CN101313942A - 一种治疗肾病的中药组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种治疗肾病的中药组合物及其制备方法。以大黄、黄蜀葵花作为配方组分，分别提取后合并，再与可药用载体制成适当的剂型使用。本发明的中药组合物，对肾病尤其是糖尿病肾病有显著疗效。本发明的制备方法重现性好，适合工业化生产。

Description

一种治疗肾病的中药组合物

技术领域

本发明涉及一种治疗肾病的中药组合物及其制备方法，属于医药领域范畴。

背景技术

肾病是一组严重危害人民身体健康的泌尿系疾病，多数反复发作，迁延难愈，治疗难度很大。特别是当肾病经过多次发作，病情得不到控制或没有得到有效的治疗，都可能发展为肾功能衰竭，最终发展到尿毒症。而一旦演变成尿毒症，就等于间接宣告患者的肾脏即将完全丧失功能。它被医学家称为沉默的杀手型疾病，而且近年来有逐渐增加的趋势。

人们通常所说的肾病主要是指原发性肾小球疾病，如急性肾小球肾炎、肾病综合征、隐匿性肾小球肾炎等；继发性肾小球疾病如紫癜性肾炎、狼疮性肾炎、糖尿病性肾病、乙肝性肾病等；以及肾功能不全，包括急性及慢性肾功能不全等。慢性肾炎、肾功能不全等病理变化以肾小球损伤为主，且这种损伤难以逆转，故最终演变成肾功能衰竭、尿毒症。

糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy，DN)即糖尿病肾小球硬化症，是糖尿病(DM)的微血管并发症之一，近年来发病率逐渐增高。在美国，糖尿病肾病已成为终末期肾病(ESRD)的首位病因。在国内，糖尿病肾病所导致的肾功能衰竭亦日益增多，在终末期肾衰病例中约占30％-40％。

目前，我国的糖尿病发病率已升至3-5％，而糖尿病肾病的发病率也随之不断攀升，随着糖尿病病程的延长，一旦患者出现持续性蛋白尿，其病情即呈进行性发展而不可逆转。统计数据表明病程在10-20年的糖尿病患者，无论年龄大小，约有50％伴有临床肾脏病，如果发展至肾衰竭阶段，则很难治疗，给病人及家属带来极大痛苦，并危及病人生命，该疾病现已成为导致糖尿病病人死亡的主要原因。

在糖尿病患者中，I型患者糖尿病肾病发生率约为33-44％，II型患者糖尿病肾病发生率约为20％。在我国，近几年在经济发达地区统计资料表明，糖尿病肾病所致终末期肾病的比例达15％左右，由于我国人口基数巨大，未来糖尿病肾病及终末期肾病的患病人群必将成为医疗和社会的重大负担。

现有的中药复方在临床治疗糖尿病肾病方面已经取得了一定的效果，进一步对于临床上常用方剂中的一些单味药如大黄、黄蜀葵花、黄芪、丹参、夏枯草、银杏等中药的研究发现，这些单味药中的某些成分对于糖尿病肾病有较为确切的疗效。

黄蜀葵Abelmoschus manihot(L.)Medic.[Hibiscus manihot L.]为锦葵科植物，黄蜀葵全草入药，能清热、凉血、解毒，其花性味甘寒滑、无毒，具有清利湿热、消炎解毒之功效，内服主治五淋、水肿，外用治疗痈疽肿毒、汤水烫伤。果实种子具有补脾健胃、生肌功效，治疗消化不良、不思饮食、跌打损伤等。黄蜀葵花大而美丽，花期长，具有较高的观赏价值，且含有丰富的黄酮类化合物，其中以金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素-3’-葡萄糖苷含量最高。研究表明，黄蜀葵花及其提取物对肾炎、心肌损伤、脑缺血损伤、糖尿病肾病等具有重要的药理作用。目前，市售黄蜀葵花胶囊即为黄蜀葵花的单味制剂，主治慢性肾炎，显著延缓肾衰进程，其疗效确切，在中药治疗慢性肾炎方面有着不可替代的优势。

大黄Radix et rhizome rhei，始载于我国现存最早的药学专著《神农本草经》，可泻热通肠、凉血解毒、逐淤通经，在复方中药里，是出现频率最高的药物之一，如厚朴大黄汤、大黄牡丹汤、三黄汤等，为多用途常用中药。近年来许多报道表明，含有大黄的方剂以及大黄提取物可有效保护肾功能，延缓糖尿病肾病患者的透析，并延缓慢性肾衰，可将其应用于糖尿病肾病的治疗。尤其是大黄酸在治疗糖尿病肾病方面的研究较为深入：1.可降低血糖，调节血脂，并改善胰岛素抵抗；2.保护肾功能，改善糖尿病导致的组织器官损伤，保护血管内皮细胞，减少蛋白尿的排泄。目前市售的大黄单味及复方制剂主要用于抗酸健胃、清热泻火、治疗便秘，但是用于治疗糖尿病肾病的大黄单味制剂还未上市。

由于肾病的发病机制十分复杂，临床表现也多种多样，因此，目前市场上尚无治疗肾病的特效药物。对于糖尿病肾病患者，除了调整生活习惯和控制饮食之外，通常需要药物进行终身治疗。西药治疗主要通过降低血糖、控制血压，与降低血脂的药物合用同时配合病人其它并发症的治疗来延缓病情的发展，西药治疗起效较快，能缓解急症，但是长期服药给肾脏功能已有缺陷的肾病患者带来较多副作用。

与西药相比，中药治疗糖尿病肾病这种慢性疾病具有明显的优势，虽然在急症的缓解方面要略逊色于西药(如降血糖作用的起效速度较慢)，但其多组分多靶点的协同作用恰恰与糖尿病肾病复杂的病理相符合，尤其在病程初期，其远期治疗效果要远优于西药，且毒副作用小，对于改善和恢复肾脏功能更为有益。但是传统中药复方因配方的选择、用量的多少以及炮制和制备方法的不同，可能产生难以预期的药理作用，同时由于所含成分复杂，在生产中质量难以控制，难以保证临床疗效，所以开发质量可控、安全有效、毒副作用小、服用方便、适合长期使用的中药一直是研究的重点。

在现有研究基础上，本发明通过药效筛选，最终选定了黄蜀葵花和大黄作为组方用药，通过组方验证，证实大黄提取物和黄蜀葵花提取物通过合理配比后，对糖尿病肾病等多种肾病有很好疗效，可有效缓解多种症状，在药效和毒理试验过程中均未见动物有明显的不良反应及毒性作用，亦无传统大黄单方使用时出现的致泄作用。

发明内容

本发明提供了一种质量可控、用于治疗肾病尤其是糖尿病肾病的中药组合物。本发明人通过现代药理筛选技术，从多种中药中筛选出大黄和黄蜀葵花为配方组分，并分别分离得到以大黄酸、金丝桃苷为主要成分的提取物，将提取物组配，从而提供了一种中药组合物。

本发明的目的是提供一种中药组合物，它是由大黄提取物和黄蜀葵花提取物组成，其重量百分比为：黄蜀葵花提取物2-98％，大黄提取物2-98％；优选为黄蜀葵花提取物30-90％，大黄提取物10-70％；最优选为黄蜀葵花提取物60-90％，大黄提取物10-40％。其中，大黄提取物中总蒽醌的含量为50-90％，黄蜀葵花提取物中总黄酮的含量为50-90％。

本发明所述的黄蜀葵花提取物中主要活性成分金丝桃苷所占的重量百分含量为2％-80％，优选为9-30％。大黄提取物中主要活性成分大黄酸的重量百分含量为2％-70％，优选为8-20％。

本发明的另一目的是提供一种制备该中药组合物的方法。其具体制备方法如下：

1、黄蜀葵花提取物的制备方法，包括以下步骤：

(1)提取：将黄蜀葵花置于提取罐中，加水或乙醇提取1-3次，每次0.5-3小时；

(2)分离纯化：合并提取液，放冷，过滤，滤液上大孔吸附树脂柱，水洗，弃去水洗液，再以乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至洗脱液体积的1/10-1/25后，加入4-6倍量的90％-95％乙醇沉淀一次，静置，过滤，将滤液蒸干溶剂，得到的固体粉碎成细粉，即为黄蜀葵花提取物。测定保证金丝桃苷的含量为2％-80％，优选为9-30％。

制备黄蜀葵花提取物时，步骤(1)中乙醇是指浓度为5-50％的乙醇；步骤(2)中所用的大孔树脂，其型号为HPD-100，HPD-400，HPD-600，HPD-700，D101；步骤(2)中所用的洗脱液乙醇的浓度为50-95％。

2、大黄提取物的制备方法，包括以下步骤：

(1)提取：将大黄酌予粉碎，加乙醇提取1-3次，每次0.5-3小时；

(2)分离纯化：合并提取液，放冷，过滤，滤液上大孔吸附树脂柱，水洗，弃去水洗液，以一定浓度的乙醇洗柱，弃去洗柱液，再以更高浓度的乙醇洗脱，将洗脱液蒸干溶剂，得到的固体粉碎成细粉，即为大黄提取物。测定保证大黄酸的含量为2％-70％，优选为8-20％。

制备大黄提取物时，步骤(1)中乙醇是指浓度为5-60％的乙醇；步骤(2)中所用的大孔树脂，其型号为HPD-100，HPD-400，HPD-450，HPD-700，D101和AB-8；步骤(2)中所述的一定浓度的乙醇是指浓度为40-70％的乙醇；更高浓度的乙醇是指浓度为70-95％的乙醇。

3、将制备好的黄蜀葵花提取物和大黄提取物按一定的重量百分比以药学常规的方法混匀即得上述本发明组合物。

本发明的另一目的是提供所述组合物在制备治疗肾病药物中的应用，尤其是制备治疗糖尿病肾病药物中的应用。其中该组合物可以与常规药用辅料通过药学常规制剂方法制备成各种适于临床使用的常规制剂形式。包括口服制剂、注射剂、外用制剂等。其中优选口服制剂，如片剂、胶囊、滴丸、颗粒剂、口服液等，最优选为片剂、胶囊。片剂包括素片、包衣片、缓释片、分散片、肠溶片、含片、咀嚼片、泡腾片等；胶囊包括硬胶囊、软胶囊、缓释胶囊、肠溶胶囊等；微丸剂包括普通微丸、缓释微丸、肠溶微丸、控释微丸等。当以片剂形式制备药物组合物时，可将活性组分与可药用载体例如淀粉、糊精、糖粉、可压性淀粉等混合，用常规片剂制剂方法制成片剂。当以胶囊剂形式制备药物组合物时，可将活性组分与可药用载体例如微晶纤维素、硬脂酸镁、微粉硅胶等混合，用常规方法制得。当以颗粒剂、口服液等形式制备药物组合物时，均可采用本领域公知的药用载体及制备方法来制备。在此不予赘述。所用有效剂量可随特定的给药方式、病症的严重程度等而调整。一般情况下以本发明所述的中药组合物计，临床使用的参考剂量为每天0.1-40g。

本说明书中所述的肾病，包括各种原因导致的急、慢性肾炎和肾功能不全。如糖尿病肾病、隐匿性肾炎、间质性肾炎、肾盂肾炎、狼疮性肾炎、IgA肾炎等。

本发明使用的药材有以下要求：

1.大黄，应为蓼科植物掌叶大黄(Rheum palmatum L.)，唐古特大黄(Rheum tanguticumMaxim.ex Balf.)或药用大黄(Rheum officinale Baill.)的干燥根及根茎，且符合《中华人民共和国药典》(2005年版一部)“大黄”各项下有关规定。

2.黄蜀葵花，又名侧金盏花，野芙蓉，应为锦葵科植物黄蜀葵(Abelmoschus manihot(L.)Medic.[Hibiscus manihot L.])或刚毛黄蜀葵(Abelmoschus manihot(L.)Medic.Var.pungens(Roxb.)Hochr.)的花。

本发明与现有技术相比，具有以下显著的优点：

(1)由黄蜀葵花提取物和大黄提取物组成的组合物对肾病尤其是糖尿病肾病具有显著的疗效，特别需要指出的是发明人经过大量的实验研究发现以所述比例配伍得到的组合物在同等剂量条件下较单独使用大黄或黄蜀葵花提取物具有更优的治疗效果，提示上述两种成分的在特定比例下能产生相互协同的治疗作用；

(2)本发明所述的制备方法，不仅能保证各有效成分相应的含量，而且在工业生产中能有效控制成分之间的含量配比，从而保证了组合物对肾病、尤其是糖尿病肾病的显著疗效；

(3)本发明的提取和纯化方法简便易行，重现性好，适合工业化生产。

下述内容为本发明组合物的药效学和安全性研究试验结果。

一、药效学研究

为了充分说明组合物的有益效果，实验中将本发明组合物(即本发明所述的中药组合物)与黄蜀葵花提取物和大黄提取物作对比。

1.1本发明组合物对肾病家兔的治疗作用

发明人成功的制备了家兔Masugi肾炎模型，并采用本发明组合物对肾炎家兔进行治疗。实验结果表明在给予本组合物后在不同时间段造模动物的尿蛋白量、血尿素氮、血肌酐显著下降。同时病理学检查结果显示模型家兔肾小球呈弥漫性损伤，肾小球有明显蛋白沉积，近曲小管上皮细胞肿胀，明显的蛋白管型，肾小球壁层细胞增生及纤维化，新月体形成50％以上。而经本发明组合物治疗后肾损伤显著减轻，其对模型动物肾功能的保护作用与阳性药地塞米松接近，优于单独的大黄提取物和黄蜀葵花提取物对肾功能的保护作用。

该部分实验结果显示本发明组合物对肾炎有明确的治疗效果，并且通过药物有效成分之间的相互协同作用其作用强度明显优于单味药材的提取物。

1.2组合物对糖尿病肾病大鼠的治疗作用

由于临床医疗实践已经证实血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)如卡托普利、依那普利等能有效预防和治疗糖尿病引起的肾损害，故发明人在药效学考察中采用卡托普利作为阳性对照药。

实验中模型大鼠经链脲佐菌素(STZ)腹腔注射72h后，空腹血糖高达27.57±4.79mmol/l，并且血糖维持高水平的同时出现饮水量及尿量增加，体重下降，肾功能降低，尿微量白蛋白水平(mAlb)显著增高，肾脏肥大，说明模型组大鼠的病理生理变化符合糖尿病肾损害的特征。经本发明组合物治疗6周，大鼠血尿素(Ure)、尿肌酐(Cr)、尿量显著低于糖尿病肾病模型组，证实本组合物能改善糖尿病肾病大鼠的肾功能，减轻了肾小球高滤过、高灌注状态。糖尿病肾病的另一重要表现是蛋白尿，在糖尿病肾病早期主要出现尿微量白蛋白(mAlb)，在糖尿病肾病早期用常规方法还不能检出尿蛋白时，尿微量白蛋白(mAlb)排出已增加。研究表明实验大鼠在接受本发明组合物治疗后，尿微量白蛋白(mAlb)显著减少，提示糖尿病肾病大鼠的肾脏病变进程明显得到了抑制。细胞外基质增多是糖尿病肾病的病理特征之一，研究发现本发明组合物组肾小球基底膜/系膜区面积比明显小于糖尿病肾病模型组、毛细血管襻/系膜区面积比则明显大于糖尿病肾病模型组，提示本组合物可能对糖尿病肾病大鼠肾脏的细胞外基质沉积具有抑制作用。

总之，研究结果表明本发明组合物能有效改善糖尿病肾病大鼠肾功能、减少蛋白尿、减轻肾小球高滤过、抑制肾脏肥大、抑制细胞外基质增加，对STZ诱导的糖尿病肾病有显著的预防和治疗作用。

二、安全性研究：

急性毒性试验：

本组合物急性毒性较小，无法测出LD₅₀，故进行最大给药量试验。当给药剂量达到20g/kg时连续观察7天，除个别动物体重稍有下降外，所有小鼠毛色、排泄物、精神状态、行为均正常并且未出现死亡。实验结束后对所有动物处死解剖肉眼观察，未见重要脏器有明显病理改变。急性毒性试验表明本发明组合物未引起动物急性毒性反应。

具体实施方式

下列实施例用来进一步解释说明本发明的内容，但不意味着对本发明的任何限制。

大黄酸含量测定采用本领域公知的高效液相色谱法测定，条件如下：色谱柱C18；λ＝254nm；v＝1.0ml/min；T＝30℃；流动相0.1％磷酸∶甲醇＝30∶70；标准品大黄酸(购自中检所)。

金丝桃苷含量的测定采用本领域公知的高效液相色谱法测定，条件如下：色谱柱C18；λ＝360nm；v＝1.0ml/min；T＝30℃；流动相乙腈∶0.1％磷酸溶液＝12∶88；标准品金丝桃苷(购自中检所)。

黄蜀葵花提取物中总黄酮和大黄提取物中总蒽醌的含量测定分别以金丝桃苷和大黄酸为对照品，采用分光光度法测定，在此不予详述。

实施例一：

步骤1、黄蜀葵花提取物的制备：取黄蜀葵花7.5kg置于提取罐中，加10％乙醇提取3次，每次75L，提取1小时。合并提取液，放冷，过滤，滤液上HPD-600型大孔吸附树脂柱，水洗，弃去水洗液，90％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至2L，加入95％乙醇10L沉淀一次，静置，过滤，将滤液蒸干溶剂，得到的固体粉碎成细粉，得到黄蜀葵花提取物189g，其中金丝桃苷含量为25.1％，总黄酮含量为85.3％。

步骤2、大黄提取物的制备：取大黄5kg酌予粉碎，加10％乙醇提取3次，每次50L，提取1.5小时。合并提取液，放冷，过滤，滤液上HPD-700大孔吸附树脂柱，水洗，弃去水洗液；以65％乙醇洗柱，弃去洗柱液；再95％乙醇洗脱，将洗脱液蒸干溶剂，得到的固体粉碎成细粉，得到大黄提取物99g，其中大黄酸的含量为17.2％，总蒽醌含量为62.0％。

步骤3、取上述方法的得到的黄蜀葵花提取物180g和大黄提取物20g均匀混合，即得。

实施例二：

步骤1、黄蜀葵花提取物的制备：取黄蜀葵花300kg置于提取罐中，加20％乙醇提取3次，每次1200L，提取0.5小时。合并提取液，放冷，过滤，滤液上HPD-100型大孔吸附树脂柱，水洗，弃去水洗液，95％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至60L，加入95％乙醇360L沉淀一次，静置，过滤，将滤液蒸干溶剂，得到的固体粉碎成细粉，得到黄蜀葵花提取物7670g，其中金丝桃苷含量为18.6％，总黄酮含量为70.5％。

步骤2、大黄提取物的制备：取大黄100kg酌予粉碎，加35％乙醇提取2次，每次600L，提取2小时。合并提取液，放冷，过滤，滤液上HPD-450大孔吸附树脂柱，水洗，弃去水洗液；以65％乙醇洗柱，弃去洗柱液；再90％乙醇洗脱，将洗脱液蒸干溶剂，得到的固体粉碎成细粉，得到大黄提取物1120g，其中大黄酸的含量为18.5％，总蒽醌含量为52.5％。

步骤3、取上述方法的得到的黄蜀葵花提取物400g和大黄提取物100g混合，加入适量淀粉制粒，压片，即得片剂。

实施例三：

步骤1、黄蜀葵花提取物的制备：取黄蜀葵花30kg置于提取罐中，加25％乙醇提取3次，每次120L，提取1小时。合并提取液，放冷，过滤，滤液上HPD-100型大孔吸附树脂柱，水洗，弃去水洗液，95％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至6L，加入95％乙醇36L沉淀一次，静置，过滤，将滤液蒸干溶剂，得到的固体粉碎成细粉，得到黄蜀葵花提取物513g，其中金丝桃苷含量为15.6％，总黄酮含量为68.8％。

步骤2、大黄提取物的制备：取大黄20kg酌予粉碎，加30％乙醇提取3次，每次100L，提取1小时。合并提取液，放冷，过滤，滤液上HPD-100大孔吸附树脂柱，水洗，弃去水洗液；以60％乙醇洗柱，弃去洗柱液；再95％乙醇洗脱，将洗脱液蒸干溶剂，得到的固体粉碎成细粉，得到大黄提取物309g，其中大黄酸的含量为15.6％，总蒽醌含量为56.8％。

步骤3、取上述方法的得到的黄蜀葵花提取物420g和大黄提取物280g混合，加入适量微粉硅胶制成胶囊制剂，即得。

实施例四：

步骤1、黄蜀葵花提取物的制备：取黄蜀葵花30kg置于提取罐中，加水提取3次，每次180L，提取1小时。合并提取液，放冷，过滤，滤液上HPD-400型大孔吸附树脂柱，水洗，弃去水洗液，95％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至6L，加入95％乙醇24L沉淀一次，静置，过滤，将滤液蒸干溶剂，得到的固体粉碎成细粉，得到黄蜀葵花提取物650g，其中金丝桃苷含量为21.8％，总黄酮含量为79.5％。

步骤2、大黄提取物的制备：取大黄10kg酌予粉碎，加10％乙醇提取3次，每次1200L，提取1小时。合并提取液，放冷，过滤，滤液上HPD-450大孔吸附树脂柱，水洗，弃去水洗液；以50％乙醇洗柱，弃去洗柱液；再95％乙醇洗脱，将洗脱液蒸干溶剂，得到的固体粉碎成细粉，得到大黄提取物357g，其中大黄酸的含量为13.9％，总蒽醌含量为59.7％。

步骤3、取上述方法的得到的黄蜀葵花提取物490g和大黄提取物210g混合，加入适量淀粉制成胶囊制剂，即得。

实施例五：

步骤1、黄蜀葵花提取物的制备：取黄蜀葵花5kg置于提取罐中，加10％乙醇提取三次，每次120L，提取0.5小时。合并提取液，放冷，过滤，滤液上D101型大孔吸附树脂柱，水洗，弃去水洗液，90％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至5L，加入95％乙醇25L沉淀一次，静置，过滤，将滤液蒸干溶剂，得到的固体粉碎成细粉，得到黄蜀葵花提取物138g，其中金丝桃苷含量为9.51％，总黄酮含量为55.1％。

步骤2、大黄提取物的制备：取大黄5kg酌予粉碎，加10％乙醇提取3次，每次100L，提取1小时。合并提取液，放冷，过滤，滤液上AB8大孔吸附树脂柱，水洗，弃去水洗液；以65％乙醇洗柱，弃去洗柱液；再75％乙醇洗脱，将洗脱液蒸干溶剂，得到的固体粉碎成细粉，得到大黄提取物87g，其中大黄酸的含量为8.7％，总蒽醌含量为51.2％。

步骤3、取上述方法的得到的黄蜀葵花提取物40g和大黄提取物60g混合，加入适量淀粉制成胶囊制剂，即得。

实施例六

步骤1、黄蜀葵花提取物的制备：取黄蜀葵花20kg置于提取罐中，加水提取3次，每次150L，提取1.5小时。合并提取液，放冷，过滤，滤液上HPD-700型大孔吸附树脂柱，水洗，弃去水洗液，90％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至5L，加95％乙醇22L沉淀一次，静置，过滤，将滤液蒸干溶剂，得到的固体粉碎成细粉，得到黄蜀葵花提取物405g，其中金丝桃苷含量为19.3％，总黄酮含量为76.4％。

步骤2、大黄提取物的制备：取大黄40kg酌予粉碎，加25％乙醇提取3次，每次100L，提取1小时。合并提取液，放冷，过滤，滤液上HPD-400大孔吸附树脂柱，水洗，弃去水洗液；以50％乙醇洗柱，弃去洗柱液；再75％乙醇洗脱，将洗脱液蒸干溶剂，得到的固体粉碎成细粉，得到大黄提取物409g，其中大黄酸的含量为16.7％，总蒽醌含量为55.1％。

步骤3、取上述方法的得到的黄蜀葵花提取物45g和大黄提取物405g混合，加入适量淀粉制成胶囊制剂，即得。

实施例七：

对STZ造模大鼠糖尿病肾病的治疗作用

1、试验材料

1.1受试药物：

组合物(即本发明所述的中药组合物，江苏正大天晴药业股份有限公司提供)，批号20051215，本试验中大鼠给药剂量为200mg/kg；卡托普利，中美上海施贵宝制药有限公司，批号：20060103，试验中大鼠给药剂量为8mg/kg；黄蜀葵花提取物，试验中大鼠给药剂量为200mg/kg；大黄提取物，试验中大鼠给药剂量为200mg/kg。上述药物以蒸馏水配制，灌胃给药。

1.2动物：

清洁级雄性SD大鼠80只，体重200～220g购于上海斯莱克实验动物有限责任公司。动物合格证号：SCXK(沪)2003-0003。

1.3试剂及药品：

链脲佐菌素(STZ)购于美国Sigma公司，用pH4.2的0.01mmol/ml枸橼酸缓冲液制成8mg/ml的STZ溶液；血糖测定仪及试纸由强生(中国)有限公司提供；血糖(BG)、尿素(Ure)、肌酐(Cr)等生化试剂购自北京中控中生生物试剂公司；尿微量白蛋白(mAlb)测定试剂购自上海太阳生物技术有限公司。

本组合物以及大黄提取物、黄蜀葵花提取物由江苏正大天晴药业股份有限公司研发中心提供。其中本组合物、黄蜀葵花提取物、大黄提取物均根据实施例一方法制备。

2.方法

2.1.动物模型的建立与分组：

以45mg/kg的链脲佐菌素(STZ)枸橼酸液缓冲液腹腔内注射制备糖尿病肾病大鼠模型，正常对照组腹腔注射等量枸橼酸缓冲液。注射72h后，大鼠尾静脉测血糖＞16.6mmol/L为造模成功。动物按血糖值随机分成5组：正常对照组、糖尿病肾病模型组、卡托普利组(8mg/kg)、黄蜀葵花提取物组(200mg/kg)、大黄提取物组(200mg/kg)、组合物组(200mg/kg)。各给药组按10ml/kg灌胃给药，正常对照组、糖尿病肾病模型组给予等体积蒸馏水。各组大鼠于给药后6周，将其置于代谢笼中，留取24h尿液，次日称重后股动脉取血，分离血清，血、尿标本-20℃保存备测。取大鼠肾称重，在冰浴上取肾皮质，置10％甲醛液中固定。

2.2.观察指标：

血、尿中生化指标按试剂盒说明书进行操作测定；相对肾指数为肾重与体重之比。肾脏进行常规HE染色与糖原PAS染色。PAS染色病理进行半定量分析：光镜下盲法观察，取PAS染色切片，进行半定量分析，每份标本观察10个肾小球，计算肾小球基底膜与系膜区面积比及毛细血管襻与系膜区面积比，取均值比较。

3.统计分析

测定数据以x±s表示，采用t检验。

4.实验结果

糖尿病肾病模型组、各给药组于注射STZ 72h后，饮水量及尿量显著增加，体重下降，精神萎靡，其血糖均＞16.6mmol/l，平均为(27.57±4.79)mmol/l，且一直保持在高水平。

4.1对STZ糖尿病肾病大鼠肾功能与尿微量白蛋白的影响

持续高血糖6周后糖尿病肾病模型组大鼠血中Ure、Cr及尿中mALB/Cr显著升高(p＜0.01)。卡托普利组、黄蜀葵花提取物组、大黄提取物组、本组合物组用药6周后血中Ure、Cr及尿中mALB/Cr均显著低于糖尿病肾病模型对照组(p＜0.01或p＜0.05)。

Tab.1对STZ糖尿病肾病大鼠肾功能与尿微量白蛋白的影响(x±s)

^##p＜0.01与正常对照组比；^*p＜0.05^**p＜0.01与模型对照组比

4.2.对STZ糖尿病肾病大鼠肾指数的影响

持续高血糖6周后糖尿病肾病模型组大鼠肾指数升高(p＜0.01)。用药6周后，卡托普利与黄蜀葵花提取物组对肾指数有一定的抑制作用，但无显著性差异(p＞0.05)，而本组合物组与大黄提取物组对肾指数有明显的抑制作用(p＜0.05)。

Tab.2对STZ糖尿病肾病大鼠肾脏指数的影响(x±s)

^##P＜0.01与正常对照组比较，^*P＜0.05与模型对照组比较。

4.3对STZ糖尿病肾病大鼠肾脏病理变化的影响

实验6周后糖尿病肾病模型组的肾小球系膜区弥漫性增宽、系膜基质增多、部分肾小球出现PAS染色阳性的匀质蛋白性物质、肾小球内皮细胞无明显增多、小管-间质无明显病理改变，卡托普利组、本发明组合物组肾脏病理改变明显轻于糖尿病肾病模型组。肾脏病理图像半定量分析显示：糖尿病肾病模型组的肾小球基底膜/系膜区面积比明显大于正常对照组，毛细血管襻/系膜区面积比明显小于正常对照组；各给药组肾小球基底膜/系膜区面积比小于糖尿病肾病模型组，毛细血管襻/系膜区面积比则大于糖尿病肾病模型组；各给药组与正常对照组相比，改变不明显。

5.结论

实验结果显示本组合物能改善造模动物肾功能、减少蛋白尿、减轻肾小球高滤过、抑制肾脏肥大、抑制细胞外基质增加，对STZ诱导糖尿病肾病大鼠的早期肾脏病变有显著的防治作用。

实施例八

本组合物对Masugi肾炎的治疗作用

1.材料和方法

1.1羊抗兔的抗肾血清制备

按文献制备羊抗兔的抗肾血清。取2～2.5kg家兔，雌雄不计，处死取肾，插入导管用生理盐水反复冲洗，取肾皮质5g匀浆，用弗氏完全佐剂混匀成10ml，加生理盐水20ml，制成混悬液。给绵羊皮下五处注射。每次1ml，每2周1次，共4次。于末次注射后2周采羊血分离血清。加入等量兔红细胞于4℃过夜吸附，离心吸取上清液，于56℃水浴30min灭活备用。

本组合物(即本发明所述的中药组合物)以及大黄提取物、黄蜀葵花提取物均根据实施例一方法制备，由江苏正大天晴药业股份有限公司研发中心提供。

1.2模型制备

取健康家兔36只，体重2.0±0.5kg，雌雄各半。实验前测24h尿蛋白总量查无异常后取其中30只，分别耳缘静脉注射羊抗兔的抗肾血清，每次2ml，30min一次，5次后所有家兔均先后出现蛋白尿，表明造模成功。将30只造模家兔随机分成5组，模型对照组、阳性组(地塞米松组)、组合物组、大黄提取物组、黄蜀葵花提取物组，每组6只，于成模后第一天开始每日灌胃给药，连续灌胃15天。地塞米松组剂量为0.1mg/kg；组合物组剂量为110mg/kg；大黄提取物组剂量为110mg/kg、黄蜀葵花提取物组剂量为110mg/kg。

1.3观察指标

各组动物在造模后第5天、10天、15天收集24h尿液，取血按浊度法、乙酰-肟法、碱性苦味酸法分别测定尿蛋白、血清Urea、血清Cre含量。第15天处死取肾，光镜下观察病理组织学形态变化。

1.4统计学方法所测的结果用x±s表示，t检验。

2、试验结果

2.1受试组合物对尿蛋白含量的影响

家兔造模后出现蛋白尿，尿蛋白含量在第5-10天之间维持较高的水平，随后尿蛋白量逐渐降低，显示了该模型一定的自愈趋势。给药后，模型动物尿蛋白含量均有明显下降，表明地塞米松、组合物、大黄提取物、黄蜀葵花提取物对Masugi肾炎模型家兔的肾功能有保护作用。并且在治疗后10天内本发明组合物的作用强度明显优于大黄提取物组和黄蜀葵花提取物组，第10-15天这种优势不明显，推测是动物自身的功能恢复掩盖了药物作用的强度差异。

表1、受试组合物对尿蛋白含量的影响(x±s)

^#P＜0.05与正常对照组比较，^*P＜0.05与模型对照组比较，°P＜0.05与组合物组比较。

2.2本组合物对血清Urea的影响

动物于造模后5、10、15天耳缘静脉取血测定不同时期血清Urea含量，阳性药物地塞米松在第10-15天能显著降低动物血清Urea含量。组合物组在15天降低血清Urea含量与模型对照组比有显著差异，并且与大黄提取物组、黄蜀葵花提取物组相比有统计学意义。而大黄提取物组、黄蜀葵花提取物组与模型对照组相比虽有降低趋势但是没有统计学差异。结果表明本组合物能有效缓解模型动物肾功能的损伤，并且作用强度大于大黄和黄蜀葵花提取物组。

表2、组合物对血清Urea的影响(x±s)

^#P＜0.05与正常对照组比较，^*P＜0.05与模型对照组比较，°P＜0.05与组合物组比较。

2.3组合物对血清Cre含量的影响

动物在造模后血清Cre含量在第10天开始出现急剧上升，同时地塞米松降低血清Cre含量与模型对照组比有显著差异。本组合物组、大黄提取物组、黄蜀葵花提取物组在第10、15天均显示出了显著降低血清Cre含量的作用。尤其是在第15天时本组合物的作用强于大黄提取物组。

表3、组合物对血清Cre含量的影响(x±s)

^#P＜0.05与正常对照组比较，^*P＜0.05与模型对照组比较，°P＜0.05与组合物组比较。

3.结论

通过表1-3的数据可以看出本发明组合物能有效提高Masugi肾炎家兔的肾功能。能有效降低尿中蛋白含量，并能促进血肌酐和尿素氮的排出。并且其作用强度大于大黄提取物、黄蜀葵花提取物组，表明本组合物中两味药材中提取的有效成分之间可能产生了相互协同的药理作用，出现了出人意料的技术效果。

实施例九

本发明组合物急性毒性的研究

预实验显示本组合物急性毒性较小无法测出LD₅₀，故进行最大给药量试验。

1.实验材料

本组合物(即本发明所述的中药组合物)由江苏正大天晴药业股份有限公司研发中心提供，根据实施例一方法制备。本组合物浓度为0.5g/ml(组合物最大浓度)。

实验动物：清洁级小鼠，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司。动物合格证号：SCXK(沪)2003-0003。

2.实验方法

小鼠20只，雌雄各半，取本组合物(0.5g/ml)，以0.4ml/10g体积灌胃，即剂量为20g/kg时，连续观察7天。除个别动物体重稍有下降外，所有小鼠未出现死亡并且毛色、行为、排泄物均正常。观察期满后，所有小鼠均处死解剖，肉眼观察未发现有明显脏器改变。

急性毒性试验表明本组合物没有引起动物明显的急性毒性反应。

Claims (12)

1、一种治疗肾病的中药组合物，其特征在于是由大黄提取物和黄蜀葵花提取物组成，其重量百分比为：黄蜀葵花提取物2-98％，大黄提取物2-98％。

2、权利要求1所述的中药组合物，其中黄蜀葵花提取物占30-90％，大黄提取物占10-70％。

3、权利要求1所述的中药组合物，其中黄蜀葵花提取物占60-90％，大黄提取物占10-40％。

4、权利要求1-3所述的任一中药组合物，其特征在于，按重量百分含量计，黄蜀葵花提取物中主要活性成分金丝桃苷含量为2％-80％。

5、权利要求4所述的中药组合物，黄蜀葵花提取物中主要活性成分金丝桃苷含量为9％-30％。

6、权利要求1-3所述的任一中药组合物，其特征在于，按重量百分含量计，大黄提取物中主要活性成分大黄酸含量为2％-70％。

7、权利要求6所述的中药组合物，大黄提取物中主要活性成分大黄酸含量为8％-20％。

8、权利要求1所述的中药组合物，其制备方法如下：

(1)黄蜀葵花提取物的制备，制备方法包括如下步骤：

i)提取：将黄蜀葵花置于提取罐中，加水或乙醇提取1-3次，每次0.5-3小时；

ii)分离纯化：合并提取液，放冷，过滤，滤液上大孔吸附树脂柱，水洗，弃去水洗液，再以乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至洗脱液体积的1/10-1/25后，加入4-6倍量的90％-95％乙醇沉淀一次，静置，过滤，将滤液蒸干溶剂，得到的固体粉碎成细粉，即为黄蜀葵花提取物；

(2)大黄提取物的制备，制备方法包括如下步骤：

i)提取：将大黄酌予粉碎，加乙醇提取1-3次，每次0.5-3小时；

ii)分离纯化：合并提取液，放冷，过滤，滤液上大孔吸附树脂柱，水洗，弃去水洗液，以一定浓度的乙醇洗柱，弃去洗柱液，再以更高浓度的乙醇洗脱，将洗脱液蒸干溶剂，得到的固体粉碎成细粉，即为大黄提取物；

(3)将上述黄蜀葵花提取物和大黄提取物按一定的重量百分比按常规方法混匀即可。

9、一种药物组合物，它包含权利要求1-7所述的任一中药组合物和一种或多种药学上可接受的载体或赋型剂。

10、权利要求1-7中任一权利要求所述的中药组合物或权利要求9所述的药物组合物用于制备治疗肾病药物的用途。

11、权利要求10所述的用途，其中肾病指各种原因导致的急、慢性肾炎和肾功能不全。

12、权利要求10所述的用途，其中肾病为糖尿病肾病。