件植入到人体或动物体的牙周区域。

附图简述

图1是定义关于微结构所使用的参数的示意图。

图2是定义关于初级纳米结构所使用的参数的示意图。

图3是定义关于次级纳米结构所使用的参数的示意图。

图4是分别定义关于微结构和初级纳米结构所使用的角度的示意图。

图5a是根据本发明的钛样品的扫描电子显微镜术图。

图5b是根据本发明的钛样品的扫描电子显微镜术图，其中标记了微结构的直径。

图6a是根据本发明的钛样品的扫描电子显微镜术图，其中标记了初级纳米结构的凹陷。

图6b是根据本发明的钛样品的扫描电子显微镜术图，其中标记了初级纳米结构的直径。

图7是经历了常规喷砂技术的钛样品的扫描电子显微镜术图。

图8是根据本发明的经喷砂的钛样品的扫描电子显微镜术图。

图9是根据本发明的钛样品的扫描电子显微镜术图。

图10是根据本发明的钛样品的原子力显微镜术3D图。

图11是根据本发明的经喷砂的钛样品的扫描电子显微镜术图，其中标记了微结构的元件。

图12a-b是在氢氟酸和草酸混合物中处理过的钛参照样品的扫描电子显微镜术图。

图12c是在氢氟酸中处理且随后在草酸中处理的钛样品的扫描电子显微镜术图。

图13a-c是分别显示了根据本发明的钛样品中微结构凹坑直径、深度和相邻凹坑间距离分布的图。

图14a-c是分别显示了根据本发明的经喷砂的钛样品中微结构凹坑直径、深度和相邻微凹坑间距离分布的图。

图15a-b是分别显示了根据本发明的钛样品中初级纳米结构凹陷直径和深度分布的图。

图16a-b是分别显示了根据本发明的经喷砂的钛样品中初级纳米结构凹陷直径和深度分布的图。

图17a-c是分别显示了根据本发明的钛样品中次级纳米结构峰直径、高度和峰至峰的距离分布的图。

图18是显示了分别在商业钛植入物表面和根据本发明的表面上生长7天的细胞增殖的图。

图19是显示了分别在商业钛植入物表面和根据本发明的表面上培养细胞7天后碱性磷酸酶产量的图。

图20a是在商业植入物表面中心生长36小时的细胞的扫描电子显微镜术图。

图20b是在根据本发明的组件表面生长36小时的细胞的扫描电子显微镜术图。

图20c是在根据本发明的组件表面生长36小时的细胞的扫描电子显微镜术图。

图21是显示了分别在商业钛植入物表面和根据本发明的表面上培养细胞7天和14天后前列腺素E2产量的图。

图22是显示了在兔模型中根据本发明的植入物和商业钛植入物拆除转矩(removal torque)试验结果的图。

图23a-b分别是在兔模型中植入6周后，根据本发明的植入物和商业钛植入物的组织学断面图。

图24a-b分别是在兔模型中植入6周后，根据本发明的植入物和商业钛植入物的组织学断面图。

图25a是代表商业钛植入物表面的参照钛样品的扫描电子显微镜术图。

图25b是图25a所示样品在浸入模拟体液(SBF)后的扫描电子显微镜术图。

图26a是根据本发明步骤b处理的钛样品的扫描电子显微镜术图。

图26b是图26a所示样品在浸入模拟体液(SBF)后的扫描电子显微镜术图。

图27a是根据本发明步骤b和c处理的钛样品的扫描电子显微镜术图。

图27b是图27a所示样品在浸入模拟体液(SBF)后的扫描电子显微镜术图。

图28是显示了通过能量色散光谱学测量的在参照样品和根据本发明处理的样品的磷灰石形成后的残留钛信号的图。

图29是在参照样品和根据本发明处理的样品的磷灰石形成后计算的Ca/P比值的图。

发明详述

如本文所使用的术语“生物相容性组件”在其范围内包括任何预期长期或短期与活组织接触且在所述接触后不引起该组织显著的不利生物反应的组件。生物相容性组件的一个实例是植入物，诸如牙科植入物。

本发明所使用的术语“植入物”在其范围内包括任何这样的装置，其中预期将其至少一部分植入到脊椎动物，特别是哺乳动物(诸如人)身体内。应用植入物以代替解剖和/或恢复身体的任何功能。

一般而言，植入物由一个或若干个植入物部分组成。例如，牙科植入物通常包含与第二植入部分偶联的牙科固定器，所述第二植入部分诸如基牙和/或修复牙。然而，预期用于植入的任何装置，诸如牙科固定器，可以单独地称作植入物，即使其它部分与之相连也如此。

本文所使用的术语“钝化(金属)氧化物”是指自然形成的氧化物，也表示为天然氧化物，其是稳定的，基本上不会随着时间而变厚，并且其阻止下面的基底与外界试剂的任何实质化学反应。在与大气氧接触的钛上形成的钝化钛氧化物一般具有2-5nm的厚度。

本文所使用的术语“骨生长增强材料”在其范围内包括能够单独或与其它物质联合促进骨形成(例如，促进成骨细胞或前-成骨细胞黏附、增殖和分化；促进骨基质成分生产、骨基质成分分泌、骨基质矿化；以及抑制破骨细胞活性)的任何物质。

本文所使用的术语“微结构”是指大小一般为0.5μm至100μm的物理结构，以及术语“纳米结构”是指大小一般为0.1nm至500nm的物理结构。

本发明的生物相容性组件可以是牙科组件，例如植入物、固定器、基牙或其组合，例如整体植入物。该生物相容性组件还可以是矫形组件，诸如预期植入到患者股骨颈部的髋关节组件。

本发明的生物相容性组件可以由任何合适的材料组成，诸如金属，例如钛或其合金、锆或其合金、铪或其合金、铌或其合金、钽或其合金、铬-钒合金或这些材料的任意组合，或非金属。该生物相容性组件可以金属层提供，例如覆盖非金属物体或部分由非金属材料组成的物体的所施加的金属表面层。非金属材料的实例包括陶瓷、塑料和复合材料。

该金属氧化物可以是天然空气形成的氧化物，或其可以是在根据本发明的方法之前以任何种类的处理形成。

可将生物相容性组件进行任何种类的前处理以产生期望的基底表面，用于根据本发明方法的进一步修饰。例如，可通过机械、化学或热处理、或其任意组合预处理该组件，以获得期望的初始表面组成或粗糙度。机械处理可以例如包括喷砂过程。化学处理可以例如包括清洁或脱脂过程。

一方面，本发明涉及用于修饰生物相容性组件的方法。

根据本发明的方法，将该生物相容性组件的至少一部分用包含草酸的水性组合物进行处理，由此获得经修饰的金属氧化物(称为“步骤b”)。在这一处理中，溶解经修饰的金属氧化物并蚀刻下面的基底，同时在该生物相容性组件上形成了新的氧化物。氧化物溶解和再氧化过程同时发生。

待处理的生物相容性组件的部分至少部分地被所述金属氧化物覆盖。在本发明的实施方案中，通过在升高的温度下在剧烈搅拌下将该组件置于草酸水溶液中一段时间进行步骤b。备选地，可仅将该组件的部分浸入该组合物中，例如通过浸渍。在处理过程中，可掩蔽预期不进行处理的组件部分。

步骤b的组合物的pH应当是酸性的，诸如pH5或以下、pH2或以下、或pH0.7或以下。优选地，考虑到处理方便性，该pH尽可能低。

包含草酸的水性组合物可以是包含约0.001至约5M的浓度的草酸的水溶液，例如在所述范围内浓度的草酸溶液。组合物中草酸浓度优选为0.01至2M，更优选约0.1至2M，以及最优选为约1M。

对于步骤b的目的，可将生物相容性组件的至少一部分浸入包含草酸的组合物中，历时约5至约60分钟的时间段，例如20至40分钟。一般地，步骤b的处理持续时间是约25分钟或约30分钟。当将该组件从包含草酸的水性组合物中移除的时刻，即认为步骤b的处理已完成。

水性组合物的温度可以是约20℃至约100℃。一般地，包含草酸的水性组合物的温度可以是60℃至90℃，例如约80℃。

作为实例，可以在80℃的温度应用约1M浓度的草酸进行步骤b的处理30分钟。

当使用钛组件时，在步骤b中得到的经修饰的氧化物比在空气中形成的钝化钛氧化物更具反应性，并且其比在空气中形成的钝化钛氧化物具有更高的水含量。本发明的经修饰的钛氧化物可能比在空气中形成的或在化学清洁预处理中形成的钝化钛氧化物是更无定形的。步骤b中获得的经修饰的氧化物的表面结构包含微结构和初级纳米结构，其实例如图5和图6所示，并且其将在以下更详细地描述。

步骤b中得到的生物相容性组件表面具有比根据本发明的方法处理之前的组件表面的金属灰色更淡且更暗的颜色。然而，通过喷砂预处理的根据本发明的组件和简单地机械加工的根据本发明的组件之间存在颜色差异，经喷砂的组件具有比机械加工组件更白的颜色。颜色的改变可用作步骤b已完成的标志。然而，在超声浴中洗涤2分钟后，更清楚地看到改变的颜色。

步骤b后，可使经修饰的氧化物的至少一部分用第二水性组合物进行处理，所述第二水性组合物包含选自电离的氟和电离的氯的至少一种材料、以及至少一种酸(称为步骤c)。通过步骤c，部分在步骤b中形成的经修饰的金属氧化物溶解，并且随后沉淀形成次级纳米结构，其包含叠加在所述微结构和初级纳米结构之上的均匀分布的圆形金属氧化物凸出。备选地，可以使用与溶解的金属氧化物的金属形成络合物的任何其它化合物。氟和氯是公知的钛络合剂。

当将该组件保持在至少0℃的温度、正常大气压和含氧气氛(诸如空气)时，应当在步骤b完成后相对短的时间内进行步骤c。一旦将该组件从步骤b的水性组合物中移除，就认为步骤b已完成。更具体地，应当在步骤b中获得的经修饰的金属氧化物被在其上形成的钝化氧化物覆盖之前进行步骤c。当其阻止下面的材料与外部试剂的任何实质化学反应时，即认为形成了钝化氧化物。步骤b中获得的经修饰的氧化物的反应性对于实现次级纳米结构圆形峰的均匀分布是非常关键的。相信在步骤c的处理过程中，酸在大批活性部位上攻击该经修饰的氧化物，以溶解该氧化物。在这一过程中产生的氢气在每一活性部位局部地升高了pH。局部升高的pH使得金属氧化物在该活性部位沉淀，假如该水性组合物具有足够高浓度的金属材料的话。步骤b中获得的经修饰的钛氧化物的溶解可以提供足够高的钛浓度用于沉淀钛氧化物。当将该组件保持在至少0℃的温度[例如室温(15至25℃)]、正常大气压和含氧气氛中时，由于在氧气的存在下随时间逐渐形成钝化氧化物，因此步骤b和步骤c之间较短的时间间隔将改善步骤c的最终结果。因此，在此类条件下，步骤b和步骤c之间的间隔优选保持尽可能短。可在步骤b完成后最多180小时内进行步骤c，例如步骤b后72小时、36小时、24小时或1小时。优选在步骤b完成后30分钟或更短时间内进行步骤c，更优选在步骤b完成后10分钟或更短时间内，并且最优选在3分钟或更短时间内。然而，如果将该组件保持在惰性气氛中或以其它方式阻止形成钝化氧化物表面的话，步骤b和步骤c之间的时间间隔可更长相当多。为避免形成钝化氧化物，可以使用与正常空气相比具有减少的活性氧气量的任何气氛。例如，在步骤b后，可将该组件置于惰性气体中，诸如氮、氦、氖、氩、氪、氙或氡。备选地，可将该组件置于降低气压的气氛中，或置于真空中。备选地，可冷却或冷冻该组件。还可使用上述用于部分地或完全地抑制钝化氧化物形成的策略的任何组合。例如，可使该组件经历步骤b，并随后冷冻或置于惰性气体中，历时很长的时间段，并且然后在含氧气氛中恢复至正常条件(至少0℃的温度，正常大气压)。在这种情况下，该组件在含氧气氛中在所述正常条件下所经历的步骤b和步骤c之间的时间应当是180小时或更短，例如72小时或更短、36小时或更短、24小时或更短、1小时或更短、30分钟或更短、10分钟或更短、或3分钟或更短。

在本发明的实施方案中，通过将该组件浸入氢氟酸水性溶液中完成步骤c。备选地，可仅将该组件的部分浸入(immerse)该组合物中，例如通过浸渍(dipping)。在该处理过程中，可掩蔽预期不处理的组件的部分。

该水性组合物包含选自电离的氟和电离的氯的至少一种材料，以及至少一种酸。该水性组合物可以是具有0.5至5、优选1至3M、以及更优选约2的pH的水性溶液。电离的氟和/或电离的氯的浓度可以是约0.05至0.5M。例如，该组合物可以是具有所述范围内浓度的氢氟酸(HF)溶液。所使用氢氟酸的浓度优选为约0.1至0.3M，以及更优选为约0.1M。

当可观察到酸对基底表面发生反应时，认为开始了步骤c处理。可通过在该组件表面氢气的形成检测这一活性，其在室温下通常在约20-30秒后发生。因此，术语“活性处理”的意思是以第一个氢气气泡形成作为开始进行的处理。步骤c的活性处理时间是10秒至60分钟；诸如10秒至3分钟、10秒至2分钟、10至60秒、10至50秒、10至40秒、以及10至30秒。

可在环境温度下进行步骤c。一般地，步骤c的水性组合物可具有15至25℃的温度，例如18至23℃的温度。

作为实例，可应用约0.1M浓度的氢氟酸在室温下进行步骤c的处理，历时40秒活性处理时间。

应当理解，处理时间、温度、pH和浓度中任一参数的调整可能需要在上述范围内适当地调整任何其它的所述参数，以获得可接受的结果。

通过步骤c，步骤b中获得的分层表面结构一般地得以保持，尽管其更精细结构可能被部分地溶解。步骤c后获得的表面结构如图8和9所示，并将在以下更详细地描述。在本发明的实施方案中，源自步骤b中获得的经修饰的金属氧化物溶解的金属氧化物沉淀以形成次级纳米结构，其包含在微结构和初级纳米结构顶部均匀分布的圆形峰。在本发明的实施方案中，该次级纳米结构的峰因此由金属氧化物组成。还可独立地将可溶的金属化合物添加到步骤c的水性组合物中，以增加步骤c组合物的金属浓度。

任选地，步骤b和步骤c中使用的组合物可包含骨生长增强材料。该骨生长增强材料可以包含金属离子，诸如钛离子、镁离子、钙离子、锂离子和/或锶离子，或其盐。可将这些离子独立地添加到组合物中。例如，步骤b的组合物或步骤c的组合物可以包含任意的上述金属离子。备选地，两种组合物均可包含金属离子。当两种组合物包含金属离子时，它们可以包含相同种类或不同种类的金属离子。通过掺入以上金属离子或其任意组合，可获得包含所述离子和/或其盐的经修饰的表面，其具有经改变的化学性质。因此可改善该组件的生物相容性并且可刺激该组件的骨整合。

特别地，本发明人已发现局部施与骨组织的锂或锶离子对所述骨组织中的骨形成和骨质量具有局部效果。还发现，与包含例如含有电离的钙或镁的表面氧化物的植入物相比，包含含有和/或释放电离的锂或锶的表面的植入物提供了改善的骨形成率，并且因此提供了改善的骨组织和该植入物之间的连接率。因此，在本发明的实施方案中，步骤b和步骤c的组合物两者，或仅步骤b的组合物包含电离的锂或锶或其组合。备选地，仅步骤c的组合物包含电离的锂或锶或其组合。

备选地，可在完成根据本发明的步骤b或步骤c之后将诸如电离的锂或锶的骨生长增强材料施加在组件的表面上。

另一方面，本发明涉及可由上述方法获得的生物相容性组件，以及涉及用于将该生物相容性组件植入人体或动物体的方法。例如，可将该生物相容性组件植入到人体或动物体的牙周区域。

另一方面，本发明涉及具有分层表面结构的生物相容性组件，所述分层表面结构包含微结构、叠加在所述微结构上的初级纳米结构，以及任选地，叠加在所述初级纳米结构之上的次级纳米结构。

在图1中定义了就微结构的剖面而言的术语“深度”(h₁)、“直径”(x₁)和“距离”(D₁)。凹坑(pit)的深度(h₁)定义为在相邻两个峰之间所画的假想线和在其最低点的中间表面之间的距离。如果不存在界限清楚的峰，在这样的点之间绘制假想线，其中表面剖面在所述点开始偏离基本上平的表面剖面(平顶)。凹坑的直径(x₁)和相邻凹坑间的距离(D₁)是图1所定义的所述相邻点之间的距离。在图1中，叠加的初级纳米结构也在微结构上图示提供。就初级纳米结构而言的术语“深度”(h₂)和“直径”(x₂)相应于图2的定义。

图3中定义了就次级纳米结构而言的术语“高度”(h₃)、“直径”(x₃)和“峰至峰的距离”。峰高度定义为在两个相邻峰之间所画的假想线和在其最低点的中间表面之间的距离。在峰的这样的点之间测量峰直径(x₃)，其中表面剖面在所述点开始偏离基本上平的表面剖面。

图4中，定义了就微结构剖面而言的角α和就初级纳米结构而言的角β。角α定义为两条假想线间的角度，其中一条代表微结构凹坑的壁在这样的点上的坡度，其中表面剖面在该点上开始偏离基本上平的表面剖面(P_1a)；以及其中一条代表微结构相邻凹坑的相邻壁在这样的点上的坡度，其中表面剖面在该点上开始偏离基本上平的表面剖面(P_1b)。所述彼此相邻的凹坑因此可以被平顶分离。因此，在两个相邻凹坑由峰隔开的情况下，假想线代表壁在所述峰的坡度。角β定义为两条假想线间的角度，所述假想线分别代表初级纳米结构凹陷的壁在其拐点上的坡度(P_2a)以及初级纳米结构的相邻凹陷的相邻壁在其拐点上的坡度(P_2b)。在其中两个凹面凹陷被峰分开的情况下，所述拐点因此位于所述峰中。

本发明组件的微结构和初级纳米结构基本上在上述方法的步骤b中获得。如上所述，步骤b提供了经修饰的氧化物表面，其是加厚了的、有活性的、并且具有白色或稍白的颜色。图5a是在本发明方法的步骤b后的组件的SEM图，其显示了所述微结构和所述初级纳米结构。该组件通过喷砂进行预处理。如在该图中所见，微结构包含不同大小的孔状凹陷和凹坑。图5b是在根据本发明的步骤b之后的组件的SEM图，其中标记了该微结构某些凹坑的直径。

图13和14展示了凹坑直径、凹坑深度和微结构彼此相邻的凹坑间的距离的分布。例如，微结构的凹坑可具有0.5至15μm、优选1至10μm、以及更优选1至5μm的直径x₁；以及0.1至2.5μm、优选0.1至1μm、以及更优选0.1至0.7μm的深度h₁。相邻的凹坑一般由平顶或脊分开，所述平顶或脊具有最高10μm、优选最高5μm、以及更优选最高3μm的直径。因此，相邻凹坑间的距离D₁可最高达10μm、最高达5μm、或最高达3μm。然而，因为通常的情况是具有分离的脊，因此可认为两个相邻的凹坑完全没有被任何距离分开。

如图5所示，微结构的单个凹坑的一般形状可以是大致的圆形或卵形，或其可以是不规则的。该微结构还可以包含咬边(undercuts)。此外，较大直径的凹坑可包含一个或若干个更小直径的凹坑。

微结构可以具有20°至130°的如上和在图4定义的角α，优选30°至120°，更优选40°至110°，以及最优选50°至100°。

在上述微结构上，提供了叠加的初级纳米结构。该初级纳米结构可在图5中看到，并且在图6中得到进一步阐释，其中在图6中标记了该初级纳米结构的元件。可将该初级纳米结构描述为波浪状连续结构。该初级纳米结构包含许多在微结构凹坑壁和底部以及在分开所述微结构凹坑的平顶和/或脊中的浅凹陷。初级纳米结构凹陷的直径x₂可以是10nm至1μm，优选10nm至600nm，以及更优选10nm至500nm；初级纳米结构凹陷的深度h₂可以是10至300nm，优选30至150nm。该凹陷一般很浅，意味着凹陷的直径超过其深度。初级纳米结构的凹陷具有基本上圆形或卵形形状。图15和16显示了初级纳米结构凹陷的直径和深度分布。

初级纳米结构凹陷可具有明显的边界或边缘。然而，初级纳米结构凹陷也可以具有这样的壁，其从所述凹陷底部升起并随后柔和地穿到下一个凹陷而不在它们之间形成清晰的边界。然而，在上述情况的任一种中，没有使初级纳米结构凹陷边界与另一个凹陷边界分离的可定义的距离。而是，所述凹陷并列地形成具有相当规则的外形的波浪状样式。初级纳米结构可以具有80°至160°的如上和在图4定义的角β，优选90°至150°，更优选100°至140°，以及最优选110°至130°。

如上所述，初级纳米结构叠加在初级微结构之上。此外，初级纳米结构的直径和深度分别比单个微结构凹坑的相应尺寸要更小。因此，单个微结构凹坑一般包含多个初级纳米结构凹陷。例如，微结构凹坑可包含约5至约50个所述凹陷。此外，初级纳米结构凹陷边界的部分一般构成另一初级纳米结构凹陷边界的部分。

图8和图9是根据本发明的经修饰的组件的SEM图。图8中，通过喷砂预处理了该样品，而在图9中，对样品进行了简单的机械加工。在这些图中，可看到叠加在上述微结构和初级纳米结构之上的次级纳米结构。图10是通过原子力显微术(AFM)获得的图片，其进一步阐明了次级纳米结构。如在图10中所看到的那样，次级纳米结构包含具有圆形峰形状的分离的凸出元件。该纳米峰稠密且均匀地分布在下面的表面结构上。例如，每单位面积的峰数目可以是15至150峰/μm²，优选50至130峰/μm²。

图17显示了次级纳米结构的峰直径、平均峰高度和峰与峰的距离分布。该次级纳米结构的平均峰高度h₃一般为5至200nm，优选5至100nm。单个次级纳米结构峰的直径x₃一般为20至550nm，优选20至150nm。峰与峰的距离D₃一般为10至450nm，优选40至200nm。图11显示了包含微结构、初级纳米结构和次级纳米结构的组件，其中标记了微结构的凹坑。

在本发明的实施方案中，其中在草酸处理之前使本发明的组件经受喷砂处理，存在较好的表面结构，在其上叠加了微结构。通过喷砂预处理的本发明组件的表面结构一般包含具有10至70μm长和3至20μm深的大凹坑。该大凹坑一般具有基本上卵形形状。相邻凹坑间的距离可以是1至20μm。叠加在这种大凹坑结构之上的是上述微结构。因此，大凹坑侧面和底部以及大凹坑之间的表面包含上述微结构的凹坑和分离的平顶和/或脊。常规喷砂的表面的SEM图显示于图7。喷砂预处理影响了随后形成的微结构、初级纳米结构和任选的次级纳米结构的尺寸。在进行了喷砂的根据本发明的组件中，随后形成的微结构一般比简单地机械加工的根据本发明的组件的微结构具有稍微更大的尺寸，并且随后形成的初级纳米结构一般地比简单地机械加工的根据本发明的组件的初级纳米结构具有稍微更小的尺寸。此外，在喷砂的组件中，微结构和初级纳米结构的直径以及微结构的深度比机械加工组件相应的特征更均匀，如通过表1所示的标准差值所证实的那样。

另一方面，本发明涉及用于将生物相容性组件植入人体或动物体的方法。该方法包括如下步骤：i)提供如上所述的生物相容性组件，以及ii)将该组件植入人或动物身体。例如，可将生物相容性组件植入到所述人体或动物体的牙周区域。

实施例

实施例1表面修饰

(i)样品制备

通过常规化学处理清洁具有硬币形状的钛样品(分别进行机械加工和喷砂)、固定器(喷砂)和基牙(机械加工)。将样品浸入1M草酸水溶液，并在剧烈搅拌下在80℃放置30分钟。30分钟后，从草酸溶液中移出该样品，并且用水漂洗，随后在超声浴中在水中漂洗2分钟。漂洗约10分钟后，将该样品浸入室温下的0.1M氢氟酸(HF)水溶液中，并且搅拌直到开始活性溶解，随后是另外40秒的活性处理时间。之后，将该样品从HF溶液中移出，并在水中漂洗，随后在超声浴中在水中漂洗5分钟。消毒前，将该样品在室温下风干约60分钟。

(ii)表面构形测量

在步骤b后的漂洗之后，以及在步骤c后的干燥之后，应用ESEMXL 30(FEI)对样品进行扫描电子显微术(SEM)。获得应用500x至15000x放大倍数的立体图象，并通过MeX 5.0程序(Alicona)评价。没有使用过滤。确定了微结构凹坑和初级纳米结构凹陷的深度和直径，以及相邻微结构凹坑之间的距离。初级微结构的结果如图13a-c(机械加工样品)和图14a-c(喷砂样品)所示，初级纳米结构的结果如图15a-b(机械加工样品)和图16a-b(喷砂样品)所示。步骤b之后获得的SEM图如图5a-b和6a-b所示。消毒后获得的SEM图如图8、9和11所示。

应用纳秒示波器IIIa仪器(Digital Instruments)进行TappingMode^TM原子力显微镜术(AFM)。分析了根据本发明的3个样品(机械加工)的次级纳米结构，每个样品在两个点上分析，每一个点位于从样品边缘约1mm处。分析的面积为2μmx2μm。确定了峰高度、峰直径、峰与峰的距离以及峰数量/μm²。以mm测量所述尺寸，并且应用在获得的剖面图中提供的比例尺转换为nm。峰高度、峰直径和峰与峰的距离的分布分别如图17a-c所示。

表1分别概述了所确定的喷砂和机械加工组件的微结构和初级纳米结构尺寸的最大、最小和平均值，所述尺寸通过SEM/MeX 5.0得以确定。还显示了通过AFM确定的机械加工组件的次级纳米结构的最大、最小和平均值。

表1.根据本发明的喷砂和机械加工的样品的表面结构尺寸

比较实施例1a

在室温将经喷砂的钛样品(硬币状)浸入包含0.1M氢氟酸和1M草酸的水溶液中，并且分别搅拌5、15、30和42分钟。从溶液中移出样品并用水漂洗，随后在超声浴中在水中漂洗2分钟。干燥样品后，通过扫描电子显微术(ESEM XL 30，FEI)检查表面构形。

结果，5分钟上述处理产生具有部分蚀刻区域和非均匀分布的凸出元件的样品。15分钟后取出的样品展示出包含稀疏凸出元件的相对平的、蚀刻的表面结构。30分钟后取出的表面具有条纹状外观并且包含小的凸出元件，并且还包含未鉴定的颗粒。处理5分钟的干燥样品的SEM图显示于图12a，处理30分钟的干燥样品的SEM图显示于图12b。

比较实施例1b

在室温下将钛样品浸入0.1M HF水溶液中，并且搅拌直到开始活性溶解，随后再处理40s时间。接下来，从HF溶液中移出该样品，并且在水中漂洗，随后在超声浴中在水中漂洗5分钟。漂洗后约10分钟，将样品浸入1M草酸水溶液中，并且在剧烈搅拌下在80℃放置30分钟。30分钟后，将样品从草酸溶液中移出，并在水中漂洗，随后在超声浴中在水中漂洗2分钟。使样品在室温下干燥1小时。

通过扫描电子显微术(ESEM XL 30，FEI)获得干燥样品的图象。结果如图12c所示。

实施例2-细胞增殖和活性

对在根据本发明的钛表面上体外培养的人类成骨细胞分别进行了细胞增殖及碱性磷酸酶(ALP)和前列腺素E2(PGE2)生产的研究，与在商业植入物表面(OsseoSpeed^TM；Asta Tech AB，Sweden)培养的细胞比较。

(i)细胞培养

MG-63是通常用于成骨细胞体外研究的人类细胞系。在本研究中，将MG-63细胞(MG-63，ATCC号CRL-1427，U.S.)在300mlFalcon细胞培养瓶(BD，WWR，Sweden)中培养于含有5％胎牛血清(FCS；Gibco，UK)和1％青霉素-链霉素(PEST；Gibco，UK)的Dulbecco最小必要培养基(Dulbecco′s Minimun Essential Medium，D-MEM)(Gibco，UK)，从来自冷冻细胞安瓿的第二代培养。当贴壁细胞长至融合时，用0.05％胰蛋白酶-EDTA(Gibco，UK)传代3代。细胞存活力很高(＞98％)，如通过光学显微镜术计数的那样。

(ii)细胞形态(SEM)

将3个硬币状的β-无菌化的钛样品体的每一个置于分开的Falcon24孔板(BD，WWR，Sweden)中，其中所述的3个样品体中，一个经历了根据本发明步骤b的处理，一个经历了根据本发明的步骤b和步骤c的处理，以及一个具有商业可获得的表面(OsseoSpeed^TM；Asta TechAB，Sweden)。往每一个孔中加入1ml含有5％FCS(Gibco，UK)和1％PEST(Gibco，UK)的D-MEM(Gibco，UK)，其具有20000细胞/ml的细胞浓度。将该板在37℃、5％CO₂和100％湿度中温育36小时。根据常规的SEM样品制备方法，在4℃用戊二醛固定样品，随后是四氧化锇固定、脱水和金溅射。通过SEM(ESEM XL 30，FEI)研究细胞形态。细胞的SEM图象显示于图20a(在常规表面生长的细胞)、图20b(在根据本发明步骤b处理的组件上生长的细胞)和图20c(在根据本发明步骤b和步骤c处理的组件上生长的细胞)。

(iii)细胞增殖、ALP活性和PGE2活性评估

将3组(n＝6)硬币状的β-无菌化的钛样品体的每一个置于分开的Falcon 24孔板(BD，WWR，Sweden)中，其中所述的3组样品中，一组经历了根据本发明步骤b的处理(“发明表面1”)，一组经历了根据本发明的步骤b和步骤c的处理(“发明表面2”)，以及一组具有商业可获得的表面(OsseoSpeed^TM；Asta Tech AB，Sweden)。往每一个孔中加入1ml含有5％FCS(Gibco，UK)和1％PEST(Gibco，UK)的D-MEM(Gibco，UK)，其具有20000细胞/ml的MG-63细胞浓度。将该板在37℃、5％CO₂和100％湿度中温育14天。

培养7天后，对来自每一孔的样品(50μl)分析外生ALP。通过以下方法分析贴壁细胞的内生性ALP：细胞裂解，随后离心并应用SenzoLyte^TM pNPP碱性磷酸酶分析试剂盒比色法(BioSite，Sweden)根据生产商的说明书确定上清夜和细胞内ALP含量(ng/ml)。7天后，经历了根据本发明步骤b和步骤c两者处理的样品(发明表面2)诱导了比参照样品(OsseoSpeed^TM)显著更高的每细胞ALP产量。结果显示于图19。

分别在培养7天和14天后应用NucleoCassette，NucleoCounter(ChemoMetec A/S Denmark)根据生产商的说明书确定每孔细胞总数。结果如图18所示。

分别在培养7天和14天后，应用ELISA试剂盒R&D SystemsPGE2免疫分析(R&D Systems，UK)根据生产商的说明确定来自每一孔的300μl上清液的PGE2。培养7天后，根据本发明的样品中的PGE2产量比参照要稍微更低。然而14天后，根据本发明的两组样品均诱导了比参照样品显著更高的每细胞PGE2产量。培养7天和14天后的结果分别显示于图21。

总之，发现根据本发明的样品诱导了比参照表面更低的细胞密度和更低的贴壁细胞数。然而，与在参照表面上生长的细胞相比，在根据本发明的表面上生长的细胞中有更高数量的细胞是增殖性的。在根据本发明的表面上生长的细胞还更少凋亡、更长且具有许多表明活性的凸出，如图20a-c所示。

与在常规表面上生长的细胞相比，培养14天后，在根据本发明的两种表面上生长的细胞展示了显著升高的PGE2产量。此外，在包含次级纳米结构的根据本发明的表面上生长的细胞具有比在常规表面上生长的细胞显著更高的ALP活性。ALP和/或PGE2活性的升高与升高的成骨细胞活性、减少的破骨细胞活性和ECM的加速矿物化相关。因此，总之，本发明提供了就骨形成率和骨整合而言改良的生物相容性组件。

实施例3-植入

在兔模型中测试了根据本发明的植入物的整合性。其目的是在体内定性和定量研究骨组织对两种根据本发明的植入物表面修饰的反应，与对商业可获得的参照植入物的反应相比较。

(i)用于拆除转矩研究的植入物

应用了如在实施例1中所描述的那样通过浸入草酸并随后浸入HF中(即，包括步骤b和c)而制备的钛转矩固定器(方形头拆除转矩设计，3.5x8.2mm)(称为测试植入物2)。此外，还应用了通过根据实施例1浸入草酸中(即，省略了步骤c)而制备的转矩固定器(3.5x8.2mm)(称为测试植入物1)。此外，应用代表商业可获得的OsseoSpeed^TM口植入物的转矩固定器(3.5x8.2mm)作为参照固定器。

(ii)用于组织学和组织形态学研究的植入物

应用了如实施例1描述的那样制备的口植入物(3.5x8mm)人类设计的固定器(测试植入物2)。此外，还应用了除省略了HF处理(即，步骤c)之外如在实施例1中所述那样制备的固定器(3.5x8mm)(测试植入物1)。此外，应用代表商业可获得的OsseoSpeed^TM口植入物的固定器(3.5x8mm)作为参照固定器。

(iii)植入物插入

将12只成熟雄性新西兰白兔安排进行外科手术。在开始的麻醉中一只兔子死亡(#8)。外科手术很顺利地进行。进行了低速穿孔(穿孔为1500rpg，以及植入物插入为20rpm)，用连续的NaCl冷却。

将一个植入物(口植入物的人类设计样式；3.5x 8mm)插入到每一股骨髁(femur chondyle)区域，并且将3个植入物(方形头拆除转矩设计；3.5x8.2mm)插入到每一胫骨粗隆(tuburositas tibia)。将股骨植入物安排用于组织形态分析，并且将胫骨植入物用于拆除转矩测试。

(iv)拆除转矩测试

6周后，终止研究并且处死兔子。检查植入物和周围组织。胫骨植入物容易定位并且它们所有都显示出骨膜骨组织生长(up-growth)的征兆。用拆除转矩测试(RTQ)进行植入物-骨界面的生物力学测试。RTQ设备(Detektor AB，Sweden)是包括应变仪传感器的电子装置，所述应变仪传感器用于测试骨床中的植入物稳定性(以Ncm的峰值放松转矩)，并且因此认为是大体上反映骨组织和植入物之间界面剪切强度的三维测试(Johansson C.B.，Albrektsson T.，Clin Oralimplants Res 1991；2：24-9)。将线性增加的转矩施加到该植入物相同的轴上，直到得到整合的破坏，并且记录峰值。插入到股骨的植入物更通常揭示骨组织对该植入物头部的“完全覆盖”。将股骨植入物浸入固定剂溶液，并且进一步加工用于组织和组织形态学研究。

测试植入物1、测试植入物2和参照植入物的拆除转矩测试的平均值显示于图22。比较所有的测试植入物1、测试植入物2和参照植入物揭示，与参照植入物相比较，测试植入物2的拆除转矩值有25％的提高。这一差异是统计学显著地(p＜0.05；Student T-检验)。此外，结果还暗示测试植入物1的拆除转矩值等于或大于参照植入物。

(v)组织学评估

6周后，终止研究并处死兔子。所选择的股骨植入部位的样品包括来自兔#1和#5的骨组织和植入物，依据骨与植入物接触(BIC)以及内螺纹内的骨面积(内部面积，ia)和从股骨取回的植入物周围各种区域的相应的镜像(mi)中的骨面积，对其进行组织形态学评估。

BIC和植入物不同区域的骨面积的平均值，以及BIC和每一植入物骨面积的总平均值报告于下表2和表3中。评估了以下植入物区域：

(a)微螺纹；

(b)大螺纹；

(c)沿着骨髓腔中的顶面(无螺纹)；以及

(d)植入物顶面的底部(这一区域仅用于报告骨植入物接触)。

表2.骨植入物接触(BIC)的平均值(％总接触)

样品	微螺纹	大螺纹	顶面	平均值	顶面的底部	包括底部的总平均值
							兔#1，测试植入物2	14	30	15	20	30	22
兔#1，参照	5	3	10	6	9	7
							兔#5，测试植入物1	15	7.5	23	15	7	13
兔#5，参照	14	19	15	16	21	17

表3.骨面积的平均值(％总面积)

样品	小螺纹(ia/mi)	大螺纹(ia/mi)	顶面(ia/mi)	平均值(ia/mi)
					兔#1，测试植入物2	29/35	29/31	69/43	42/36
兔#1，参照	13/26	10/8	29/10	17/15
					兔#5，测试植入物1	34/45	9/6	48/4	30/18
兔#5，参照	36/35	25/17	6/10	22/31

ia＝内部面积，mi＝镜像

对于兔#5，参照植入物，通过存在于所有植入物中的切口随机地制备切片。对于这一样品，所计算的底部接触距离基于兔#3，测试样品1的底部接触距离总距离的近似值(图24a)。

如可在表2和表3中所看到的那样，与参照表面相比较，测试植入物2显示了较高的骨植入物接触和螺纹中较大的骨面积。测试植入物1显示出与参照表面几乎相等的骨植入物接触。还观察到与参照植入物相比更大的螺纹中的内部骨面积(表2)。

定性显示骨形成的组织切片图显示于图23-24，其中

图23a代表兔#1，测试植入物2；

图23b代表兔#1，参照植入物；

图24a代表兔#5，测试植入物1；以及

图24b代表兔#5，参照植入物。

几乎所有样品均揭示在上部微螺纹区域，与植入物密切相关的新形成的骨比旧骨更多。在大螺纹中、骨髓腔中植入物的非螺纹侧和在顶面底层中观察到的骨组织也是新形成的。

在兔#1中，与参照植入物相比，在测试植入物2周围观察到大量的正在形成的骨。经常可以观察到具有成骨细胞的各种形状的成骨细胞边缘的类骨质缝(图23a，b)。

在兔#5中，与参照植入物相比，观察到在测试植入物1周围的大量正在形成的骨。经常能观察到成骨细胞，但是不如兔#1测试植入物2周围的那么显著(图24a，b)。

植入物表面与骨髓腔中的脂肪细胞紧密连接，而与植入物表面无关，表明所有表面与敏感的骨髓细胞的高度生物相容性。

实施例4-体外磷灰石形成

用于研究骨形成的一个常规体外模型将生物材料浸入模拟体液(SBFs)中。SBF是具有与人血浆大约相等的离子浓度的溶液(Kokubo T.，Kushitani H.，Sakka S.，Kitsugi T.，Yamamuro T.，J Biomed Mater Res1990；24：721-734；Oyane A.，Kim H.K.，Furuya T.，Kokubo T.，Miyazaki T.，Nakamura T.，J Biomed Mater Res 2003；65A，188-195)。依赖于生物材料的成核能力，骨样磷酸钙将沉淀到其表面。已报道了在具有体内骨生物活性的SBF中磷灰石形成的定量关系(Kokubo T.，Takadama H.，Biomaterials 2006；27：2907-2915)。今天经常使用SBF体外模型，并且由国际标准ISO 23317：2007E描述。

(i)SBF浸入

选择了具有与人类血浆非常类似的电介质浓度(Vander A.J.，Sherman J.H.，Luciano D.S.，“Human physiology The mechanisms ofbody function”，第5版.McGraw-Hill Publishing Company，New York，1990：349-400)的修正SBF(Oyane A.等，J Biomed Mater Res 2003；65A，188-195)。通过将10.806g NaCl、1.480g NaHCO₃、4.092gNa₂CO₃、0.450g KCl、0.460g K₂HPO₄·3H₂O、0.622g MgCl₂·6H₂O、23.856g 2-(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基)乙磺酸(HEPES)、0.776g CaCl₂和0.144g Na₂SO₄溶解于2000ml去离子水中而制备SBF。在将其加入到溶液之前，将HEPES溶解于200ml去离子水中。在37℃用1.0MNaOH将终pH调节至7.40。所有的化学物质均来自Merck(Sweden)，除了来自Fluka(Sweden)的NaCl和Na₂SO₄之外。

在37℃将3组硬币状的β无菌化的钛样品浸入到在分离且密封的50ml聚苯乙烯小瓶(VWR，Sweden)中的37ml SBF中，其中所述的3组样品中，一组经历了根据本发明步骤b的处理(称为发明表面1)，一组经历了根据本发明的步骤b和步骤c的处理(发明表面2)，以及一组参照组代表商业可获得的表面(OsseoSpeed^TM；Asta Tech AB，Sweden)。将该样品安装悬挂在小瓶的盖上，使得待分析的硬币的侧面向下而不与任何其它物体接触。3天后，中断SBF浸入，并且用去离子水彻底地漂洗样品，以移除任何松散附着的磷酸钙材料。然后在层流气流台上在室温下干燥样品。每一组3个样品没有浸入SBF，因此作为对照。

(ii)形成的磷灰石的形态(SEM)

应用环境扫描电子显微(ESEM，XL 30，FEI)进行可能的磷灰石形成分析。SBF浸入之前的表面结构SEM图显示于图25a(参照)、26a(发明表面1)和27a(发明表面2)。当研究SBF浸入后的表面结构时，得出在所有样品组上均形成磷酸钙薄层的结论；参照(图25b)，发明表面1(图26b)和发明表面2(图27b)。

(iii)形成的磷灰石的化学评估(EDS)

应用能量色散光谱学(EDS，Apollo 40，EDAX)对磷灰石形成之前和之后的样品进行化学分析。通过分析钛信号，可以间接地评估样品被磷酸钙覆盖的程度。发明表面2显示出在SBF浸入后钛信号的最大降低(图28)，因此表明在研究的样品组之间最大量的磷灰石形成。

还应用EDS计算Ca/P比值，以估计非晶形和晶形磷酸钙的相对发生率(prevalence)。Ca/P比值显示于图29。得到的Ca/P比值表明在发明表面1和发明表面2上形成的磷灰石的结晶程度比参照表面要更高。磷酸三钙(Ca₃(PO₄)₂)和羟基磷灰石(Ca₅(PO₄)₃OH)的化学计量Ca/P原子比分别为1.5和1.67。

总之，在所有样品组中均发现了早期的磷灰石形成，发明表面2显示出最高程度的磷灰石覆盖，如通过钛信号推断的那样(图28)。

Claims (41)

1.用于修饰生物相容性组件的方法，其包括以下步骤：

a)提供至少部分被金属氧化物覆盖的生物相容性组件；以及

b)用含有草酸的水性组合物处理所述组件的至少一部分，该部分被所述金属氧化物覆盖，

由此得到经修饰的金属氧化物，

且还包括步骤：

c)用第二水性组合物处理所述经修饰的金属氧化物的至少部分，所述组合物包含

i)选自电离的氟和电离的氯中的至少一种材料；以及

ii)至少一种酸，

其中在钝化氧化物在所述经修饰的金属氧化物上形成之前进行步骤c。

2.权利要求1的方法，其中步骤b的组合物具有0.001至5M浓度的草酸；并且步骤b的处理时间是10至60分钟。

3.权利要求2的方法，其中步骤b的组合物具有1M浓度的草酸。

4.权利要求2或3的方法，其中所述的处理时间是20至40分钟。

5.权利要求2或3的方法，其中所述的处理时间是20至30分钟。

6.权利要求2或3的方法，其中所述的处理时间是25分钟。

7.权利要求1-3任一项的方法，其中步骤b的组合物的温度是20℃至100℃。

8.权利要求1-3任一项的方法，其中步骤b的组合物的温度是60℃至90℃。

9.权利要求1-3任一项的方法，其中步骤b的组合物的温度是80℃。

10.权利要求1的方法，其中在完成步骤b后180小时或更短时间内进行步骤c，当在0℃或更高的温度，在正常大气压和在含有氧气的气氛中保存该组件时计数所示时间。

11.权利要求1-3任一项的方法，其中在完成步骤b后72小时或更短时间内进行步骤c。

12.权利要求1-3任一项的方法，其中在完成步骤b后24小时或更短时间内进行步骤c。

13.权利要求1-3任一项的方法，其中在完成步骤b后1小时或更短时间内进行步骤c。

14.权利要求1-3任一项的方法，其中在完成步骤b后10分钟或更短时间内进行步骤c。

15.权利要求1-3任一项的方法，其中所述的第二水性组合物包含氢氟酸。

16.权利要求1-3任一项的方法，其中所述的第二水性组合物具有0.5至5的pH；所述选自电离的氟和电离的氯的至少一种材料的浓度是0.02至0.5M；并且步骤c的处理进行10秒至3分钟的活性处理时间。

17.权利要求16的方法，其中所述的pH是1至3。

18.权利要求16的方法，其中所述的pH是2。

19.权利要求16的方法，其中所述选自电离的氟和电离的氯的至少一种材料的浓度是0.05至0.3M。

20.权利要求16的方法，其中所述选自电离的氟和电离的氯的至少一种材料的浓度是0.1M。

21.权利要求16的方法，其中所述的活性处理时间是10秒至50秒。

22.权利要求1-3任一项的方法，其中所述第二水性组合物的温度为15至25℃。

23.权利要求1-3任一项的方法，其中所述第二水性组合物的温度为18至23℃。

24.权利要求1-3任一项的方法，其中所述的步骤b的水性组合物包含骨生长增强材料。

25.权利要求1-3任一项的方法，其中所述第二水性组合物包含骨生长增强材料。

26.权利要求24的方法，其中所述的骨生长增强材料包括金属离子或其盐。

27.权利要求25的方法，其中所述的骨生长增强材料包括金属离子或其盐。

28.权利要求26或27的方法，其中所述金属离子包含选自钛离子、镁离子、钙离子、锂离子、锶离子或其任意组合的离子。

29.权利要求26或27的方法，其中所述金属离子包含锂离子。

30.权利要求26或27的方法，其中所述金属离子包含锶离子。

31.权利要求1-3任一项的方法，其中所述组件至少部分地由钛或钛合金组成。

32.权利要求1-3任一项的方法，其中所述的金属氧化物包括钛氧化物。

33.权利要求1-3任一项的方法，其中所述的金属氧化物基本上由一种钛氧化物或复数种钛氧化物的组合组成。

34.权利要求1-3任一项的方法，其中所述的金属氧化物包含钝化钛氧化物。

35.权利要求1-3任一项的方法，其中在步骤b之前使所述组件经历机械表面处理。

36.权利要求35的方法，其中所述机械表面处理包括喷砂。

37.权利要求1-3任一项的方法，其中在步骤b之前使所述组件经历化学表面处理。

38.权利要求37的方法，其中所述的化学表面处理包括脱脂或清洁处理。

39.权利要求1-3任一项的方法，其中所述的生物相容性组件是选自植入物、固定器、基牙、整件植入物或其组合的牙科组件。

40.权利要求1-3任一项的方法，其中所述的生物相容性组件是矫形外科组件。

41.可通过根据前述任一项权利要求的方法获得的组件。