CN101679502A - 一种新型复合干扰素及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及复合干扰素蛋白的变体及其应用，该复合干扰素蛋白的变体相对于已有复合干扰素，在理化性质上有明显改善，提高抗病毒、抗感染能力。而且该变体在变性处理后更易于复性。本发明还涉及复合干扰素变体的制备方法。

Description

一种新型复合干扰素及其制备方法
本申请要求于2008年3月4日提交的CN200810101309.4的优先权，其全文通过引用结合于此。
技术领域
本发明涉及具有改善的性能的复合干扰素变体，并涉及制备的方法以及利用这些变体的方法和组合物。
背景技术
干扰素(IFN)是一种表现出抗病毒及抗增殖活性的细胞因子的亚类，且广泛应用于肝炎、炎症和癌症的临床治疗中。在生物化学和免疫性质的基础上，将天然存在的人类干扰素分为三类：干扰素α(白细胞)、干扰素β(成纤维细胞)和干扰素γ(免疫细胞)。
美国专利No.4,695,623、No.4,897,471和No.5,541,293披露了人类干扰素多肽，该人类干扰素多肽包括在天然存在的α干扰素亚型多肽之间的每一个位置处发现的共有或主要氨基酸的氨基酸序列，且被称为复合干扰素(IFN-con)。披露的IFN-con氨基酸序列指的是IFN-con1、IFN-con2、IFN-con3。还披露了编码IFN-con基因的制备方法以及所述基因在大肠杆菌中的表达。体外比较重组IFN-con与白细胞或其他重组型干扰素的相对抗病毒、抗增殖、及天然杀伤细胞活性的研究表明，当在大量的基础上比较时，IFN-con表现出高得多的活性；Ozes et al.，J Interferon Research，12：55-59，1992。美国FDA批准了Amgen在1997年开发的复合干扰素(INFERGENTM)。
在开发干扰素产品中存在两种趋势：开发高活性干扰素和长效干扰素。复合干扰素INFERGENTM是高活性干扰素的代表。通过比较十多种的天然干扰素设计得到的人工序列的复合干扰素的活性比天然干扰素高得多(5-10倍)。由Roche Company和Schering-Plough Corporation开发的“Pegasys”和“PEG-Intron”分别是长效干扰素，且它们每年的销售额超过十亿美元，因此，它们是“重磅炸弹”级的生物技术药物。这两种药物通过PEG修饰而延长了干扰素的半衰期，同时，产品的活性很大程度上依赖于修饰的干扰素的初始活性。因此，高活性干扰素的开发对于进一步优化药物的效果是重要因素。
INFERGENTM是用大肠杆菌系统生产的，之后进行体外折叠处理(用变性剂处理包涵体，然后复性以整体上恢复，形成变性蛋白的活性结构)。然而，研究揭示了尽管复合干扰素的活性显著增强，但是序列的变化阻碍了体外折叠。
因此，需要改善复合干扰素。
发明内容
本发明提供一种亲本复合干扰素(parent consensus IFN)蛋白(SEQ ID NO：1)的复合干扰素蛋白变体(SEQ ID NO：3)。该变体具有两种突变即V115E(V115E表示在115位由Val→Glu)和L122R(L122R表示在122位由Lys→Arg)。本发明还提供了亲本复合干扰素蛋白(SEQ ID NO：1)的复合干扰素蛋白变体(SEQ ID NO：5)。该变体具有三种突变即V115E、L122R、和S156C(S156C表示在156位由Ser→Cys)。
本发明还提供了一种具有氨基酸序列SEQ ID NO：5的复合干扰素蛋白变体；且该蛋白变体包括在156位点的PEG部分。在一些实施方式中，该PEG部分是(PEG)n。在一些实施方式中，该PEG部分是PEG衍生物。
本发明还提供了编码该复合干扰素变体的DNA、包括该DNA的表达载体、表达该复合干扰素变体的宿主细胞、以及生产复合干扰素变体的方法。
本发明还提供了包括本文所提供的复合干扰素蛋白变体和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
附图说明
图1A-1C示出了复合干扰素及其变体。
图2示出了亲本复合干扰素(A)及干扰素变体((V115E/L122R/S156C))(B)的SDS-PAGE分析。泳道从左至右依次为诱导前的全细胞裂解物、诱导后的全细胞裂解物、超声波裂解并离心后的上清液部分S和沉淀部分P。目标条带用箭头标记。图(A)中的第五泳道和图(B)中的第一泳道是标准的分子量标记物。
图3示出了三种类型干扰素的SDS-PAGE分析。泳道从左至右依次为：V115E/L122R/S156C、IFN-α2b和“INFERGENTM”。第四泳道是标准的分子量标记。
图4示出了三种类型干扰素的非还原型SDS-PAGE电泳结果，泳道从左至右依次为：V115E/L122R/S156C、IFN-α2b和“INFERGENTM”。
图5示出了序列改造前后(A和B)折叠干扰素的离子交换色谱。使用的介质是CM Sepharose Fast Flow(GE HealthcareCompany)，缓冲剂的pH值为4.5。采用盐梯度洗脱。将正确折叠的干扰素用“*”标记。
具体实施方式
本发明提供了具有改善的重折叠性能和/或生物活性的复合干扰素变体(有时称为“IFN蛋白变体”)。
I.复合干扰素的变体
通过优化处理，可将天然干扰素在体外折叠为活性结构。然而，通常，总是有一部分复合干扰素由于不当折叠而造成生物活性降低或无生物活性。为了满足药物产品中通常要求的均质性的要求，经常需要进行昂贵复杂的分离工艺来将错误折叠的、低活性的干扰素与正确折叠的干扰素分开。与亲本复合干扰素相比，本发明提供了基于结构生物学研究的干扰素变体，其具有改善的重折叠性能，且其在变性处理后也更容易恢复活性结构。
一方面，本发明提供了亲本复合干扰素蛋白(SEQ ID NO：1)的一种复合干扰素蛋白变体(V115E/L122R)(SEQ ID NO：3)。该变体具有两种突变：V115E和L122R，且有时称为“双变体”。
另一方面，本发明提供了亲本复合干扰素蛋白(SEQ ID NO：1)的一种复合干扰素蛋白变体(V115E/L122R/S156C)(SEQ ID NO：5)。该变体具有三种突变：V115E、L122R和S156C，有时称为“三变体”。
另一方面，本发明提供了进一步包括PEG部分的三突变体，其优选结合于S156C位点。
II.表达载体和DNA编码变体IFN蛋白
另一方面，本发明提供了编码具有SEQ ID NO：3或SEQ IDNO：5的氨基酸序列的复合干扰素蛋白变体的DNA。在一些实施方式中，该DNA具有SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的核苷酸序列。在一种实施方式中，编码IFN变体的核酸通过全基因合成法或通过编码野生型或IFN蛋白变体的核酸的定点突变而进行制备。可使用的方法包括模板介导连接、循环PCR、盒式突变、定点突变或其他本领域已知的技术，例如参见Strizhov et.al.PNAS 93：15012-15017(1996)，Prodromou and Perl，Prot.Eng.5：827-829(1992)，Jayaramanand Puccini。
一方面，本发明提供了一种表达载体，该表达载体包括编码具有SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5氨基酸序列的复合干扰素蛋白变体的DNA。在一些实施方式中，该表达载体包括具有SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的核苷酸序列的DNA。
在一些实施方式中，IFN变体核酸编码IFN蛋白变体。如本领域人员可理解的，由于遗传密码的兼并性，可形成很多种核酸，其全部可编码本发明的IFN蛋白变体。因此，具有确定的特定氨基酸序列，本领域技术人员可以不改变IFN变体的氨基酸序列的方式通过简单地修饰一种或多种密码子的序列，形成任意种不同的核酸。
在一种实施方式中，通过杂交研究可确定核酸同源性。因此，例如，在高度严格的条件下与图1所示的核酸序列(SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6)杂交的核酸或它们的互补序列被认为是IFN变体基因。高度严格条件是本领域已知的；参见例如Maniatis，et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2d Edition(1989)，和ShortProtocols in Molecular Biology，ed.Ausubel，et al.，将这二者通过引用结合于此。这样的条件的一个实例包括在约42℃下在含有50％甲酰胺的约6XSSC中进行杂交，清洗条件为约65℃下在约0.2XSSC、0.1XSDS中。在另一种实施方式中，使用了较不严格的杂交条件；例如，可使用如本领域已知的中或低严格条件；参见Maniatis andAusubel，supra。这样的条件的一个实例包括在约50至55℃的5XSSPE中杂交并在约50℃下约5XSSPE中的条件下清洗。
本发明的IFN蛋白变体和核酸优选是重组的。如本文所使用的，“核酸”可指DNA或RNA，或含有脱氧核糖核苷酸以及核糖核苷酸的分子。该核酸包括含有正义和反义核酸的基因组DNA、cDNA以及寡核苷酸。这样的核酸可包括核糖-磷酸骨架中的修饰以增强生理环境中的这样的分子的稳定性和半衰期(half life)。
核酸可以是双链的、单链的、或即包含双链又包含单链序列部分。如本领域人员将理解的，一条链(“Watson”)的描述也限定了另一条链(“Crick”)的序列；因此，图1中所描述的序列还包括该序列的互补体。本文中，术语“重组核酸”是指通常通过利用核酸内切酶的核酸操作，最初是在体外形成的核酸，其以在正常的情况下不会在自然界中发现的形式存在。因此，以线性形式存在的分离的IFN变体核酸，或通过连接非常规加入的DNA分子而在体外形成的表达载体，均是为了本发明的目的考虑的重组。应当理解，一旦形成重组核酸，并再次导入宿主细胞或生物体内，其将非重组地复制，即利用宿主细胞的细胞内机制而不是体外操作；然而，这样的核酸一旦重组地生成，也被认为是为了本发明目的的重组，尽管随后进行非重组地复制。
类似地，“重组蛋白”是利用重组技术形成的蛋白，即，通过上述重组核酸的表达。重组蛋白与天然出现的蛋白在至少一个或多个特性上不同。例如，该蛋白可以从在其野生型宿主中常规存在的部分或全部蛋白和化合物中分离或提纯，因此，可以基本上是纯的。例如，分离的蛋白并不伴随至少一些在其天然状态下与其常规相连的材料，该材料优选构成了所给样品中按重量计的总蛋白的至少约0.5％、更优选至少约5％。该基本纯的蛋白包括按重量计至少约75％的总蛋白，且至少约80％是优选的，且至少约90％是特别优选的。该限定包括在一种不同的生物体或宿主细胞中，由一种生物体来生产IFN蛋白变体。可替换地，通过使用可诱导的启动子或高表达启动子，可以使用比通常所见的浓度高得多的浓度的蛋白，以便形成更高浓度水平的蛋白。可替换地，该蛋白可添加表位标签或氨基酸取代、插入及缺失，如本文所讨论的。
在一种实施方式中，制备了包括以下所述组分及编码变体IFN蛋白的基因的表达载体。用于各种宿主细胞的多种类型的适当的表达载体和合适的调节序列在本领域中是已知的。该表达载体可包括转录或翻译调节序列，其包括但不限于，启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列、转录终止子信号、聚腺苷酸化信号、和增强子或激活子序列。在一种实施方式中，调节序列包括启动子和转录起始和终止序列。另外，该表达载体可包括其他的元件。例如，该表达载体可具有两种复制系统，因此允许其在两种生物体中生存，例如，用于表达的哺乳动物或昆虫细胞中及在用于克隆和扩增的原核宿主中。此外，对于整合型表达载体，该表达载体包括与宿主细胞基因组同源的至少一种序列，且优选两种同源序列，其位于表达构建体的侧面。通过针对载体的内容来选择合适的同源序列，可将整合型载体指向宿主细胞中的特定基因座。用于整合载体的构建体是本领域已知的。此外，在一种优选的实施方式中，表达载体包括选择性标记基因以实现转化的宿主细胞的选择。选择基因是本领域中已知的，并随着所使用的宿主细胞而变化。表达载体可以是染色体外载体或者是整合进宿主基因组的载体中的一种。表达载体可包括分泌的前导序列或信号肽序列，其使IFN蛋白变体从宿主细胞分泌。导致蛋白质分泌的合适的分泌前导序列是本领域已知的。如本领域已知的，该信号序列通常编码由疏水氨基酸构成的信号肽，其导致蛋白质从细胞分泌。蛋白或者被分泌至生长培养基中或对于原核生物分泌至位于细胞的内膜或外膜之间的壁膜间隙。对于细菌内的表达，一般通常优选可操作地连接至编码IFN变体的核酸的细菌分泌前导序列。
一方面，本发明提供了包含编码复合干扰素蛋白变体的DNA的宿主细胞，该复合干扰素蛋白变体具有SEQ ID NO：3或SEQ IDNO：5的氨基酸序列。在一些实施方式中，宿主细胞包括具有SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：4的核苷酸序列的DNA。
III.形成IFN蛋白变体的方法
一方面，本发明提供了一种制造复合干扰素的方法，该方法包括以下步骤：在可以表达IFN变体的条件下生长本文所提供的宿主细胞，收集宿主细胞，并且纯化复合干扰素变体。
转染/转化将IFN变体核酸以适于核酸的随后表达的方式单独地或与表达载体组合地引入细胞中。该引入方法很大程度上受靶细胞类型的限制，如以下所述的。示例性方法包括CaPO4沉淀、脂质体融合、
Figure G2009800001779D00081
电穿孔，病毒感染、葡聚糖介导的转染、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、直接显微注射等。IFN变体核酸可稳定地整合至宿主细胞的基因组中或可瞬时地或稳定地存在于细胞质中。
用于IFN变体表达的合适的宿主细胞用于IFN变体表达的合适的宿主细胞包括酵母、细菌、原始细菌、真菌、及昆虫和动物细胞，包括哺乳动物细胞。特别感兴趣的是细菌诸如大肠杆菌和枯草杆菌，真菌诸如酿酒酵母、毕赤酵母、及脉胞菌属，昆虫诸如黑腹果蝇及昆虫细胞系诸如SF9，哺乳细胞系包括293、CHO、COS、Jurkat、NIH3T3、等(参见ATCC细胞系目录，明确地通过引用结合于此)。
干扰素变体还可以在更加复杂的生物体中形成，包括但不限于，植物(诸如谷物、烟草、及藻类)和动物(诸如鸡、山羊、牛)；参见例如Dove，Nature Biotechnol.20：777-779(2002)。
在一种实施方式中，该细胞可额外地进行基因改造，即，除了包括含有IFN变体核酸的表达载体还包括外源的核酸。
表达方法本发明的IFN蛋白变体是在合适条件下通过培养具有包含编码IFN蛋白变体的核酸的表达载体的转化的宿主细胞，以诱导或引起IFN蛋白变体的表达。适合于IFN蛋白变体表达的条件将随着表达载体及宿主细胞的选择而变化，并且本领域技术人员可以通过常规实验很容易地确定。例如，在表达载体中的组成型启动子的使用将要求宿主细胞的生长及繁殖优化，而诱导型启动子的使用要求对于诱导的合适的生长条件。此外，在一些实施方式中，收集的时机是重要的。例如，在昆虫细胞表达中使用的杆状病毒体系为裂解病毒，因此收集时间的选择对于产物产量是至关重要的。
提纯在一种实施方式中，IFN变体在表达后进行纯化或分离。标准的纯化方法电泳、分子的、免疫学的和色谱技术、包括离子交换、疏水、亲和、及逆相HPLC色谱、以及色谱聚焦。例如，IFN变体可使用标准的抗重组蛋白抗体柱进行提纯。结合蛋白质浓缩的超滤和渗滤技术也是有用的。对于合适的纯化技术的一般性指南，参见Scopes，R.，Protein Purification，Springer-Verlag，NY，3dr ed.(1994)。必要的纯化度将随着期望的应用进行变化，而且在某种情况下，没必要进行提纯。
IV.翻译后修饰及衍生
一旦形成，该IFN蛋白变体可进行共价修饰。因此，蛋白质的共价及非共价修饰包含在本发明的范围内。通过多肽的靶氨基酸残基与能够与所选的侧链或端部残基进行反应的有机衍生试剂的反应，可以将这样的修饰引入IFN变体多肽中。可使用各种标准来选择用于修饰的最佳位点，包括但不限于，直接观察、结构分析、序列分析及分子模拟。
在一种实施方式中，本发明的IFN蛋白变体用至少一种元素、同位素或化学化合物进行标记。通常，标记分为三种：a)同位素标记，其可以是放射性或重同位素；b)免疫标记，其可以是抗体或抗原；及c)带颜色的或荧光颜料。该标记可在任何位置引入所述化合物。标记包括但不限于生物素、标签(例如FLAG、Myc)及荧光标记(例如荧光素)。
通常，与未修饰的复合干扰素蛋白质相比，本文所提供的氨基酸修饰改善了再折叠和回收速率。优选地，与亲本复合干扰素蛋白质相比，该复合干扰素蛋白变体质还改善了抗病毒活性。
另一方面，本发明提供了一种具有SEQ ID NO：5氨基酸序列的复合干扰素蛋白变体，且该蛋白变体包括在位点156处的PEG部分。如本文所使用的，术语“PEG部分”意在包括但不限于直链型或支链型PEG、甲氧基PEG、可水解或可酶解的PEG、分枝型PEG、树状PEG、PEG与一种或多种多元醇的共聚物、以及PEG与PLGA(聚(乳酸/乙醇酸))的共聚物。在一些实施方式中，PEG部分是(PEG)n，包含适当的端基氢。即如果使用三单元的PEG聚合物，则该部分为(CH2CH2O)3-H。在一些实施方式中，该PEG部分是PEG衍生物。如本文所提及的，为了讨论方便，以下使用术语“PEG”，但其意在包括如下所限定的“聚合的部分”的范围。
连接至蛋白质的聚合物部分的效果取决于连接的位点以及聚合物的大小。连接的高度柔性的PEG部分表现出较宽范围的构象，其根据连接位置及该部分中单体单元的数目(即PEG大小)而变化。连接的PEG的构象的范围可直接根据其大小及其分子环境而折叠。与蛋白质中的原子重叠的构象由于空间位阻而受限制(prohibited)。如果分子环境发生变化，例如在PEG化蛋白结合至另一种蛋白的情况下，对于连接的PEG，所允许的构象的范围可发生巨大的变化。统计力学的基本原则预测，已知如同热动力学上的熵减少，PEG构象的减小将导致PEG化蛋白质与其结合伙伴之间的相互作用亲和力的减少。
如本发明所使用的，术语“聚合物”和“聚合部分”或其叫法上的等同物是指可连接至蛋白质的任何非单体部分，其至少部分可溶，并具有合适的柔性以获得所需的功能。该聚合物可以是均聚物或杂聚物。在本发明的一种优选实施方式中，聚合物部分可包括但不限于诸如乙二醇部分或糖类部分的醇类。优选的分子量范围为约1000道尔顿至约100,000道尔顿。该聚合物可以是无支链的、有支链的、或不稳定的，包括内部不稳定性(例如，进入患者体内之后的裂解)，以及连接不稳定性(其中，蛋白质与聚合物之间的键接是可逆的)。聚合物可具有有机或无机组分或部分。在一些实施方式中，该聚合物是药学上可接受的，并且可以连接至治疗蛋白。合适的聚合物的优选实例为聚乙二醇(PEG)((CH2CH2O)n-H)及其衍生物。为了便于讨论，将使用术语“PEG”，但其意在包括如上所限定的“聚合物”的范围。合适的聚合物的实例包括但不限于实例Roberts，M.J.et al.(2002)″Chemistry for peptide and protein PEGylation″Adv.DrugDeliv.Rev.54，459-476以及Kinstler，O.et al.(2002)″Mono-N-terminal poly(ethylene glycol)-protein conjugates″Adv.DrugDeliv.Rev.54；美国申请No.60/360,722；美国专利No.5,795,569；美国专利No.5,766,581；EP 01064951；美国专利No.6,340,742；WO 00176640；WO 002017；EP0822199A2；WO 0249673A2；美国专利No.4,002,531；美国专利No.5,183,550；美国专利No.5,985,263；美国专利No.5,990,237；美国专利No.6,461,802；美国专利No.6,495,659；美国专利No.6,448,369；美国专利No.6,437,025；美国专利No.5,900,461；美国专利No.6,413,507；美国专利No.5,446,090；美国专利No.5,672,662；美国专利No.6,214,966；美国专利No.6,258,351；美国专利No.5,932,462；美国专利No.5,919,455；美国专利No.6,113,906；美国专利No.5,985,236；WO 9428024A1；美国专利No.6,340,742；美国专利No.6,420,339；以及WO 0187925A2，其全文通过引用结合于此。PEG衍生物可包括杂原子以及氢原子的取代基团，且聚合物可包括“常规”PEG与衍生的PEG的混合物。
本发明的PEG-IFN共轭体可通过本领域已知的任何方法制备。美国专利号6,638,500，全文通过引用结合于此。根据本发明的实施方式，IFN变体与PEG化试剂在适当的溶剂中进行反应，使所希望的结合分子分离并纯化，例如通过应用一种或多种色谱法进行提纯。
V.分析变体的活性
在一些实施方式中，利用本领域已知的合适的方法，对野生型及蛋白变体质的生物活性进行分析。这样的分析包括但不限于干扰素应答基因的活性、受体结合分析、抗病毒活性分析、细胞病变抑制效果分析，(Familletti et.al.，Meth.Enzymol.78：387-394)、抗增殖分析，(Aebersold and Sample，Meth.Enzymol.119：579-582)、免疫调节分析，(US 4,914,033；4,753,795)、以及监测诱导MHC分子的分析(例如，Hokland et al，Meth.Enzymol.119：688-693)，如在Meager，J.Immunol.Meth.，261：21-36(2002)中所描述的。
在一种实施方式中，将分析野生型和蛋白变体激活干扰素-敏感信号转导途径的能力。一种实例是干扰素-模拟应答元件(ISRE)分析，将在以下及实施例中描述。组成型表达I型干扰素受体(例如，Hela细胞、293T细胞)的细胞利用ISRE-荧光素酶载体进行瞬时转染。转染之后，用干扰素变体处理细胞。在一种优选的实施方式中，检测若干蛋白质浓度(例如0.0001-10ng/mL)以得到剂量反应曲线。在可替换的实施方式中，检测两种或多种浓度。如果变体结合并激活其受体，所得的信号转导级联反应诱导荧光素酶表达。可按多种方式测量其发光量，例如利用TopCountTM或FusionTMmicroplate reader。
在一种实施方式中，对蛋白变体分析其结合至I型干扰素受体(IFNAR)的能力，并与野生型IFN或亲本复合IFN比较。合适的结合分析包括但不限于BIAcore分析(Pearce et al.，Biochemistry38：81-89(1999))以及AlphaScreenTM分析(可商购自PerkinElmer)(Bosse R.，Illy C.，and Chelsky D(2002)。Principles of AlphaScreenTMPerkinElmer Literature Application Note Ref#s4069。AlphaScreenTM is基于珠的非放射性荧光接近似分析法，用680nm的激光激发供体珠，以释放纯态氧。该纯态氧扩散并与二甲基噻吩衍生物在受体珠的表面上反应，以导致在～600nm的荧光发射。荧光发射仅出现在当由于每一个分别连接至配体和受体时分子发生相互作用而使供体和受体珠密切接近。这种配体-受体相互作用可被受体结合变体竞争，而非结合变体将不参与竞争。
在一种可替换的实施方式中，与野生型IFN或亲本复合IFN相比，对蛋白变体分析其治疗动物疾病模型的效力，诸如对于多发性硬化的小鼠或大鼠EAE模型。
在一种可选的实施方式中，与野生型IFN或亲本共有IFN相比，对亲本复合干扰素和蛋白变体分析其抗病毒活性。
抗增殖活性：在一种可替换的优选的实施方式中，将与野生型IFN或亲本复合IFN相比，对野生型和蛋白变体分析其治疗疾病动物模型，诸如多发性硬化的小鼠或大鼠EAE模型的效力。
VI.使用IFN变体的方法
使用IFN变体的给药和治疗本发明的变体IFN蛋白和核酸一旦制成会发现在多个方面有用。在一些实施方式中，给予变体IFN蛋白或核酸可以治疗受试者(患者)IFN相关的失调。
本发明的变体IFN蛋白的给予可以多种方式来完成，优选以无菌水溶液的形式，包括但不限于，口服、肠道外给药，皮下给药、静脉给药、鼻内给药、经皮给药、腹腔内给药、肌肉内给药、肺内给药、阴道给药、直肠给药、鼻内给药、或眼内给药。在一些情况下，变体IFN蛋白可作为溶液或喷雾直接给药。根据引入的方式，可以多种方式形成药物组合物。
一方面，本发明提供了一种药物组合物，包括本文所提供的变体复合干扰素蛋白，以及药学上可接受的赋形剂或载体。
“药学上可接受的载体”或其同义语包括药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington′s Pharmaceutical Sciences 16th edition，Osol，A.Ed.，1980)，以冻干制剂、水溶液等形式。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所用剂量和浓度方面对接受者是无毒的，且包括诸如磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐及其他有机酸的缓冲液；包括抗坏血酸和蛋氨酸的抗氧化剂；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苯甲基氯化铵；氯化六甲铵(hexamethonium chloride)；氯化苯二甲烃铵(benzalkonium chloride)，氯化苄氧乙铵(benzethonium chloride)；酚，丁基或苄基醇；对羟基苯甲酸烷基酯(alkyl parabens)诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯(methyl or propyl paraben)；邻苯二酚(catechol)；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；及间甲酚)；低分子量多肽(少于约10个残基)；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶、或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸诸如甘氨酸、谷酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、或赖氨酸；单糖类，二糖类、及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂诸如EDTA；糖类诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；甜味剂和其他增香剂；填料诸如微晶纤维素、乳糖、谷物、及其他淀粉；粘合剂；添加剂；着色剂；成盐反离子(salt-forming counter-ions)诸如钠；金属配合物(例如Zn-蛋白质配合物)；和/或非离子型表面活性剂诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。在一种优选的实施方式中，包含本发明的组合物的药物组合物是以可溶于水的形式，诸如以药学上可接受的盐的形式存在，其意在包括酸和碱加成盐。可接受的载体包括但不限于药学上可接受的酸和碱盐。“药学上可接受的酸加成盐”指的是那些保持游离碱的生物有效性并且在生物上或其他方面不会是不利地，与无机酸诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等，以及有机酸诸如乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙二酸、丁二酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲烷磺酸、乙烷磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等。“药学上可接受的碱加成盐”包括衍生自无机碱诸如钠、钾、锂、铵、钙、镁、铁、锌、铜、锰、铝盐等盐。特别优选的是铵、钾、钠、钙、和镁盐。衍生自药学上可接受的有机无毒性碱盐包括伯、仲、叔胺的盐、取代胺(包含天然存在的取代胺)、环状胺及碱性离子交换树脂，诸如异丙基胺、三甲基胺、二乙基胺、三乙基胺、三丙基胺、及乙醇胺。
本发明的药物组合物包括以适合给予患者的形式的IFN蛋白变体。在优选的实施方式中，该药物组合物以可溶于水的形式，诸如以药学上可接受的盐的形式存在，包括酸和碱加成盐。
该药物组合物还包括下列中的一种或多种：载体蛋白诸如血清白蛋白；缓冲液诸如NaOAc；填料诸如微晶纤维素、乳糖、谷物、及其他淀粉；粘合剂；甜味剂和其他增香剂；着色剂；及聚乙二醇。添加剂是本领域中已知的，并用于如上讨论的各种制剂中。
在另一实施方式中，将IFN蛋白变体加入到胶束制剂(micellular formulation)中；参见美国专利No.5,833,948，其全文通过引用结合于此。
可给予该药物组合物的组合。而且，该组合物可结合其他的治疗给药。
在一种实施方式中，还可以在基因治疗中使用编码IFN蛋白变体的核酸。在基因治疗应用中，将基因引入细胞内以使有治疗效果的基因产品在体内合成，例如用于代替缺陷基因。“基因治疗”既包括传统的基因治疗(其中，通过单一治疗获得持续的效果)，还包括给予基因治疗药物(其包括有治疗效果的DNA或mRNA的一次或重复给药)。修饰寡核苷酸可能可以提高对其的摄入，例如，利用不带电荷的基团取代其带负电荷的磷酸二酯基团。
有各种技术可用于将核酸引入至活细胞中。根据核酸是否转移至体外培养的细胞中或目标宿主的细胞内来选择该技术。适合用于将核酸体外转移至体外的哺乳动物细胞中的技术包括使用脂质体、电穿孔、显微注射、细胞融合、DEAE-葡聚糖、磷酸钙沉淀法等。目前优选的体内基因转移技术包括用病毒(通常为逆转录病毒)载体的转染和病毒外壳蛋白-脂质体介导的转染[(Dzau et al.，Trends inBiotechnology 11：205-210(1993))]。在一些情况下，需要将核酸源与靶向目标细胞的试剂一起提供，诸如特异于细胞表面膜蛋白或靶细胞的抗体，针对靶细胞上的受体的配体等。在采用脂质体的情况下，蛋白质结合至细胞表面与胞吞作用相关的膜蛋白可用于靶向和/或促进摄取，例如，针对特定细胞型的壳体蛋白或其片段、对于在循环中进行内化的蛋白的抗体、引导胞内定位并提高胞内半衰期的蛋白。。受体介导胞吞作用的技术描述于例如Wu et al.，J.Biol.Chem.262：4429-4432(1987)；和Wagner et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87：3410-3414(1990)。基因标记和基因疗法手册的综述参见Anderson et al.，Science 256：808-813(1992)。
一方面，本发明提供了在受试者(患者)体内抑制病毒活性的方法，该方法包括给予动物或人类受试者治疗有效量的本文提供的复合干扰素蛋白变体。这里的“抑制病毒活性”是指使病毒活性下降。这可以通过本领域已知的方法测量，诸如病毒滴度。病毒活性的抑制优选为大于10％，大于20％、30％、40％，优选大于50％、60％、70％、80％及90％，或受试者的病毒活性的全部消除。
适合本发明目的的“患者”包括人类和其他动物，特别是哺乳动物及有机体。因此，该方法可应用至人类治疗及动物治疗中。在一种优选的实施方式中，患者是哺乳动物，且在最优选的实施方式中，患者是人。
这里的“治疗有效量”是指产生所给药的效果的剂量。精确剂量将取决于治疗的目的，且本领域技术人员使用已知技术可以确定。对于75kg的平均体重，剂量为每天10μg至1mg之间，且优选每天剂量为20μg至200μg之间。在一种优选的实施方式中，使用了约5μg/kg的剂量，进行静脉内或皮下给药。如本领域已知的，调节IFN蛋白变体降解、全身或局部递送、及新蛋白酶合成速率、以及年龄、体重、健康状况、性别、饮食、给药时间、药物的相互作用以及疾病的严重性是必要的，并且本领域技术人员可通过常规实验而确定。
这里的“治疗”是指包括针对该疾病或失调的治疗措施、以及预防性或抑制性措施。因此，例如，在疾病发作之前的IFN蛋白变体的成功给药可能使疾病得到治疗。在另一种实施例中，在疾病临床表现出现之后，为对抗疾病症状的IFN蛋白变体的成功给药包括对疾病的治疗。“治疗”还包括在疾病出现之后为改善或根除疾病而进行的IFN蛋白变体的给药。伴随着可能的临床症状的减弱或者是可能的疾病的改善，已经开发了病发之后或临床症状出现之后的试剂的成功给药进一步包括疾病的“治疗”。
尽管上面已经对之前的发明进行了描述，但本领域技术人员将清楚认识到，只要不背离本发明的范围，可以存在各种改变和其他的实施方式。所有的出版物、专利、专利申请(临时的、实用新型及PCT)或其他文件，其全文通过引用结合于此。
实施例
实施例1
获得“INFERGEN TM ”的核酸序列。
基于INFERGENTM的氨基酸序列并考虑到大肠杆菌(Escherichia coli)中的基因密码子偏爱性以及克隆与鉴定的方便，如图1所示，本发明提供了复合干扰素的DNA序列(SEQ ID NO：2)。相应的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)也如图1所示。
根据如上提供的DNA序列，合成了两组寡核苷酸片段。在每一组中存在十二种寡核苷酸，每一种寡核苷酸为约40mer。该寡核苷酸片段是重叠的。这两组在室温下独立地进行退火，使用T4DNA连接酶以形成两个双链DNA片段。该两个DNA片段的末端具有Hind III端。通过电泳提纯后，将两段DNA等量混合以使用连接酶形成一个双链DNA。该单个DNA片段利用上游引物ATATAGCTTAAGCTAGAAACCATGAGGGTAATAAATAATGTGTGATTTACCTCAA(SEQ ID NO：7)及下游引物ATATAGTCTAGACTAT TATTCTTTACGGC(SEQ ID NO：8)经PCR进一步扩增。将Afl II限制性位点(CTTAAG)和核糖体结合序列(引物中的下划线部分)引入5’末端，而将Xba I限制位点(TCTAGA)引入3’末端。对PCR的产物应用Afl II和Xba I双限制性酶解并克隆到表达载体pTac-CI。将该表达载体pTac-CI转染至大肠杆菌BL-21中。将转染的大肠杆菌保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)。保藏号：CGMCC 2379。
实施例2
通过氨基酸的序列改造获得的新型干扰素。
通过氨基酸的大量序列改造及筛选试验，发现：(1)与复合干扰素INFERGENTM相比，通过将115位的Val变为Glu，将122位的Lys变为Arg获得的变体(SEQ ID NO：3)的活性得到改善；(2)进一步通过将156位的Ser变为Cys获得的变体(SEQ ID NO：5)的折叠性能显著改善。
表达上述两种变体的转染的大肠杆菌保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)。保藏号：CGMCC 0978和CGMCC 2267。
将含有conIFN质粒的大肠杆菌BL21(DE3)进行过夜培养，然后接种到含有100mg/L氨比西林的2ml LB培养基中，在37℃下生长约2小时(OD＝0.6-0.8)。在培养基中添加IPTG直至最终浓度为0.5mmol/L。利用IPTG诱导细菌4小时，然后用4000rpm离心法进行收集。将收集的细菌进行超声波破裂，在12,000rpm下离心以分别收集上清液部分和沉淀部分，并利用SDS-PAGE分析。浓缩凝胶的密度为4％，分离凝胶的密度为12％。用考马斯亮蓝染色该凝胶1小时，然后用甲醇-冰醋酸进行脱色。用扫描图像装置Bio-Rad记录染色凝胶。图2A和2B示出了分别在序列改造前和后的干扰素的表达，泳道从左至右为诱导前的全细胞裂解物、诱导后的全细胞裂解物、超声波裂解并离心后的上清液部分S和沉淀部分P。目标条带用箭头标记。表达的数量和形式主要根据电泳的条带确定。结果揭示出，干扰素的表达的数量在序列改造之后并未变化。然而，干扰素的溶解性明显发生变化。之前在沉淀部分中以包涵体的形式存在的干扰素大部分被转移至上清液中。最初，人们认为在序列改造之后，在分子水平上促进了干扰素的折叠动力学。这是因为，由于在原核表达体系中，相比于体内重组蛋白的折叠率，存在重组蛋白的更高的表达率的形成，使得不会折叠成正确的三维结构聚集体的大量蛋白质形成不可溶的沉淀。
实施例3
折叠性质的研究
用三种洗脱液洗脱亲本复合IFN和干扰素变体的包涵体，以获得用于分析折叠性能的高纯度包涵体。包涵体洗脱后用变性剂溶解(1g包涵体溶解在10ml变性剂中)，室温下放置12小时，然后，将得到的变性蛋白在15000rpm下离心分离20分钟。
具体溶液的配制如下：
洗脱液1：20mM Tris、1mM EDTA、1％Triton X-100、pH8.5
洗脱液2：20mM Tris、1mM EDTA、1M NaCl、pH8.5
洗脱液3：20mM Tris、1mM EDTA、2M尿素、pH8.5
变性剂：6M胍基盐酸盐、50mM Tris、1mM EDTA、1％β-巯基乙醇、pH8.5。
在上述清洗步骤之后，在一定程度上纯化包涵体。实施复性试验以便研究序列改造之前和之后的干扰素的折叠性。使用天然IFN-α2b作对照。已经报道，在特定的复性条件下，可使天然干扰素在变性后恢复具有适当的三维结构和生物活性。本发明所用的天然IFN-α-2b在大肠杆菌中进行表达，表达条件和包涵体清洗条件如上所述。将通过清洗获得的三种干扰素用还原的SDS-PAGE处理，结果示于图3中。对该三种干扰素用考马斯亮蓝R-250染色之后出现的单个条带，显示出三种干扰素都具有一定程度的纯度。然而，基于条带的迁移率，三种干扰素在还原的SDS-PAGE电泳、过量的SDS和巯基乙醇-β的存在下是相等的。这种差异不是由分子的分子量造成的，因为三种干扰素之间的差异小于3‰，这并不足以造成SDS-PAGE分析中的差异。因此，除分子量之外，在三种干扰素之间存在其他的性能上的明显差异(诸如氨基酸的表面性质和结构域分布)。为确定复性蛋白是否已经复性为天然三维结构，非还原性SDS-PAGE电泳是通常使用的方法。蛋白质的正确折叠结构是最紧密的，其电泳迁移性也是最大的，从而能够评估蛋白变性的效率。将三种干扰素的变性溶液复性，然后，使用非还原性SDS-PAGE分析复性样品，如图4所示，50％的未进行序列改造的(复合)干扰素保持非天然状态，而多于90％的已进行序列改造的干扰素和天然干扰素-α-2b恢复到天然状态。这就表明了，在氨基酸的序列改造之后，基于“INFERGENTM”的变体IFN可具有能够与天然干扰素相媲美的折叠性质。这就促进了生产工艺的简化和成本降低。
实施例4
产品的纯化，以及错配干扰素的分离
复性之后，利用错配的和正确折叠的干扰素之间的电荷差异通过离子交换介质(CM Sephorose Fast Flow，GE Healthcare company)纯化干扰素。图5中的A示出了亲本复合干扰素的离子交换色谱图。洗脱过程中出现的两种组分，利用非还原性SDS-PAGE检测确定它们为错配的干扰素。它们的迁移性小于适当折叠的干扰素。图5中的B示出了变体(V115E/L122R/S156C)的离子交换色谱图。利用非还原性SDS-PAGE电泳检测示出了仅有一个单一组分和一个单一条带。这表明了变体IFN完全折叠成合适的三维结构。
实施例5
抗病毒活性的研究
分别研究了Amgen开发的复合干扰素INGERGENTM和改造后的新型干扰素conIFN以及天然干扰素-α-2b的抗病毒活性。VSV病毒可诱导WISH细胞中的CPE。利用干扰素的预处理能够保护WISH细胞不会被VSV病毒所裂解，这是所谓的“WISH细胞中的细胞病变效果抑制实验”，该方法记录在“中国药典”(第三版)中。这是通常使用的细胞病变效果抑制实验。
结果示出了两种变体IFN(V115E/L122R  和V115E/L122R/S156C)的活性可与“INFERGENTM”相当，且甚至略高于INFERGENTM。干扰素变体比天然干扰素-α-2b及亲本复合干扰素具有更高的抗病毒和抗感染活性(见表1)。
表1.抗病毒活性和折叠性质的比较结果
  INFERGENTM   干扰素-α-2b   V115E/L122R   V115E/L122R/S156C
  抗病毒活性，U/mg   2.80×108   1.11×107   3.78×108   5.44×108
  折叠性，％   50％   90％   50％   90％

Claims (15)

1.一种复合干扰素蛋白变体，包括氨基酸序列SEQ ID NO：3。
2.根据权利要求1所述的复合干扰素蛋白变体，进一步包括在156位点的突变，其中，所述突变为S156C。
3.根据权利要求2所述的复合干扰素蛋白变体，进一步包括至少一个共价连接至所述蛋白的聚乙二醇(PEG)部分。
4.根据权利要求3所述的复合干扰素蛋白变体，其中所述PEG部分连接至所述蛋白的S156C位点。
5.根据权利要求3或4所述的复合干扰素蛋白变体，其中所述PEG部分是(PEG)n。
6.根据权利要求2-5中任一项所述的复合干扰素蛋白变体，其中所述PEG部分是一种PEG衍生物。
7.一种编码权利要求1或2所述的复合干扰素变体的DNA。
8.一种包括权利要求7所述的DNA的表达载体。
9.一种包括权利要求7所述的DNA的宿主细胞。
10.一种利用权利要求8所述的表达载体转化的宿主细胞。
11.根据权利要求9或10所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为原核细胞。
12.根据权利要求11所述的宿主细胞，其中，所述宿主细胞为大肠杆菌。
13.一种药物组合物，包括权利要求1至6中任一项所述的复合干扰素蛋白变体以及药学上可接受的赋形剂。
14.一种生产复合干扰素蛋白变体的方法，所述方法包括以下步骤：
在可表达所述复合干扰素变体的条件下，生长权利要求
9-12所述的宿主细胞；
收集所述宿主细胞；以及
纯化所述复合干扰素蛋白变体。
15.一种抑制受试者体内病毒活性的方法，所述方法包括将根据权利要求1至6中任一项所述的复合干扰素蛋白变体给予动物或人类受试者。
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