CN101525381A - 一种新型重组复合干扰素及其高效表达载体的构建 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型重组复合干扰素的基因，并提供了该基因的高效表达载体，其保藏号为：CGMCC No.2379。相对于已有的复合干扰素，这种通过定点突变筛选得到的新型重组复合干扰素在理化性质上有明显差异、活性提高10倍，具有更高的抗病毒、抗感染能力。所用的高效表达载体相对已经发表的发明大大提高了目标蛋白的表达量。本发明还公开了上述重组复合干扰素的制备方法。

Description

一种新型重组复合干扰素及其高效表达载体的构建

技术领域

本发明涉及重组复合干扰素的序列改造和高效表达载体的构建。

背景技术

干扰素是一类具有广谱抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等生物活性的细胞素的总称，被广泛应用于临床治疗肝炎，炎症与癌症。哺乳动物的干扰素有α、β、γ三种型别，其中的α-干扰素又分为多种亚型。

八十年代初，科学家们比较了当时已查明的13中α-干扰素的氨基酸序列及其功能之后，发现它们具有很多相同之处，说明它们的相似的生物活性与功能；同时它们又具有各自特异之处，这就决定了它们各自的作用专一性。综合这些相同与相异之处，美国安进公司(Amgen)设计出一种综合各种天然干扰素的优点的全人工干扰素——复合干扰素(Consensus interferon)。复合干扰素具有天然干扰素无法匹配的优点：A.复合干扰素集中了各种天然干扰素的优点，故而具有更强、更广谱的抗病毒作用。例如，在治疗丙型肝炎方面，干扰素α-2b的有效率略大于50％，但其中近三分之二的病人停药后病情复发，因而其净治愈率只有15-20％。与其呈鲜明对照的是，复合干扰素的治愈率高达40％。B.对天然干扰素α-2b无法治疗的病人，复合干扰素的治愈率达17％左右；而对干扰素α-2b治疗后复发的病人，复合干扰素的治愈率高达50％。

安进公司开发的复合干扰素于1997年获美国FDA批准上市，商品名Infergen，临床上用于治疗对干扰素α-2b治疗无效的丙型肝炎。

中国四川省生物工程研究中心于2001年申请了“重组高效复合干扰素用作乙型肝炎表面抗原和e抗原抑制剂”的国际专利保护(公开号WO 02/80958A1)。

从已发表的复合干扰素的专利文件中，我们注意到，复合干扰素的表达量并不理想，每升发酵液中只有100毫克的复合干扰素蛋白，以包涵体的形式存在，经变性、复性、纯化后才能得到纯度较高的目的蛋白，其总纯化效率很低。

发明内容

本发明的目的是建立一种低成本高量表达高活性复合干扰素的表达方法。通过定点突变和功能筛选，以得到活性比已有复合干扰素更高的新型重组复合干扰素。

本发明的另一个目的是提供一种用于本发明的方法的表达载体。

为实现上述发明目的，本发明提供了一个表达复合干扰素的载体。含有该表达载体的大肠杆菌宿主细胞大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21-CI已于2008年2月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏中心地址：北京市朝阳区大屯路甲3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101。保藏号：CGMCC No.2379。

本发明还提供了利用上述表达载体在大肠杆菌中表达复合干扰素的方法。该方法包括用本发明的表达载体转化宿主细胞，和培养转化的宿主细胞的步骤。

利用本发明的上述技术方案，复合干扰素的表达量达到500毫克/升。

附图说明

图1是新型重组复合干扰素、复合干扰素和干扰素α-2b对比的SDS-PAGE电泳检测图谱。各泳道分别为：1-Amgen公司复合干扰素；2-干扰素α-2b；3-新型重组复合干扰素；4-标准分子量蛋白。

图2是筛选得到的新型重组复合干扰素与Amgen公司复合干扰素的活性比较图。其中Con-IFN为新型重组复合干扰素、control为Amgen公司复合干扰素。

图3是分离新型重组复合干扰素的离子交换层析图谱，目标蛋白用箭头标出。

图4是分离新型重组复合干扰素的凝胶过滤层析图谱，目标蛋白用箭头标出。

图5是新型重组复合干扰素制备过程的SDS-PAGE电泳检测图。各泳道分别为：1-未诱导表达的对照；2-50μl发酵诱导表达液；3-包涵体洗涤液1；4-包涵体洗涤液2；5-洗涤后包涵体复性液；6-标准分子量蛋白质；7-离子交换层析后，含还原剂；8-离子交换层析前透析步骤的沉淀；9-凝胶过滤精制后，不含还原剂。

实施例

下面通过优选实验对本发明做更详细的描述。

实施例一、新型复合干扰素表达载体构建

根据文献报道的Amgen公司的复合干扰素的氨基酸序列，选择大肠杆菌偏爱的密码子，并考虑克隆、鉴定的方便性，设计了编码复合干扰素的DNA序列如下：

ATG TGT GAT TTA CCT CAA ACT CAT TCT CTT GGT AAC CGT CGC GCT CTG ATTCTG CTG GCA CAG ATG CGT CGT ATT TCC CCG TTT AGC TGC CTG AAA GAC CGTCAC GAC TTC GGC TTT CCG CAA GAA GAA TTC GAT GGC AAC CAA TTC CAG AAAGCT CAG GCA ATC TCT GTA CTG CAC GAA ATG ATC CAA CAG ACC TTC AAC CTGTTT TCC ACT AAA GAC AGC TCT GCT GCT TGG GAC GAA AGC TTG CTG GAG AAGTTC TAC ACC GAG CTG TAT CAG CAG CTG AAC GAC CTG GAA GCA TGC GTA ATCCAG GAA GTT GGT GTA GAA GAG ACT CCG CTG ATG AAC GTC GAC TCT ATT CTGGCA GTT AAA AAG TAC TTC CAG CGT ATC ACT CTG TAC CTG ACC GAA AAG AAATAT TCT CCG TGC GCT TGG GAA GTA GTT CGC GCT GAA ATT ATG CGT TCT TTC TCTCTG AGC ACT AAC CTG CAG GAG CGT CTG CGC CGT AAA GAA TAA TAG

根据上述设计的DNA序列，分别合成两组寡聚核苷酸片段，每组12个，长度在40个碱基左右。每组中的12个片段依次重叠，两组分别室温退火，利用T4DNA连接酶使形成两条双连DNA。此两段DNA末端含有HindIII粘性末端，经电泳纯化后，等比例混合，利用连接酶使之形成一条完整的双链DNA。利用上游引物ATATAGCTTAAG

ATGTGTGATTTACCTCAA和下游引物ATATAGTCTAGACTATTATTCTTTACGGC，用PCR方法扩增上述DNA片段，在5′端引入AflII酶切位点(CTTAAG)和核糖体结合位点序列(引物中斜体表示部分)；在3′端引入Xba I酶切位点(TCTAGA)。PCR产物经AflII和Xba I双酶切后，克隆到自建的表达载体pTac中，命名为pTac-CI。经过定点突变和活性筛选，得到高活性的新型重组复合干扰素，序列为SEQ1，突变分别是已有复合干扰素序列中115位Val→Glu和122位Lys→Arg。

实施例二、在大肠杆菌中表达复合干扰素

表达载体pTac-CI转化于大肠杆菌BL-21，并把转化的大肠杆菌在2003年7月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏中心地址：北京市朝阳区大屯路甲3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101。保藏号：CGMCC No.2379。从划线培养的菌板挑取单菌落，接种于100毫升含有100微克/毫升氨苄青霉素的液体LB培养基，37℃培养，发酵罐转速300rpm，氧饱和度20％-60％，pH7.0-7.4。培养至OD6002.0时，加诱导物IPTG终浓度1mM，继续培养4-6小时，离心收集菌体，称菌体湿重1200克，15％SDS-PAGE电泳检测表明目标蛋白在包涵体中，占总蛋白的25％。菌体裂解后，测定蛋白含量为每克菌体含100毫克总蛋白。据此计算，60升发酵液得到总蛋白120克，其中30克为复合干扰素，相当于每升发酵液得到500毫克复合干扰素。

实施例三、复合干扰素的复性与纯化

菌体裂解后，离心收集包涵体。充分洗涤包涵体，至目标蛋白纯度达，75％，将包涵体溶解于溶液A(25mM Tris-HCl，2mM巯基乙醇，1mM EDTA-Na，pH8.3)稀释至蛋白浓度为2毫克/毫升，在以溶液B(20mM HAC-NaAC缓冲液，pH4.5)缓慢稀释三倍，然后4℃搅拌，均匀缓慢滴加溶液B，12小时透析至盐酸胍浓度为0.2M。此后以五倍体积溶液A透析，每次4小时，共4次。离心、过滤去除不溶物。SDS-PAGE电泳判断目标蛋白纯度大于80％，复性率为80％。

蛋白纯化：将复性蛋白透析至溶液B，利用杂质、错配复性中间体和目标蛋白之间的稳定性差异，去除大部分杂质和错配复性中间体。CM Fast Flow(购自Pharmacia)离子交换层析，以10倍柱体积的溶液B平衡后，加载不大于20倍柱体积的复性样品，随后以5倍柱体积溶液B加50mM NaCl洗柱，最后以5倍柱体积缓冲液B加50mM-250mM NaCl连续梯度洗脱。离子交换目标蛋白得率约为80％，纯度为90％。

凝胶过滤：预装Sephacryl-100(26/60，Pharmacia)，以PBS平衡2个柱体积，上样1-2毫升(含蛋白10-20毫克)，以PBS洗脱。凝胶过滤后，目标蛋白得率60-80％。15％SDS-PAGE电泳检测未见杂带，样品中加入还原剂与否未见纯度发生变化，表明经纯化的复合干扰素为单体分子，而非通过二硫键连接的双体或多体。

实施例四、新型复合干扰素、Amgen复合干扰素和干扰素α-2b的电泳对比

15％SDS-PAGE检测纯化得到的本发明提出的新型复合干扰素、Amgen公司复合干扰素和干扰素α-2b。结果显示，新型复合干扰素的电泳迁移率明显低于Amgen公司的复合干扰素，也低于国内市场上主要的干扰素α-2b。说明相对于Amgen公司的已公开的复合干扰素，本发明提出的新型复合干扰素在理化性质上有明显的差异。同样，新型复合干扰素也不同于干扰素α-2b。

实施例五、新型重组复合干扰素的活性检测

分别将Amgen公司复合干扰素和新型复合干扰素稀释到5个浓度梯度，分别是10^-5μg/ml，10^-4μg/ml，10^-3μg/ml，10^-2μg/ml和10^-1μg/ml。检测新型复合干扰素(Con-IFN)和Amgen公司复合干扰素(Control)的浓度与细胞相对感染强度的关系。根据曲线计算，新型复合干扰素的活性是已有复合干扰素的10倍，具有更高的抗病毒、抗感染能力。

序列表

1.新型重组复合干扰素(SEQ1)

Total amino acid number：167，MW＝19582

Max ORF starts at AA pos 1(may be DNA pos 1)for 167AA(501bases)，MW＝19582

1     ATGTGTGATTTACCTCAAACTCATTCTCTTGGTAACCGTCGCGCTCTGATTCTGCTGGCA

1     METCysAspLeuProGlnThrHisSerLeuGlyAsnArgArgAlaLeuIleLeuLeuAla

61    CAGATGCGTCGTATTTCCCCGTTTAGCTGCCTGAAAGACCGTCACGACTTCGGCTTTCCG

21    GlnMETArgArgIleSerProPheSerCysLeuLysAspArgHisAspPheGlyPhePro

121   CAAGAAGAATTCGATGGCAACCAATTCCAGAAAGCTCAGGCAATCTCTGTACTGCACGAA

41    GlnGluGluPheAspGlyAsnGlnPheGlnLysAlaGlnAlaIleSerValLeuHisGlu

181   ATGATCCAACAGACCTTCAACCTGTTTTCCACTAAAGACAGCTCTGCTGCTTGGGACGAA

61    METIleGlnGlnThrPheAsnLeuPheSerThrLysAspSerSerAlaAlaTrpAspGlu

241   AGCTTGCTGGAGAAGTTCTACACCGAGCTGTATCAGCAGCTGAACGACCTGGAAGCATGC

81    SerLeuLeuGluLysPheTyrThrGluLeuTyrGlnGlnLeuAsnAspLeuGluAlaCys

301   GTAATCCAGGAAGTTGGTGTAGAAGAGACTCCGCTGATGAAC

GACTCTATTCTGGCA

101   ValIleGlnGluValGlyValGluGluThrProLeuMETAsn

AspSerIleLeuAla

361   GTT

AAGTACTTCCAGCGTATCACTCTGTACCTGACCGAAAAGAAATATTCTCCGTGC

121   Val

LysTyrPheGlnArgIleThrLeuTyrLeuThrGluLysLysTyrSerProCys

421    GCTTGGGAAGTAGTTCGCGCTGAAATTATGCGTTCTTTCTCTCTGAGCACTAACCTGCAG

141    AlaTrpGluValValArgAlaGluIleMETArgSerPheSerLeuSerThrAsnLeuGln

481    GAGCGTCTGCGCCGTAAAGAATAATAG

161    GluArgLeuArgArgLysGlu^{＊＊＊＊＊＊}

Claims (6)

1.一种新型重组复合干扰素，其特征是具有SEQ1序列。

2.一种用于表达权利要求1的复合干扰素的重组载体。

3.用权力要求2的重组载体转化的宿主细胞。

4.根据权力要求3的宿主细胞，是原核细胞。

5.根据权力要求4的宿主细胞，是大肠杆菌细胞。

6.一种生产复合干扰素的方法，该方法包括使用权力要求2所述的载体的步骤。

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