CN101680018B - 体外血液动力学的内皮/平滑肌细胞共培养模型在鉴定血管疾病的新型治疗靶标中的应用 - Google Patents

体外血液动力学的内皮/平滑肌细胞共培养模型在鉴定血管疾病的新型治疗靶标中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于将人体循环模型化后的血液动力学(即血流)模式施加于培养中的人类/动物细胞的体外生物机械模型。这一模型复现了使用非侵入式磁共振成像从人体循环直接测量的并且翻译给控制椎台转动的马达的血液动力学流模式。椎台浸入流体(即细胞培养基)中并且达到密切接近在平板表面生长的细胞表面。椎台的转动将动量传感到流体上并且在平板或细胞表面产生依时间变化的剪切应力。这一模型最接近地模拟了体内施加于内皮细胞(血管内衬的细胞)的生理血液动力学力并且克服了早前应用更简化的非生理流动式的流装置的局限性。本发明的另一方面涉及结合Transwell的共培养皿。这允许在培养皿环境下物理分离两种、三种或更多种不同细胞类型，同时将内部的细胞表面暴露于模拟的血液动力学流模式。其他重要的改变包括定制的流入和流出管道以向共培养模型的内和外室两者分别且独立地供给培养基、药物等。使用外部组件来控制生理温度和气体浓度。通过人工Transwell膜以及Petri皿的底部的贴壁细胞的物理分离允许分别地分离每个细胞层、或表面用于生物分析阵列(即蛋白质、基因等)。

Description

体外血液动力学的内皮/平滑肌细胞共培养模型在鉴定血管 疾病的新型治疗靶标中的应用
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)主张2007年1月10日递交的美国临时专利申请No.60/879,710的优先权，其在此通过引用作为参考。关于资助研究或开发的声明
不适用。序列表的引用
不适用。
发明背景
发明领域
本发明通常涉及用于体外分析细胞(例如，内皮细胞)上流体流动(例如，血液动力学)的装置和方法。更具体地，本发明涉及使用允许在培养皿环境内物理分开一种以上的不同细胞类型，同时内部的细胞表面暴露于模拟的血液动力学流模式的装置的方法。
相关技术的说明
动脉粥样硬化是由动脉损害形成以及管腔变窄为特征的血管炎性疾病。内皮细胞(EC)和平滑肌细胞(SMC)局部(regional)表型在血管疾病进展中具有显著的影响。早期动脉粥样化形成期间，内皮变得活化，导致粘附分子表达，对脂蛋白的通透性以及细胞因子产生的增加。此种环 境改变可以影响SMC以经历“表型转换”，该表型转换特征为形态的改变、提高的增殖和迁移、以及降低的确定的静止SMC标记的表达。
动脉粥样硬化进一步的特征为其在大动脉中于血液动力学上受限(defined)的区域处形成斑块，例如在产生复杂流动模式的分叉处形成斑块。对空斑形成敏感的倾向于动脉硬化的(Atheroprone)区域经受低时均(time averaged)剪切应力和“干扰的”振荡流模式。相反，对空斑形成不很敏感的防止动脉硬化的(atheroprotective)区域遭受相对较高的时均剪切应力和脉动层流(13，39)。血流长期受干扰的区域中，EC表型的变化，例如增加的粘附分子表达(即血管细胞粘附分子1(VCAM-1)、细胞间粘附分子1(ICAM-1)、e-选择蛋白)，和对于低密度脂蛋白(LDL)的穿内皮通透性，将影响局部信号环境并且可以改变SMC表型，导致动脉粥样硬化的增生、迁移和发病。
对于涉及EC和血液动力学流模式的控制SMC表型改变的因素并未全面理解。然而，动脉粥样硬化中SMC表型转换的标志是限定分化的SMC的收缩蛋白质的遏制，包括SMMHC、SMαA和myocardin。
为了理解动脉粥样化形成中剪切应力对内皮的作用，广泛地研究了将EC暴露于多种剪切应力条件的体外模型。由于EC可以辨别流模式中的变化并且对于剪切应力幅度和血液动力学的时间变化特征敏感，仿效体内流环境似乎对于概括内皮的体内表型具有更大影响。此外，很少有研究显示了在任何模式的流存在下，EC和SMC的复杂的相互作用和交叉通讯，并且目前尚无已知的调查关于内皮上的体内来源的人血液动力学力如何调控SMC表型转换的研究，所述转换正如典型地由文献所定义的。
发明概述
本发明的一方面涉及(但不限于)用于将在人体循环模型化后的血液动力学(即血流)模式施加于培养中的人类/动物细胞的体外生物机械模型。这一模型复现使用非侵入式磁共振成像从人体循环直接测量的并且翻译给控制椎台(cone)转动的马达的血液动力学流模式。椎台浸入流体(即细胞培养基)中并且达到非常接近平板表面上生长的细胞表面。椎台的转动将动量传递到流体上并且在平板或细胞表面产生依时间变化的剪切应力。该模型最接近地模拟了体内施加于内皮细胞(血管内衬的细胞)的生理血液动力学力并且克服了早前应用更简化的非生理流动模式的流动装置的局限性。
本发明的另一方面涉及结合市售可得的transwell的共培养皿，例如75mm直径的transwell。这允许在培养皿环境下物理分开两种、三种或更多种不同细胞类型，同时将内部的细胞表面暴露于模拟的血液动力学流模式。其他重要的改变包括流入和流出管道以向共培养模型的内和外室两者分别且独立地供给培养基、药物等。使用外部组件来控制生理温度和气体浓度。贴壁细胞通过人工transwell膜以及Petri皿的底部的物理分离允许分别地分离每个细胞层、或表面用于生物分析阵列(即蛋白质、基因等)。
本发明的直接应用包括1)研究人类/动物内皮和平滑肌细胞的交叉对话，这两种细胞是构成血管壁并参与动脉粥样硬化(心脏病、中风、外周血管疾病)和其他血管疾病的病理进展的两种关键细胞类型。2)这一模型也可用作诊断模型，检测新型基于药物的治疗的毒性、炎症(例如单核细胞粘附、炎性细胞因子释放、炎性基因诱导)和通透性。
涉及本发明的多种实施方案的一些示例性新方面包括但不限于下述(没有指定的顺序)：
该装置可以以最高水平的保真性来复现在对动脉粥样硬化敏感和有防御性的动脉循环中以及来自对其他生理(例如锻炼)或病理状况(例如高血压、糖尿病、血脂异常)敏感的患者的血液动力学剪切应力谱。
该装置可以以最高水平的保真性来复现来自动脉、静脉或任何器官循环的任何类型的可测量的或理想的剪切应力谱。
在transwell膜的反面上培养有或者无另一种类型细胞的情况下，将血液动力学流模式暴露于transwell膜的内表面上。
在transwell皿的底表面上培养有或者无另一种类型细胞的情况下，将血液动力学流模式暴露在transwell膜的内表面上。
在transwell膜的反面上培养有或者无另一种类型细胞以及在transwell皿的底表面上培养有或者无第三种类型细胞的情况下，将血液动力学流模式暴露在transwell膜的内表面上。该第三种细胞可包括用于炎性细胞粘附检测的单核细胞或巨噬细胞。
在transwell膜的反面上培养有或者无另一种类型细胞以及在transwell膜的内表面的培养基中悬浮有或者无第三种类型细胞的情况下，将血液动力学流模式暴露在transwell膜的内表面上。
使用装在transwell侧部的夹子将用于内(上)室和外(下)室两者的流入和流出管道固定在原位上。使用该管道来分别地向transwell的上和/或下室灌注培养基、生化化合物、激动剂、拮抗剂等和使其流出而不扰乱流动环境。可以使用由该实验取出的培养基来进一步检测来自每层的细胞因子或体液因子分泌。
从单个实验独立地分离每种细胞类型(所用的一种、两种或三种不同细胞类型)用于在后加工的生物(蛋白质组/基因组)分析(包括基因阵列、蛋白质组学)的能力。
该装置可以接受并检测来自物种的无论贴壁或非贴壁的任何细胞类型。
该装置可以用作血管生物模拟细胞培养模型用于调查从胚胎血管发育到成人严重的动脉粥样硬化情形的所有阶段。例如，可将内皮细胞在transwell膜的内表面铺板接种和/或将平滑肌细胞在transwell膜反面铺板接种和/或将巨噬细胞(或白细胞)接种在上或下室中。
该装置可以用于检测在血液动力学条件下来自血管支架材料的细胞的兼容性、细胞粘附、以及表型调节。例如，可将内皮和/或平滑肌细胞紧邻该材料、在该材料上部、或在该材料下面接种，该材料安装在装置的固定的表面上。材料包括但不限于金属纳米多孔(nanoporous)金属、聚合物、生物可降解聚合物、碳表面、刮擦或蚀刻了的表面。
该装置可以用于检测在血液动力学条件下从细胞存在或不存在的血管支架材料洗脱的药物(即化合物)。
该装置可以用于检测在血液动力学条件下由聚合材料包覆的表面上或其附近接种的细胞的兼容性、细胞粘附性、和表型调节。
该装置可以用作血管生物模拟细胞培养模型用于调查血-脑屏障。例如，可将内皮细胞在transwell膜的内表面铺板接种和/或将神经胶质细胞和/或星形细胞和/或神经元在transwell膜的反面和/或底部的Petri皿表面铺板接种。
该装置可以用作气道生物模拟细胞培养模型用于调查哮喘的发展和进程。例如可将上皮细胞在transwell膜的内表面铺板接种和/或将平滑肌细胞在transwell膜的反面铺板接种和/或将巨噬细胞(或白细胞)接种在下室。通过紧密接近于椎台和上皮表面之间的分泌和/或人工粘膜层的椎台的移动仿效节律性呼吸模式。
该装置可以用作肾脏生物模拟模型用于调查内皮细胞和上皮足细胞相互作用。
该装置可以用于产生模拟患者药物治疗的特异性体液环境然后确定与该患者药物治疗结合的已知或未知药物化合物的兼容性。例如，该装置可以在具有药物立普妥(Lipitor)的培养基中运行指定的时间，然后可以加入未知药物来确定毒性、炎症(例如单核细胞粘附、炎性细胞因子释放、炎性基因诱导)和通透性的改变。
该装置可以用于确定取自具有与药物毒性或一些病理生理端点相联系的经鉴定基因型的患者的血管细胞或其他器官细胞类型中的功能性改变。例如，可以将取自具有鉴定为与药物毒性相关的单核苷酸多态性(SNP)患者的内皮细胞用于检测对于在毒性、炎症(例如单核细胞粘附、炎性细胞因子释放、炎性基因诱导)和通透性方面有改变的新型或已知化合物。这通常称作药物基因组学。
本发明的一个实施方案是将血液动力学模式施用于培养中的细胞的方法，所述方法包括下述步骤：将第一组细胞在transwell上铺板接种，将第二组细胞在所述transwell上铺板接种，其中所述第一组细胞与所述第二组细胞分开，向所述transwell中加入流体；并且造成所述流体旋转一段 时间，其中所述培养基因此对所述第二组细胞施加剪应力。
本发明的另一实施方案是将血液动力学模式施用于培养中的细胞的方法，所述方法包括下述步骤：监测受试者的血液动力学模式；使所述血液模式模型化为一组电指令；以及使用一种装置根据所述电指令在transwell上的多组细胞上造成剪切应力。
本发明的另一实施方案是血液动力学流装置，包括电控制器；马达，其中所述马达通过所述电控制器来操作；与所述马达相连的椎台，从而通过所述马达转动所述椎台；具有膜的transwell，其中所述椎台至少部分浸入所述transwell中的培养基中并且其中所述椎台对所述培养基施加旋转力；向所述transwell加入培养基的流入管；以及从所述transwell取出培养基的流出管。
附图简要说明
附图简要说明
图1提供在transwell上对EC/SMC铺板接种的示例性视图；
图2提供椎台和平板流装置的视图，将该装置改良为适应Transwell培养皿；
图3提供展示源自人颈总动脉(CCA)和颈内动脉窦(ICS)的MRI的示例性血液动力学流模式的图；
图4示出在EC接种后24小时EC和SMC的示例性汇合层；
图5示出对F-肌动蛋白和FM4-64染色的或由微分干涉相差显微镜可视化的示例性横切片，示出膜孔内的细胞突起；
图6示出EC/SMC形态学和定向的示例性免疫荧光图像；
图7示出用于EC和SMC的形状系数(shape factors)(SF)的示例性标准化直方图的曲线；
图8示出SMC和EC方向相对于防止动脉硬化的流方向(0o)的平均角度；
图9示出SMC方向(或角度)相对于流方向的定向直方图；
图10示出阐明标准化的基因表达的示例性图；
图11示出阐明标准化的mRNA表达的示例性图；
图12示出示例性蛋白质分析的结果；
图13示出标准化的mRNA表达的示例性图；
图14示出标准化的mRNA表达的示例性图；
图15示出示例性印迹分析的结果；
图16示出在倾向于动脉硬化和防止动脉硬化的流条件化培养基上进行的IL-8的示例性ELISA分析的结果；
图17示出标准化的mRNA表达的示例性图；
图18示出膜的表面的示例性扫描电镜显微照片；和
图19示出示例性成倍富集的图。
发明详细说明
发明详细说明
动脉粥样硬化。
动脉粥样硬化优选地发生于动脉区域，例如分叉以及高曲率区，其特征在于干扰的、低时均的以及振荡壁剪切应力。体内倾向于动脉硬化的区以及体外对内皮的倾向于动脉硬化的剪切应力可以诱导由下游炎性靶标的激活和调控所表示的促炎性引发。尽管EC和SMC是已知在起始动脉粥样硬化事件期间，经历表型调节，或“转换”的两种主要细胞类型，本发明以前都不清楚对EC的血液动力学力是否调控或有助于在SMC中的这一过程。应用于EC的源自人的倾向于动脉硬化的剪切应力通过在染色质水平的后生修饰来调控EC和SMC中的促炎性表型以及SMC中的促动脉粥样硬化的表型转换。这一过程被称作机械转录耦合(mechanotranscriptional coupling)。
来自本发明共培养过程的结果支持了血液动力学诱导血管EC和SMC引发促动脉粥样硬化的应答的假说，从而验证了使用共培养体系作为新型生理相关的生物模拟血管模型用于早期动脉粥样硬化事件的研究。这些结果与早先出版的动脉粥样硬化相关的体内和体外流研究相一致(图10)。此外，之前EC和SMC的Transwell共培养模型除了一些流研究外，都限于静止型实验，并且尚无已知的研究使用了生理相关的人源血液动力学流模式。本发明的方法通过直接比较两种血液动力学流模式、得到用于脉管体系中体内区域准确比较的更加生理相关的模型，并且关注于传统SMC分化标记而克服了这些限制。
血管疾病中的SMC表型调节的标志是限定可收缩的表型的基因表达。SMC分化标记以及作为分化的SMC的绘制者的转录因子受到倾向于动脉硬化的流的影响。在mRNA和蛋白质水平上的分化标记(SMαA和myocardin)的表达损失以及炎性标记VCAM-1的诱导确认了暴露于倾向于动脉硬化的流的EC相比于防止动脉硬化的流，差异地调控SMC表型。ChIP分析揭示了相比于防止动脉硬化的流的这样的机制，其起始倾向于动脉硬化诱导的CArG-依赖的SMC基因表达的损失，涉及SFR结合到SMαA和SMMHC的CArG框区域的减少以及组蛋白H4的脱乙酰化。这对于早期生长应答基因c-fos并非如此。这些结果与应答PDGF-BB处理的单培养物SMC研究，以及更重要地，针对完整血管中应答急性血管损伤的SMαA、SMMHC以及c-fos的后生指纹相一致。因此，组蛋白H4乙酰化对于维持CArG染色质启动子区域为SRF-可接近状态是至关重要的此通常模式由两种暴露于EC的不同血液动力学流模式所差异地调控。SRF共激活因子myocardin对于与SFR形成较高-量级复合体用于SMC选择性CArG依赖型基因的正调控起至关重要的作用。相反，KLF4可以取消CArG依赖型SMC分化基因的myocardin依赖型调控。Myocardin表达显著降低以应答倾向于动脉硬化的流，而KLF4趋于表达增加。由于KLF4基因表达在培养的SMC中可以被快速且瞬时诱导以应答PDGF-BB，而在完整的血管经历急性血管损伤后被瞬时诱导至多6小时然后在24小时时返回基线，可能在这一时间点没有捕获到KLF4表达的最大以及最显著的变化。然而，这一研究中产生的基因谱与文献中现有的数据相关，并且放在一起时，结果表明暴露于倾向于动脉硬化的流的SMC的表型调节在转录水平发生并且涉及已经被很好地表征的SRF/myocardin和KLF4信号轴。
感兴趣的是，EC在倾向于动脉硬化的流中展现了降低的KLF4表 达。已经显示了KLF4在单培养物中被EC中的流所调控；然而，以前不清楚相比于防止动脉硬化的流，KLF4在倾向于动脉硬化的流的情况下差异地表达。近来显示了LKF4在EC中的功能重要性与KLF2相似(即抗炎症、防止动脉硬化的，以及止血控制)。此外，KLF4涉及细胞周期调控，以及针对体内区域和体外倾向于动脉硬化的相关流报道了更多细胞周期活性。因此，KLF4转录调控可在调控血管EC和SMC增殖中发挥相同的重要作用。此外，由于已经显示了myoeardin随着急性、机械血管损伤降低而KLF4增加，这一过程提供了这些转录因子在模拟早期导致动脉粥样硬化的事件的模型中被差异调控的证据。目前尚不清楚动脉粥样硬化的体内调控。
出人意料地，SMMHC是唯一不遵循期望的调节趋势的SMC标记。这可能是由于RT-PCR引物识别两种SMMHC异构型(SM-1和SM-2)。对每种异构型单独分析可说明与其他SMC标记一致的应答。在稍后的时间点(即48小时)的分析可解决它。在倾向于动脉硬化的流存在下，对EC以及对SMC的组合的表型应答与在动脉粥样硬化的人类和实验模型中定义的历史上的EC和SMC表型谱惊人地相似(图10)。
对于相对于防止动脉硬化的流而应答倾向于动脉硬化的流的EC基因表达的评估与下述研究相一致，即使用类似流谱的仅仅是EC单培养物的研究以及使用类似幅度的稳定剪切应力的研究以及动脉粥样硬化的体内模型的研究，强调了血液动力学相比于SMC的存在更加有力地调控EC表型。暴露于倾向于动脉硬化的流24小时的EC诱导与eNOS、Tie2和KLF2降低相称的较高水平促动脉粥样硬化和增殖的基因以及蛋白质：IL-8、VCAM-1、和PCNA。eNOS和Tie2的表达损失表明较高的重塑率以及增加的通透性这些体内对动脉硬化敏感的区域的特征。证据已经确立了KLF2，以及可能的KLF4作为防止动脉硬化的上游转录调控子的作用。体内区域以及体外防止动脉硬化的血液动力学似乎是KLF2表达和转录控制的关键调节子。如增加的VCAM-1mRNA水平所表明，SMC也展现了对于倾向于动脉硬化的流的早期炎性反应。在人类动脉粥样硬化斑块的 SMC中观察到VCAM-1调节，并且将其与体外和体内早期动脉粥样化形成期间的增殖相联系。然而，由于增殖标记PCNA在针对倾向于动脉硬化的流的SMC中没有显示出变化，可能这一体系中存在更多的迁移型SMC表型。
已经说明了在早期动脉粥样化形成期间调控SMC表型调节的EC分泌的细胞因子/促分裂原并且其包括候选物如PDGF-BB、IL-1和IL-8。此处，示出EC在倾向于动脉硬化的流之后增加IL-8mRNA产生和IL-8分泌。事实上，IL-8可以刺激在SMC中迁移表型的诱导。因此，通过EC的IL-8分泌可能是SMC调控更多合成表型的一种机制。感兴趣的是，近来对E-/-小鼠的载脂蛋白的研究显示了实验上诱导的低剪切应力导致生长相关的蛋白质(Gro)-αmRNA的增加。然而，考虑到这一研究的体内性质，并不确定(Gro)-αmRNA的改变是否在EC、SMC中或两者中。尽管Gro-α如IL-8结合相同的受体，但是不存在IL-8的鼠科动物同源物。因此人类共培养模型对于检查源自EC的IL-8对SMC的作用是理想的，并且继续进一步研究以建立此种交叉通讯机制的相对作用。
在倾向于动脉硬化的对防止动脉硬化的流中观察到的细胞形态学改变也是可以导致定位下游导致动脉粥样硬化的应答的早期重塑的迹象。已知EC在脉动生理条件在流方向中重新定向并且在暴露于扰流后保持更多边的多边形形状，如在本体系中所观察。然而，由于内皮所感应的剪切应力，对于SMC重新定向的理解是处于其最早阶段。在防止动脉硬化的波形下，SMC定向更加垂直于血液动力学流，而SMC暴露于倾向于动脉硬化的流动导致了更随机的排列。重要地，此SMC定向几乎与完整的血管在分叉区域(高度易感动脉粥样硬化的区域)处的SMC的空间模式相同。总之，这表明血液动力学流可以通过倾向于动脉硬化或防止动脉硬化的流模式内在不同的独特控制机制而调控EC和SMC定向。
本发明提供了使用人类EC和SMC的新型体外共培养模型，其显示了直接施加至内皮的人类血液动力学力(防止动脉硬化的或者倾向于动脉硬化的)可以调节SMC表型并影响SMC重塑，我们将这一过程定义为 机械转录耦合。此外，对EC和SMC表型和形态学改变的概要表明在内皮上的血液动力学力是动脉粥样化形成的重要调节子。
如图1所示，在血液动力学流过程中使用transwell 100。transwell允许平行检测多种细胞110，120并且也提供了多孔界面。也示出了用于铺板接种以共培养的示例性过程；然而，可通过本领域技术人员可获得的方法来改变这一过程。这一实施方案中，在初始时间将SMC 110铺板接种，之后翻转transwell。孵育SMC 110持续24至48小时，之后将EC120在transwell上铺板接种并且孵育。插入transwell的Petri皿底部也可用作第三表面来将其他的细胞类型或者与直接在transwell膜170中铺板接种的那种相同的细胞类型铺板接种，孵育EC120后，马达和椎台装置的椎台140用于施加剪切应力。
如图2所示，使用马达和椎台装置200对细胞施加剪切应力。马达230造成椎台240以精确的转动速度转动，并且可以以任何方向(即顺时针或逆时针)影响转动。通过椎台将此转动力施加于液体培养基。依次，该培养基直接向培养板250中的transwell膜270上的细胞260施加剪切应力。编制软件以控制椎台的连续运动。向马达控制器单元上传该软件文件，然后直接将信息发送到马达以实施经编制的任务。
优选实施方案中，培养基为配制成在实验期间维持细胞完整性和健康的细胞培养液。并不限制该配剂并且可根据所使用的细胞类型以及实验研究而变化。另外，药物化合物可以是此制剂的一部分，该药物化合物或者开始就在该制剂中，或者在流实验过程期间灌注到细胞培养物环境中。这可包括但不限于可以抑制、活化或改变细胞中蛋白质/基因功能的化合物。
一个实施方案中，可以使用该装置来检测血液动力学条件下，来自血管支架材料的细胞的兼容性、细胞粘附性以及表型调节。例如，可以将表皮和/或平滑肌细胞在该材料旁边、上部或下面接种，该材料安放在该装置的固定表面上。材料包括但不限于金属纳米多孔金属、聚合物、生物可降解聚合物、碳表面、刮擦或蚀刻的表面。这些材料还包括不可降解的聚 合物或共聚物，例如聚乙烯-醋酸乙烯共聚物(PEVA)和聚正丁基甲基丙烯酸酯，并且可以包覆到transwell表面上。这些材料还包括生物可降解聚合物或共聚物，例如聚乳酸乙醇酸(PLGA)或磷酸胆碱，并且可以包覆到transwell表面上。这些材料还包括纳米多孔表面修饰，例如陶瓷、金属或其他材料并且可以添加到transwell表面作为纳米多孔表面修饰。这些材料还包括微孔表面修饰，例如陶瓷、金属、物理蚀刻(例如喷砂)或其他添加到transwell表面的材料以形成微孔表面修饰。
本发明的另一实施方案中，该装置可以对在transwell膜的任一侧或两侧铺板接种的细胞进行操作。transwell膜的膜部分可以包括任何具有一定范围的孔隙率和厚度的生物或合成材料。类似地，可以由任何合成材料制成容纳并支撑该transwell膜的结构。
实施例
下面是使用本发明的方法的实例，但是并不旨在将本发明的范围限于该实施例中描述的确切方法。
人类细胞分离和培养
从脐带分离原代人类EC和SMC、扩增并用作细胞源。如前所述，从脐静脉分离人类EC(人类脐静脉EC)，随后使用与前述类似的方法从静脉分离SMC。
在第2代使用EC进行实验而直到第10代才使用SMC进行实验，已将它们都建立为根据特异EC和SMC标记的保留来保留基本EC/SMC表型。使用补充有10％FBS(GIBCO)，2mM L-谷氨酰胺(BioWhitaker)，生长因子[10μg/ml肝素，(Sigma)，5μg/ml内皮细胞生长添加剂(Sigma)，以及100U/ml青霉素-链霉素(GIBCO)]的培养基199(M 199；BioWhitaker)分别培养并传代细胞类型。
Transwell共培养铺板接种条件。
如图1所示，开始用0.1％明胶在上下表面包覆多孔的Transwell膜(聚碳酸酯，10μm厚度和0.4μm孔径，no.3419，Corning)。颠倒 Transwell，然后以10,000个细胞/cm2的密度在下表面将SMC铺板接种2h。然后将Transwell翻转过来放置在支持皿中并在降低血清的生长培养基(补充有2％FBS，2mM L-谷氨酰胺和100U/ml青霉素-链霉素的M199)中维持48小时。然后在相同培养基条件下以80,000个细胞/cm2的密度在膜的上表面将EC铺板接种持续另外的24小时。对于血液动力学流实验，平行制备两个皿。
共培养血液动力学流装置和流模式。
如图2所示，本方法体外模型中的新型共培养使用从人体循环所模型化的动脉流模式施加至人类EC。椎台和平板装置的形式是直接驱动，从而由马达直接驱动(而非通过正时皮带连接偏移到一侧)椎台。将这一模型修改为整合75-mm直径的Transwell共培养皿(聚碳酸酯，10μm厚度和0.4μm孔径，Corning)。其它修改包括牢固地容纳Transwell皿的基底，装在Transwell隔室内部的较小椎台(71.4mm直径以及1°椎台角)，以及空间安装的支架用于Transwell内外室的流入和流出管道，其提供对于培养物流体环境的直接接触以连续交换EC和SMC层的培养基。通过椎台的转动，该体系向EC/SMC共培养的EC层施加血液动力学剪切应力。
用于本方法的血液动力流模式源自人类颈总动脉(CCA)和颈内动脉窦(ICS)的MRI以分别在体外最佳模拟防止动脉硬化(CCA)和倾向于动脉硬化(ICS)的剪切应力模式。对于每个EC/SMC亚群平行进行该两种血液动力流动条件。图3示出将来自颈总动脉(CCA；防止动脉硬化的，右，310)和颈内动脉窦(ICS；倾向于动脉硬化的，320)的人类血液动力学流谱(左)施加于Transwell的EC表面。
实时RT-PCR.
应用血液动力学流模式24小时后，在具有Ca2+/Mg2+的PBS中漂洗SMC和EC两次。从支持皿移出膜并倒转。用小的柔性细胞刮刀朝皿中心轻轻地刮擦SMC。然后使用1ml PBS将细胞漂洗到灭菌表面上，然后将其于冰上转移到微离心管。翻转该膜并将其在灭菌表面上放平，然后在1ml PBS中刮擦EC并随后于冰上转移至单独的微离心管。离心试管并 除去PBS。使用TRIzol试剂(Invitrogen)提取总RNA并使用iScript cDNA合成试剂盒(Bio-Rad)反转录。使用Beacon Designer 2.0为平滑肌α-肌动蛋白(SMαA)、myocardin、平滑肌肌球蛋白重链(SMMHC)、VCAM-1、单核细胞化学吸引蛋白-1(MCP-1)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、血管生成素受体Tie2、IL-8、以及Kruppel样转录因子(KLF2和KLF4)设计引物。表1示出用于每种人类基因的正义和反义引物。使用AmpliTaq Gold(Applied Biosystems)，SYBR green(Invitrogen)以及iCycler(Bio-Rad)，通过实时RT-PCR来分析mRNA的表达。
表1.为基因和ChIP分析设计的RT-PCR引物
ChIP：染色质免疫沉淀反应，eNOS：内皮型一氧化氮合酶：KLF：Kruppel 样因子，MCP：单核细胞化学吸引蛋白，SMαA：平滑肌α-肌动蛋白，SMMHC：平滑肌肌球蛋白重链；CArG，CC(A/T)xGG
Western印迹分析
按实时PCR所述收集血管SMC和EC并且在RIPA缓冲液(1％Nonidet P-40，脱氧胆酸钠，1mM EDTA，1mM PMSF，1mM Na3VO4，1mM NaF，1μg/ml抑蛋白酶肽，1μg/ml亮抑肽酶和1μg/ml抑胃酶肽)中裂解。在7.5％SDS-PAGE凝胶上分解总蛋白裂解物并印在聚乙烯衍生物膜上。于室温用一抗[SMαA(Sigma，1∶1，000)，eNOS(BD Transduction Laboratories，0.1μg/ml)，VCAM-1(R&D Systems，1∶500)，和PCNA(Cell Signaling，1∶1,000)]孵育该印迹1小时或者于4℃过夜。于室温用辣根过氧化物酶结合的二抗[山羊抗兔，山羊抗鼠(Santa CruzBiotechnology，1∶5,000)，和驴抗山羊(1∶5,000)]孵育该印迹1小时。使用Alphalmager8900和AlphaEaseFC软件分别获取印迹图像和光密度测定分析。
ELISA.
制备共培养的Transwell并将其暴露于不同的血液动力学环境。在4、8、12和24h后，于冰上对该膜的每个室收集整个流实验灌注的培养基(即来自倾向于动脉硬化的和防止动脉硬化的流的EC和SMC条件化的培养基)。然后将样品储存于-80℃直到通过ELISA(GEHealthcare)对它们分析分泌的IL-8蛋白质。使用分光光度计在450nm确定蛋白质浓度并且每小时将收集的培养基体积标准化。
染色质免疫沉淀检测。
应用流模式后，按带有修改的前述方法进行染色质免疫沉淀反应(ChIP)，该修改为允许定量分析蛋白质：DNA相互作用(30)。向来自每个实验的流出培养基补充1％甲醛然后在流动24h后立即孵育细胞10min。抗体包括兔多克隆抗血清应答因子(SRF；Santa CruzBiotechnology，5μg/mD和抗-组蛋白H4乙酰化(Upstate Biotechnologies，5μg/ml)。用picogreen试剂(Molecular Probes)根据制造商的推荐通过荧光量化回收的DNA。以1ng来自用如前所述有微小修改的ChIP实验的基因组DNA进 行实时PCR。设计实时PCR引物在SMαA，SMMHC，c-fos CArG的5’-CC(a/T)6GG(CArG)元件的侧翼。表1示出用于ChIP分析的引物。通过下面等式来确定蛋白质：DNA相互作用/富集的量，2(CtRef-CtIP)-2(CtRef -Ct无抗体对照)，其中Ct Ref是参照阈值循环(Ct)而CtIP是免疫沉淀的Ct。ChIP数据代表5至6个收集在一起且重复分析的独立实验。
免疫荧光
对于免疫荧光检测法(IF)，对于对开正面(en face)制备物和横切片，将Transwell膜在4％多聚甲醛中固定。在0.2％Triton X-100中透化对开正面制备物。将SMC的一抗加样到一张封口膜[Cy3-SMαA(Sigma，4μg/ml)和SMMHC(Biomedical Technologies，1∶100)]，并且将样品皿放在上部。然后将EC的一抗[血管内皮钙粘附蛋白(VE-cad；SantaCruz Biotechnology，2μg/ml)]直接加入皿内，并且同时孵育两种抗体1小时。类似地，将二抗[Cy2驴抗山羊(Jackson ImmunoResearch，4μg/ml)和Alexa fluor546山羊抗兔(Molecular Probes，6μg/ml)]按需要加入样品并孵育1h。通过加入具有4′，6-二咪基-2-苯基吲哚(DAPI；Molecular Probes)的Prolong Gold Antifade Reagent至大的盖玻片并将该皿放到上部而固定样品。将另一滴DAPI加入到该皿内部，并且将22-mm直径的盖玻片放到上面并允许固化。使用手术刀从固定的样品除去支持皿以允许成像。使用共聚焦显微镜通过从EC至SMC层的z轴使对开正面样品成像(Nikon Eclipse Microscope TE2000-E2和Melles Griot Argon Ion Laser System no.35-IMA-840)。
为了制备横切片，使用上述方法学，用鬼笔环肽-488(Molecular Probes)或FM 4-64FX(Molecular Probes)染色EC/SMC培养物，在30％蔗糖中过夜浸没，在OCT化合物中冷冻，用恒低温箱切成5μm厚的切片，然后固定用于通过共聚焦显微镜来评估。如前所述，在静止条件下使用共聚焦显微镜和微分干涉相差显微镜分析IF染色的样品的Transwell膜孔内细胞与细胞的相互作用。
EC/SMC定向和形态测量
使用IF染色的样品的共聚焦显微镜量化了EC和SMC相对于流方向的定向。血液动力学流动后，按上述固定共培养物，切下来自75-mm直径皿的等腰三角形样品，其具有朝向皿中心的顶点。这一方法建立了相对于流动方向的正确定向。然后按上述将样品染色并固定在两盖玻片之间。对于成像，用面向右侧的三角顶点将样品定向在共聚焦台上，以致穿过所有样品的流方向一致。在相同位置取EC和SMC的图像，只由膜距离而分离。
对三个独立实验至少获取三个显微镜场。使用MetaMorph软件来确定所分析的每种细胞相对于流方向的定向角和形状系数(SF)。为了确定细胞类型的伸长，概述对VE-cad(图6)和EC(CCA：n＝111和ICS：n＝53)的β-联蛋白(未示出)和SMαA(Fig.6)，SMMHC，以及SMC(CCA：n＝64和ICS：n＝25)的β-联蛋白(未示出)染色的边界，并且输出面积和周长的测量值。使用下面等式SF＝(4πA)/p2计算SF，其中A是细胞面积而P是周长。对于直方图范围内的每个SF空间(bin)，将每个空间的细胞数标准化成所分析的细胞在整个范围的总数，以产生标准化的频率。绘制直方图以显示SF对于每种条件的分布(参见图7)。对于定向角度，在流方向以及沿着来自两种流模式的SMC的长轴(CCA：n＝119和ICS：n＝104)和只是沿着防止动脉硬化的流的EC(CCA：n＝124)的长轴画线。测量两线之间的角度作为相对于流方向的定向角，并且绘制直方图以便具有相同定向的细胞频率表示为条长。
数据分析和统计
将实时RT-PCR结果报告为倾向于动脉硬化的流样品相对于防止动脉硬化的流的循环扩增时间的成倍诱导并且根据内源表达的基因β2-微球蛋白进行标准化。对mRNA、定向、以及伸长数据进行Student′st-检验以确定表达水平或形态改变作为血液动力学流模式和时间的函数的显著性。使用每个条件下来自至少三个独立实验的数据在P＜0.05来分析和评估。
示例性结果
EC/SMC共培养物铺板接种和生长条件的优化。
优化用于人类EC和SMC铺板接种的共培养条件以便每种细胞类型在应用血液动力学流之前达到汇合。图4示出EC接种后24小时EC和SMC汇合层。更具体地，图4示出共培养24小时时显示出汇合状态的EC(左)和SMC(右)(上部，对开正面图像；下部，横切片))。EC保持它们的经典多边形形态，形成贴壁结合，如由VE-cad的连续外周染色所阐述，而SMC伸长并且随机定向成典型的“山谷”结构。在SMC单独铺板接种中，降低血清的培养基(2％FBS，相比于10％FBS)增加SMC标记SMαA和myocardin的mRNA表达，表明更加差异化的SMC表型(具有2％FBS的标准化基因表达：SMA，2.51±0.36和myocardin，2.07±0.05；具有10％FBS的标准化基因表达：SMA，0.69±0.23和myocardin，0.54±0.14，参见图10)。
鼠共培养模型近来证明了EC和SMC通过穿过Transwell膜的线性孔的间隙连接物理地相互作用和通讯。这一模型仿效体内血管壁内存在的肌内皮(myoendothelial)连接，产生通过间隙连接用于离子通讯的工具和物理异源细胞的贴壁。为了确定在我们的人类共培养模型中是否形成EC/SMC物理相互作用，对Transwell膜的横切片进行F-肌动蛋白或FM4-64FX的IF标记并使用共聚焦和相差显微镜分析。图5示出的结果证明孔中存在细胞突起，建立了异源细胞的相互作用。将横切片进行F-肌动蛋白(上部)和FM 4-64(中部)染色或者通过微分干涉相差显微镜(底部)来可视化并在膜孔510、520、530内显示了细胞突起。所示代表了来自三个独立实验的图像。对开正面图像上的条等于50μm；横切片上的条等于10μm。
EC/SMC形态学重建在倾向于动脉硬化的流中改变
体内EC和SMC的形态学是高度有序的，EC随血液动力学流动方向伸长和对齐，而SMC垂直于动脉的长轴以及血流方向定向。然而，在复杂流动的区域内(例如动脉交叉处)，内皮为更多边的多边形且较不对齐，并且SMC不总与流动垂直对准。为了确定内皮上血液动力学流是否诱导EC和SMC形态学改变，对两种细胞类型确定下面的SF测量：1)伸长改变和2)相对于流方向的定向角测量。如图6-8所示，相比于防止动脉硬化的流，在应用倾向于动脉硬化的流以后，在细胞形状(SF)和细胞定向中都观察到显著不同。SF表示细胞伸长的程度，将数值1指定为圆形(即未伸长)而将数值接近0指定为伸长的细胞。图6示出了代表性的IF图像。如前所建立，暴露于倾向于动脉硬化的流的EC保持更多边的多边形形状(SF＝0.75±0.002)，而防止动脉硬化的条件下的EC为更多伸长的(SF＝0.64±0.015)。流之后通过免疫荧光检测法确定EC/SMC形态学和定向。对EC染色血管内皮钙粘附蛋白(VE-钙粘附蛋白)，而对SMC染色平滑肌α-肌动蛋白(SMαA)。图6的箭头表示净流的方向而条等于50μm。
图7示出对于所分析的细胞数标准化的EC SF的分布。当暴露于防止动脉硬化的流动时，EC的对齐与流动方向一致(相对于流的角度＝8.6±4.01°；图8)，而在倾向于动脉硬化的流下，由于圆形的形态而不能测量到EC优选的极性。
暴露于倾向于动脉硬化的流的Transwell上的SMC(SF＝0.26±0.009)相比于暴露于防止动脉硬化的流的那些(SF＝0.31±0.018；图6和7)在伸长上显示了重要的但很小的增加。引起兴趣的是，防止动脉硬化的流中的SMC一贯性地更加朝向相对于流动方向的垂直方向而对齐(图8和9)，而相反，在倾向于动脉硬化的条件下的SMC展示了更加随意、更少协调的定向(分别是-47.9±1.3°对-13.1±5.0°，P＜0.0001)。图6示出了相对于流的SMC定向的代表性图像，而图9示出了SMC定向的直方图分布。
血液动力学流动后自EC/SMC分离的RNA和蛋白质的纯度
通过实时RT-PCR和Western印迹分析对在流实验后从每种细胞层收集的RNA和蛋白质的纯度评估EC-和SMC-特异蛋白质(分别是(eNOS和SMαA，图11和图12)的存在。在mRNA和蛋白质水平没有检测到交叉污染。
图11显示了防止动脉硬化的流后24小时对EC和SMC群的实时RT-PCR。分离了每种细胞类型后，两种细胞类型表达各自的SMC和EC标记[分别地，SMαA和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)]。SMC比EC明显表达更多量的SMαA，而在CCA流动后，eNOS的EC表达显著大于SMC中的，表明用于分析差异基因调控的细胞群体是纯的。数值是平均值±SE；n＝3；＊P＞0.05。
图12显示了蛋白质分析确认了只有SMC表达SMαA而只有EC表达eNOS。IB，免疫印迹分析。
倾向于动脉硬化的流差异地调控EC和SMC表型并促进促炎性引发。
主要目的是确定应用于EC的不同人源化的血液动力流模式是否 影响SMC表型调节。考虑到这一目的，在应用倾向于动脉硬化或防止动脉硬化的流24小时后，检查了表示EC和SMC表型调节的已经建立的标记的改变。将目的基因分类为EC-或SMC-特异的细胞标记(EC：eNOS，Tie2和KLF2/KLF4；SMC：SMαA，SMMHC和myocardin)或炎性标记(VCAM-1，IL-8和MCP-I)。此外，在标记子集(eNOS，SMαA，VCAM-1和PCNA)中进行蛋白质分析。通过相比于防止动脉硬化的流在倾向于动脉硬化中的相对改变来确定基因和蛋白质调节。
一贯地，观察到EC静止标记eNOS、Tie2、KLF2和KLF4的mRNA水平的显著降低以应答倾向于动脉硬化的流(图13)，这也被eNOS蛋白质水平的改变所确认(图15)。以前通过涉及动脉粥样硬化的剪切应力刺激阐述了这些EC标记的调节；然而，在SMC存在下，从没发生针对血液动力学流模式的这种复杂EC表型检测。
以前从没有分析过经典的SMC分化标记在暴露于任何剪切应力刺激的共培养模型中的基因调节。与动脉粥样硬化相关的SMC表型调节的标志包括限定静止的收缩表型的基因(例如SMαA，SMMHC和myocardin)的减少，与合成的表型相关的基因(例如KLF4和VCAM-1)的增加，以及增殖和迁移事件的开始。在存在倾向于动脉硬化的流下，SMC显示出SMC分化标记SMαA和myocardin的显著降低(图13)。蛋白质分析进一步确认了对于SMαA的这一观察(图15)。尽管近来被发现对于遏制myocardin依赖型转录很重要的转录因子KLF4相比于防止动脉硬化的流，对于倾向于动脉硬化的流并未被显著地诱导(P＝0.10)，这一趋势可能仍旧指明了调控SMC表型转换的机制。由于血管损伤仅仅在4h后就最大程度地诱导KLF4，可能在流动24h后，错过了KLF4的最大应答。显然，SMMHC并未明显受到调节(P＝0.62)。
引起最大兴趣的是EC静止标记和SMC收缩标记的减少与若干促炎性基因的上调相符合。在EC和SMC中，VCAM-1在mRNA和蛋白质水平都显著上调(图14和15)。在EC中也观察到mRNA水平上IL-8的显著增加，NF-κB活化的下游促炎性基因。进一步测量来自EC和SMC 层的IL-8的分泌作为应用两种流模式期间的时间函数并且只在倾向于动脉硬化的流的较后时间点期间在EC中显著增强IL-8分泌(图16)。相反，在SMC中同时观察到IL-8和MCP-1的减少(图14)。最后，增殖标记PCNA的分析显示了在暴露于倾向于动脉硬化的流的EC中增加的蛋白质水平，但对于SMC，则没有变化(图15)。
为了控制流动诱导的EC对SMC应答的影响，在两种条件下以单一培养方式将SMC铺板接种：如图17所示，1)在Transwell膜(SMC D)存在下，在Transwell支持皿底部或者2)在Transwell膜底部(SMC T)。对于每种条件，将流施加于没有EC的Transwell膜上部。对样品的实时RT-PCR分析显示了在每种条件中对于SMαA和VCAM-1都存在显著差异而对于myocardin则没有(图17)。VCAM-1是在两种条件下唯一被倾向于动脉硬化的流所明显诱导的基因。针对SMC T条件诱导的潜在混杂因子为通过多孔膜伸出到施加了流的Transwell上部的平滑肌细胞突起(图18)，这在EC存在下的实验中没有发现。每种条件(SMC D对SMC T)之间的显著变化表明SMC对于它们的局部环境的敏感性。因此，对于这一研究，在存在两种细胞类型下施加的两种不同流模式的比较是最稳健的方法以控制血液动力学共培养环境的所有特征(例如培养基交换、实验建立、培养时间以及异源细胞存在)。
SMC基因表达的动脉血液动力学控制后生调控
多数编码SMC选择性收缩蛋白质的基因的启动子区域含有结合SRF的CArG顺式调控元件，包括SMαA和SMMHC。进行ChIP实验来确定血液动力学流动是否在后生水平调控SMαA、SMMHC和c-fos启动子的5′-CArG启动子区域的SRF结合和组蛋白H4乙酰化。结果表明对于SMαA和SMMHC，相对于防止动脉硬化的流动而言，组蛋白H4乙酰化和SRF结合降低以应答倾向于动脉硬化的流(图19)。相反地，在流条件之间，对于c-fos CArG区域的组蛋白H4乙酰化和SRF结合没有统计学上的不同(图19)。这一后生指纹与在SMC中应答PDGF-BB的体外实验和应答急性血管损伤的体内实验相同。
药物
药物可选自下组，该组包括放线菌素D、巴马司他(batimastat)、c-myc反义物、地塞米松(dexamethasone)、紫杉醇、紫杉烷、西罗莫司(sirolimus)、他克莫司(tacrolimus)和依维莫司(everolimus)、未分级的肝素(unfractionated heparin)、低分子量肝素、依诺肝素(enoxaprin)、比伐卢定(bivalirudin)、酪氨酸激酶抑制剂、格列卫(Gleevec)、渥曼青霉素(wortmannin)、PDGF抑制剂、AG 1295、rho激酶抑制剂、Y27632、钙通道阻断剂、氨氯地平(amlodipine)、硝苯地平(nifedipine)、以及ACE抑制剂、合成的多糖、噻氯匹定(ticlopinin)、双嘧达莫(dipyridamole)、氯吡格雷(clopidogrel)、磺达肝素(fondaparinux)、链激酶、尿激酶、r-尿激酶、r-尿激酶原、rt-PA、APSAC、TNK-rt-PA、瑞替普酶(reteplase)、阿替普酶(alteplase)、孟替普酶(monteplase)、兰替普酶(lanoplase)、帕米普酶(pamiteplase)、葡萄球菌激酶、阿昔单抗(abciximab)、替罗非班(tirofiban)、奥波非班(orbofiban)、珍米洛非班(xemilofiban)、西拉非班(sibrafiban)、罗西非班(roxifiban)、抗再狭窄剂、抗血栓形成剂、抗生素、抗血小板剂、抗凝血剂、抗炎剂、抗瘤剂、抗高血压剂、螯合剂、青霉胺、三乙烯羟化四甲胺、EDTA、DMSA(二巯丁二酸)、去铁胺甲磺酸酯、降胆固醇剂、斯达汀(statin)、升高的HDL试剂、环加氧酶(cyclyoxygenase)抑制剂、西乐葆(Celebrex)、万络(Vioxx)、放射性造影剂、放射性同位素、前药、抗体片段、抗体、活细胞、治疗性药物递送微球或微珠，以及其任何组合。
对于本领域技术人员将容易地产生其它优点和改变。因此，本发明在其较宽的方面并不限于此处示出并描述的具体细节和代表性实施方案。因此，可进行多种改变而不背离如所附权利要求及其等效物限定的总体发明理念的精神或范围。

Claims (32)

1.在细胞培养期间模拟血液动力学流的方法，所述方法包括步骤：
向petri皿中加入培养基；
将第一种类型的细胞在多孔膜的第一面铺板接种；
将第二种类型的细胞在多孔膜的第二面铺板接种，其中所述petri皿包含含有第一种类型的细胞的外室和含有第二种类型的细胞的内室；
将培养基灌注进和灌注出内室；
将培养基灌注进和灌注出外室；
向被铺板的第二种类型的细胞施加剪切应力，所述剪切应力由血液动力学流装置的旋转椎台引起的培养基的流产生，所述流模拟了血液动力学流；
其中所述方法不包括任何疾病或健康状况的诊断。
2.权利要求1的方法，其中加入petri皿的培养基包括药物或化合物；其中灌注进和灌注出内室的培养基包括药物或化合物；或其中灌注进和灌注出外室的培养基包括药物或化合物。
3.在细胞培养期间模拟血液动力学流的方法，所述方法包括：
将血液动力学模式模型化成一组电指令；
向petri皿加入培养基；
将第一种类型的细胞在多孔膜的第一面铺板接种；
将第二种类型的细胞在多孔膜的第二面铺板接种，其中所述petri皿包含含有第一种类型的细胞的外室和含有第二种类型的细胞的内室；
将培养基灌注进和灌注出内室；
将培养基灌注进和灌注出外室；
基于该组电指令，使用装置向浸在培养基中的被铺板的第二种类型的细胞施加剪切应力，所述剪切应力由培养基的血液动力学流产生，其中所述血液动力学流由血液动力学流装置的旋转椎台引起；
其中所述方法不包括任何疾病或健康状况的诊断。
4.权利要求1-3中任一项的方法，还包括培养所有类型的细胞的步骤。
5.权利要求1-3中任一项的方法，其中第一种类型的细胞是平滑肌细胞、神经胶质细胞、星形细胞、神经元、上皮足细胞并且第二种类型的细胞是内皮细胞。
6.权利要求1-3中任一项的方法，其中第一种类型的细胞和第二种类型的细胞的至少一种是来自一个或者多个患者之血管的细胞或器官的细胞，所述患者具有与药物毒性相联系的经鉴定的基因型。
7.权利要求6的方法，其中所述的一个或者多个患者具有与药物毒性相联系的单核苷酸多态性。
8.权利要求1-3中任一项的方法，其中血液动力学流源自之前测量的血液动力学模式。
9.权利要求8的方法，其中所述的之前测量的血液动力学模式是人来源的。
10.权利要求8的方法，其中血液动力学模式来自动脉、静脉或者器官。
11.权利要求8的方法，其中所述模式源自具有病理状态的患者。
12.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述血液动力学流是依时间变化的。
13.权利要求1的方法还包括：
将血液动力学模式模型化成一组电指令；
基于该组电指令，向被铺板的第二种类型的细胞施加剪切应力。
14.权利要求3或者13的方法，其中所述血液动力学模式来自超声数据的分析。
15.权利要求3或者13的方法，其中所述血液动力学模式来自磁共振成像(MRI)数据的分析。
16.权利要求3或者13的方法，其中所述血液动力学模式是依时间变化的。
17.权利要求3或者13的方法，其中该组电指令被血液动力学流装置的电控制器接受，电控制器操作装置的马达，以及马达使得与所述马达相连的椎台转动，其中所述椎台的转动导致培养基的所述流。
18.权利要求2的方法，其中当施加所述剪切应力时或者在施加剪切应力之前将药物或者化合物加入培养基中。
19.权利要求2的方法，其中药物或化合物选自PDGF抑制剂、rho激酶抑制剂、合成的多糖、抗再狭窄剂、抗血栓形成剂、抗生素、抗凝血剂、抗炎剂、抗瘤剂、抗高血压剂、螯合剂、降胆固醇剂、升高HDL的试剂、放射性造影剂、放射性同位素、前药、抗体片段、抗体、活细胞、治疗性药物递送微球或微珠，以及其任何组合。
20.权利要求19的方法，其中：
所述PDGF抑制剂是AG1295；
所述rho激酶抑制剂是Y27632；
所述抗生素是放线菌素D；
所述抗血栓形成剂是r-尿激酶、r-尿激酶原、比伐卢定、瑞替普酶、阿替普酶、孟替普酶、葡萄球菌激酶、链激酶、兰替普酶、rt-PA、APSAC、TNK-rt-PA、帕米普酶、未分级的肝素或抗血小板剂；
所述抗凝血剂是低分子量肝素、链激酶、r-尿激酶、r-尿激酶原、三乙烯四胺二盐酸盐、EDTA、DMSA、去铁胺甲磺酸酯或抗血小板剂；
所述抗炎剂是环加氧酶抑制剂、青霉胺、或地塞米松；
所述抗瘤剂是c-myc反义物、渥曼青霉素、西罗莫司、他克莫司、依维莫司、放线菌素D、巴马司他、紫杉烷、或酪氨酸激酶抑制剂；
所述抗高血压剂是ACE抑制剂、钙通道阻断剂、或Y27632；
所述螯合剂是三乙烯四胺二盐酸盐、EDTA、DMSA或去铁胺甲磺酸酯；
所述降胆固醇剂是斯达汀；或
所述抗体是阿昔单抗。
21.权利要求20的方法，其中：
所述环加氧酶抑制剂是西乐葆(塞来昔布)或万络(罗非昔布)；
所述斯达汀是立普妥(阿托伐他汀钙)；
所述抗瘤剂是紫杉醇；
所述酪氨酸激酶抑制剂是格列卫(甲磺酸伊马替尼)；
所述钙通道阻断剂是氨氯地平或硝苯地平；
所述低分子量肝素是依诺肝素；或
所述抗血小板剂是噻氯匹定、双嘧达莫、氯吡格雷、磺达肝素、尿激酶、阿昔单抗、替罗非班、奥波非班、珍米洛非班、西拉非班、罗西非班。
22.权利要求2的方法，其中化合物能抑制、激活或者改变在所述类型的细胞中的蛋白质或者基因的功能。
23.权利要求2的方法，其中该方法还包括将药物或者化合物灌注到至少内室和外室之一。
24.权利要求1-3任一项的方法，其中还包括或者将第三种类型的细胞铺板在petri皿的表面，或者将第三种类型的细胞悬浮在内室培养基中。
25.权利要求24的方法，还包括培养所有类型的细胞的步骤。
26.权利要求24的方法，还包括在施加一段时间剪切应力之后分析第一种类型的细胞、第二种类型的细胞或者第三种类型的细胞至少一种的步骤。
27.权利要求24的方法，其中第一种类型的细胞是平滑肌细胞、神经胶质细胞、星形细胞、神经元或上皮足细胞并且第二种类型的细胞是内皮细胞。
28.权利要求1-3任一项的方法，还包括将单核细胞、巨噬细胞、神经胶质细胞、星形细胞、神经元、内皮细胞或平滑肌细胞铺板在petri皿的表面上；将巨噬细胞或白细胞悬浮在内室中；或将巨噬细胞或白细胞悬浮在外室中。
29.权利要求1-3任一项的方法，还包括在施加剪切应力一段时间后分析至少一种类型的细胞的步骤。
30.权利要求1-3任一项的方法，还包括分析所述培养基的细胞因子或者体液因子分泌。
31.权利要求2的方法，其中分析所述第一种类型的细胞和第二种类型的细胞的至少一种细胞由药物或者化合物导致的毒性、炎症、通透性、相容性、细胞粘附或者表型调节。
32.权利要求1-3任一项的方法，其中通过模拟血液动力学流的装置在细胞培养期间施加剪切应力，所述装置包含：
用于接收一组电指令的电控制器；
通过电控制器操作的马达；
与马达有效相连的椎台，从而通过马达驱动该椎台，其中该装置还包括Petri皿的部分中的流入和流出管道，所述流入和流出管道确定了内室和外室。
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