CN101420942B - Trp-p8活性的小分子调节剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供小分子Trp-p8调节剂，包括Trp-p8激动剂和Trp-p8拮抗剂，含有小分子Trp-p8激动剂的组合物，以及鉴定和表征新型小分子Trp-p8调节剂的方法和降低Trp-p8表达细胞的活力和/或抑制其生长的方法，激活Trp-p8介导的阳离子内流的方法，刺激凋亡和/或坏死的方法，和治疗与Trp-p8表达有关的疾病，包括诸如肺癌、乳腺癌、结肠癌和/或前列腺癌等癌症和诸如良性前列腺肥大等其它疾病的相关方法。

Description

TRP-P8活性的小分子调节剂
相关申请的交叉参考
本申请要求2006年2月15日提交的美国临时专利申请60/773,435的优先权，将其内容内切入本文作参考。
发明背景
本发明总地涉及细胞生物学、生物化学和有机化学领域。更具体说，本发明提供Trp-p8活性的小分子调节剂，包括Trp-p8激动剂和Trp-p8拮抗剂，以及含有小分子Trp-p8调节剂的组合物。本发明也提供鉴定和表征新型小分子Trp-p8调节剂的方法以及调节Trp-p8介导的细胞阳离子内流和/或细胞凋亡的方法，以及治疗与细胞表达、激活和/或信号转导有关的疾病的相关方法。适合用本发明组合物和方法治疗的示范性疾病包括癌症，如肺癌、乳腺癌、结肠癌和/或前列腺癌。
发明背景
前列腺癌是美国男性中诊断出的最常见的癌症，其死亡率仅次于肺腺癌。Paker等，CA Cancer J.Clin.46：5-27(1996)。虽然可能有效治疗器官限定的前列腺癌，但对转移性疾病的治疗选择非常有限。因此，找到诊断早期疾病和密切监视疾病进展和治疗的新方法，以及开发新的治疗方法非常重要。为了实现这一目的，理解前列腺癌发生的分子机制和鉴定疾病诊断和进展的新生化标记物很重要。
迄今为止，可用的前列腺-特异性标记物非常少。已证明具有前列腺癌诊断价值的最熟知和良好鉴定的标记物是前列腺酸性磷酸酶(PAP)、前列腺特异性抗原(PSA)和前列腺特异性膜抗原(PSMA)。这些蛋白也变成治疗疾病的新型免疫治疗方法的靶点。Horoszewicz等，Anticancer Res.7：927-935(1987)；Barren等，Prostate30：65-68(1997)；Murphy等，Prostate33：281-285(1997)；Murphy等，Prostate26：164-168(1995)；Rochon等，Prostate25：219-223(1995)；Correale等，J.Immunol.161：3186-3194(1998)；和Murphy等，Prostate38：73-78(1999)。
已报道阳离子通道蛋白，广泛称为Trp-p8(短暂受体潜力-p8)、TRPM8和CMR1(感冒和薄荷醇受体1)在前列腺中特异性表达。全长人Trp-p8cDNA的克隆揭示出对应于1104个氨基酸多肽的转录物，该多肽与trp钙通道家族有同源性。Clapham等，Nature Reviews2：387-396(2001)和Clapham等，IUPHARCompendium，TRP Channels(2002)。Trp-p8与人TRPC7基因的同源性特别高--人TRPC7基因是推定的trp家族的Ca2+通道蛋白，在脑组织中高表达。Nagamine等，Genomics54：124-131(1998)。Trp-p8也与人黑素细胞抑制素(melastatin)有明显的同源性，人黑素细胞抑制素是在黑素细胞中表达的另一种Trp家族相关蛋白，被认为是肿瘤抑制基因。Duncan等，Cancer Res.58：1515-1520(1998)和Hunter等，Genomics54：116-123(1998)。也许，最感兴趣的是观察到除前列腺、肿瘤损伤之外，Trp-p8基因似乎在各种非前列腺细胞中广泛表达。Tsavaler等，Cancer Res.61(9)：3760-9(2001)。
Trp超家族包括20种以上的相关阳离子通道蛋白，它们参与包括感觉生理学至血管舒张和雄性能育性等各种过程。Trp通道缺陷与生长控制和肿瘤抑制的改变有关联。虽然所有Trp蛋白都是钙通道，但它们的选择性和激活模式有很大不同。Trp超家族成员具有相当高的序列同源性和预测的结构相似性，例如预测跨膜区段的大小。
Trp-p8在多种癌症中过度表达，包括前列腺癌、乳腺癌、肺癌和结肠癌，然而在正常组织中，它主要在人体前列腺[Tsavaler等，同上]和背根神经节(DRG)(Dendreon，未发表)中表达。Fuessel等报道，Trp-p8是具有高度前列腺特异性的基因和前列腺癌相关基因，因此它能够用作特定治疗的潜在靶点。InternationalJ.of Oncology23：221-228(2003)。据报道，在其它物种中，Trp-p8正向同源物在大鼠[McKemy等，Nature416(6876)：52-8(2002)]和小鼠[Peier等，Cell108(5)：705-15(2002)]的一部分DRG和三叉神经节(TG)神经元中表达。因此，Trp-p8是一种泛肿瘤表达的标记物，显然可用于疾病诊断和在治疗过程中监测疾病进展，并且可用作癌症治疗中的活靶点。
Trp-p8与前列腺癌、肺癌、乳腺癌和结肠癌的相关性和各种离子通道在关键细胞功能中所起的重要作用表明，Trp-p8通道可能在癌细胞信号转导和/或增殖中具有重要功能。在生理温度下对Trp-p8活性进行调节(用激动剂激活或用抑制剂抑制)是有价值的治疗方法，以便以特异性方式操控Trp-p8表达细胞。参见例如，美国专利申请10/923,413。
因此，本领域仍然需要Trp-p8活性的小分子调节剂、含有一种或多种小分子Trp-p8调节剂的组合物，以及用于调节细胞的Trp-p8活性和治疗与Trp-p8表达异常有关的疾病的小分子的鉴定方法和应用。
发明概述
本发明通过提供Trp-p8活性的小分子调节剂和含有这类Trp-p8调节剂的组合物，以及鉴定和使用Trp-p8调节剂的方法，满足了这些和其它相关需要，这些调节剂包括Trp-p8激动剂和Trp-p8拮抗剂。在某些实施方式中，本发明化合物能结合和激活Trp-p8和/或刺激细胞的阳离子内流，包括但不限于钙内流，其中阳离子内流与Trp-p8调节剂诱导的毒性有关联。因此，在这些和其它实施方式中，本发明Trp-p8激动剂能有效抑制表达Trp-p8的细胞生长和/或诱导其凋亡和/或坏死。其它实施方式提供能有效降低细胞的Trp-p8基础活性，从而降低Trp-p8表达细胞活力的Trp-p8拮抗剂。因此，有利的是，本发明激动剂和拮抗剂均可用于治疗与Trp-p8表达有关的疾病，包括但不限于乳腺癌、肺癌、结肠癌和/或前列腺癌。
可将一种或多种Trp-p8调节剂配制成组合物，包括药物组合物，其中含有一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂和/或一种或多种其它治疗性化合物。这类组合物在与Trp-p8表达相关的一种或多种疾病的治疗方法中有应用价值。
因此，在一个实施方式中，本发明提供小分子Trp-p8调节剂及其衍生物，其中所述小分子包括下式I所示化合物：
Figure G2007800131557D00041
式中，R1选自H、烷基、杂烷基、芳基烷基或芳基，或者，R1和R2可与氮基团一起形成至多25个原子的环基或杂环基；
R2选自芳基或芳基烷基；
R3选自烷基、杂烷基或芳基烷基；
R4选自H、烷基、杂烷基或芳基烷基；和
R3和R4与氮基团一起形成脂族胺。
在相关实施方式中，本发明提供小分子Trp-p8调节剂和其衍生物，其中所述小分子包括下式I-A所示化合物：
Figure G2007800131557D00042
式中A、B、C和D独立地选自CR2或N；A、B、C和D中至少一个是CR2；R2选自H、烷基、杂烷基、芳基、卤素或芳基烷基、R6O-或R6S-，其中R6是烷基；当A、B、C和D中两个相邻的基团是CR2时，两个R2可组合形成一个芳基、环烷基或杂环烷基；和
R1选自H、烷基、杂烷基、芳基或芳基烷基；
R3选自烷基、杂烷基、芳基、芳基烷基、-NR7C(O)-、-C(O)NR7-、-O-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-或-NR7-，其中R7选自H、烷基、杂烷基、芳基或芳基烷基；
R4选自-C(O)R8-、烷基、芳基烷基或杂烷基，其中R8选自烷基或杂烷基；
R5选自H、烷基、杂烷基或芳基烷基；和
R4和R5与氮基团一起形成脂族胺。
在式I-A的某些示范性化合物中，R1是H；R7是H；R8包含2、3或4个碳；R4选自丙酰基、乙基、丁酰基、羟基丙酰基或3-羟基丁酰基；R5选自H或甲基；R6包含1、2、3、4、5或6个碳；和/或R2选自甲氧基、甲硫烷基、苯基或H。
本文举例说明了式I-A化合物，包括选自下组的化合物：2-(2-氨基-丙酰基氨基)-4-甲氧基-苯基、N-(2-氨基-乙基)-2-氨基-5-甲硫烷基-苯基、1-(2-氨基-乙氧基)-萘-2-基、2-(2-氨基-乙基氨基)-4-甲硫烷基-苯基、N-(2-氨基-乙基)-5-甲氧基-苯甲酰胺、2-(2-氨基-丁酰基氨基)-4-甲氧基-苯基、2-(2-氨基-3-羟基-丙酰基氨基)-4-甲氧基-苯基、3-(2-氨基-乙基氨基)-萘-2-基、N-(2-氨基-乙基)-2-氨基-苯甲酰胺、2-(2-氨基-3-羟基-丙酰基氨基)-4-甲氧基-苯基、2-(2-氨基-乙酰基氨基)-苯基、2-(2-氨基-3-羟基-丁酰基氨基)-4-甲氧基-苯基酰胺和2-(2-氨基-乙酰基氨基)-4-甲氧基-苯基。
在其它相关实施方式中，本发明提供小分子Trp-p8调节剂和其衍生物，其中所述小分子包括下式I-B所示化合物：
式中，R1选自H、烷基、杂烷基、芳基或芳基烷基；
R2选自芳基、烷基、杂烷基或芳基烷基；
R3选自烷基、杂烷基或芳基烷基；
R4选自H、烷基、杂烷基或芳基烷基；和
R3和R4与氮基团一起形成脂族胺。
在式I-B的某些示范性化合物中，R1是H；R3选自亚甲基、亚乙基、亚丙基或亚丁基；R4选自H或甲基；和/或R2选自苯基、呋喃、甲基吡咯、苯甲酸甲酯、氨基苯基、羟基苯基、氰基苯基或甲氧基苯基。
本文举例说明了式I-B化合物，包括选自下组的化合物：2-(2-氨基-乙基)-5-呋喃-2-基-2H-吡唑-3-基、2-(2-氨基-丙基)-5-苯基-2H-吡唑-3-基、2-(2-氨基-乙基)-5-苯基-2H-吡唑-3-基、2-(2-氨基-乙基)-5-(1-甲基-1H-吡咯-2-基)-2H-吡唑-3-基、2-(2-氨基-丙基)-5-苯基-2H-吡唑-3-基、2-(2-氨基-乙基)-5-(4-氨基-苯基)-2H-吡唑-3-基、2-(2-氨基-乙基)-5-(4-羟基-苯基)-2H-吡唑-3-基、2-(2-甲基氨基-乙基)-5-苯基-2H-吡唑-3-基、2-(2-氨基-丙基)-5-苯基-2H-吡唑-3-基、2-(2-氨基-乙基)-5-(3-氰基-苯基)-2H-吡唑-3-基、2-(2-氨基-乙基)-5-(3-甲氧基-苯基)-2H-吡唑-3-基、4-{1-(2-氨基-乙基)-1H-吡唑-3-基}-苯甲酸甲酯、2-(2-氨基-乙基)-5-(3-氨基-苯基)-2H-吡唑-3-基和2-(2-氨基-乙基)-5-(3-羟基-苯基)-2H-吡唑-3-基。
在其它相关实施方式中，本发明提供小分子Trp-p8调节剂和其衍生物，其中所述小分子包括下式I-C所示化合物：
Figure G2007800131557D00061
式中，R1选自H、烷基、杂烷基、芳基或芳基烷基；
R2选自芳基或芳基烷基；
R3选自烷基、杂烷基、芳基烷基、-NHC(O)R5-、-OR5-或-NHR5-，其中R5是烷基或杂烷基；
R4选自H、烷基、杂烷基或芳基烷基；和
R3和R4与氮基团一起形成脂族胺。
在式I-C的某些示范性化合物中，R1是H；R2是苯基；R5选自亚甲基、亚乙基、亚丙基或亚丁基；R3选自丙酰基氨基、乙氧基、丙氧基或乙基氨基；或/或R4选自H或甲基。
本文举例说明了式I-C化合物，包括选自下组的化合物：2-(2-氨基-丙酰基氨基)-2-苯基-乙基、2-(2-氨基-乙氧基)-2-苯基-乙基、2-(2-氨基-乙氧基)-2-苯基-乙基、2-(3-氨基-丙氧基)-2-苯基-乙基、2-(2-二甲基氨基-乙氧基)-2-苯基-乙基和2-(2-氨基-乙基氨基)-2-苯基-乙基。
在其它相关实施方式中，本发明提供小分子Trp-p8调节剂和其衍生物，其中所述小分子包括下式I-D所示化合物：
Figure G2007800131557D00071
式中，R1选自H、烷基、杂烷基、芳基或芳基烷基；
R2选自芳基或芳基烷基；
R3选自烷基、杂烷基或芳基烷基；
R4选自H、烷基、杂烷基或芳基烷基；和
R3和R4与氮基团一起形成脂族胺。
在式I-D的某些示范性化合物中，R1是H；R2选自苯基或苯基氨基；R3选自亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、甲基氨基、乙基氨基、丙基氨基、丁基氨基或乙酰基；和/或R4选自H或甲基。
本文举例说明了式I-D化合物，包括选自下组的化合物：2-[2-(2-氨基-乙基氨基)-苯基]-乙基、2-(2-氨基甲基-苯基)-乙基和2-[(2-氨基-乙酰基)-苯基-氨基]-乙基。
在其它相关实施方式中，本发明提供小分子Trp-p8调节剂和其衍生物，其中所述小分子包括下式I-E所示化合物：
Figure G2007800131557D00081
式中A、B、C和D独立地选自CR1或N；A、B、C和D中至少一个是CR1；R1选自H、烷基、杂烷基、芳基、芳基烷基或卤素；其中当A、B、C和D中两个相邻的基团是CR1时，两个R1可组合形成一个芳基、环烷基或杂环烷基；
R2选自烷基、杂烷基或芳基烷基；
R3选自H、烷基、杂烷基或芳基烷基；和
R2和R3与氮基团一起形成脂族胺。
在式I-E的某些示范性化合物中，
(i)R1是H或-ORi，Ri选自甲基、羟甲基、乙基、羟乙基、丙基、羟丙基、丁基、羟丁基、乙腈，苯基，苯基甲氧基、苯基乙氧基、苯基丙氧基、苯基丁氧基或苄基；
(ii)R1是-SRii，其中Rii选自甲基、羟甲基、乙基、羟乙基、丙基、羟丙基、丁基、羟丁基、乙腈、苯基、苯基甲氧基、苯基乙氧基、苯基丙氧基、苯基丁氧基或苄基；
(iii)R1是-S(O)Riii，其中Riii选自甲基、羟甲基、乙基、羟乙基、丙基、羟丙基、丁基、羟丁基、乙腈、苯基、苯基甲氧基、苯基乙氧基、苯基丙氧基、苯基丁氧基或苄基；
(iv)R1是-S(O)2Riv，其中Riv选自甲基、羟甲基、乙基、羟乙基、丙基、羟丙基、丁基、羟丁基、乙腈、苯基、苯基甲氧基、苯基乙氧基、苯基丙氧基、苯基丁氧基和苄基；
(v)R1是-C(O)NRvRvi，其中Rv和Rvi独立地选自H、甲基、羟甲基、乙基、羟乙基、丙基、羟丙基、丁基、羟丁基、二乙基氨基乙基、苯基、吡啶基、甲氧基乙基、羟基乙氧基乙基、苄基、甲基苯基、苯基乙基、羟基羟甲基苯基乙基、氨甲酰基甲基或羟甲基羟乙基；
(vi)R1是-C(O)NRvRvi，其中Rv和Rvi一起形成吗啉、哌嗪、哌嗪乙酯；
(vii)R2选自亚甲基、亚乙基、亚丙基或亚丁基；
(viii)R2是亚乙基，R3是H；和
(ix)R1是CF3或卤素。
本文列举了式I-E所示的化合物，包括选自下组的化合物：3-(2-氨基-乙基)-5-甲氧基-1，3-二氢-苯并咪唑-2-酮、3-(2-氨基-乙基)-5-(3-羟基-丙氧基)-1，3-二氢-苯并咪唑-2-酮、3-(2-氨基-乙基)-5-乙氧基-1，3-二氢-苯并咪唑-2-酮、3-(2-氨基-乙基)-5-甲磺酰基-1，3-二氢-苯并咪唑-2-酮、3-(2-氨基-乙基)-5-(2-羟基-乙氧基)-1，3-二氢-苯并咪唑-2-酮、3-(2-氨基-乙基)-2-氧代-2，3-二氢-1H-苯并咪唑-5-羧酸酰胺、3-(2-氨基-乙基)-5-甲基硫烷基-1，3-二氢-苯并咪唑-2-酮、3-(2-氨基-乙基)-5-甲烷亚磺酰基-1，3-二氢-苯并咪唑-2-酮、3-(2-氨基-乙基)-2-氧代-2，3-二氢-1H-苯并咪唑-5-羧酸(2-二乙基氨基-乙基)-酰胺、3-(2-氨基-丙基)-2，3-二氢-苯并咪唑-2-酮、[3-(2-氨基-乙基)-2-氧代-2，3-二氢-1H-苯并咪唑-5-基氧]-乙腈、3-(2-氨基-乙基)-2-氧代-2，3-二氢-1H-苯并咪唑-5-羧酸乙基酰胺、3-(2-氨基-乙基)-2-氧代-2，3-二氢-1H-苯并咪唑-5-羧酸吡啶-3-基酰胺、3-(2-氨基-乙基)-2-氧代-2，3-二氢-1H-苯并咪唑-5-羧酸(2-甲氧基-乙基)-酰胺、1-(2-氨基-乙基)-1，3-二氢-苯并咪唑-2-酮、1-(2-氨基-乙基)-1，3-二氢-萘并[2，3-d]咪唑-2-酮、3-(2-氨基-乙基)-2-氧代-2，3-二氢-1H-苯并咪唑-5-羧酸(2-羟基-乙基)-酰胺、3-(2-氨基-乙基)-5-丙氧基-1，3-二氢-苯并咪唑-2-酮、3-(2-氨基-乙基)-1，3-二氢-咪唑并[4，5-c]吡啶-2-酮、3-(2-氨基-乙基)-2-氧代-2，3-二氢-1H-苯并咪唑-4-羧酸(2-二乙基氨基-乙基)-酰胺、3-(2-氨基-乙基)-2-氧代-2，3-二氢-1H-苯并咪唑-5-羧酸吡啶-4-基酰胺、3-(2-氨基-乙基)-1，3-二氢-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-酮、1-(3-氨基-丙基)-1，3-二氢-苯并咪唑-2-酮、3-(2-氨基-乙基)-2-氧代-2，3-二氢-1H-苯并咪唑-5-羧酸苯基酰胺、3-(2-氨基-乙基)-2-氧代-2，3-二氢-1H-苯并咪唑-5-羧酸[2-(2-羟基-乙氧基)-乙基]-酰胺、1-(2-氨基-乙基)-5-三氟甲基-1，3-二氢-苯并咪唑-2-酮、1-(2-氨基-乙基)-1，3-二氢-咪唑并[4，5-c]吡啶-2-酮、3-(2-氨基-乙基)-2-氧代-2，3-二氢-1H-苯并咪唑-5-羧酸苄基酰胺、3-(2-氨基-乙基)-5-(吗啉-4-羰基)-1，3-二氢-苯并咪唑-2-酮、3-(2-氨基-乙基)-5-(2-氧代-2-苯基-乙氧基)-1，3-二氢-苯并咪唑-2-酮、3-(2-甲基氨基-乙基)-1，3-二氢-苯并咪唑-2-酮、3-(2-氨基-乙基)-5-丁氧基-1，3-二氢-苯并咪唑-2-酮、3-(2-氨基-乙基)-2-氧代-2，3-二氢-1H-苯并咪唑-5-羧酸甲基-苯基-酰胺、4-[3-(2-氨基-乙基)-2-氧代-2，3-二氢-1H-苯并咪唑-5-羰基]-哌嗪-1-羧酸乙酯、3-(2-氨基-乙基)-2-氧代-2，3-二氢-1H-苯并咪唑-5-羧酸二乙基酰胺、3-(2-氨基-乙基)-2-氧代-2，3-二氢-1H-苯并咪唑-5-羧酸苯乙基-酰胺、3-(2-氨基-乙基)-2-氧代-2，3-二氢-1H-苯并咪唑-5-羧酸(2-羟基-1-羟甲基-2-苯基-乙基)-酰胺、3-(2-氨基-乙基)-2-氧代-2，3-二氢-1H-苯并咪唑-5-羧酸氨甲酰基甲基-酰胺、3-(2-氨基-乙基)-2-氧代-2，3-二氢-1H-苯并咪唑-5-羧酸(2-羟基-1-羟甲基-乙基)-酰胺、N-{2-[2-氧代-2，3-二氢-苯并咪唑-1-基]-乙基}-胍、3-(2-氨基-乙基)-5-苄氧基-1，3-二氢-苯并咪唑-2-酮或1-(4-氨基-丁基)-1，3-二氢-苯并咪唑-2-酮。一个这类实施方式提供化合物3-(2-氨基-乙基)-1-(2-异丙基-5-甲基-环己烷羰基)-5-甲氧基-1，3-二氢-苯并咪唑-2-酮。
本发明其它方面提供组合物，包括药物组合物，其含有一种或多种式I、式I-A、式I-B、式I-C、式I-D和式I-E所示的小分子Trp-p8调节剂以及药学上可接受的赋形剂、载体和/或稀释剂。实施例中举例说明式I、式I-A、式I-B、式I-C、式I-D和式I-E所示的具体Trp-p8激动剂和拮抗剂；式I、式I-A、式I-B、式I-C、式I-D和式I-E所示的示范性Trp-p8激动剂和拮抗剂的合成方法；以及证明式I、式I-A、式I-B、式I-C、式I-D和式I-E所示的各Trp-p8激动剂和拮抗剂的体外功效和比活的EC50数据。
在其它方面，本发明组合物包含一种或多种式I、式I-A、式I-B、式I-C、式I-D和/或式I-E所示的化合物，以及配制在一起的一种或多种癌症治疗剂。或者，本发明组合物包含式I、式I-A、式I-B、式I-C、式I-D和/或式I-E所示的化合物，以及单独配制的一种或多种癌症治疗剂。即，式I、式I-A、式I-B、式I-C、式I-D和/或式I-E所示的一种或多种化合物和癌症治疗剂是分开配制的。
合适的癌症治疗剂包括但不限于：抗有丝分裂剂，包括但不限于：紫杉醇、长春新碱和依托泊甙；烷化剂，包括但不限于：双氯乙基甲胺、环磷酰胺和卡莫司汀；抗代谢剂，包括但不限于：甲氨蝶呤、吉西他滨、洛美曲索、5-氟尿嘧啶和6-巯基嘌呤；细胞毒性抗生素，包括但不限于：多柔比星、道诺霉素、博来霉素、丝裂霉素C和链佐星；铂剂，包括但不限于：顺铂和卡铂；激素药物，包括但不限于：抗-雌激素如他莫昔芬和二乙基已烯雌酚，以及抗-雄激素如氟他胺；抗血管新生剂；以及法尼基转移酶抑制剂。
在某些方面，式I、式I-A、式I-B、式I-C、式I-D和/或式I-E所示的化合物与本身不能有效地调节Trp-p8表达细胞中的Trp-p8活性的抗癌剂联合给药。令人惊讶的是，相对于单独使用式I、式I-A、式I-B、式I-C、式I-D和/或式I-E所示的化合物，这些类型的联合治疗导致疗效提高。
在其它方面，将式I、式I-A、式I-B、式I-C、式I-D和/或式I-E所示的化合物与一种或多种其它Trp-p8调节剂联合给药，所述其它Trp-p8调节剂包括但不限于式I、式I-A、式I-B、式I-C、式I-D和/或式I-E所示的化合物。
某些实施方式中提供本文所述小分子Trp-p8激动剂的小分子拮抗剂。因此，某些实施方式中提供一种或多种式I、式I-A、式I-B、式I-C、式I-D和/或式I-E所示Trp-p8激动剂的式I、式I-A、式I-B、式I-C、式I-D和/或式I-E所示的小分子Trp-p8拮抗剂和其衍生物。
本发明其它实施方式提供降低细胞活力和/或抑制细胞生长的方法、刺激阳离子内流的方法和诱导Trp-p8表达细胞凋亡和/或坏死的方法。这类方法的示范性例子包括使细胞与一定浓度的式I、式I-A、式I-B、式I-C、式I-D和/或式I-E所示化合物接触一段时间的步骤，所述接触能降低细胞活力和/或抑制细胞生长、提高胞内钙、和/或诱导该细胞凋亡和/或坏死。
在其它实施方式中，本发明提供通过给予一种或多种本发明化合物和/或组合物来治疗哺乳动物，最常见是人的疾病的方法。在某些方面，该方法包括以同时的方式，例如在一种制剂中递送给予含有式I、式I-A、式I-B、式I-C、式I-D和/或式I-E所示化合物与一种或多种癌症治疗剂的组合的组合物。在某些其它方面，本发明方法包括联合治疗，其中首先在一种制剂中给予式I、式I-A、式I-B、式I-C、式I-D和/或式I-E所示化合物，然后在另一制剂中给予癌症治疗剂。该方法也包括首先在一种制剂中递送癌症治疗剂，然后在另一制剂中递送式I、式I-A、式I-B、式I-C、式I-D和/或式I-E所示化合物。
本发明治疗方法在治疗与Trp-p8表达相关的癌症方面特别有效，这些癌症包括但不限于某些结肠癌、肺癌、乳腺癌和前列腺癌。
本发明的上述和其它特征以及获得它们的方式明显可见，可通过参照下文中更详细的描述并阅读附图来更好地理解本发明。
附图简要说明
图1A-1B描述适用于测试和鉴定本发明小分子Trp-p8调节剂的示范性ATP活力实验。在预实验(图1A)中，检测1μM的化合物，在37℃测得特异性杀伤表达Trp-p8的CHO细胞(CHO/Trp-p8)。在后续实验(图1B)中，检测不同浓度的化合物，在37℃测得杀伤表达Trp-p8的CHO细胞(CHO/Trp-p8)。由细胞活力与浓度的曲线图得到EC50值。
图2A-2C描述Trp-p8调节剂诱导的胞内钙增加，该结果是用37℃进行的钙流实验测定的。图2A是阳性对照，显示出37℃的钙流实验中CHO和CHO/Trp-p8细胞对2μM伊屋诺霉素的反应相似。图2B是阴性对照，显示出不表达内源性或外源性Trp-p8的亲代CHO细胞对10μM浓度的Trp-p8激动剂无反应。图2C显示，Trp-p8激动剂在37℃诱导CHO/Trp-p8细胞发生浓度依赖性的特异性反应。
图3是流式细胞测定数据图，显示Trp-p8激动剂能够在37℃以剂量依赖方式特异性诱导表达Trp-p8的CHO细胞凋亡。
图4描述了通过本文所述的ATP活力实验用CHO/Trp-p8细胞在37℃初步筛选Trp-p8拮抗剂的示范性结果。使CHO/Trp-p8细胞接触1％DMSO或含有毒性浓度Trp-p8激动剂的1％DMSO配制的不同浓度的化合物。37℃培育24-26小时后，用ATP实验测定细胞活力。将保护细胞免受Trp-p8激动剂的毒性作用的化合物称为Trp-p8拮抗剂(化合物A-B)。无活性化合物(化合物C)没有保护作用，在本文中用于说明实验的目的。
图5描述了通过37℃进行的钙流实验筛选和鉴定Trp-p8拮抗剂。用钙指示剂染料Fura-2加载CHO/Trp-p8细胞，通过荧光增强来确定因化合物所致的胞内钙增加。使Fura-2染料加载的CHO/Trp-p8细胞于37℃接触1％DMSO或1％DMSO配制的不同浓度的拮抗剂。三分钟后，向细胞中加入激动剂。细胞接触有效浓度的拮抗剂时，它们对激动剂的反应能力显著降低或被完全消除。
图6A-6B描述适用于测试和鉴定本发明小分子Trp-p8调节剂的示范性动物模型的结果。用CHO/Trp-p8细胞皮下注射小鼠，导致形成实体瘤。用Vernier游标卡尺测定各肿瘤的长度(最长的尺寸)和宽度(垂直于长度并与长度在同一平面上的尺寸)，通过椭圆体积计算公式0.52*L*W2估算肿瘤体积。平均肿瘤体积达到约100mm3时，将小鼠随机分组。在图6A中，通过经口强饲法给予小鼠单剂量水性制剂形式的研究化合物或单独的运载体。在图6B中，通过经口强饲法重复给予小鼠水性制剂形式的研究化合物或单独的运载体。然后，在所示日期测定肿瘤。数据表示为平均肿瘤体积±平均值的标准差。
图7描述了单次腹膜内注射给予小鼠后，几种化合物的血浆浓度随时间和剂量的变化。化合物均溶解于水性制剂中，并以相当的剂量水平给药。在所示时间点采集血液，分析药物水平。
图8A-8B描述了在表达Trp-p8的鼠肿瘤异种移植模型中几种化合物的功效。用CHO/Trp-p8细胞皮下注射小鼠，导致形成实体瘤。用游标卡尺测定各肿瘤的长度(L：最长的尺寸)和宽度(W：垂直于长度并与长度在同一平面上的尺寸)，通过椭圆体积计算公式0.52*L*W2估算肿瘤体积。平均肿瘤体积达到约100mm3时，将小鼠随机分组，并在所示日期通过腹膜内注射给予水性制剂形式的化合物或单独的运载体。所有化合物的给药剂量水平相当。然后，在所示日期测定肿瘤。数据表示为平均肿瘤体积±平均值的标准差。
图9A和9B描述了单次经口给予大鼠(图9A)和犬(图9B)后，几种化合物的血浆浓度随时间和剂量的变化。化合物均溶解于水性制剂中，并通过经口强饲法以相当的剂量水平给药。在所示时间点采集血液，并分析药物水平。
图10A和10B描述了在表达Trp-p8的鼠异种移植瘤模型中几种化合物的功效。用CHO/Trp-p8细胞皮下注射小鼠，导致形成实体瘤。用游标卡尺测定各肿瘤的长度(L：最长的尺寸)和宽度(W：垂直于长度并与长度在同一平面上的尺寸)，通过椭圆体积计算公式0.52*L*W2估算肿瘤体积。平均肿瘤体积达到约100mm3时，将小鼠随机分组，并通过经口强饲法给予一个剂量的水性制剂形式的化合物或单独的运载体。然后，在所示日期测定肿瘤。数据表示为平均肿瘤体积±平均值的标准差。
图11描述了在不表达Trp-p8的鼠异种移植瘤模型中，示范性化合物没有效果。用不表达Trp-p8的CHO-K1细胞皮下注射小鼠，导致形成实体瘤。用Vernier游标卡尺测定各肿瘤的长度(L：最长的尺寸)和宽度(W：垂直于长度并与长度在同一平面上的尺寸)，通过椭圆体积计算公式0.52*L*W2估算肿瘤体积。平均肿瘤体积达到约50mm3时，将小鼠随机分组，并通过经口强饲法给予一个剂量的水性制剂形式的化合物或运载体。然后，在所示日期测定肿瘤。数据表示为平均肿瘤体积±平均值的标准差。
图12描述了在表达Trp-p8的鼠异种移植瘤模型中，示范性化合物具有疗效。LuCaP肿瘤模型获自Robert L.Vassella博士，他是华盛顿大学医学院泌尿学系的教授(Professor of Urology in the University of Washington’s School ofMedicine)。用Vernier游标卡尺测定各肿瘤的长度(L：最长的尺寸)和宽度(W：垂直于长度并与长度在同一平面上的尺寸)，通过椭圆体积计算公式0.52*L*W2估算肿瘤体积。平均肿瘤体积达到150mm3时，通过腹膜内注射给予小鼠水性制剂形式的化合物，每天一次，共5天。然后，在所示日期测定肿瘤。数据表示为平均肿瘤体积±平均值的标准差。
SEQ ID NO：1是人Trp-p8cDNA的核苷酸序列(GenBank登录号AY090109)。
SEQ ID NO：2是SEQ ID NO：1的核苷酸序列所编码的氨基酸序列(GenBank登录号NP_076985)。
发明详述
本发明基于以下发现：某些小分子Trp-p8调节剂，包括Trp-p8活性激动剂能够抑制Trp-p8表达细胞的生长和/或诱导其凋亡和/或坏死。如果不希望受任何具体作用方式的束缚，相信Trp-p8激动剂介导的Trp-p8受体激活能显著增加阳离子内流，这与细胞毒性有关联。还相信，Trp-p8拮抗剂可抑制内源性Trp-p8激活的基础水平和/或天然配体诱导的活性，从而导致表达这种阳离子通道蛋白的细胞生长减慢或死亡。
因此，本发明提供小分子Trp-p8调节剂，包括Trp-p8活性的激动剂和拮抗剂，以及含有一种或多种小分子Trp-p8调节剂和一种或多种药学上可接受的载体和/或赋形剂的组合物，包括药物组合物。本发明也提供含有一种或多种Trp-p8调节剂和一种或多种其它治疗性化合物，如癌症治疗剂的联用组合物。Trp-p8调节剂和含有Trp-p8调节剂的组合物在激活Trp-p8介导的细胞阳离子内流的方法、诱导细胞凋亡和/或坏死的方法、以及治疗与Trp-p8表达有关的疾病的方法中有应用价值，所述疾病包括但不限于癌症，如乳腺癌、结肠癌、肺癌和前列腺癌。
定义
术语“Trp-p8调节剂”总地指能结合或者提高或降低细胞中的Trp-p8活性的小分子激动剂和拮抗剂的化合物。Trp-p8激动剂包括式I、式I-A、式I-B、式I-C、式I-D和/或式I-E所示化合物和其化学衍生物。本领域技术人员不难利用本文明确提供的方法和/或本领域可用的方法来合成和表征式I、式I-A、式I-B、式I-C、式I-D和/或式I-E所示的Trp-p8拮抗剂。
术语“激活Trp-p8”指激动剂介导的激活细胞表面上表达的Trp-p8。例如，在某些实施方式中，本发明激动剂与细胞接触和/或体内给予哺乳动物对象时，能激活Trp-p8，从而促进阳离子如钙离子内流，达到一定细胞内水平和/或维持一定时间，足以引起细胞生长减慢和/或坏死性和/或凋亡性细胞死亡开始所表现的细胞毒性。
术语“脂族胺”指其中除H以外的任何取代基均通过饱和碳原子连接于氮的取代的氮原子。
除非另有说明，单独或作为另一取代基一部分的术语＂烷基＂指含有所标碳原子数目(即C1-C10指1-10个碳)的直链或支链或者环状烃基，或其组合，它们可以是完全饱和、单不饱和或多不饱和的，并可包括二价和多价基团。饱和烃基的例子包括例如：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、(环己基)乙基、环丙基甲基，例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基等的同系物和异构体。不饱和烷基是含有一个或多个双键或三键的基团。不饱和烷基的例子包括乙烯基、2-丙烯基、丁烯基、2-异戊烯基、2-(丁间二烯基)、2，4-戊二烯基、3-(1，4-戊二烯基)、乙炔基、1-和3-丙炔基、3-丁炔基，以及更高级同系物和异构体。
术语“烯基”指含有一个或多个碳碳双键的分支或不分支的烃链。
术语“炔基”指含有一个或多个碳碳三键的分支或不分支的烃链。
单独或作为另一取代基一部分的术语“亚烷基”指由烷产生的二价基团，如--CH2CH2CH2CH2--。亚烷基一般含有1-24个碳原子，本发明优选含有10个以下碳原子的基团。“低级烷基”或“低级亚烷基”是通常含有8个以下碳原子的短链烷基或亚烷基。
单独或作为另一取代基一部分的术语“环亚烷基”指由环烷产生的二价基团，如环亚己基。环亚烷基一般含有5-8个碳原子，本发明优选含有6个碳原子的基团。
单独或作为另一取代基一部分的术语“亚烯基”指由烯基产生的二价基团，如-CH＝CHCH2CH2-。亚烯基一般含有2-24个碳原子，本发明优选含有10个以下碳原子的基团。
术语“烷氧基”、“烷基氨基”和“烷硫基”指所含烷基分别通过氧、氮或硫原子连接于分子其余部分的基团。相似地，常规意义上所用术语“二烷基氨基”指--NR′R，其中R基团可以是相同或不同的烷基。
除非另有说明，单独或与另一术语组合的术语“杂烷基”指稳定的直链或支链或者环状烃基，或其组合，它是完全饱和或含有1-3个不饱和键，由所标识数量的碳原子和1-3个杂原子组成，所述杂原子选自O、N、Si或S，其中所述氮原子和硫原子可任选被氧化，所述氮杂原子可任选被季铵化。杂原子O、N和S可位于杂烷基的任何内部位置上。杂原子Si可位于杂烷基的任何位置上，包括烷基与该分子其余部分连接的位置。例子包括--CH2--CH2--O--CH3、--CH2--CH2--NH--CH3、--CH2--CH2--N(CH3-)--CH3、--CH2--S--CH2--CH3、--CH2--CH2--S(O)--CH3、--CH2--CH2--S(O)2--CH3、--CH＝CH--O--CH3、--Si(CH3)3、--CH2--CH＝N--OCH3-和-CH＝CH--N(CH3)--CH3。至多可以出现2个连续的杂原子，例如--CH2--NH--OCH3和--CH2--O--Si(CH3)3。术语“杂烷基”包括下文中称为“杂环烷基”的基团。单独或作为另一取代基一部分的术语“杂亚烷基”指由杂烷基产生的二价基团，例如--CH2--CH2--S--CH2CH2—和--CH2--S--CH2CH2--NH--CH2--。在杂亚烷基中，杂原子也可占据一个或两个链末端的位置。另外，在亚烷基和杂亚烷基连接基团中，不限定连接基团的取向。
术语“酰基”指有机酸去除羟基部分后产生的基团。因此，酰基包括例如，乙酰基、丙酰基、丁酰基、癸酰基、新戊酰基、苯甲酰基等。
“活化羰基”是因为连接于羰基任一侧的基团致使其亲电子性提高的羰基。这类活化羰基的例子是(聚氟代烷基)酮、(聚氟代烷基)醛、α-酮酯、α-酮酸、α-酮酰胺、1，2-二酮、2-酰基噻唑、2-酰基咪唑等。
除非另有说明，单独或与其它术语一起使用的术语“环烷基”和“杂环烷基”分别代表环状“烷基”和“杂烷基”。此外，在杂环烷基中，杂原子可占据杂环与分子其余部分连接的位置。环烷基的例子包括环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等。杂环烷基的例子包括1-(1，2，5，6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。
除非另有说明，单独或作为另一取代基一部分的术语“卤原子”或“卤素”指氟、氯、溴或碘原子。此外，术语如“氟代烷基”旨在包括一氟代烷基和多氟代烷基。
除非另有说明，单独或与其它术语联合使用(如芳氧基、芳硫氧基、芳烷基)的术语“芳基”指可能是单环或融合或共价连接在一起的多环(至多三个环)的芳族取代基。术语“杂芳基”旨在包括含有0-4个选自N、O或S的杂原子的芳环，其中所述氮和硫原子任选被氧化，所述氮原子任选被季铵化。“杂芳基”可通过杂原子连接于分子的其余部分。芳基和杂芳基的非限制例子包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-唑基、4-唑基、2-苯基-4-唑基、5-唑基、3-异唑基、4-异唑基、5-异唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。上述芳环系统的取代基选自下述可接受的取代基。术语“芳基烷基”旨在包括芳基或杂芳基连接于烷基(如苄基、苯乙基、吡啶基甲基等)或杂烷基(如苯氧基甲基、2-吡啶基氧基甲基、3-(1-萘基氧基)丙基等)的基团。
上述术语(如“烷基”、“杂烷基”和“芳基”)各自包括所述基团的取代和未取代形式。各种类型基团的优选取代基如下所述。
烷基和杂烷基(包括常常称为亚烷基、烯基、杂亚烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基的基团)的取代基可以是选自下组的各种基团：--OR′、＝O、＝NR′、＝N--OR′、--NR′R″、--SR′、-卤素、--SiR′R″R″′、--OC(O)R′、--C(O)R′、--CO2R′、CONR′R″、--OC(O)NR′R″、--NR″C(O)R′、--NR′--C(O)NR″R″′、--NR″C(O)2R′、--NH--C(NH2)＝NH、--NR′C(NH2)＝NH、--NH--C(NH2)＝NR′、--S(O)R′、S(O)2R′、--S(O)2NR′R″、--CN和—NO2，数量为0至(2N+1)个，其中N是这类基团中的碳原子总数。R′、R″和R″′各自独立地指氢、未取代的(C1-C8)烷基和杂烷基、未取代的芳基、用1-3个卤原子取代的芳基、未取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基，或者芳基-(C1-C4)烷基。R′和R″连接于同一个氮原子时，它们可与该氮原子一起形成5-、6-或7-元环。例如，--NR′R″包括1-吡咯烷基和4-吗啉基。从上述有关取代基的讨论中，本领域技术人员应理解，术语“烷基”包括诸如卤代烷基(如--CF3和--CH2CF3)和酰基(如--C(O)CH3、--C(O)CF3、--C(O)CH2OCH3等)等基团。
相似地，芳基的取代基可以变化，选自：-卤素、--OR′、--OC(O)R′、--NR′R″、--SR′、--R′、--CN、--NO2、--CO2R′、--CONR′R″、--C(O)R′、--OC(O)NR′R″、--NR″C(O)R′、--NR″C(O)2R′、--NR′---C(O)NR″R″′、--NH--C(NH2)＝NH、--NR′C(NH2)＝NH、--NH--C(NH2)＝NR′、--S(O)R′、--S(O)2R′、--S(O)2NR′R″、--NR″--S(O)2--R′、--N3、--CH(Ph)2、全氟(C1-C4)烷氧基或全氟(C1-C4)烷基，数量为0至芳环系统上开放价位的总数；其中R′、R″和R″′独立地选自：氢、(C1-C8)烷基或杂烷基、未取代的芳基、(未取代的芳基)-(C1-C4)烷基或(未取代的芳基)氧-(C1-C4)烷基。
可用通式为--T--C(O)--(CH2)q--U--的取代基任选取代芳基环的相邻原子上的两个取代基，其中T和U独立地是--NH--、--O--、--CH2--或单键，下标q是0-2的整数。或者，可用通式为--A--(CH2)r--B--的取代基任选取代芳基环的相邻原子上的两个取代基，其中A和B独立地是--CH2--、--O--、--NH--、--S--、--S(O)--、--S(O)2--、--S(O)2NR′--或单键，r是1-3的整数。可用双键任选地替代如此形成的新环的一个单键。或者，可用通式为--(CH2)s--X--(CH2)t--的取代基任选取代芳环相邻碳上的两个取代基，其中s和t独立地是0-3的整数，X是--O--、--NR′--、--S--、--S(O)--、--S(O)2--或--S(O)2NR′--。--NR--和--S(O)2NR′--中的取代基R′选自氢或未取代的(C1-C6)烷基。
本文所用术语“杂原子”旨在包括氧(O)、氮(N)和硫(S)。
术语“药学上可接受的盐”旨在包括根据本文所述化合物上的特定取代基，用相对无毒的酸或碱制备的式I、式I-A、式I-B、式I-C、式I-D和式I-E所示活性化合物的盐。药学上可接受的碱加成盐的例子包括但不限于钠盐、钾盐、钙盐、铵盐、有机氨基盐、镁盐或其它类似盐。药学上可接受的酸加成盐的例子包括但不限于：衍生自无机酸的盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、硝酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐，磷酸盐、磷酸氢盐，磷酸二氢盐、硫酸盐、硫酸氢盐、氢碘酸盐或亚磷酸盐等，以及衍生自相对无毒的有机酸的盐，如乙酸盐、丙酸盐、异丁酸盐、草酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、富马酸盐、扁桃酸盐、邻苯二甲酸盐、苯磺酸盐、对甲基苯磺酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐等。
TRP-P8活性的小分子调节剂
本文列举了适用于本发明组合物和方法的小分子Trp-p8调节剂，即式I、式I-A、式I-B、式I-C、式I-D和式I-E所示化合物和其衍生物。
因此，在一个实施方式中，本发明提供小分子Trp-p8调节剂和其衍生物，其中所述小分子包括下式I所示化合物：
Figure G2007800131557D00191
式中，R1选自H、烷基、杂烷基、芳基烷基或芳基，或者，R1和R2可与氮基团一起形成至多25个原子的环基或杂环基；
R2选自芳基或芳基烷基；
R3选自烷基、杂烷基或芳基烷基；
R4选自H、烷基、杂烷基或芳基烷基；和
R3和R4与氮基团一起形成脂族胺。
在相关实施方式中，本发明提供小分子Trp-p8调节剂和其衍生物，其中所述小分子包括下式I-A所示化合物：
Figure G2007800131557D00201
式中A、B、C和D独立地选自CR2或N；A、B、C和D中至少一个是CR2；R2选自H、烷基、杂烷基、芳基、卤素、芳基烷基、R6O-或R6S-，其中R6是烷基；当A、B、C和D中两个相邻的基团是CR2时，两个R2可组合形成一个芳基、环烷基或杂环烷基；和
R1选自H、烷基、杂烷基、芳基或芳基烷基；
R3选自烷基、杂烷基、芳基、芳基烷基、-NR7C(O)-、-C(O)NR7-、-O-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-或-NR7-，其中R7选自H、烷基、杂烷基、芳基或芳基烷基；
R4选自-C(O)R8-、烷基、芳基烷基或杂烷基，其中R8选自烷基或杂烷基；
R5选自H、烷基、杂烷基或芳基烷基；和
R4和R5与氮基团一起形成脂族胺。
在式I-A的某些示范性化合物中，R1是H；R7是H；R8包含2、3或4个碳；R4选自丙酰基、乙基基、丁酰基、羟基丙酰基或3-羟基丁酰基；R5选自H或甲基；R6包含1、2、3、4、5或6个碳；和/或R2选自甲氧基、甲硫烷基、苯基或H。
本文举例说明了式I-A化合物，包括选自下组的化合物：2-(2-氨基-丙酰基氨基)-4-甲氧基-苯基、N-(2-氨基-乙基)-2-氨基-5-甲硫烷基-苯基、1-(2-氨基-乙氧基)-萘-2-基、2-(2-氨基-乙基氨基)-4-甲硫烷基-苯基、N-(2-氨基-乙基)-5-甲氧基-苯甲酰胺、2-(2-氨基-丁酰基氨基)-4-甲氧基-苯基、2-(2-氨基-3-羟基-丙酰基氨基)-4-甲氧基-苯基、3-(2-氨基-乙基氨基)-萘-2-基、N-(2-氨基-乙基)-2-氨基-苯甲酰胺、2-(2-氨基-3-羟基-丙酰基氨基)-4-甲氧基-苯基、2-(2-氨基-乙酰基氨基)-苯基、2-(2-氨基-3-羟基-丁酰基氨基)-4-甲氧基-苯基酰胺和2-(2-氨基-乙酰基氨基)-4-甲氧基-苯基。
在其它相关实施方式中，本发明提供小分子Trp-p8调节剂和其衍生物，其中所述小分子包括下式I-B所示化合物：
式中，R1选自H、烷基、杂烷基、芳基或芳基烷基；
R2选自芳基、烷基、杂烷基或芳基烷基；
R3选自烷基、杂烷基或芳基烷基；
R4选自H、烷基、杂烷基或芳基烷基；和
R3和R4与氮基团一起形成脂族胺。
在式I-B的某些示范性化合物中，R1是H；R3选自亚甲基、亚乙基、亚丙基或亚丁基；R4选自H或甲基；和/或R2选自苯基、呋喃、甲基吡咯、苯甲酸甲酯、氨基苯基、羟基苯基、氰基苯基或甲氧基苯基。
本文举例说明了式I-B化合物，包括选自下组的化合物：2-(2-氨基-乙基)-5-呋喃-2-基-2H-吡唑-3-基、2-(2-氨基-丙基)-5-苯基-2H-吡唑-3-基、2-(2-氨基-乙基)-5-苯基-2H-吡唑-3-基、2-(2-氨基-乙基)-5-(1-甲基-1H-吡咯-2-基)-2H-吡唑-3-基、2-(2-氨基-丙基)-5-苯基-2H-吡唑-3-基、2-(2-氨基-乙基)-5-(4-氨基-苯基)-2H-吡唑-3-基、2-(2-氨基-乙基)-5-(4-羟基-苯基)-2H-吡唑-3-基、2-(2-甲基氨基-乙基)-5-苯基-2H-吡唑-3-基、2-(2-氨基-丙基)-5-苯基-2H-吡唑-3-基、2-(2-氨基-乙基)-5-(3-氰基-苯基)-2H-吡唑-3-基、2-(2-氨基-乙基)-5-(3-甲氧基-苯基)-2H-吡唑-3-基、4-{1-(2-氨基-乙基)-1H-吡唑-3-基}-苯甲酸甲酯、2-(2-氨基-乙基)-5-(3-氨基-苯基)-2H-吡唑-3-基和2-(2-氨基-乙基)-5-(3-羟基-苯基)-2H-吡唑-3-基。
在其它相关实施方式中，本发明提供小分子Trp-p8调节剂和其衍生物，其中所述小分子包括下式I-C所示化合物：
Figure G2007800131557D00221
式中，R1选自H、烷基、杂烷基、芳基或芳基烷基；
R2选自芳基或芳基烷基；
R3选自烷基、杂烷基、芳基烷基、-NHC(O)R5-、-OR5-或-NHR5-，其中R5是烷基或杂烷基；
R4选自H、烷基、杂烷基或芳基烷基；和
R3和R4与氮基团一起形成脂族胺。
在式I-C的某些示范性化合物中，R1是H；R2是苯基；R5选自亚甲基、亚乙基、亚丙基或亚丁基；R3选自丙酰基氨基、乙氧基、丙氧基或乙基氨基；或/或R4选自H或甲基。
本文举例说明了式I-C化合物，包括选自下组的化合物：2-(2-氨基-丙酰基氨基)-2-苯基-乙基、2-(2-氨基-乙氧基)-2-苯基-乙基、2-(2-氨基-乙氧基)-2-苯基-乙基、2-(3-氨基-丙氧基)-2-苯基-乙基、2-(2-二甲基氨基-乙氧基)-2-苯基-乙基和2-(2-氨基-乙基氨基)-2-苯基-乙基。
在其它相关实施方式中，本发明提供小分子Trp-p8调节剂和其衍生物，其中所述小分子包括下式I-D所示化合物：
式中，R1选自H、烷基、杂烷基、芳基或芳基烷基；
R2选自芳基或芳基烷基；
R3选自烷基、杂烷基或芳基烷基；
R4选自H、烷基、杂烷基或芳基烷基；和
R3和R4与氮基团一起形成脂族胺。
在式I-D的某些示范性化合物中，R1是H；R2选自苯基或苯基氨基；R3选自亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、甲基氨基、乙基氨基、丙基氨基、丁基氨基或乙酰基；和/或R4选自H或甲基。
本文举例说明了式I-D化合物，包括选自下组的化合物：2-[2-(2-氨基-乙基氨基)-苯基]-乙基、2-(2-氨基甲基-苯基)-乙基和2-[(2-氨基-乙酰基)-苯基-氨基]-乙基。
在其它相关实施方式中，本发明提供小分子Trp-p8调节剂和其衍生物，其中所述小分子包括下式I-E所示化合物：
Figure G2007800131557D00231
式中A、B、C和D独立地选自CR1或N；A、B、C和D中至少一个是CR1；R1选自H、烷基、杂烷基、芳基、芳基烷基或卤素；其中当A、B、C和D中两个相邻的基团是CR1时，两个R1可组合形成一个芳基、环烷基或杂环烷基；
R2选自烷基、杂烷基或芳基烷基；
R3选自H、烷基、杂烷基或芳基烷基；和
R2和R3与氮基团一起形成脂族胺。
在式I-E的某些示范性化合物中，
(i)R1是H或-ORi，Ri选自甲基、羟甲基、乙基、羟乙基、丙基、羟基丙基、丁基、羟基丁基、乙腈，苯基，苯基甲氧基、苯基乙氧基、苯基丙氧基、苯基丁氧基或苄基；
(ii)R1是-SRii，其中Rii选自甲基、羟甲基、乙基、羟乙基、丙基、羟基丙基、丁基、羟基丁基、乙腈、苯基、苯基甲氧基、苯基乙氧基、苯基丙氧基、苯基丁氧基或苄基；
(iii)R1是-S(O)Riii，其中Riii选自甲基、羟甲基、乙基、羟乙基、丙基、羟基丙基、丁基、羟基丁基、乙腈、苯基、苯基甲氧基、苯基乙氧基、苯基丙氧基、苯基丁氧基或苄基；
(iv)R1是-S(O)2Riv，其中Riv选自甲基、羟甲基、乙基、羟乙基、丙基、羟基丙基、丁基、羟基丁基、乙腈、苯基、苯基甲氧基、苯基乙氧基、苯基丙氧基、苯基丁氧基和苄基；
(v)R1是-C(O)NRvRvi，其中Rv和Rvi独立地选自H、甲基、羟甲基、乙基、羟乙基、丙基、羟基丙基、丁基、羟基丁基、二乙基氨基乙基、苯基、吡啶基、甲氧基乙基、羟基乙氧基乙基、苄基、甲基苯基、苯基乙基、羟基羟甲基苯基乙基、氨甲酰基甲基或羟甲基羟乙基；
(vi)R1是-C(O)NRvRvi，其中Rv和Rvi一起形成吗啉、哌嗪、哌嗪乙酯；
(vii)R2选自亚甲基、亚乙基、亚丙基或亚丁基；
(viii)R2是亚乙基，R3是H；
(ix)R1是CF3或卤素。
本文举例说明了式I-E化合物，包括选自下组的化合物：3-(2-氨基-乙基)-5-甲氧基-1，3-二氢-苯并咪唑-2-酮、3-(2-氨基-乙基)-5-(3-羟基-丙氧基)-1，3-二氢-苯并咪唑-2-酮、3-(2-氨基-乙基)-5-乙氧基-1，3-二氢-苯并咪唑-2-酮、3-(2-氨基-乙基)-5-甲磺酰基-1，3-二氢-苯并咪唑-2-酮、3-(2-氨基-乙基)-5-(2-羟基-乙氧基)-1，3-二氢-苯并咪唑-2-酮、3-(2-氨基-乙基)-2-氧代-2，3-二氢-1H-苯并咪唑-5-羧酸酰胺、3-(2-氨基-乙基)-5-甲硫烷基-1，3-二氢-苯并咪唑-2-酮、3-(2-氨基-乙基)-5-甲烷亚磺酰基-1，3-二氢-苯并咪唑-2-酮、3-(2-氨基-乙基)-2-氧代-2，3-二氢-1H-苯并咪唑-5-羧酸(2-二乙基氨基-乙基)-酰胺、3-(2-氨基-丙基)-2，3-二氢-苯并咪唑-2-酮、[3-(2-氨基-乙基)-2-氧代-2，3-二氢-1H-苯并咪唑-5-基氧基]-乙腈、3-(2-氨基-乙基)-2-氧代-2，3-二氢-1H-苯并咪唑-5-羧酸乙基酰胺、3-(2-氨基-乙基)-2-氧代-2，3-二氢-1H-苯并咪唑-5-羧酸吡啶-3-基酰胺、3-(2-氨基-乙基)-2-氧代-2，3-二氢-1H-苯并咪唑-5-羧酸(2-甲氧基-乙基)-酰胺、1-(2-氨基-乙基)-1，3-二氢-苯并咪唑-2-酮、1-(2-氨基-乙基)-1，3-二氢-萘并[2，3-d]咪唑-2-酮、3-(2-氨基-乙基)-2-氧代-2，3-二氢-1H-苯并咪唑-5-羧酸(2-羟基-乙基)-酰胺、3-(2-氨基-乙基)-5-丙氧基-1，3-二氢-苯并咪唑-2-酮、3-(2-氨基-乙基)-1，3-二氢-咪唑并[4，5-c]吡啶-2-酮、3-(2-氨基-乙基)-2-氧代-2，3-二氢-1H-苯并咪唑-4-羧酸(2-二乙基氨基-乙基)-酰胺、3-(2-氨基-乙基)-2-氧代-2，3-二氢-1H-苯并咪唑-5-羧酸吡啶-4-基酰胺、3-(2-氨基-乙基)-1，3-二氢-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-酮、1-(3-氨基-丙基)-1，3-二氢-苯并咪唑-2-酮、3-(2-氨基-乙基)-2-氧代-2，3-二氢-1H-苯并咪唑-5-羧酸苯基酰胺、3-(2-氨基-乙基)-2-氧代-2，3-二氢-1H-苯并咪唑-5-羧酸[2-(2-羟基-乙氧基)-乙基]-酰胺、1-(2-氨基-乙基)-5-三氟甲基-1，3-二氢-苯并咪唑-2-酮、1-(2-氨基-乙基)-1，3-二氢-咪唑并[4，5-c]吡啶-2-酮、3-(2-氨基-乙基)-2-氧代-2，3-二氢-1H-苯并咪唑-5-羧酸苄基酰胺、3-(2-氨基-乙基)-5-(吗啉-4-羰基)-1，3-二氢-苯并咪唑-2-酮、3-(2-氨基-乙基)-5-(2-氧代-2-苯基-乙氧基)-1，3-二氢-苯并咪唑-2-酮、3-(2-甲基氨基-乙基)-1，3-二氢-苯并咪唑-2-酮、3-(2-氨基-乙基)-5-丁氧基-1，3-二氢-苯并咪唑-2-酮、3-(2-氨基-乙基)-2-氧代-2，3-二氢-1H-苯并咪唑-5-羧酸甲基-苯基-酰胺、4-[3-(2-氨基-乙基)-2-氧代-2，3-二氢-1H-苯并咪唑-5-羰基]-哌嗪-1-羧酸乙酯、3-(2-氨基-乙基)-2-氧代-2，3-二氢-1H-苯并咪唑-5-羧酸二乙基酰胺、3-(2-氨基-乙基)-2-氧代-2，3-二氢-1H-苯并咪唑-5-羧酸苯乙基-酰胺、3-(2-氨基-乙基)-2-氧代-2，3-二氢-1H-苯并咪唑-5-羧酸(2-羟基-1-羟甲基-2-苯基-乙基)-酰胺、3-(2-氨基-乙基)-2-氧代-2，3-二氢-1H-苯并咪唑-5-羧酸氨甲酰基甲基-酰胺、3-(2-氨基-乙基)-2-氧代-2，3-二氢-1H-苯并咪唑-5-羧酸(2-羟基-1-羟甲基-乙基)-酰胺、N-{2-[2-氧代-2，3-二氢-苯并咪唑-1-基]-乙基}-胍、3-(2-氨基-乙基)-5-苄氧基-1，3-二氢-苯并咪唑-2-酮和1-(4-氨基-丁基)-1，3-二氢-苯并咪唑-2-酮。一个这类实施方式提供化合物3-(2-氨基-乙基)-1-(2-异丙基-5-甲基-环己烷羰基)-5-甲氧基-1，3-二氢-苯并咪唑-2-酮。
小分子Trp-P8活性调节剂的合成
如上所述，本发明化合物包括式I、式I-A、式I-B、式I-C、式I-D和式I-E所示化合物。在某些方面，可采用本领域已知的合成方法，利用市售原料制备这些化合物。可利用本领域已知的典型分离和纯化技术分离式I、式I-A、式I-B、式I-C、式I-D和式I-E所示化合物，这些技术包括例如：层析和重结晶方法。
本领域技术人员不难认识到，适合包含在本发明组合物和方法中的化合物可以顺式和反式异构体、E/Z形式、非对映异构体和光学异构体中的多种形式出现。因此，用于本发明组合物和方法的化合物包括所有这些组合和变化。
在式I、式I-A、式I-B、式I-C、式I-D和式I-E所示化合物中，连接四个不同取代基的碳原子是不对称碳原子。因此，式I、式I-A、式I-B、式I-C、式I-D和式I-E所示化合物可以对映异构体、非对映异构体或其混合物的形式出现。可通过层析或结晶方法，或本领域已知的其它方法来分离对映异构体和非对映异构体。不对称碳原子可以是两种构型R或S之一，这两种构型均属于本发明范围。最终的纯化产物中存在少量相反的对映异构体或非对映异构体不会影响这类化合物的治疗应用。
还可进一步处理式I、式I-A、式I-B、式I-C、式I-D和式I-E所示化合物，以形成药学上可接受的盐。用酸或碱处理本发明化合物可分别形成药学上可接受的酸加成盐和药学上可接受的碱加成盐，其各自定义如上所述。可利用本领域已知的各种无机和有机的酸和碱，包括本文上述酸和碱转化成盐。
本发明也涉及式I、式I-A、式I-B、式I-C、式I-D和式I-E所示化合物的药学上可接受的异构体、水合物和溶剂合物。这些结构式的化合物也可以各种异构体和互变异构体的形式出现，包括这类异构体和互变异构体的药学上可接受的盐、水合物和溶剂合物。
本发明也包括式I、式I-A、式I-B、式I-C、式I-D和式I-E所示化合物的前药衍生物。术语“前药”指母体药物分子的衍生物，经过生物体内的自发性或酶学生物转化，释放母体药物。前药是含有在代谢条件下可切割的基团的本发明式I、式I-A、式I-B、式I-C、式I-D和式I-E所示化合物的变体或衍生物。前药在生理条件下发生溶剂解或发生酶降解时，变成在体内有药学活性的本发明化合物。适合用于本发明化合物的示范性前药技术是美国专利申请号10/156,214和PCT申请公开号WO02/095007所详述的蛋白酶活化的癌症治疗(PACT)技术，将这两篇文献纳入本文作参考。
可通过对薄荷烷-3羧酸与亚硫酰氯反应获得的酰基氯和合适胺反应，合成式I、式I-A、式I-B、式I-C、式I-D和式I-E所示化合物。如下所述，该反应一般在存在氯化氢受体(如氢氧化钠)的溶液中，室温下进行。
基本的对薄荷烷基结构是可以顺式或反式形式出现的椅-形分子。将羧基或酰胺基团取代到3位上产生四种构型异构体或几何异构体，这取决于该取代是以轴向或赤道向(equatorially)取代形成顺式或反式异构体，这四种异构体的相互关系类似于薄荷醇与新薄荷醇、异薄荷醇和新异薄荷醇之间的关系。
在示范性实施方式中，用特定的立体化学合成式I、式I-A、式I-B、式I-C、式I-D和式I-E所示化合物，其中有关薄荷烷环的相对立体化学是薄荷醇的立体化学和/或有关薄荷烷环的绝对立体化学是(-)-薄荷醇的立体化学。
本文的实施例1-9描述了制备本发明示范性小分子Trp-p8调节剂式I、式I-A、式I-B、式I-C、式I-D和式I-E的合成方法。
含有小分子TRP-P8调节剂的组合物
如上所述，本发明涉及小分子Trp-p8调节剂，包括结合和改变Trp-p8活性的Trp-p8激动剂和Trp-p8拮抗剂。在某些实施方式中，Trp-p8调节剂是在某些情况下能够刺激表达Trp-p8通道蛋白的细胞发生阳离子内流或毒性作用的激动剂。在其它实施方式中，Trp-p8调节剂是能够降低细胞中表达的Trp-p8的活性的Trp-p8活性拮抗剂。因此，可将本发明Trp-p8调节剂用于治疗与Trp-p8表达有关的疾病的组合物，包括药物组合物。适用于本发明的组合物包含如上所述的一种或多种式I、式I-A、式I-B、式I-C、式I-D和式I-E所示的Trp-p8激动剂和/或一种或多种式I、式I-A、式I-B、式I-C、式I-D和式I-E所示的Trp-p8拮抗剂，以及一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。
在一个实施方式中，本发明提供小分子Trp-p8调节剂和药学上可接受的赋形剂，如无菌盐水或其它介质、水、明胶、油等，以形成药学上可接受的组合物。该组合物和/或激动剂可单独给药或者与任何方便的载体、稀释剂等一起给药，可以通过单个或多个剂量进行这种给药。有用的载体包括但不限于：固体、半固体或包含水和无毒有机溶剂的液体介质。
可通过将一种或多种式I、式I-A、式I-B、式I-C、式I-D和式I-E所示的Trp-p8激动剂与药学上可接受的载体或物质混合，来制备本发明药物组合物。或者，可通过将一种或多种式I、式I-A、式I-B、式I-C、式I-D和式I-E所示的Trp-p8拮抗剂与药学上可接受的载体或物质混合，来制备本发明药物组合物。此外，药物组合物还可含有赋形剂、稳定剂、稀释剂等，可以缓释或定时释放的剂型提供。用于治疗目的的可接受的载体、试剂、赋形剂、稳定剂、稀释剂等是药剂学领域众所周知的，参见例如“雷明顿药物科学”(麦克出版公司(Mack Publishing Co.)，A.R.Gennaro编，1985)。这些材料在所用剂量和浓度下对接受者无毒，包括缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐和其它有机酸盐，抗氧化剂如抗坏血酸，低分子量肽如聚精氨酸，蛋白质如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白，亲水性聚合物如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白，亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮，氨基酸如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸，单糖、二糖和其它糖，包括纤维素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖或糊精，螯合剂如EDTA，糖醇如甘露糖醇或山梨糖醇，抗衡离子如钠和/或非离子表面活性剂如吐温，或聚乙二醇。
在其它方面，本发明组合物包含式I、式I-A、式I-B、式I-C、式I-D和/或式I-E所示的化合物，以及配制在一起的一种或多种癌症治疗剂。或者，本发明组合物包含式I、式I-A、式I-B、式I-C、式I-D和/或式I-E所示的化合物，以及单独配制的一种或多种癌症治疗剂。即，式I、式I-A、式I-B、式I-C、式I-D和/或式I-E所示化合物和癌症治疗剂是分开配制的。
合适的癌症治疗剂包括但不限于：抗有丝分裂剂，包括但不限于：紫杉醇、长春新碱和依托泊甙；烷化剂，包括但不限于：双氯乙基甲胺、环磷酰胺和卡莫司汀；抗代谢剂，包括但不限于：甲氨蝶呤、吉西他滨、洛美曲索、5-氟尿嘧啶和6-巯基嘌呤；细胞毒性抗生素，包括但不限于：多柔比星、道诺霉素、博来霉素、丝裂霉素C和链佐星；铂剂，包括但不限于：顺铂和卡铂；激素药物，包括但不限于：抗-雌激素如他莫昔芬和二乙基已烯雌酚，以及抗-雄激素如氟他胺；抗血管新生剂；以及法尼基转移酶抑制剂。
在某些方面，式I、式I-A、式I-B、式I-C、式I-D和/或式I-E所示的化合物与不能有效刺激Trp-p8介导的阳离子内流的癌症治疗剂联合给药。
在其它方面，将式I、式I-A、式I-B、式I-C、式I-D和/或式I-E所示的化合物与一种或多种其它Trp-p8调节剂联合给药，所述其它Trp-p8调节剂包括但不限于式I、式I-A、式I-B、式I-C、式I-D和/或式I-E所示的化合物。
根据所考虑的具体治疗方案，可经胃肠外、外用、口服或局部给予本发明药物组合物。在某些方面，经胃肠外，如静脉内、皮下、皮内或肌内给予药物组合物。在一个实施方式中，本发明提供含有溶解或悬浮于载体如水性载体中的本发明化合物的胃肠外给药组合物。
在固体制剂中，可将化合物与常规无毒固体载体，如药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬质酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等混合。
在气雾剂给药中，可将细粉形式的本发明化合物与无毒表面活性剂和推进剂一起提供。这类物质的示范性例子是含有6-22个碳原子的脂肪酸的酯或部分酯，如己酸、辛酸(actanoic acid)、月桂酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、油脂酸(olesteric acid)和油酸的酯或部分酯。
可通过注射，即静脉内、肌内、皮内、皮下、十二指肠内或腹膜内注射给予本发明组合物。或者，可通过吸入，如鼻内吸入给予组合物，并可通过透皮途径，例如通过贴剂等给予组合物。
应理解，组合物，包括药物组合物的实际优选制剂取决于给药方式和所治疗的具体疾病。通常，根据本领域技术人员对患者和疾病的判断来确定最优的剂型和给药方式。
鉴定和表征Trp-p8小分子调节剂的体外和体内功效的方法
如上所述，本发明涉及小分子Trp-p8调节剂，包括Trp-p8活性的激动剂和拮抗剂。本文公开了Trp-p8调节剂，如上所述的式I、式I-A、式I-B、式I-C、式I-D和/或式I-E所示的化合物。本发明还考虑到，其它Trp-p8调节剂也可能适用于本发明的组合物和方法。
此外或可选地，可通过所附实施例所公开的方法来鉴定Trp-p8激动剂和拮抗剂。例如，具有治疗Trp-p8表达相关性疾病的功效的Trp-p8激动剂包括导致一种或多种以下情况的小分子：(1)抑制表达Trp-p8的细胞的生长或降低其活力；(2)刺激表达Trp-p8的细胞中的钙和/或其它阳离子内流；(3)诱导表达Trp-p8的细胞凋亡和/或坏死；和/或(4)在一种或多种人类疾病的动物模型系统中有功效。具有治疗Trp-p8表达相关性疾病的功效的Trp-p8拮抗剂包括导致一种或多种以下情况的小分子：(1)在体外模型系统中保护Trp-p8表达细胞免受激动剂的毒性作用；(2)在一种或多种人类疾病的动物模型系统中有功效。
因此，在某些实施方式中，本发明提供鉴定Trp-p8激动剂的方法，所述方法包括将Trp-p8表达细胞与一定量的候选Trp-p8激动剂接触一定时间的步骤，所述接触应足以抑制Trp-p8表达细胞的生长和/或降低其活力，其中生长抑制和/或活力降低表明候选Trp-p8激动剂能够激活该细胞表达Trp-p8。
其它实施方式提供鉴定Trp-p8激动剂的方法，所述方法包括将Trp-p8表达细胞与一定量的候选Trp-p8激动剂接触一定时间的步骤，所述接触应足以诱导钙和/或其它阳离子内流到细胞中，其中阳离子内流升高与细胞毒性提高有关联。
其它实施方式提供鉴定Trp-p8激动剂的方法，所述方法包括将一定量的候选Trp-p8激动剂给予包含一种或多种表达Trp-p8的肿瘤细胞的动物一定时间的步骤，所述给予应足以抑制细胞的生长和/或诱导其凋亡和/或坏死，从而延长动物的存活期，其中细胞生长抑制、凋亡诱导、坏死诱导和/或动物存活期延长中任何一种或多种现象表明Trp-p8激动剂的功效。
本发明提供鉴定除本文所述Trp-p8拮抗剂外的Trp-p8拮抗剂的方法。该方法包括(1)检测保护Trp-p8表达细胞免受Trp-p8激动剂诱导的毒性作用的体外实验体系；(2)检测内源性表达Trp-p8的癌细胞和/或癌细胞系的生长抑制的体外和体内实验体系；(3)体内动物模型，其中将一定量的一种或多种候选Trp-p8拮抗剂给予包含Trp-p8表达细胞的一种或多种肿瘤细胞的动物一定时间，所述给予足以抑制所述细胞的生长和/或诱导其凋亡和/或坏死，从而延长该动物的存活期。
使用Trp-p8调节剂的方法
本发明小分子Trp-p8调节剂适合在调节(即激活或降低)细胞中Trp-p8介导的钙内流的方法以及治疗与Trp-p8表达有关的一种或多种疾病的治疗方法中应用。例如，如上所述，已经观察到Trp-p8表达异常与各种癌组织，包括乳腺癌、结肠癌、肺癌和前列腺癌组织的肿瘤表型相关联。Tsavaler等，CancerResearch，同上。
因此，在某些实施方式中提供激活细胞中Trp-p8介导的钙内流的方法，这种方法包括将Trp-p8表达细胞与一定量的Trp-p8激动剂接触一定时间的步骤，所述接触足以抑制该细胞生长和/或诱导该细胞坏死和/或凋亡。激活Trp-p8的示范性方法参见本文所述的实施例。
本发明其它实施方式提供治疗与Trp-p8表达有关的疾病的方法，所述方法包括给予哺乳动物，一般是人治疗有效量的含Trp-p8激动剂的组合物一定时间的步骤，所述给予足以抑制该细胞的生长和/或诱导该细胞坏死和/或凋亡。本文所用术语“治疗有效量”指给予哺乳动物用于治疗疾病时，足以实现对疾病的治疗的化合物用量。“治疗有效量”取决于化合物、疾病及其严重程度、所治疗哺乳动物的年龄、体重等。
本文所用术语“治疗”包括：(1)预防疾病，即使得易于发生该疾病但尚未发生该疾病任何症状的哺乳动物不发生该疾病的临床症状；(2)抑制疾病，即阻滞或减少该疾病或其临床症状的发生；或(3)缓解疾病，即使得该疾病或其临床症状消退。
虽然治疗方案的频率和剂量取决于诸如所治疗的疾病和患者等因素，但包含一种或多种式I、式I-A、式I-B、式I-C、式I-D和/或式I-E所示化合物的组合物的给药剂量范围一般是约0.001毫克化合物/千克体重至约1000毫克/千克。一般地，用小于该化合物最优剂量的较小剂量开始治疗。然后，提高剂量，直到达到最优疗效。
在大多数情况下，通过能保证全身接触式I、式I-A、式I-B、式I-C、式I-D和/或式I-E所示化合物的任何方法给予本发明组合物。因此，可通过口服、胃肠道外、十二指肠内和鼻内途径给予组合物。这类组合物一般包含一种或多种这类化合物和一种或多种药学上可接受的载体或稀释剂，如上文中所详述的那样。
本发明其它实施方式提供联合治疗，其中一种或多种式I、式I-A、式I-B、式I-C、式I-D和/或式I-E所示化合物与一种或多种癌症治疗剂联合给药，如上文中所详述，这些癌症治疗剂包括例如：抗有丝分裂剂、烷化剂、抗代谢剂、细胞毒性抗生素、铂剂、激素药物和/或抗-雄激素。本发明其它实施方式提供联合治疗，其中两种或多种式I、式I-A、式I-B、式I-C、式I-D和/或式I-E所示化合物同时或依次给药，以实现所需疗效。
因此，本文所用术语“联合”指至少两种化合物可以同时方式递送，以先给予第一种化合物、再给予第二种化合物的联合治疗递送，以及以先给予第二种化合物、再给予第一种化合物的联合治疗递送。所需结果可以是症状的主观缓解，或剂量接受者可鉴定的客观改善。
通过说明的方式、而非限制的方式提供以下实施例。
实施例
实施例1
薄荷烷-3-羧酰胺化合物的合成
本实施例公开了薄荷烷-3-羧酰胺化合物的合成方法。
薄荷烷-3-羧酸
将水(300ml)加入装有大型搅拌棒的2-L锥形烧瓶中。在搅拌时小心加入硫酸(500ml)。使该溶液冷却至75℃，加入N-乙基-对薄荷烷-3-羧酰胺(62.5g)。用加热板将温度维持在75℃，小心加入亚硝酸钠(31g)。以1小时的间隔再加入两份31克NaNO2，在75℃将该混合物搅拌过夜。
将该混合物冷却至室温，用～1L冰水稀释，用～500ml醚萃取。分离醚层，用水洗涤，用2x350ml的1M NaOH萃取。用浓盐酸使水层酸化，用醚萃取。用MgSO4干燥醚层，蒸发得到结晶状固态薄荷烷-3-羧酸(33.2g，61％)，□□□＝-50.3deg(c＝1，CHCl3，25℃)。
薄荷烷-3-碳酰氯
用80ml亚硫酰氯回流薄荷烷-3-羧酸(54.35g)3小时。通过蒸馏去除SOCl2，在114-115℃(8托)蒸馏酰基氯。(Lit.b.p.84-85℃，3.5托)。产率：50g(84％)。
制备薄荷烷-3-羧酰胺的一般方法
向搅拌的1ml乙腈或NMP配制的0.2mmol胺和0.4mmol DIPEA溶液中加入0.022ml薄荷烷-3-碳酰氯。振荡该反应混合物3小时。对反应性较低的胺而言，加热该混合物(60℃)并振荡24小时。通过HPLC(用0.05％TFA的CH3CN溶液和0.05％TFA的H2O溶液以40-95％梯度洗脱10分钟)由粗反应混合物纯化该产物，蒸发至干燥。
实施例2
式I-E的二氢苯并咪唑化合物的合成
本实施例公开了式I-E的二氢苯并咪唑Trp-p8调节剂的合成方法。
Figure G2007800131557D00331
4-甲氧基-2-氟-1-硝基苯
向装有搅拌棒和回流冷凝器的2L圆底烧瓶中装入乙腈(1L)、K2CO3(263g，1.9mol)和4-羟基-2-氟-1-硝基苯(100g，0.64mol)。将甲基碘(271g，1.9mol)加入反应混合物中，在回流温度下加热并剧烈搅拌5小时。去除乙腈，加入乙酸乙酯(1L)和H2O(700mL)。将此不均一的混合物转移到分液漏斗中，在其中分离水相，并用乙酸乙酯再次萃取(2x200mL)。合并有机相，用H2O(2x500mL)、盐水(500mL)洗涤，用MgSO4干燥，过滤并减压浓缩，得到淡黄色固态的所需产物(107g，98％)。
Figure G2007800131557D00341
[2-(5-甲氧基-2-硝基苯基氨基)-乙基]-氨基甲酸叔丁酯
将DMSO(800mL)、K2CO3(161g，1.6mol)和4-甲氧基-2-氟-1-硝基苯(100g，0.58mol)加入装有搅拌棒的2L烧瓶中。将单-N-Boc-1，2-二氨基乙烷(94g，0.55mol)加入反应混合物中，60℃搅拌12小时。用冰冷的水(1.2L)研磨该反应混合物，通过真空过滤收集得到黄色沉淀。用水洗涤该沉淀数次(5x1L)，在高真空中干燥48小时，得到亮黄色固态所需产物(178g，98％)。
Figure G2007800131557D00342
[2-(5-甲氧基-2-氨基-苯基氨基)-乙基]-氨基甲酸叔丁酯
将20％Pd(OH)2(5g)和1，4-二烷(800mL)的悬浮液加入装有搅拌棒的2L圆底烧瓶中。将[2-(5-甲氧基-2-硝基苯基氨基)-乙基]-氨基甲酸叔丁酯(100g，0.32mol)加入该悬浮液。将反应混合物氢化(气球)48小时(直到原料已被消耗)，然后将K2CO3(100g)加入该混合物，再搅拌12小时，以去除痕量水。过滤悬液，以去除Pd(OH)2和K2CO3。滤出液无需进一步纯化即可用于下一步骤(产率未测定)。
Figure G2007800131557D00343
[2-(6-甲氧基-2-氧代-2，3-二氢苯并咪唑-1-基)-乙基]-氨基甲酸叔丁酯
用过量碳酰二咪唑(104g，0.64mol)处理上述溶液，90℃加热4小时。去除1，4-二烷，用水(1.5L)研磨残留物。通过真空过滤收集得到的沉淀，用水洗涤数次(5x500mL)。在高真空下70℃干燥粗产物12小时，无需进一步纯化即可使用(66g，2步产率67％)。
Figure G2007800131557D00351
{2-[3-(2-异丙基-5-甲基环己烷羰基)-6-甲氧基-2-氧代-2，3-二氢苯并咪唑-1- 基]-乙基}-氨基甲酸叔丁酯
将[2-(2-氧代-2，3-二氢苯并咪唑-1-基)-乙基]-氨基甲酸叔丁酯(40g，0.20mol)、DMAP(48g，0.39mol)和CH2Cl2(500mL)加入装有搅拌棒的2L烧瓶中。在15分钟的时间内逐滴加入薄荷酰氯(40g，0.20mol)，在室温下搅拌4小时。用1N HCl淬灭该反应混合物，再搅拌20分钟。将此不均一混合物转移到分液漏斗中，在其中分离水相，并用CH2Cl2再次萃取(2x200mL)。合并有机相，用1N HCl(2x300mL)、H2O(300mL)、NaHCO3饱和水溶液(2x300mL)、盐水(300mL)洗涤，用MgSO4干燥，过滤并减压浓缩。将粗产物溶解于少量CH2Cl2中，通过硅胶柱(10％己烷/乙酸乙酯用于洗脱)洗脱，得到无色固态所需产物(93g，96％)。
Figure G2007800131557D00352
3-(2-氨基乙基)-1-(2-异丙基-5-甲基环己烷羰基)-5-甲氧基-1，3-二氢-苯并咪 唑-2-酮的TFA盐(化合物#36)
将{2-[3-(2-异丙基-5-甲基环己烷羰基)-2-氧代-2，3-二氢苯并咪唑-1-基]-乙基}-氨基甲酸叔丁酯(90g，0.19mol)和95％TFA/H2O(200mL)加入500mL圆底烧瓶中。搅拌该反应2小时。减压去除TFA，得到浓稠油状粗产物(真空下静置后固化形成易碎的泡沫)。将粗产物溶解于30％乙腈/H2O中，采用40-60％乙腈/H2O(含0.1％TFA)梯度通过制备级HPLC(Ultro120(10um)C18Q)纯化。合并纯组分，浓缩并冻干得到轻质绒毛状无色固体(79g，94％)。MS(ESI)m/z374(M++1)。
Figure G2007800131557D00361
3-(2-氨基乙基)-5-乙氧基-1-(2-异丙基-5-甲基环己烷羰基)-1，3-二氢-苯并咪 唑-2-酮的TFA盐(化合物#38)
在类似于化合物#36的合成的方法中，由4-乙氧基-1-2-氟-1-硝基苯(由溴乙烷和4-羟基-2-氟-1-硝基苯制备)制备化合物#38。MS(ESI)m/z387(M++1)。
Figure G2007800131557D00362
1-(2-氨基乙基)-3-(2-异丙基-5-甲基环己烷羰基)-1，3-二氢-苯并咪唑-2-酮的 TFA盐(化合物#50)
在类似于化合物#36的合成的方法中，由2-氟-1-硝基苯制备化合物#50。MS(ESI)m/z344(M++1)。
Figure G2007800131557D00363
3-(2-氨基乙基)-5-(3-羟基丙氧基)-1-(2-异丙基-5-甲基环己烷羰基)-1，3-二 氢-苯并咪唑-2-酮的TFA盐(化合物#37)
在类似于化合物#36的合成的方法中，由4-(2-叔丁氧基丙氧基)-2-氟-1-硝基苯(由1-溴-3-叔丁氧基丙烷和4-羟基-2-氟-1-硝基苯制备)制备化合物#37。MS(ESI)m/z418(M++1)。
Figure G2007800131557D00371
3-(2-氨基乙基)-5-(2-羟基乙氧基)-1-(2-异丙基-5-甲基环己烷羰基)-1，3-二 氢-苯并咪唑-2-酮的TFA盐(化合物#40)
在类似于化合物#36的合成的方法中，由4-(2-叔丁氧基乙氧基)-2-氟-1-硝基苯(由1-溴-3-叔丁氧基乙烷和4-羟基-2-氟-1-硝基苯制备)制备化合物#40。MS(ESI)m/z404(M++1)。
Figure G2007800131557D00372
1-(2-氨基-2-(R)-甲基乙基)-3-(2-异丙基-5-甲基环己烷羰基)-1，3-二氢-苯并 咪唑-2-酮的TFA盐(化合物#45)
在类似于化合物#36的合成的方法中，由2-氟-1-硝基苯和(2-氨基-1-(R)-乙基)氨基甲酸叔丁酯制备化合物#45。MS(ESI)m/z358(M++1)。
实施例3
其它式I-E的二氢苯并咪唑化合物的合成
本实施例公开了式I-E的二氢苯并咪唑Trp-p8调节剂的合成方法。
Figure G2007800131557D00381
3-氟-4-硝基苯甲酸甲酯。
将H2SO4(4mL)、甲醇(400mL)和3-氟-4-硝基苯甲酸(10g)加入装有搅拌棒和回流冷凝器的1L圆底烧瓶中。在回流温度下加热该反应混合物并剧烈搅拌18小时。去除甲醇，用己烷研磨粗残留物，浓缩得到无色固体(9.79g)，无需进一步纯化即可使用。
Figure G2007800131557D00391
3-(2-叔丁氧基羰基氨基乙基氨基)-4-硝基苯甲酸甲酯
将1，4-二烷(300mL)、DMF(40mL)、K2CO3(10g)和3-氟-4-硝基苯甲酸(9.7g)加入装有搅拌棒的2L烧瓶中。将单-N-Boc-1，2-氨基乙烷(8.6g)加入反应混合物中，60℃搅拌12小时。浓缩该反应混合物，将残留物溶解于CH2Cl2(400mL)和H2O(500mL)中。将此不均一混合物转移到分液漏斗中，在其中分离水相，并用CH2Cl2再次萃取(2x100mL)。合并有机相，用H2O(5x500mL)洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩，得到橙色固态的标题化合物(14g，84％)。
Figure G2007800131557D00392
4-氨基-3-(2-叔丁氧基羰基氨基-乙基氨基)-苯甲酸甲酯
将20％Pd(OH)2和1，4-二烷(400mL)的悬浮液加入装有搅拌棒的2L圆底烧瓶中。将4-氨基-3-(2-叔丁氧基羰基氨基-乙基氨基)-苯甲酸甲酯(14g)加入该悬液中。将反应混合物氢化(气球)48小时(直到原料已被消耗)，然后将K2CO3(100g)加入该混合物，再搅拌12小时，以去除痕量水。过滤悬液，以去除Pd(OH)2和K2CO3。滤出液无需进一步纯化即可用于下一步骤。
3-(2-叔丁氧基羰基氨基乙基)-2-氧代-2，3-二氢-1H-苯并咪唑-5-羧酸甲酯
用过量碳酰二咪唑(26.8g，4当量)处理上述溶液，90℃加热4小时。去除1，4-二烷，用水(1.5L)研磨残留物。通过真空过滤收集得到的沉淀，用水洗涤数次(5x500mL)。将粗产物溶解于少量CH2Cl2中，通过快速硅胶层析(10％甲醇/CH2Cl2用于洗脱)纯化，得到乳白色固态所需产物(11.8g，85％)。
3-(2-叔丁氧基羰基氨基乙基)-2-氧代-2，3-二氢-1H-苯并咪唑-5-羧酸
将溶解于H2O(300mL)的1，4-二烷(70mL)、3-(2-叔丁氧基羰基氨基乙基)-2-氧代-2，3-二氢-1H-苯并咪唑-5-羧酸甲酯(10.4g)和LiOH(3.7g)加入装有搅拌棒的2L烧瓶中。在65℃搅拌该反应溶液6小时。浓缩该混合物，将粗残留物溶解于H2O。用浓盐酸(水溶液)中和该溶液，通过真空过滤收集得到沉淀。用H2O洗涤该固体数次，在高真空下干燥过夜，得到白色固态所需产物(8.66g，87％)。
Figure G2007800131557D00402
3-(2-氨基-乙基)-1-(2-异丙基-5-甲基环己烷羰基)-2-氧代-2，3-二氢-1H-苯并 咪唑-5-羧酸的TFA盐
将THF(20mL)、DMAP(1.8g)和3-(2-叔丁氧基羰基氨基乙基)-2-氧代-2，3-二氢-1H-苯并咪唑-5-羧酸(4g)加入装有搅拌棒的100mL反应容器中。将该反应混合物冷却至0℃，用薄荷酰氯(2.9g)处理。使该反应混合物恢复至室温并浓缩。加入1N HCl(水溶液)(50mL)和CH2Cl2(50mL)。将此不均一混合物转移到分液漏斗中，在其中分离水相，并用乙酸乙酯再次萃取(2x100mL)。合并有机相，用1N HCl(2x50mL)、H2O(50mL)、盐水(100mL)洗涤，用MgSO4干燥，过滤并减压浓缩。用快速硅胶层析(4:1CH2Cl2/THF用于洗脱)纯化残留物，得到无色固态标题化合物(3.2g，52％)。
Figure G2007800131557D00411
3-(2-氨基-乙基)-1-(2-异丙基-5-甲基-环己烷羰基)-2-氧代-2，3-二氢-1H-苯 并咪唑-5-羧酸酰胺的TFA盐(化合物#41)
将DMF(5mL)、3-(2-氨基-乙基)-1-(2-异丙基-5-甲基环己烷羰基)-2-氧代-2，3-二氢-1H-苯并咪唑-5-羧酸(1.5g，3.9mmol)、EDC(824mg，4.3mmol)、HOBt(581mg，4.3mmol)、DIEA(1.11g，8.6mmol)和NH4Cl(230mg，4.3mmol)加入装有搅拌棒的10mL反应容器中。通过微波60℃加热该反应混合物10分钟，倾倒入乙酸乙酯(50mL)和1N HCl(50mL)的混合物中。将此不均一混合物转移到分液漏斗中，在其中分离水相，并用乙酸乙酯再次萃取(2x50mL)。合并有机相，用1N HCl(100mL)、H2O(2x100mL)、NaHCO3饱和溶液(3x100mL)、盐水(100mL)洗涤，用MgSO4干燥，过滤并减压浓缩。将残留物溶解于95％TFA/H2O中，搅拌2小时并浓缩。将粗产物溶解于30％乙腈/H2O中，采用10-60％乙腈/H2O(含0.1％TFA)梯度通过制备级HPLC(Ultro120(10um)C18Q)纯化。合并纯组分，浓缩并冻干得到轻质绒毛状无色固体(910mg，61％)。MS(ESI)m/z387(M++1)。
Figure G2007800131557D00412
3-(2-氨基-乙基)-1-(2-异丙基-5-甲基环己烷羰基)-2-氧代-2，3-二氢-1H-苯并 咪唑-5-羧酸(2-二乙基氨基-乙基)酰胺的TFA盐(化合物#44)
在类似于化合物#41的合成的方法中，由NI，NI-二乙基乙-1，2-二胺制备化合物#44。MS(ESI)m/z486(M++1)。
3-(2-氨基-乙基)-1-(2-异丙基-5-甲基环己烷羰基)-2-氧代-2，3-二氢-1H-苯并 咪唑-5-羧酸乙酰胺的TFA盐(化合物#47)
在类似于化合物#41的合成的方法中，由乙胺制备化合物#47。MS(ESI)m/z415(M++1)。
Figure G2007800131557D00422
3-(2-氨基-乙基)-1-(2-异丙基-5-甲基环己烷羰基)-2-氧代-2，3-二氢-1H-苯并 咪唑-5-羧酸吡啶-3-基酰胺的TFA盐(化合物#48)
在类似于化合物#41的合成的方法中，由吡啶-3-基胺制备化合物#48。MS(ESI)m/z464(M++1)。
实施例4
其它式I-E的二氢苯并咪唑化合物的合成
本实施例公开了式I-E的二氢苯并咪唑Trp-p8调节剂的合成方法。
Figure G2007800131557D00431
[2-(5-甲基-硫烷基-2-硝基-苯基氨基)-乙基]-氨基甲酸叔丁酯
将DMSO(200mL)、K2CO3(13g，0.10mol)和2，4-二氟-1-硝基苯(5g，0.03mol)加入装有搅拌棒的1升圆底烧瓶中。用单-N-Boc-1，2-二氨基乙烷(5g，0.32mol)处理该反应混合物，室温下搅拌18小时。将硫代甲醇钠(2.24g，0.03mol)加入反应混合物中，60℃搅拌12小时。将该反应混合物冷却至0℃，用水(800mL)研磨，通过真空过滤收集形成的黄色沉淀。用水洗涤该沉淀数次(5x500mL)，在高真空中干燥48小时，得到亮黄色固态所需产物(8.7g，71％)。
Figure G2007800131557D00432
[2-(2-氨基-5-甲基-硫烷基-苯基氨基)-乙基]-氨基甲酸叔丁酯
将MeOH(200mL)、[2-(5-甲基-硫烷基-2-硝基-苯基氨基)-乙基]-氨基甲酸叔丁酯(5g，0.02mol)和NiCl2(19g，0.05mol)加入装有搅拌棒的500mL圆底烧瓶中，冷却至0C。在1小时内将NaBH4(1.7g，0.05mol)加入(以四个等份)反应混合物中。加入完成后，再搅拌该反应混合物2小时。将盐水(100mL)和乙酸乙酯(200mL)加入反应混合物中。将此不均一混合物转移到分液漏斗中，在其中分离水相，并用乙酸乙酯再次萃取(2x100mL)。合并有机相，用H2O(3x100mL)、盐水(l00mL)洗涤，用MgSO4干燥，过滤并减压浓缩，得到黑色残留物。将粗产物溶解于100mL CH2Cl2中，分入两个100mL圆底烧瓶中(各50mL)，减压浓缩，无需进一步纯化即可使用。
Figure G2007800131557D00441
3-(2-氨基-乙基)-1-(2-异丙基-5-甲基-环己烷羰基)-5-甲硫烷基-1，3-二氢-苯 并咪唑-2-酮(化合物#42)
在类似于化合物#36的合成的方法中，由粗产物[2-(2-氨基-5-甲基-硫烷基-苯基氨基)-乙基]-氨基甲酸叔丁酯制备化合物#42。MS(ESI)m/z390.1(M++1)。
Figure G2007800131557D00442
3-(2-氨基-乙基)-1-(2-异丙基-5-甲基-环己烷羰基)-5-甲基亚磺酰基-1，3-二 氢-苯并咪唑-2-酮(化合物#43)
将3-(2-氨基-乙基)-1-(2-异丙基-5-甲基-环己烷羰基)-5-甲硫烷基-1，3-二氢-苯并咪唑-2-酮(化合物#42,300mg)和1％TFA/DMSO(1mL)加入10mL反应烧瓶中。向该反应混合物鼓入氧气20分钟，然后密封。搅拌该反应混合物18小时，通过制备级HPLC(Ultro120(10um)C18Q)，用40-60％乙腈/H2O(含0.1％TFA)梯度纯化粗产物。合并纯组分，浓缩并冻干得到轻质绒毛状无色固体(296mg，94％)。MS(ESI)m/z406(M++1)。
Figure G2007800131557D00451
3-(2-氨基-乙基)-1-(2-异丙基-5-甲基-环己烷羰基)-5-甲基磺酰基-1，3-二氢- 苯并咪唑-2-酮(化合物#39)
3-(2-氨基-乙基)-1-(2-异丙基-5-甲基-环己烷羰基)-5-甲硫烷基-1，3-二氢-苯并咪唑-2-酮(化合物#42)、过硫酸氢钾制剂(Oxone)(1g)和20％甲醇水溶液(5mL)加入装有搅拌棒的10mL反应容器中。用NaHCO3饱和水溶液研磨该反应混合物，至pH约为5。搅拌该反应混合物1小时。过滤并浓缩该反应混合物。将粗产物溶解于30％乙腈/H2O中，采用15-50％乙腈/H2O(含0.1％TFA)梯度通过制备级HPLC(Ultro120(10um)C18Q)纯化。合并纯组分，浓缩并冻干得到绒毛状无色固体(79g，94％)。MS(ESI)m/z422(M++1)。
实施例5
式I-B化合物的合成
本实施例公开了式I-A的二氢苯并咪唑Trp-p8调节剂的合成方法。
Figure G2007800131557D00452
Figure G2007800131557D00461
2-异丙基-5-甲基-环己烷羧酸(4-甲氧基-2-硝基苯基)-酰胺
将4-甲氧基-2-硝基苯胺(5g，0.018mol)溶解于吡啶(50)中，并用薄荷酰氯(3.57g，0.018mol)处理。将该反应混合物加热到50℃，剧烈搅拌6小时。将该反应混合物冷却至室温，倾倒入CH2Cl2(100mL)和1N HCl(100mL)的混合物中。将此不均一混合物转移到分液漏斗中，在其中分离水相，并用CH2Cl2再次萃取(2x100mL)。合并有机相，用1N HCl(8x100mL)、H2O(1x100mL)、1N NaOH(2x100mL)、盐水(100mL)洗涤，用MgSO4干燥，过滤并减压浓缩。用快速硅胶层析(20-50％乙酸乙酯/己烷用于洗脱)纯化残留物，得到无色固态标题化合物(4.9g，83％)。
Figure G2007800131557D00462
2-异丙基-5-甲基-环己烷羧基(2-氨基-4-甲氧基苯基)-酰胺
将2-异丙基-5-甲基-环己烷羧酸(4-甲氧基-2-硝基苯基)-酰胺(4.9g)溶解于10％Pd-C(5g)和THF(150mL)的悬液中。用20％Pd(OH)2氢化该反应混合物48小时(气球)。过滤并浓缩该反应混合物，得到纯度足以不经纯化即可用于下一反应的所需化合物。
(1-{2-[2-异丙基-5-甲基-环己烷羰基)-氨基]-5-甲氧基-苯基氨甲酰基}-乙基) 氨基甲酸叔丁酯
将2-异丙基-5-甲基-环己烷羧基(2-氨基-4-甲氧基苯基)-酰胺(5g，0.016mol)、EDC(4.2g，0.022mol)、HOBt(2.97g，0.022mol)和DIEA(8.53g，0.066mol)溶解于DMF(50mL)，45℃搅拌6小时。将该反应混合物冷却至室温，倾倒入乙酸乙酯和1N HCl的混合物(100mL)中。将该不均一混合物转移到分液漏斗中，在其中各相分离。用乙酸乙酯再次萃取水相，合并有机相，用1N HCl(5x100mL)、H2O(100mL)、1N NaOH饱和溶液(2x100mL)、盐水(100mL)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并浓缩得到淡黄色固体(7.5g)。通过快速硅胶层析(SiO2，30％乙酸乙酯/己烷用于洗脱)纯化一部分粗产物(1.5g)，得到无色固态所需产物。
Figure G2007800131557D00471
2-异丙基-5-甲基-环己烷羧酸-[2-(2-氨基丙酰基氨基)-4-甲氧基苯基]酰胺 的TFA盐(化合物#1)
将(1-{2-[2-异丙基-5-甲基-环己烷羰基)-氨基]-5-甲氧基-苯基氨甲酰基}-乙基)氨基甲酸叔丁酯(1g)溶解于95％TFA/H2O，搅拌1小时。浓缩该反应混合物，将粗产物溶解于30％乙腈/H2O中，采用40-60％乙腈/H2O(含0.1％TFA)梯度通过制备级HPLC(Ultro120(10um)C18Q)纯化。合并纯组分，浓缩并冻干得到轻质绒毛状无色固体(880mg)。MS(ESI)m/z376(M++1)。
Figure G2007800131557D00472
2-异丙基-5-甲基-环己烷羧酸[2-(2-氨基-乙基氨基)-4-甲硫烷基-苯基]酰胺 的TFA盐(化合物#4)
将THF(50g)和DMAP(1.8g，0.02mol)加入含有粗产物[2-(2-氨基-5-甲基-硫烷基-苯基氨基)-乙基]-氨基甲酸叔丁酯的装有搅拌棒的100mL圆底烧瓶中。将该反应混合物冷却至0℃，5分钟内逐滴加入薄荷酰氯(1.5g，0.008mol)。使该反应混合物恢复至室温，再搅拌30分钟。将粗产物溶解于少量CH2Cl2中，用硅胶柱层析(10％己烷/乙酸乙酯用于洗脱)纯化，得到淡黄色固体(1.76g，61％)。将纯化的物质溶解于20mL95％TFA/H2O中，搅拌1小时并浓缩。将粗产物溶解于30％乙腈/H2O中，采用40-60％乙腈/H2O(含0.1％TFA)梯度通过制备级HPLC(Ultro120(10um)C18Q)纯化。合并纯组分，浓缩并冻干得到轻质绒毛状无色固体(1.41g)。MS(ESI)m/z364(M++1)。
Figure G2007800131557D00481
[2-(4-氟-2-硝基-苯甲酰氨基)-乙基]-氨基甲酸叔丁酯
将乙腈(40mL)、EDC(1.12g，5.9mmol)、HOBt(0.796g，5.9mmol)、DIEA(3.76mL，21.6mmol)和单-N-Boc-1，2-二氨基乙烷(0.865g，5.4mmol)加入装有搅拌棒的100mL圆底烧瓶中。搅拌该反应混合物～18h并浓缩。将残留物溶解于乙酸乙酯(50mL)和1N HCl(50mL)的混合物中。将此不均一混合物转移到分液漏斗中，在其中分离水相，并用乙酸乙酯再次萃取(2x100mL)。合并有机相，用1N HCl(2x50mL)、H2O(1x50mL)、NaHCO3饱和溶液(3x50mL)、盐水(100mL)洗涤，用MgSO4干燥，过滤并减压浓缩。用快速硅胶层析(30-50％乙酸乙酯/己烷用于洗脱)纯化残留物，得到淡紫色固态标题化合物(1.12g，63％)。
Figure G2007800131557D00482
[2-(5-甲基-硫烷基-2-硝基-苯基氨基)-乙基]-氨基甲酸叔丁酯
将DMF(5mL)、NaSMe(0.162g，2.3mmol)和[2-(4-氟-2-硝基-苯甲酰氨基)-乙基]-氨基甲酸叔丁酯(0.757g，2.3mmol)加入装有搅拌棒的10mL反应容器中。室温搅拌该反应混合物2小时，倾倒入乙酸乙酯(20mL)和H2O(25mL)的混合物中。将此不均一混合物转移到分液漏斗中，在其中分离水相，并用乙酸乙酯再次萃取(2x10mL)。合并有机相，用1N HCl(2x10mL)、H2O(1x10mL)、NaHCO3饱和溶液(2x10mL)、盐水(10mL)洗涤，用MgSO4干燥，过滤并减压浓缩。用快速硅胶层析(30-50％乙酸乙酯/己烷用于洗脱)纯化残留物，得到淡黄色固态标题化合物(500mg，61％)。
Figure G2007800131557D00491
N-(2-氨基-乙基-2-[(2-异丙基-5-甲基-环己烷羰基)-氨基-4-甲硫烷基-苯甲 酰胺(化合物#2)
在类似于化合物#42的合成的方法中，由[2-(5-甲基-硫烷基-2-硝基-苯基氨基)-乙基]-氨基甲酸叔丁酯制备化合物#2。MS(ESI)m/z392(M++1)。
实施例6
式I-B化合物的合成
本实施例公开了式I-B的二氢苯并咪唑Trp-p8调节剂的合成方法。
Figure G2007800131557D00492
方案5.
2-(5-氨基-3-苯基-吡唑-1-基)-乙醇
将苯甲酰乙腈(25g，0.17mol)悬浮于125mL试剂级无水乙醇和20mL冰醋酸的混合物中。一次性加入溶解于35mL乙醇的2-羟乙基肼(14.4g，1.1当量)。将该混合物加热至回流4小时，冷却，加入水使总体积为500mL，在冰箱中冷却该溶液过夜。在布氏漏斗上冷过滤结晶，用冷水洗涤，高真空干燥得到所需产物(27.2g，79％)。
2-异丙基-5-甲基-环己烷羧酸[2-(2-羟基-乙基)-5-苯基-2H-吡唑-3-]-酰胺
将2-(5-氨基-3-苯基-吡唑-1-基)-乙醇(87.3g，0.43mol)悬浮于二氯甲烷(500mL)和吡啶(40mL)的混合物中，在冰浴中冷却。将薄荷酰氯(100g，1.15当量)溶解于二氯甲烷(200mL)，通过CaCl2干燥管保护的加样漏斗逐滴加入。完全加入需要45分钟，之后，撤去冰浴，继续搅拌3小时。加入1M HCl(水溶液，200mL)，分离各相。再用1M HCl(水溶液，100mL)萃取有机相。再次加入1M HCl，减压去除二氯甲烷，得到大量沉淀。通过真空过滤收集沉淀，用水洗涤固体数次。用400mL1:1醚/己烷(快速搅拌2小时)研磨固体残留物。在布氏漏斗上过滤固体，用己烷洗涤。空气干燥过夜后，在高真空中进一步干燥24小时，得到无色固体(144.4g)。
Figure G2007800131557D00511
甲磺酸-2-{5-[2-异丙基-5-甲基-环己烷羰基)-氨基]-3-苯基-吡唑-1-基}乙酯
2-异丙基-5-甲基-环己烷羧酸[2-(2-羟基-乙基)-5-苯基-2H-吡唑-3-]-酰胺(140g，0.38mol)悬浮于CH2Cl2(500mL)中，在冰浴温度下加入吡啶(47mL，1.5当量)，然后加入甲磺酰氯(44mL，1.5当量)。使该溶液恢复至室温，再搅拌12小时。加入水(500mL)，搅拌该混合物0.5小时。蒸发去除二氯甲烷，产生轻质黄色粒状沉淀。倾析后，再用500mL水处理，再次倾析。最后用500mL水将固体转移到布氏漏斗中，在布氏漏斗中被抽干(产率未测定)。
Figure G2007800131557D00512
2-异丙基-5-甲基-环己烷羧酸-[2-叠氮基-乙基)-5-苯基-2H-吡唑-3-基]-酰胺
将粗制的甲磺酸盐(0.38mol)溶解于含有叠氮化钠(37g，1.5当量)的DMSO(500mL)中。将该混合物加热到70℃6小时。冷却后，加入水(1L)和乙酸乙酯(500mL)，在分液漏斗中振荡该混合物。分离各层，依次用200mL水、NaHCO3饱和溶液和盐水洗涤有机层。用Na2SO4干燥有机层，倾析，在旋转蒸发器上去除溶剂。产率未测定，因为在进行下一步骤之前产物并非完全不含溶剂。
2-异丙基-5-甲基-环己烷羧酸-[2-氨基-乙基)5-苯基-2H-吡唑-3-基]-酰胺
将粗制叠氮化合物溶解于500mL试剂级纯乙醇中，用5g活性碳处理。搅拌该混合物数小时，通过硅藻土过滤。在旋转蒸发器上去除约300mL溶剂，用新鲜溶剂代替。加入10％Pd-C(4.8g，～50％-wt.H2O)，在反应混合物上维持稳定的氢气流的同时快速搅拌24小时。撤去氢气，缓慢加入浓HCl(32mL)。通过硅藻土过滤后，在旋转蒸发器上浓缩滤出液，得到大量沉淀。将二异丙醚加入仍然湿的残留物，快速搅拌该悬液0.5小时。将固体过滤到布氏漏斗中，用二乙醚洗涤。产生空气干燥的白色粉末。
产率：108.6g(经过3个步骤的产率为71％)。
Figure G2007800131557D00521
2-异丙基-5-甲基-环己烷羧酸-[2-氨基-乙基)-5-苯基-2H-吡唑-3-基]-酰胺的 TFA盐(化合物#16)
转变为三氟乙酸盐：中和固体，在分液漏斗中与500mL醚和150mL2NNaOH一起振荡分层。固体完全溶解时，分离各层，用Na2CO3干燥有机相。倾析并与23mL三氟乙酸混合后，蒸发溶剂，在高真空中干燥。碾碎泡沫，用300mL己烷(快速搅拌3小时)研磨，过滤后，产生含有较少醚的白色粉末。最终通过在圆底烧瓶中80℃加热6小时完全去除溶剂。
Figure G2007800131557D00522
2-异丙基-5-甲基-环己烷羧酸-[2-(2-氨基-乙基)-5-呋喃-2-基-2H-吡唑-3- 基]-酰胺的TFA盐(化合物#14)
在类似于化合物#16的合成的方法中，由2-糠酰乙腈和2-羟乙基肼制备化合物#14。通过制备级HPLC(Ultro120(10um)C18Q)，利用40-60％乙腈/H2O(含有0.1％TFA)梯度纯化该物质。MS(ESI)m/z344(M++1)。
Figure G2007800131557D00523
2-异丙基-5-甲基-环己烷羧酸-[2-(2-氨基-乙基)-5-(1-甲基-1H-吡咯-2- 基)-2H-吡唑-3-基]-酰胺的TFA盐(化合物#17)
在类似于化合物#16的合成的方法中，由1-甲基-1H-吡咯-2-甲醛(carbaldehyde)和2-羟乙基肼制备化合物#17。通过制备级HPLC(Ultro120(10um)C18Q)，利用40-60％乙腈/H2O(含有0.1％TFA)梯度纯化该物质。MS(ESI)m/z372(M++1)。
Figure G2007800131557D00531
2-异丙基-5-甲基-环己烷羧酸-[2-(2-氨基-乙基)-5-(1-甲基-1H-吡咯-2- 基)-2H-吡唑-3-基]-酰胺的TFA盐(化合物#15)
在类似于化合物#16的合成的方法中，由2-苯甲酰乙腈和(2-二氮烯基-乙基)-氨基甲酸叔丁酯制备化合物#15。通过制备级HPLC(Ultro120(10um)C18Q)，利用40-60％乙腈/H2O(含有0.1％TFA)梯度纯化该物质。MS(ESI)m/z383(M++1)。
Figure G2007800131557D00532
2-异丙基-5-甲基-环己烷羧酸-[2-(2-氨基-乙基)-5-(1-甲基-1H-吡咯-2- 基)-2H-吡唑-3-基]-酰胺的TFA盐(化合物#18)
在类似于化合物#16的合成的方法中，由2-苯甲酰乙腈和(3-二氮烯基-丙基)-氨基甲酸叔丁酯制备化合物#18。通过制备级HPLC(Ultro120(10um)C18Q)，利用40-60％乙腈/H2O(含有0.1％TFA)梯度纯化该物质。MS(ESI)m/z383(M++1)。
实施例7
式I-C化合物的合成
本实施例公开了式I-C的二氢苯并咪唑Trp-p8调节剂的合成方法。_
Figure G2007800131557D00541
方案6.
Figure G2007800131557D00542
2-异丙基-5-甲基-环己烷羧酸(2-羟基-2-苯基-乙基)-酰胺
将CH2Cl2(200mL)、DIEA(28g，0.219mol)和2-氨基-1-苯基-乙醇(10g，0.073mol)加入装有搅拌棒的500mL圆底烧瓶中，冷却至0℃。用15分钟逐滴加入薄荷酰氯(14.8g，0.073mol)。加入完成后，使该反应恢复至室温，搅拌2小时。将CH2Cl2(100mL)和1N HCl(100mL)加入该反应混合物，再搅拌20分钟。将此不均一混合物转移到分液漏斗中，在其中分离水相，并用CH2Cl2再次萃取(2x100mL)。合并有机相，用1N HCl(8x100mL)、H2O(1x100mL)、1N NaOH(2x100mL)、盐水(100mL)洗涤，用MgSO4干燥，过滤并减压浓缩。通过硅胶柱(50％乙酸乙酯/己烷用于洗脱)洗脱残留物，得到无色固态标题化合物(18.8g，85％)。
Figure G2007800131557D00543
2-异丙基-5-甲基-环己烷羧基[2-(2-氨基-4-乙氧基)-2-苯基-乙基]-酰胺的 TFA盐(化合物#30)
将无水THF(200mL)和2-异丙基-5-甲基-环己烷羧酸(2-羟基-2-苯基-乙基)-酰胺(10g，0.03mol)加入装有搅拌棒的500mL圆底烧瓶中。加入一份NaH(0.87g，0.04mol)，搅拌10分钟(搅拌到不再产生H2为止)。将1-溴乙基-2-胺溴化氢(6.74g，0.033mol)和NaH(0.87g，0.036mol)加入该反应混合物，搅拌2小时。再加入等量的NaH(0.87g，0.036mol)，再搅拌2小时。通过将反应混合物倾倒在冰上来淬灭过量NaH的作用。加入乙酸乙酯(200mL)和水，搅拌20分钟。将此不均一混合物转移到分液漏斗中，在其中分离水相，并用乙酸乙酯再次萃取(2x100mL)。合并有机相，用H2O(1x100mL)、盐水(100mL)洗涤，用MgSO4干燥，过滤并减压浓缩。将粗产物溶解于30％乙腈/H2O中，采用30-60％乙腈/H2O(含0.1％TFA)梯度通过制备级HPLC(Ultro120(10um)C18Q)纯化。合并纯组分，浓缩并冻干得到轻质绒毛状无色固体(9.4g，62％)。MS(ESI)m/z347(M++1)。
Figure G2007800131557D00551
2-异丙基-5-甲基-环己烷羧基[2-(2-氨基-4-丙氧基)-2-苯基-乙基]-酰胺的 TFA盐(化合物#31)
在类似于化合物#30的合成的方法中，由2-异丙基-5-甲基-环己烷羧酸(2-羟基-2-苯基-乙基)-酰胺和1-溴丙基-3-胺溴化氢制备化合物#31。通过制备级HPLC(Ultro120(10um)C18Q)，利用40-60％乙腈/H2O(含有0.1％TFA)梯度纯化该物质。MS(ESI)m/z361(M++1)。
实施例8
其它式I-D的二氢苯并咪唑化合物的合成
本实施例公开了式I-D的二氢苯并咪唑Trp-p8调节剂的合成方法。
Figure G2007800131557D00561
方案7.
Figure G2007800131557D00562
2-异丙基-5-甲基-环己烷羧酸[2-(2-溴-苯基)-乙基]-酰胺
将CH2Cl2(30mL)、2-溴-苯乙胺(1.0g，5.00mmol)和三乙胺(684μl，5.05mmol)加入装有搅拌棒的100mL圆底烧瓶中。用一份薄荷酰氯(1.02g，5.05mmol)处理该反应溶液，室温下搅拌30分钟。用CH2Cl2(50mL)稀释该反应，用水洗涤(3x100mL)。用无水硫酸钠干燥有机层，减压浓缩，得到浓稠的油状物(1.8g)。产物无需纯化即可用于下一步骤。
Figure G2007800131557D00571
2-异丙基-5-甲基-环己烷羧酸{2-[2-(2-氨基-乙基氨基-)苯基]-乙基}-酰胺的 TFA盐(化合物#33)
将纯二氨基乙烷(10mL)、2-异丙基-5-甲基-环己烷羧酸[2-(2-溴-苯基)-乙基]-酰胺(1.5g，4.1mmol)和Cu粉(390mg，6.147mmol，1.5当量)加入装有搅拌棒的25mL微波反应容器中。对该反应容器进行微波处理，180℃持续40分钟。将该反应混合物转移到一圆底烧瓶中并浓缩。将残留物溶解于DMSO(1mL)中，采用10-40％乙腈/H2O(含0.1％TFA)梯度通过制备级HPLC(Ultro120(10um)C18Q)纯化。合并纯组分，浓缩，冻干得到无色固体(1g，52％)(MS(ESI)m/z346(M++1)。
Figure G2007800131557D00572
2-异丙基-5-甲基-环己烷羧酸[2-(2-氰基-苯基)-乙基]-酰胺
将2-异丙基-5-甲基-环己烷羧酸[2-(2-溴-苯基)-乙基]-酰胺(1.54g，4.2mmol)、CuCN(0.60g，6.4mmol)和NMP(10mL)加入装有搅拌棒的20mL微波反应容器中。对该反应容器进行微波处理，180℃持续40分钟。将该反应混合物转移到一圆底烧瓶中并浓缩。通过硅胶快速层析(10％乙酸乙酯/己烷，用于洗脱)纯化该残留物，得到无色固体(1.25g，81％)。
Figure G2007800131557D00573
2-异丙基-5-甲基-环己烷羧酸[2-2-氨基甲基-苯基)-乙基]-酰胺(化合物#34)
将2-异丙基-5-甲基-环己烷羧酸[2-(2-氰基-苯基)-乙基]-酰胺(1.25g，4.0mmol)和甲醇(50mL)加入装有搅拌棒的100mL圆底烧瓶中。NiCl2(1.14g，8.8毫摩尔)和NaBH4(0.64g，16.8毫摩尔)。用30分钟小份加入NaBH4，搅拌1小时。将NaBH4(0.20g)加入反应混合物中，再搅拌20分钟。使该反应混合物通过硅藻土滤饼，减压浓缩。将黑色残留物溶解于少量乙腈，并通过C18硅胶柱，通过制备级HPLC(Ultro120(10um)C18Q)、利用10-40％乙腈/H2O(含有0.1％TFA)梯度纯化。合并纯组分，浓缩并冻干得到无色固体(1.1g)。MS(ESI)m/z317(M++1)。
实施例9
其它式I-C化合物的合成
本实施例公开了式I-C的Trp-p8调节剂的合成方法。_
Figure G2007800131557D00581
方案7.
2-异丙基-5-甲基-环己烷羧酸(2-氧代-2-苯基-乙基)-酰胺
将2-异丙基-5-甲基-环己烷羧酸(2-羟基-2-苯基-乙基)-酰胺(100mg，0.33mmol)和乙酸(1mL)加入装有搅拌棒的20mL圆底烧瓶中。将乙酸(500μl)和水(100μl)配制的CrO3(36mg，0.363毫摩尔，1.1当量)溶液缓慢加入该反应混合物中。在室温下搅拌该反应混合物15分钟，用乙酸乙酯(30mL)和NaHCO3饱和水溶液(30mL)稀释。将此不均一混合物转移到分液漏斗中，在其中分离水相，并用乙酸乙酯再次萃取(2x10mL)。合并有机相，用NaHCO3饱和溶液(3x10mL)、H2O(10mL)、盐水(10mL)洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。用快速硅胶层析(30-50％乙酸乙酯/己烷用于洗脱)纯化残留物，得到白色固态标题化合物(92mg，93％)。
Figure G2007800131557D00591
2-异丙基-5-甲基-环己烷羧酸(2-氨基-2-苯基-乙基)-酰胺
将2-异丙基-5-甲基-环己烷羧酸(2-氧代-2-苯基-乙基)-酰胺(80mg)和氨水(1.5mL，7M的甲醇溶液)加入装有搅拌棒的25mL微波反应容器中。将一滴乙酸和NaCNBH3(20mg)加入该反应混合物中，80℃微波处理80分钟。将残留物收集到乙酸乙酯(30mL)和NaHCO3饱和水溶液(30mL)中。将此不均一混合物转移到分液漏斗中，在其中分离水相，并用乙酸乙酯再次萃取(2x10mL)。合并有机相，用NaHCO3饱和溶液(3x10mL)、H2O(10mL)、盐水(10mL)洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩，得到固体(75mg)。
Figure G2007800131557D00592
(1-{2-[(2-异丙基-5-甲基-环己烷羰基)-氨基]-1-苯基-乙基氨甲酰基}-乙基)- 氨基甲酸叔丁酯
将THF(15mL)、Boc-(R)-丙氨酸(52mg，0.273毫摩尔)、HOBt(37.87mg，0.273毫摩尔)、EDCI(53mg，0.273毫摩尔)和TEA(37μl，0.273毫摩尔)加入装有搅拌棒的15mL反应容器中。搅拌该反应混合物15分钟，然后加入2-异丙基-5-甲基-环己烷羧酸(2-氨基-2-苯基-乙基)-酰胺(75mg，0.248毫摩尔)，再搅拌3小时。将乙酸乙酯(10mL)和H2O(10mL)加入反应混合物中。将此不均一混合物转移到分液漏斗中，在其中分离水相，并用乙酸乙酯再次萃取(2x10mL)。合并有机相，用1N HCl(2x10mL)、H2O(1x10mL)、NaHCO3饱和溶液(3x10mL)、盐水(10mL)洗涤，用MgSO4干燥，过滤并减压浓缩。用快速硅胶层析(20％乙酸乙酯/己烷用于洗脱)纯化残留物，得到无色固态标题化合物(30mg)。
Figure G2007800131557D00601
2-异丙基-5-甲基-环己烷羧酸[2-(2-氨基-丙酰基氨基)-2-苯基-乙基]-酰胺的 TFA盐(化合物#28)
将10％TFA/CH2Cl2和(1-{2-[(2-异丙基-5-甲基-环己烷羰基)-氨基]-1-苯基-乙基氨甲酰基}-乙基)-氨基甲酸叔丁酯(30mg)加入装有搅拌棒的5mL圆底烧瓶中，搅拌1小时。减压去除TFA，将残留物溶解于30％乙腈/H2O(含0.1％TFA)，通过制备级HPLC(Ultro120(10um)C18Q)，利用10-40％乙腈/H2O(含0.1％TFA)梯度纯化。合并纯组分，浓缩，冻干得到无色固体(17.7mg)(MS(ESI)m/z374(M++1)。
实施例10
Trp-p8在CHO细胞中的表达
产生人Trp-p8转染的CHO细胞(在本文中称为CHO/Trp-p8)，用于本发明实验。利用Trp-p8特异性抗体(GS2.20)进行Western印迹和免疫荧光，并利用Icilin(1-[2-羟基苯基]-4-[3-硝基苯基]-1，2，3，6-四氢嘧啶-2-酮)和薄荷醇(2-异丙基-5-甲基-环己醇)进行钙流实验，以确认Trp-p8在此转染子中的表达和非转染CHO中没有任何内源性表达。利用非转染CHO细胞建立用CHO/Trp-p8观察到的化合物作用的特异性。
实施例11
CHO/Trp-p8细胞与候选Trp-p8激动剂化合物于37℃接触后Trp-p8-介导 的细胞活力降低
本实施例公开了适用于筛选有效的Trp-p8激动剂的ATP活力实验。本文所述的ATP活力实验利用表达外源性Trp-p8cDNA的CHO细胞。本实施例还确认，本发明Trp-p8激动剂能有效降低Trp-p8表达细胞的活力。
代谢活性细胞发生坏死和/或凋亡时，胞内ATP浓度快速降低。可利用市售试剂，通过已建立的方法测定ATP浓度，从而确定相对细胞活力。在本文所述的激动剂筛选方法中，将特异性降低CHO/Trp-p8细胞活力的化合物称作激动剂。
作为激动剂有效性和特异性的初步筛选方案，在96孔黑壁黑底细胞培养处理板中使非转染CHO和CHO/Trp-p8接触1-10μM1％二甲亚砜(DMSO)配制的受试化合物或1％DMSO(对照)。DMSO是所有受试化合物的溶剂。37℃培育24-26小时后，裂解细胞，用市售试剂盒Cell Titer-Glo(威斯康星州麦迪逊的普洛麦格公司(Promega；Madison，WI))通过化学发光实验测定ATP浓度。用化合物处理的细胞中ATP水平占单独用DMSO处理的细胞中ATP水平的百分数表示相对活力(％)，它是候选化合物激动剂活性的量度--％活力越低，Trp-p8激动剂效力越高。通过测定8-10个激动剂浓度下的活力来确定37℃时大多数活性候选Trp-p8激动剂的EC50值。(EC50在本文中定义为使相对细胞活力降低50％时的激动剂浓度)。
表1-5中列举了在ATP活力实验中有功效的式I、式I-A、式I-B、式I-C、式I-D和式I-E所示的示范性Trp-p8激动剂。EC50数据如下：A＝<0.020μM；B＝0.021-0.050μM；C＝0.051-0.10μM。
在表1-5中，提供以下通式所示的结构：
Figure G2007800131557D00621
其中提供X和/或Y的化学名称。提供“X/Y”的名称时，该名称包含氮基团。
表1列出用示范性Trp-p8激动剂处理后CHO/Trp-p8细胞的活力。
表1
式I-A的示范性化合物
Figure G2007800131557D00622
Figure G2007800131557D00631
Figure G2007800131557D00641
表2
式I-B的示范性化合物
Figure G2007800131557D00642
Figure G2007800131557D00651
Figure G2007800131557D00661
Figure G2007800131557D00671
表3
式I-C的示范性化合物
Figure G2007800131557D00672
Figure G2007800131557D00681
表4
式I-D的示范性化合物
Figure G2007800131557D00682
Figure G2007800131557D00691
表5
式I-E的示范性化合物
Figure G2007800131557D00692
Figure G2007800131557D00701
Figure G2007800131557D00711
Figure G2007800131557D00721
Figure G2007800131557D00731
Figure G2007800131557D00741
Figure G2007800131557D00751
Figure G2007800131557D00761
实施例12
通过测定CHO/Trp-p8细胞在37℃的钙内流筛选和鉴定Trp-p8激动剂化 合物
本实施例公开用于进一步评估本发明候选Trp-p8激动剂活性的基于CHO/Trp-p8的钙内流实验。
利用Flexstation微孔板荧光阅读仪(加州桑尼维尔的分子设备公司(Molecular Devices；Sunnyvale，CA))测定钙内流。典型的钙内流实验如下所述。将DMEM/Ham’s F-12基础培养基培养的密度一般为30,000个细胞/孔/100μl的细胞接种于96孔黑壁、透明底组织培养板(Greiner Bio-one)中，37℃培育16-20小时。用Fura2-AM荧光染料/Pluronic F-27混合物(俄勒冈尤金的分子探针公司(Molecular Probes；Eugene，Oregon))于37℃培育各孔的细胞1小时，然后溶解于含有Probenecid的培养基中。最终浓度一般是：5-8μM Fura2-AM，0.01％Pluronic F-27，2.5mM Probenecid(降低水解染料由细胞内向外运输，从而最大程度减少实验期间的染料损失的阴离子交换抑制剂)。一小时后，利用含终浓度为2.5mM的Probenecid的缓冲液(20mM含有1.26mM CaCl2的HEPES和汉克斯平衡盐溶液(Hanks Balanced Salt Solution))，pH7.4洗涤细胞，并在37℃试验温度下预培育至少30分钟。
一般地，用多通道移液器机器人将上述HEPES/HBSS-基缓冲液和各种浓度的化合物(以最终浓度的5倍)加入各孔中，所述缓冲液不含额外钙或含有钙以使浓度提高到2mM。在进行该实验(37℃)之前，于37℃预培育化合物至少30分钟。用双激发波长340和380nm，发射波长510nm，以及5nm截止滤光片来阅读信号。该信号表示为340nm激发时的发射与380nm激发时的发射之比[荧光单位(RFU)]。通常将伊屋诺霉素用作阳性对照。
在激动剂实验中，将不同浓度的化合物加入加载染料的细胞中(如上所述)。RFU增加是化合物的激动剂效力的量度。示范性结果见图2。
实施例13
CHO/Trp-p8细胞与Trp-p8激动剂化合物于37℃接触后凋亡增加
本实施例公开了Trp-p8激动剂化合物在诱导Trp-p8表达细胞凋亡中的有效性。
用膜联蛋白V/碘化丙锭(PI)流式细胞术实验进一步研究Trp-p8激动剂化合物诱导的细胞死亡的机制。膜联蛋白V染色能检测磷脂酰丝氨酸易位到质膜外层，这是凋亡的标志性事件，而PI染色表明膜被破坏的死亡细胞。
用1％DMSO配制的化合物或1％DMSO(对照)37℃处理细胞24-26小时。在控制条件下，简单地用胰蛋白酶处理细胞，按照供应商(例如阿拉巴马州伯明翰的南方生物技术公司(Southern Biotech；Birmingham，Alabama))提供的方法用膜联蛋白V/PI试剂盒进行染色。示范性结果见图3。
实施例14
根据保护Trp-p8表达细胞免受毒性激动剂化合物作用，用Trp-p8拮抗剂 化合物的细胞活力实验进行体外筛选
本实施例公开了鉴定和表征Trp-p8拮抗剂候选化合物的试验体系。
利用CHO/Trp-p8在37℃进行的细胞活力实验(参见实施例11)和以下改动来鉴定Trp-p8拮抗剂。在本发明内容中，保护CHO/Trp-p8细胞免受对照激动剂的毒性作用，从而维持接触Trp-p8激动剂的CHO/Trp-p8细胞的活力的化合物被鉴定为拮抗剂。作为拮抗剂的初步筛选方法，使CHO/Trp-p8细胞接触10μM1％二甲亚砜(DMSO)配制的受试化合物或1％DMSO加毒性浓度的对照激动剂。如实施例11所述测定的10μM的相对活力是该化合物用作Trp-p8拮抗剂的潜能的量度--活力越高，该拮抗剂的效力越高。示范性结果见图4。
实施例15
根据抑制CHO/Trp-p8细胞中Trp-p8激动剂诱导的钙内流的能力，用 Trp-p8拮抗剂化合物的钙流实验进行体外筛选
本实施例公开了用于进一步筛选和鉴定候选的Trp-p8拮抗剂的体外试验系统。
也按照实施例12所述(除以下两点区别)，利用37℃的钙流实验筛选和表征Trp-p8拮抗剂：(1)将化合物与对照激动剂预先混合，或者仅将对照激动剂加入细胞中，对反应的抑制是该化合物的拮抗剂功效的量度，和(2)将不同浓度的该化合物加入细胞中，2-3分钟后加入对照激动剂，对激动剂诱导的反应的抑制是该化合物的拮抗剂功效的量度。示范性结果见图5。
实施例16
测定候选Trp-p8激动剂和拮抗剂在治疗癌症时的体内功效的动物模型体 系
本实施例提供适用于测定候选Trp-p8调节剂-包括激动剂和拮抗剂的体内功效的动物模型体系。
将表达Trp-p8的人前列腺癌异种移植瘤(LuCaP，来自华盛顿大学(University of Washington)Robert Vessella博士的实验室—经过利用蛋白质特异性兔多颗粒抗体T-904进行的原位杂交实验、定量聚合酶链反应实验和免疫组化实验的评估)以及经工程改造表达Trp-p8的细胞系，包括CHO(中华仓鼠卵巢)和EL-4(小鼠胸腺瘤)细胞系用于建立小鼠肿瘤模型。利用Trp-p8特异性抗体(GS2.20)进行Western印迹和免疫荧光，以及钙内流功能实验中对已知激动剂的反应，来确认转染子中Trp-p8的表达。此外，经ATP活力和凋亡实验证实(如本文实施例11和13所述)，转染细胞系易于被Trp-p8激动剂杀死。
将CHO/Trp-p8细胞皮下注射给SCID小鼠，从而建立小鼠肿瘤模型。用RT-PCR、免疫组化和Western印迹分析来确认从这些小鼠切下的肿瘤中的Trp-p8表达。用上述人前列腺癌异种移植瘤在无胸腺裸小鼠或SCID小鼠中，并用EL4/Trp-p8转染子在正常小鼠中进一步建立肿瘤模型。其它来源的前列腺异种移植瘤和可经工程改造而表达Trp-p8的其它细胞系也是建立更多模型系统的潜在候选物。
根据体外和体内评价的结果，选择一组Trp-p8激动剂测定小鼠中的功效。体外评价包括在细胞杀伤实验中的功效、水溶性、血浆结合研究和代谢稳定性(用肝细胞和/或小鼠微粒体测定的肝脏代谢化合物的可能性)。体内评价包括药代动力学和毒性研究。通过不同途径[口服、静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内]将所选化合物给予表达Trp-p8肿瘤的小鼠。在这些化合物的不同剂量下评估这些小鼠的肿瘤缩小和存活期。选择最能有效对抗肿瘤的化合物进行进一步研究。
实施例17
几种示范性化合物的实验表征
本实施例公开了式I所示的几种示范性小分子Trp-p8调节剂，称为化合物I、II、III和IV的实验表征和结果。其化学式和分子量见表6。
表6
化学式和分子量
 
化合物 I II III IV
化学式 C21H31N3O3 C20H29N3O2 C22H32N4O C21H34N2O2
分子量 373 343 368 346
体外活性
如表8所示，化合物对杀伤表达Trp-p8的细胞具有高度的功效和特异性。一般地，与表达Trp-p8的细胞相比，需要浓度>1000x的化合物来杀伤缺少Trp-p8的细胞。化合物II、III和IV在本实验中显示出相似活性，而化合物I的功效比它们高约3倍。
表8
几种优选化合物的ATP活力实验的结果
 
化合物 I II III IV
CHO/Trp-p8EC50(μM) 0.003 0.01 0.01 0.01
亲代CHOEC50(μM) >10 >10 >10 >10
体内活性
如图9A和9B所示，在单次口服给予啮齿动物(图9A)和比格犬(图9B)后，化合物I、II和III产生延长的接触(exposure)。与小鼠相比，大鼠需要约两倍的口服剂量(根据体重)才能获得相当的接触水平，而犬需要不到三分之一。与持续的血浆水平(t1/2～9h)相一致，在CHO/Trp-p8异种移植瘤模型中单次口服给药提供延长的持续反应。
如图10A和10B显示，在CHO/Trp-p8异种移植瘤模型中口服给予这些化合物能提供持续反应。单次给予低至10mg/kg的剂量后，观察到肿瘤生长被显著抑制，而在100mg/kg时仍未观察到显著的毒性，治疗窗>10x。
如图7所示，与口服给药相比，通过单次腹膜内注射式I化合物产生的接触时间明显较短。如图8A和8B所示，在CHO/Trp-p8异种移植瘤模型中给小鼠腹膜内注射这些化合物产生的反应水平较低，IP给药终止后持续时间也较短。
为证明该功效是Trp-p8介导的，图11阐述了在匹配的CHO(Trp-p8-)模型中对化合物I的评价。与提出的作用机制相一致，在此模型中，化合物I在100mg/kg时仍未产生明显功效；该剂量是类似的CHO/Trp-p8模型中有效剂量的10倍以上。
如图12所示，与CHO/Trp-p8模型相比，LuCaP模型的反应相当或更好。CHO/Trp-p8是快速生长的肿瘤；用化合物I治疗能减慢其生长，但无法使其消退。相反，LuCaP是生长较缓慢的肿瘤，治疗能引起统计学显著性消退以及生长抑制。在这种情况下，通过对小鼠切下的肿瘤组织进行免疫组化实验测定，LuCAP异种移植瘤的Trp-p8水平与CHO/Trp-p8模型相当。
对任何化合物而言，口服给予小鼠的最高剂量100mg/kg不会产生明显毒性。由于单次口服给予10mg/kg化合物I在CHO/Trp-p8异种移植瘤模型中产生明显功效，所以用式I化合物可获得>10的治疗窗。通过大鼠毒理学实验，扩展此剂量，可以更高的剂量水平给予该化合物。在大鼠中进行的毒理学研究中，250mg/kg的口服剂量并未诱导任何可观察的毒性作用。单次给予500mg/kg和1000mg/kg产生轻微和中等毒性，但没有达到MTD。表7小结了用式I化合物可获得的最小治疗窗的数据。
表7
 
大鼠口服剂量(mg/kg) 观察到的毒性程度 相当的小鼠口服剂量(mg/kg) 小鼠最低有效口服剂量的倍数
250 无 125 12.5
500 轻微 250 25
1000 中等 500 50
虽然出于易于理解的目的以说明和实施例的方式详细描述了本发明，但可以在不背离本发明范围的情况下进行改变和修改，本发明范围应仅受所附权利要求书范围的限制。

Claims (23)

1.一种下式I化合物或其药学上可接受的盐：
式中，
R2选自C1-C8亚烷基；
R3选自H或C1-C8烷基；和
A、B、C和D独立地选自CR1或N；A、B、C和D中至少一个是CR1；R1选自H、-ORi、-SRii、-S(O)Riii、-C(O)NRvRvi和CF3，其中Ri选自甲基、乙基、羟乙基、羟丙基、丁基、乙腈或苄基；Rii和Riii是甲基；Rv和Rvi独立地选自H、甲基、乙基、羟乙基、羟丙基、二乙基氨基乙基、苯基、吡啶基、甲氧基乙基、羟基乙氧基乙基、苄基、苯基乙基、羟基羟甲基苯基乙基或氨甲酰基甲基，或Rv和Rvi一起形成吗啉或哌嗪乙酯。
2.如权利要求1所述的化合物，其中，A、B、C和D独立地选自CR1或N；A、B、C和D中至少一个是CR1；R1选自H、-ORi、-SRii、-S(O)Riii、-C(O)NRvRvi和CF3，其中Ri选自甲基、乙基、羟乙基、羟丙基、丁基、乙腈或苄基；Rii和Riii是甲基；Rv和Rvi独立地选自H、甲基、乙基、羟乙基、羟丙基、二乙基氨基乙基、苯基、吡啶基、甲氧基乙基、羟基乙氧基乙基、苄基、苯基乙基、羟基羟甲基苯基乙基或氨甲酰基甲基，或Rv和Rvi一起形成吗啉或哌嗪乙酯；其中当A、B、C和D中两个相邻的基团是CR1时，两个R1可组合形成一个苯基；
R2是C1-C8亚烷基；和
R3选自H或C1-C8烷基。
3.如权利要求2所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，R1是H。
4.如权利要求2所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，R2选自亚甲基、亚乙基、亚丙基或亚丁基。
5.如权利要求4所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，R2是亚乙基，R3是H。
6.如权利要求2所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，R1是甲氧基。
7.如权利要求2所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，R3是H。
8.如权利要求2所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，下述部分
Figure FDA0000406989660000021
选自下组：3-(2-氨基-乙基)-5-甲氧基-1,3-二氢-苯并咪唑-2-酮、3-(2-氨基-乙基)-5-(3-羟基-丙氧基)-1,3-二氢-苯并咪唑-2-酮、3-(2-氨基-乙基)-5-乙氧基-1,3-二氢-苯并咪唑-2-酮、3-(2-氨基-乙基)-5-甲磺酰基-1,3-二氢-苯并咪唑-2-酮、3-(2-氨基-乙基)-5-(2-羟基-乙氧基)-1,3-二氢-苯并咪唑-2-酮、3-(2-氨基-乙基)-2-氧代-2,3-二氢-1H-苯并咪唑-5-羧酸酰胺、3-(2-氨基-乙基)-5-甲基硫烷基-1,3-二氢-苯并咪唑-2-酮、3-(2-氨基-乙基)-5-甲烷亚磺酰基-1,3-二氢-苯并咪唑-2-酮、3-(2-氨基-乙基)-2-氧代-2,3-二氢-1H-苯并咪唑-5-羧酸(2-二乙基氨基-乙基)-酰胺、3-(2-氨基-丙基)-2,3-二氢-苯并咪唑-2-酮、[3-(2-氨基-乙基)-2-氧代-2,3-二氢-1H-苯并咪唑-5-基氧基]-乙腈、3-(2-氨基-乙基)-2-氧代-2,3-二氢-1H-苯并咪唑-5-羧酸乙基酰胺、3-(2-氨基-乙基)-2-氧代-2,3-二氢-1H-苯并咪唑-5-羧酸吡啶-3-基酰胺、3-(2-氨基-乙基)-2-氧代-2,3-二氢-1H-苯并咪唑-5-羧酸(2-甲氧基-乙基)-酰胺、1-(2-氨基-乙基)-1,3-二氢-苯并咪唑-2-酮、1-(2-氨基-乙基)-1,3-二氢-萘并[2,3-d]咪唑-2-酮、3-(2-氨基-乙基)-2-氧代-2,3-二氢-1H-苯并咪唑-5-羧酸(2-羟基-乙基)-酰胺、3-(2-氨基-乙基)-5-丙氧基-1,3-二氢-苯并咪唑-2-酮、3-(2-氨基-乙基)-1,3-二氢-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-酮、3-(2-氨基-乙基)-2-氧代-2,3-二氢-1H-苯并咪唑-4-羧酸(2-二乙基氨基-乙基)-酰胺、3-(2-氨基-乙基)-2-氧代-2,3-二氢-1H-苯并咪唑-5-羧酸吡啶-4-基酰胺、3-(2-氨基-乙基)-1,3-二氢-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-酮、1-(3-氨基-丙基)-1,3-二氢-苯并咪唑-2-酮、3-(2-氨基-乙基)-2-氧代-2,3-二氢-1H-苯并咪唑-5-羧酸苯基酰胺、3-(2-氨基-乙基)-2-氧代-2,3-二氢-1H-苯并咪唑-5-羧酸[2-(2-羟基-乙氧基)-乙基]-酰胺、1-(2-氨基-乙基)-5-三氟甲基-1,3-二氢-苯并咪唑-2-酮、1-(2-氨基-乙基)-1,3-二氢-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-酮、3-(2-氨基-乙基)-2-氧代-2,3-二氢-1H-苯并咪唑-5-羧酸苄基酰胺、3-(2-氨基-乙基)-5-(吗啉-4-羰基)-1,3-二氢-苯并咪唑-2-酮、3-(2-氨基-乙基)-5-(2-氧代-2-苯基-乙氧基)-1,3-二氢-苯并咪唑-2-酮、3-(2-甲基氨基-乙基)-1,3-二氢-苯并咪唑-2-酮、3-(2-氨基-乙基)-5-丁氧基-1,3-二氢-苯并咪唑-2-酮、3-(2-氨基-乙基)-2-氧代-2,3-二氢-1H-苯并咪唑-5-羧酸甲基-苯基-酰胺、4-[3-(2-氨基-乙基)-2-氧代-2,3-二氢-1H-苯并咪唑-5-羰基]-哌嗪-1-羧酸乙酯、3-(2-氨基-乙基)-2-氧代-2,3-二氢-1H-苯并咪唑-5-羧酸二乙基酰胺、3-(2-氨基-乙基)-2-氧代-2,3-二氢-1H-苯并咪唑-5-羧酸苯乙基-酰胺、3-(2-氨基-乙基)-2-氧代-2,3-二氢-1H-苯并咪唑-5-羧酸(2-羟基-1-羟甲基-2-苯基-乙基)-酰胺、3-(2-氨基-乙基)-2-氧代-2,3-二氢-1H-苯并咪唑-5-羧酸氨甲酰基甲基-酰胺、3-(2-氨基-乙基)-2-氧代-2,3-二氢-1H-苯并咪唑-5-羧酸(2-羟基-1-羟甲基-乙基)-酰胺、3-(2-氨基-乙基)-5-苄氧基-1,3-二氢-苯并咪唑-2-酮和1-(4-氨基-丁基)-1,3-二氢-苯并咪唑-2-酮。
9.如权利要求8所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述化合物是3-(2-氨基-乙基)-1-(2-异丙基-5-甲基-环己烷羰基)-5-甲氧基-1,3-二氢-苯并咪唑-2-酮或其药学上可接受的盐。
10.权利要求1或2所述化合物、其组合、或其药学上可接受的盐在制备治疗与Trp-8表达有关的癌症的药物中的应用。
11.权利要求1或2所述的化合物、其组合、或其药学上可接受的盐在制备治疗哺乳动物的与Trp-8表达有关的癌症的药物中的应用。
12.如权利要求11所述的应用，其特征在于，所述哺乳动物是人。
13.如权利要求11所述的应用，其特征在于，所述癌症是前列腺癌、肺癌、乳腺癌或结肠癌。
14.如权利要求11所述的应用，其特征在于，所述癌症是前列腺癌。
15.权利要求1或2所述的化合物、其组合、或其药学上可接受的盐，以及一种或多种癌症治疗剂在制备治疗哺乳动物的与Trp-8表达有关的癌症的药物中的应用。
16.如权利要求15所述的应用，其特征在于，所述联合是同时给药。
17.如权利要求15所述的应用，其特征在于，所述哺乳动物是人。
18.如权利要求15所述的应用，其特征在于，所述癌症是前列腺癌、肺癌、乳腺癌或结肠癌。
19.如权利要求15所述的应用，其特征在于，所述癌症是前列腺癌。
20.一种药物组合物，其包含权利要求1或2所述的化合物、其组合、或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的赋形剂。
21.如权利要求20所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物是用药学上可接受的载体或试剂配制的。
22.化合物1-(2-氨基乙基)-3-(2-异丙基-5-甲基-环己基羰基)-1,3-二氢-苯并咪唑-2-酮或其药学上可接受的盐。
23.化合物3-(2-氨基乙基)-1-(2-异丙基-5-甲基-环己基羰基)-2-氧代-2,3-二氢-1H-苯并咪唑-5-羧酸酰胺或其药学上可接受的盐。
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