CN101188996A - 表面改性的微粒及其形成和使用方法 - Google Patents

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Abstract

本文公开了表面改性的微粒及所述微粒的制备和使用方法。所述表面改性微粒包括含有至少一种活性剂的预成形或核心微粒。所述预成形或核心微粒的外表面携带净表面电荷。一个单层与所述预成形或核心微粒的外表面结合。该单层包括至少一种带电化合物，该化合物的电荷不同于所述预成形或核心微粒的净表面电荷。

Description

表面改性的微粒及其形成和使用方法
相关申请的交叉参考
本申请要求2005年4月27日提交的美国临时专利申请系列号60/675,372和2005年12月16日提交的美国临时专利申请系列号60/750,903的利益。
发明领域和背景
本公开一般涉及包含一种或多种活性剂的微粒和将所述微粒递送至受试者的方法。更具体地，本公开涉及表面改性所述微粒，从而使得它们能够控制一种或多种活性剂的释放。本公开还涉及制备和使用所述表面改性微粒的方法。
微粒已经被用于许多不同的应用，包括活性剂的控制递送和/或释放。如果需要，控制或改变活性剂的释放曲线能够延长活性剂在受试者血流中的水平(例如治疗水平)，改进药物动力学和药效学，并导致对受试者有更大的方便性。
发明概述
本公开一般涉及制备表面改性的微粒的方法。在一个实施例中，所述方法包括提供含有至少一种活性剂的无定形固体预成形微粒。所述预成形微粒的外表面携带净表面电荷。该方法还包括将预成形微粒的至少外表面暴露至具有净电荷的至少一种带电化合物，其净电荷的符号与预成形微粒外表面的净表面电荷符号相反。形成了带电化合物的单层，所述单层由此与预成形微粒外表面结合。
本公开还涉及制备表面改性微粒的方法，该方法包括提供含有溶剂、至少一种活性剂和一种或多种相分离促进剂的液体连续相体系。所述方法包括：任选地以控制速率诱导液-固相分离作用，以引起液-固分离，形成包括固体和含有所述活性剂的无定形微粒的固体相，所述微粒具有携带净表面电荷的外表面，而溶剂和相分离促进剂留在液相中。在形成微粒后，使成形微粒的至少外表面暴露于具有净电荷的至少一种带电化合物，该净电荷的符号与微粒外表面的净表面电荷符号相反。该方法还包括在成形微粒上形成包括至少一种带电化合物的单层，成形单层由此与微粒外表面结合。
本公开还涉及制备表面改性微粒的方法，该方法包括提供含有至少一种活性剂的无定形固体预成形微粒，所述预成形微粒的外表面携带净表面电荷。在该实施例中，所述方法还包括将预成形微粒的至少外表面暴露至具有净电荷的至少一种带电化合物，所述净电荷的符号与预成形微粒的净表面电荷符号相反。形成了中间体微粒，该微粒包括预成形微粒和含有至少一种带电化合物的成形单层，其中成形单层与预成形微粒外表面结合。然后将成形单层暴露于至少带不同电荷的化合物，以形成表面改性微粒，该微粒包括中间体微粒和含有至少一种带不同电荷化合物的后续单层。所述表面改性微粒释放至少一种活性剂的释放曲线不同于中间体微粒的释放曲线。
本公开还涉及包括固体无定形核心微粒的微粒，该核心微粒包括80％重量或更多的至少一种活性剂。核心微粒的外表面携带经选择的净表面电荷。至少一种带电化合物的单层携带着与核心微粒外表面的表面电荷完全不同的净表面电荷以允许与其结合，该单层至少通过但不限于与外表面的静电相互作用而与核心微粒的外表面结合。
固体微粒包括重量比为至少80％的至少一种活性剂，其中微粒的外表面包括与活性剂结合的至少一种带电化合物，当在经选择的pH和温度下，在合适的缓冲液中进行体外释放时，所述固体微粒的1小时活性剂累积释放百分比为50％或更少。
此外，固体预成形微粒包含重量比为至少80％的至少一种蛋白质化合物，其中预成形微粒的外表面具有与蛋白质化合物结合的至少一种带电化合物，该预成形微粒适用于体内给药。在所述给药后，微粒提供的Cmax和tmax不同于核心微粒的Cmax和tmax。
下面描述上述微粒、制备微粒的方法和控制活性剂从微粒中释放的方法的其它细节。
附图简述
图1的流程图显示本公开所述的示例方法；
图2示意说明在预成形微粒上构造带电化合物单层；
图3显示具有交替的带电单层的胰岛素微粒的ζ电位变化(实施例1A&1B)；
图4显示分别具有一单层不同聚阴离子化合物的胰岛素微粒的ζ电位变化(实施例2A)；
图5显示分别具有一单层不同聚阳离子化合物的胰岛素微粒的ζ电位变化(实施例2B)；
图6显示具有一单层FITC标记鱼精蛋白的胰岛素微粒的激光扫描共焦(LSC)显微图(实施例2B)；
图7显示分别具有第一单层不同聚阴离子化合物和第二单层聚-L-赖氨酸的胰岛素微粒的表面电荷变化(实施例3A)；
图8是具有第一单层PSS和第二单层FITC标记PLL的胰岛素微粒的LSC显微图(实施例3A)；
图9显示在QCM电极上分别连续沉积正负电荷性质交替的聚电解质单层(例如PLL和硫酸软骨素)后的累积膜厚度(实施例3A)；
图10显示在连续沉积硫酸软骨素单层和明胶A单层后胰岛素微粒的ζ电位变化(实施例3B)；
图11比较了在包含PEG的反应介质中存在和不存在锌阳离子的情况下，具有硫酸鱼精蛋白和硫酸软骨素单层的胰岛素微粒的ζ电位(实施例4A)；
图12显示在不含PEG的反应介质中存在锌阳离子的情况下，具有硫酸鱼精蛋白和硫酸软骨素单层的胰岛素微粒的ζ电位(实施例4B)；
图13显示具有一单层罗丹宁B标记鱼精蛋白(上左)和一单层FITC标记DAP(上右)的胰岛素微粒的LSC显微图(实施例5)；
图14显示在按实施例5所述沉积各单层后胰岛素微粒的ζ电位；
图15显示在反应介质聚阳离子各种浓度下，胰岛素从用硫酸鱼精蛋白单层涂布的微粒中的释放曲线(实施例6)；
图16显示在反应介质聚阴离子各种浓度下，胰岛素从具有第一单层硫酸鱼精蛋白和第二单层羧甲基纤维素的微粒中的释放曲线(实施例7)；
图17显示胰岛素从用三种单层涂布的胰岛素微粒中的释放曲线(实施例7)；
图18A显示在接受单次皮下注射未涂布的胰岛素微粒、或用鱼精蛋白涂布的胰岛素微粒的大鼠体内，人血清胰岛素(hINS)浓度与时间的曲线(实施例8)；
图18B显示在用单次皮下注射未涂布的胰岛素微粒、或用鱼精蛋白涂布的胰岛素微粒治疗的大鼠体内，血清葡萄糖抑制与时间的曲线(实施例8)；
图19显示在pH7.0的各种降低溶解性的介质中，通过沉积一单层鱼精蛋白改变胰岛素微粒的表面电荷(实施例9)；
图20A显示反应介质中鱼精蛋白的浓度对胰岛素微粒的表面电荷、和从体外释放开始48h后的溶出度的影响(实施例10)；
图20B显示反应介质中CMC的浓度对用鱼精蛋白涂布的胰岛素微粒表面电荷、和从体外释放开始48h后的溶出度的影响(实施例10)；
图20C显示反应介质中鱼精蛋白的浓度对用一单层鱼精蛋白和一单层CMC涂布的胰岛素微粒表面电荷、和它们在从体外释放开始48h后的溶出度的影响(实施例10)；
图21A显示在连续沉积硫酸鱼精蛋白和硫酸软骨素单层后hGH微粒的ζ电位变化(实施例11)；
图21B显示hGH从用一、二或三单层正负电荷交替的硫酸鱼精蛋白和硫酸软骨素涂布的微粒中的释放曲线(实施例11)；
图22显示在连续沉积硫酸软骨素和硫酸鱼精蛋白单层后，静脉免疫球蛋白(IVIG)微粒的ζ电位变化(实施例12)；
图23显示在4至7.5的pH范围内，胰岛素微球在16％PEG溶液中的净表面电荷特性(实施例13)；
图24的流程图显示制备本公开所述微粒的另一种示例方法；
图25显示反应pH对已经用一单层硫酸鱼精蛋白、聚-L-赖氨酸、或聚-L-精氨酸表面改性的胰岛素微粒的ζ电位的影响(实施例14)；
图26显示反应pH对用一单层硫酸鱼精蛋白、聚-L-赖氨酸、或聚-L-精氨酸表面改性的胰岛素微粒的体外1小时胰岛素累积释放百分比的影响(实施例14)；
图27是用一单层罗丹宁B标记的聚-L-赖氨酸表面改性的核酸微粒的激光扫描共焦(LSC)显微图(实施例15)；
图28显示在不同温度下热处理的PLL-胰岛素微粒的体外释放曲线；和
图29A显示在已经接受单次皮下注射未涂布的胰岛素微粒、在28℃处理的PLA改性胰岛素微粒、和在4℃处理的PLA改性胰岛素微粒的大鼠体内，血清胰岛素浓度与时间的曲线(实施例18)；和
图29B显示在已经接受单次皮下注射未涂布的胰岛素微粒、在28℃处理的PLA改性胰岛素微粒、和在4℃处理的PLA改性胰岛素微粒的大鼠体内，血清葡萄糖抑制浓度与时间的曲线(实施例18)。
发明详述
除非本文另有说明，本公开中使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解和使用的意义。除非上下文另有需要，将理解单数术语应包括该术语的复数形式，复数术语应包括单数。具体地，除非上下文另有清楚地说明，在用于本文和权利要求书中时，单数形式“一”包括复数指代物。因此，例如，指代具体的微粒是指一个所述微粒或多个所述微粒，包括本领域技术人员已知的其等价物。而且，在用于本文和权利要求书中时，术语“至少一种”和“一种或多种”具有相同的意义，包括一种、两种、三种或多种。除非另有说明，在用于本公开的语境中时，下列术语应理解为具有下列意义。
“活性剂”指能够在体外和/或体内直接或间接引起一种或多种物理、化学、和/或生物学效果的天然、合成或半合成材料(例如化合物、发酵物、提取物、细胞结构)。活性剂例如通过破坏寄生生物体，或通过本质上改变宿主或寄生虫的生理来限制疾病或异常的效果，可能能够防止、减轻、治疗、和/或治愈活体的异常和/或病理症状。活性剂可能能够维持、提高、减少、限制、或破坏机体的生理功能。活性剂可能能够通过体外和/或体内检验来诊断生理病症或状态。活性剂可能能够通过吸引、失能、抑制、杀灭、改性、排斥和/或阻碍动物或微生物，来控制或保护环境或活体。活性剂可能能够通过其它方式来治疗(例如脱臭、保护、装饰、修整)机体。根据效果和/或其应用，所述活性剂还可以指生物活性剂、药用剂(例如预防剂、治疗剂)、诊断剂、营养补充剂、和/或化妆剂，并且包括但不限于前药、亲和分子、合成有机分子、聚合物、分子量为2kD或更小的分子(例如1.5kD或更小，或1kD或更小)、大分子(例如分子量为2kD或更大、优选5kD或更大的那些)、蛋白质化合物、肽、维生素、甾体、甾体类似物、脂质、核酸、碳水化合物、其前体及其衍生物。活性剂可以是离子或非离子，可以是中性的、带正电的、带负电的、或两性的，并且可以单独使用或将其中两种或多种组合使用。活性剂可以是水不溶性的，但更优选是水溶性的。活性剂的等电点可以为7.0或更大，但优选小于7.0。
“微粒”指这样的固体粒子(基本上包括固体或半固体，但排除凝胶、液体和气体)，其平均几何粒度(有时称为直径)小于1mm，优选200微米或更小，更优选100微米或更小，最优选10微米或更小。在一个实施例中，粒度可以为0.01微粒或更大，优选0.1微米或更大，更优选0.5微米或更大，最优选0.5微米至5微米。通过动态光散射法(例如光子对射光谱、激光衍射、低角度激光散射(LALLS)、中角度激光散射(MALLS))、光阻法(例如Coulter分析法)、或其它方法(例如流变学、光学显微镜或电子显微镜)可以测量平均几何粒度。肺部递送粒子的空气动力学粒度将通过飞行时间测量或Andersen级联撞击器测量确定。微粒可以具有球形(有时称为微球)和/或可以被包封(有时称为微囊)。某些微粒可以具有一个或多个内部空隙和/或空穴。其它微粒可以不含所述空隙或空穴。微粒可以是多孔的或者优选无孔的。微粒可以部分或全部由一种或多种非限制性材料形成，例如本文公开的活性剂、载体、聚合物、稳定剂和/或络合剂。
“肽”指至少部分地由两种或多种相同或不同氨基酸和/或亚氨基酸形成的天然、合成或半合成化合物。肽的非限制性例子包括寡肽(例如包含少于50个氨基酸/亚氨基酸单体单元的那些，包括二肽和三肽等)、多肽、如本文定义的蛋白质化合物、以及其前体和衍生物(例如糖基化、超糖基化化、PEG化、FITC标记、其盐)。肽可以单独使用或将其中两种或多种组合使用。肽可以是中性的、带正电的、带负电的、或两性的，并且可以单独使用或将其中两种或多种组合使用。
“蛋白质化合物”指蛋白质的天然、合成或半合成、或重组化合物或结构和/或功能相关化合物，例如包含或基本上由通过肽键共价结合的α-氨基酸组成的那些。非限制性的蛋白质化合物包括球状蛋白(例如白蛋白、球蛋白、组蛋白)、纤维状蛋白(例如胶原、弹性蛋白、角蛋白)、复合蛋白(包括含有一种或多种非肽组分的那些，例如糖蛋白、核蛋白、粘蛋白、脂蛋白、金属蛋白)、治疗蛋白、融合蛋白、受体、抗原(例如合成或重组抗原)、病毒表面蛋白、激素和激素类似物、抗体(例如单克隆或多克隆抗体)、酶、Fab片段、环状肽、线性肽等。非限制性治疗蛋白包括骨形态发生蛋白、耐药性蛋白、类毒素、红细胞生成素、血液凝结级联蛋白(例如因子VII、因子VIII、因子IX等)、枯草杆菌蛋白酶、卵白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶(AAT)、DNase、超氧化物岐化酶(SOD)、溶菌酶、核糖核酸酶、透明质酸酶、胶原酶、人生长激素(hGH)、红细胞生成素、胰岛素和胰岛素样生长因子或其类似物、干扰素、格拉默(glatiramer)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞集落刺激因子、去氨加压素、促黄体生成激素释放激素(LHRH)激动剂(例如亮丙立德、戈舍瑞林、布舍瑞林、戈那瑞林、组氨瑞林、那法瑞林、地洛瑞林、夫替瑞林、曲普瑞林)、LHRH拮抗剂、加压素、环孢菌素、降钙素、副甲状腺激素、副甲状腺激素肽、胰岛素、糖原样肽、及其类似物。蛋白质化合物可以是中性的、带正电的、带负电的、或两性的，并且可以单独使用或将两种或多种组合使用。
“核酸”指至少部分地由两种或多种相同或不同核苷形成的天然、合成、半合成或重组化合物，并且可以是单链或双链的。核酸的非限制性例子包括寡核苷酸(例如具有20个或更少碱基对的那些，例如有义、反义或错义)、适体(aptamers)、多核苷酸(例如有义、反义或错义)、DNA(例如有义、反义、或错义)、RNA(例如有义、反义或错义)、siRNA、核苷酸构建体、其单链或双链片段、以及其前体和衍生物(例如糖基化、超糖基化、PEG化、FITC标记、核苷、其盐)。核酸可以是中性的、带正电的、带负电的、或两性的，并且可以单独使用或将两种或多种组合使用。
“碳水化合物”指至少部分地由单体糖单元形成的天然、合成、或半合成化合物。非限制性碳水化合物包括多糖、糖、淀粉和纤维素，例如羧甲基纤维素、葡聚糖、羟乙基淀粉、环糊精、藻酸盐、壳聚糖、软骨素、肝素、以及其前体和衍生物(例如糖基化、超糖基化、PEG化、FITC标记、其盐)。碳水化合物可以是离子或非离子，可以是中性的、带正电的、带负电的、或两性的，并且可以单独使用或将两种或多种组合使用。
“脂质”指天然、合成或半合成的化合物，它们通常是两性的。脂质通常包括亲水组分和疏水组分。非限制性例子包括脂肪酸、中性脂肪、磷脂、油、糖脂、表面活性剂、脂肪醇、蜡、萜烯和甾体。脂质可以是离子或非离子，可以是中性的、带正电的、带负电的、或两性的，并且可以单独使用或将两种或多种组合使用。
“络合剂”指能够与活性剂形成一个或多个非共价结合的材料。通过这种结合，络合剂能够促进将一种或多种活性剂装载到微粒内、将活性剂保留在微粒内、和/或以其它方式改良活性剂从微粒中的释放。络合剂可以是离子或非离子，可以是中性的、带正电的、带负电的、或两性的，并且可以单独使用或将两种或多种组合使用。
特别是与试剂(例如化合物)、过程或条件结合使用时，“稳定”指所述试剂、过程或条件能够至少部分地形成微粒(或包含所述微粒的组合物、制剂或试剂盒)、促进其形成、和/或增强其稳定性(例如维持相对平衡的条件，如对破坏、分解、降解等的耐受性增强)。非限制性的稳定过程或条件包括热输入/输出(例如加热、冷却)、电磁辐射(例如γ射线、X射线、UV、可见光、光化性射线、红外线、微波、无线电波)、高能粒子辐射(例如电子束、核子)、和超声波辐射。非限制性的稳定剂包括脂质、蛋白质、聚合物、碳水化合物、表面活性剂、盐(例如有机或无机盐，其阳离子是一价或多价金属、有机或有机金属阳离子，阴离子是一价或多价有机、无机、或有机金属阴离子)、以及本文公开的某些载体、活性剂、交联剂、助剂、和络合剂。稳定剂可以是离子或非离子，可以是中性的、带正电的、带负电的、或两性的，并且可以单独使用或将两种或多种组合使用。
“大分子”指能够提供三维(例如三级和/或四级)结构的材料，包括本公开的载体和某些活性剂。其中用于形成微粒的非限制性大分子包括聚合物、共聚物、蛋白质(例如酶、重组蛋白、白蛋白如人血清白蛋白)、肽、脂质、碳水化合物、多糖、核酸、载体(例如病毒、病毒粒子)、其络合物和共轭物(例如通过两种大分子之间的共价和/或非共价结合如碳水化合物-蛋白质共轭物、通过活性剂与大分子之间的共价和/或非共价结合如半抗原-蛋白质共轭物，活性剂能够或不能具有三级和/或四级结构)、及其中两种或多种的混合物，优选分子量为1,500或更大。大分子可以是中性的、带正电的、带负电的、或两性的，并且可以单独使用或将两种或多种组合使用。
“球形”指至少“基本上为球形”的几何形状。“基本上为球形”指在通过几何中心的任何切面上，最长长度(即位于周长上、并穿过所述形状的几何中心的两点之间的长度)与最短长度的比率为约1.5或更小，优选约1.33或更小，更优选1.25或更小，球形不需要对称线。此外，微粒可以具有表面纹理(例如当与微粒的总尺寸相比时，比例很小的连续或离散线条、隔断、格子、锯齿、通道开口、隆起物)并仍然为球形。在球形微粒之间的表面接触最小，这使得微粒的不合意附聚最小化。相反，通过离子和/或非离子相互作用，晶体或薄片微粒通常会在相对大的平坦表面上发生明显附聚。
“单分散尺寸分布”指优选的微粒尺寸分布，其中第90个百分点(即最大的10％微粒的平均粒度)的体积直径与第10个百分点(即最小10％微粒的平均粒度)的体积直径之比为约5或更小，优选约3或更小，更优选约2或更小，最优选约1.5至1。因此，“多分散尺寸分布”指其中上述直径之比大于5，优选大于8，更优选大于10。在具有多分散尺寸分布的微粒中，较小的微粒可以填充在较大微粒之间的缝隙内，因此其间可能具有很大的接触表面和明显的附聚。还可以使用2.5或更小、优选1.8或更小的几何标准偏差(GSD)来指示单分散尺寸分布。本领域技术人员知道并理解GSD的计算。
“无定形”指“基本上无定形”的材料和结构，例如具有多个非晶结构域的微粒(或完全缺少结晶性)或其它非晶体。本公开的基本上无定形微粒通常是随机的固体粒子，其中晶格构成微粒体积和/或重量的小于50％、或者不存在晶格，包括本领域技术人员理解的半晶体微粒和非晶体微粒。
“固体”指包括至少基本上为固体和/或半固体的状态，但排除凝胶、液体和气体。
“预成形微粒”指使用例如本领域技术人员已知的一种或多种非限制性方法构造的微粒，未进行本文所述的表面改性，在其外表面上具有或能够具有正、负、或中性净表面电荷。预成形微粒在本文中还称为“核心微粒”或“核心”。预成形或核心微粒通常包括一种或多种活性剂，和任选的一种或多种载体，它们可以独立包含在一部分预成形或核心微粒中，或者优选基本上均匀分布到整个预成形微粒中。净表面电荷优选不为零，可以主要或至少基本上来自活性成分和/或任选的载体。
“载体”指主要功能是提供三维结构(包括三级和/或四级结构)的化合物，通常为大分子。在形成上述微粒时，载体可以与活性剂不结合或结合(例如其共轭物或络合物)。载体还可以提供其它功能，例如作为活性剂、改良活性剂从微粒中的释放曲线、和/或为微粒提供一种或多种特定性质(例如至少部分地提供净表面电荷)。在一个实施例中，载体是分子量为1500道尔顿或更大的蛋白质(例如白蛋白，优选人血清白蛋白)。
“聚合物”或“聚合的”指天然、合成、或半合成分子，分子中具有主链或环状结构和两个或多个重复单体单元。聚合物广义地包括二聚体、三聚体、四聚体、低聚物、较高分子量的聚合物、加合物、均聚物、无规共聚物、假共聚物、统计共聚物、交替共聚物、周期共聚物、二聚物、三聚物、四聚物、其它形式的共聚物、其取代的衍生物、及其混合物，狭义地指具有10个或更多重复单体单元的分子。聚合物可以是线性的、分枝的、嵌段的、接枝的、单分散的、多分散的、规则的、不规则的、有规立构的、全同立构的、间同立构的、有规立构的、无规立构的、立构嵌段的、单链的、双链的、星状的、梳状的、枝状的、和/或离聚的，可以是离子或非离子，可以是中性的、带正电的、带负电的、或两性的，并且可以单独使用或将两种或多种组合使用。
“悬浮体”或“分散体”指两相或多相(例如固体、液体、气体)的混合物，优选是细分的，例如固体在液体中、液体在液体中、气体在液体中、固体在固体中、固体在气体中、液体在气体中等。悬浮体或分散体可以优选长期保持稳定(例如几分钟、几小时、几天、几周、几个月、几年)。
“再悬浮”指通过添加可流动的介质(例如液体)，将微粒从不可流动的(例如固体)状态转变为可流动的(例如液体)状态，同时保留微粒的大多数或全部性质。液体可以是例如水性的、水混溶性的、或有机的。
“带电”和“带电的”互换地指能够提供一个、两个、三个、或多个相同或相反符号电荷的形式单位和/或所述电荷的存在(即“带电”指可带电的和/或带电的)的能力。优选当面临某些条件时(例如在溶液或悬浮体中)，电荷可以以相关化合物(例如聚电解质、蛋白质)或结构(例如预成形微粒、单层)中的一种或多种相同或不同有机和/或有机金属部分的形式(例如离子基团、可离子化的基团、其前体)提供和/或存在。
“带电化合物”和“带电的化合物”互换地指如上所述带电的单个化合物，或未结合和/或结合形式的两种或多种不同化合物的组合(例如其共轭物、聚集物、和/或络合物)，它们分别独立地具有和/或能够具有相同符号的净电荷。
“单层”指由一种或多种化合物(例如上述带电化合物)的组合物在三维基材上形成的单一层。单层可以是连续无孔的单层、连续有孔的单层(例如网格)、多个离散元素(例如隔离物、条带、簇丛等)的不连续单层、或其组合。通常，单层将是可分解或可降解的，例如可生物降解的、可酶解的或可水解的等，以允许(从微粒)非扩散地释放活性剂，所述活性剂上沉积有单层。单层的厚度可以为100nm或更小，优选50nm或更小，更优选20nm或更小，最优选10nm或更小。在一个实施例中，通过带电化合物的自组装形成单层。
“饱和单层”指当面临单层形成的相同条件设置时，上述单层不能够进一步累积掺入过量的单层构成组合物。饱和单层是用于表面改性微粒的优选单层。
“净电荷”和“净电负荷”互换使用，指例如在可流动的介质和某些条件下(优选在某些pH的溶液中)，带电化合物能够具有的所有形式单位电负荷的总和。净电荷可以是正的、负的或零(例如两性化合物)，并且是条件依赖性的(例如溶剂、pH)。
“净表面电荷”和“净表面电负荷”互换使用，指三维结构(例如微粒、单层)最外表面上的总累积电荷。净表面电荷可以是正的、负的或零，并且是条件(例如溶剂、pH)依赖性的。
“环境温度”指室温左右的温度，典型范围为约20℃至约40℃。
“受试者”或“患者”指动物，包括脊椎动物如哺乳动物，优选人。
“受试者区域”指受试者的局部内部或外部区域或部分(例如器官)，或遍布整个受试者的区域或部分的集合(例如淋巴细胞)。所述区域的非限制性例子包括肺部区域(例如肺、肺泡)、胃肠道区域(例如由食道、胃、小大肠、和直肠限定的区域)、心血管区域(例如心肌组织)、肾区域(例如由肾、腹动脉、以及直接朝向和离开肾的血管限定的区域)、血管系统(即血管，例如动脉、静脉、毛细血管等)、循环系统、健康或患病组织、良性或恶性(例如肿瘤性或癌性)组织、淋巴细胞、受体、器官等，以及要用诊断成像法成像的区域、要用活性剂给药和/或治疗的区域、要靶向以递送活性剂的区域、和升高温度的区域。
“治疗”指可用于治疗(包括预防、诊断、减轻、抑制、免除或治愈)受试者体内的病变、痛苦、疾病或损伤的任何药剂、药物、预防剂、造影剂、或染料。治疗有用的肽和核酸可以包括在术语“药剂”或“药物”的定义内。
“亲和分子”指能够促进体内区域和/或体外组织/受体结合和/或靶向的任何材料或物质。亲和分子包括受体和靶向配体，可以是天然的、合成的或半合成的，可以是离子或非离子，可以是中性的、带正电的、带负电的、或两性的，并且可以单独使用或将两种或多种组合使用。非限制性的亲和分子包括蛋白质化合物(例如抗体、抗体片段、激素、激素类似物、糖蛋白和卵磷脂)、肽、多肽、氨基酸、糖、糖类(例如单糖、多糖、碳水化合物)、维生素、甾体、甾体类似物、辅因子、活性剂、核酸、病毒、细菌、毒素、抗原、其它配体、其前体及其衍生物。
“前体”指能够被转化为所需材料或物质的任何材料或物质，优选通过化学和/或生化反应或途径，例如将前体锚定到物质上。非限制性前体部分包括马来酰亚胺基、二硫化物基(例如邻吡啶基二硫化物)、乙烯基砜、叠氮基、和α-碘乙酰基。
“衍生物”指由母材料或物质形成的任何材料或物质，优选通过本领域普通技术人员认为常见的化学和/或生化反应或途径。衍生物的非限制性例子包括糖基化、超糖基化、PEG化、FITC标记、用保护基保护(例如苄基用于醇或硫醇，叔丁氧羰基用于胺)、以及盐、酯、酰胺、共轭物、络合物、与制造相关的化合物、及其代谢物。盐可以是有机或无机盐，阳离子为一价或多价金属、有机或有机金属阳离子，阴离子为一价或多价有机、无机、或有机金属阴离子。优选的盐是可药用的，包括但不限于碱性残基(例如胺)的无机或有机酸盐、酸性残基(例如羧酸)的碱盐或有机盐等，例如由无毒无机酸(例如氢氯酸、氢溴酸、硫酸、磺酸、磷酸、硝酸)和有机酸(例如乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、双羟萘酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、对氨基苯磺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙烷二磺酸、草酸、羟乙磺酸)形成的母化合物的常规无毒盐或季铵盐。
“类似物”指具有主化合物或其类别的化学改性形式的化合物，它保留了主化合物或类别的药学和/或药理学活性。
“前药”指当给药至受试者时，能体内释放活性剂的任何共价键合的载体。已知前药可增强活性剂的许多合意性质(例如溶解度、生物利用度、制造)。通过对活性剂所含的官能团(例如羟基、氨基、羧基、和/巯基)的改性，可以制备前药，改性方式使得该改性在常规操作中或在体内被逆转(例如改性基团被切割)以提供源活性剂。体内转换可以是例如作为一些代谢过程，例如羧酸酯、磷酸酯或硫酸酯的化学或酶水解，或者敏感官能团的还原或氧化的结果。
“代谢物”指通过机体对化合物给药形式的作用，在受试者体内获得的化合物形式。例如，在将带有甲基的甲基化化合物给药后，可以在体内获得去甲基化代谢物。代谢物本身可以具有生物学活性，优选治疗活性。
“诊断剂”指与感知观察(例如成像)正常或异常生物学症状或状态、或检查病原体或病理症状存在或不存在的方法结合使用的任何材料或物质。非限制性诊断剂包括与辐射成像(例如X射线成像)、超声波成像、磁共振成像、计算机X线断层扫描成像、正电子发射X线断层扫描成像等结合使用的造影剂和染料。诊断剂还包括用于促进体内和/或体外诊断的任何其它试剂，无论是否使用成像方法。
“交联”、“交联的”和“交联着”通常指通过一个或多个共价和/或非共价(例如离子)结合，联接两种或多种材料和/或物质，包括本文公开的任何材料和/或物质。可以天然实现交联(例如胱氨酸残基的二硫化物键)，或者例如任选地在一种或多种交联剂(即分子X本身能够与两种或多种材料/物质Y和Z反应以形成交联产物Y-X-Z，其中Y-X和X-Z的结合是独立的共价和/或非共价作用)、引发剂(即分子本身能够提供活性类物质如自由基用于交联反应，例如可热分解的引发剂如有机过氧化物、偶氮引发剂、和碳-碳引发剂、可光化性分解的引发剂如各种波长的光引发剂)、活化剂(即分子A能够与第一材料/物质Y反应以形成活化中间体[A-Y]，然后中间体与第二材料/物质Z反应以形成交联产物Y-Z，同时A在过程中被化学改变或消耗)、催化剂(即分子能够改良交联反应的动力学，而不会在过程中被化学改性)、助剂(即当与引发剂、活化剂、和/催化剂中的一种或多种共同存在时，分子能够改良交联反应的动力学和/或被掺入两种或多种材料/物质的交联产物中，但不会以其它方式与材料/物质反应)、和/或能源(例如加热；冷却；高能辐射如电磁、电子束、和核子；声音辐射如超声波等)存在的情况下，通过合成或半合成途径实现。
“共价结合”指在两个原子的键合轨道中，参与共用电子的两个或多个个体分子之间的分子间相互作用(例如键)。
“非共价结合”指两个或多个个体分子之间的分子间相互作用，不涉及共价键。分子间相互作用取决于例如个体分子的极性、电荷、和/或其它特性，包括但不限于静电(例如离子)相互作用、偶极-偶极相互作用、范德华力、及其中两种或多种的组合。
“静电相互作用”指两个或多个正电或负电部分/基团之间的分子间相互作用，当两个电荷相反时吸引(即一个正电、一个负电)，当两个电荷符号相同时排斥(即两个正电或两个负电)，或其组合。
“偶极-偶极相互作用”指两个或多个极性分子、例如具有无电荷、部分正性末端δ+(例如正电性头基如磷脂酰胆碱的胆碱头基)的第一分子与具有无电荷、部分负性末端δ-(例如负电性原子，如多糖中的杂原子O、N、或S)的第二分子之间的分子间相互作用。偶极-偶极相互作用还指分子间的氢键键合，其中氢原子作为相隔分子上负电原子之间的桥梁，且其中氢原子通过共价键结合至第一分子，通过静电力结合至第二分子。
“氢键”指共价键合至第一负电原子(例如O、N、S)和第二负电原子的氢原子之间的吸引力或桥梁，其中第一和第二负电原子可以处于两个不同的分子中(分子间氢键键合)或处于单个分子中(分子内氢键键合)。
“范德化力”指非极性分子之间的吸引力，由量子力学说明。范德化力通常涉及由电子分布发生变化的相邻分子诱导的瞬间偶极。
“亲水相互作用”指对水分子的吸引，其中材料/化合物或其部分可以与水结合、吸收水、和/或溶于水。这可能导致溶胀和/或形成可逆的水凝胶。
“疏水相互作用”指对水分子的排斥，其中材料/化合物或其部分不与水结合、不吸收水、和/或不溶于水。
“可生物相容的”指材料/物质通常不会损害生物学功能，并且不会导致不可接受的毒性(例如致敏反应或疾病状态)。
“与…结合”或“与…结合的”通常指微粒的不同材料(通常为微粒的部分)之间、一种或多种所述材料和一种或多种结构(或其部分)之间、和微粒的不同结构(或其部分)之间的一种或多种相互作用和/或包含。微粒的材料包括但不限于离子如本文公开的一价和多价离子，以及本文公开的化合物如活性剂、稳定剂、交联剂、带电或不带电的化合物、各种聚合物、以及其中两种或多种的组合。微粒及其部分的结构包括但不限于核心、核心微粒、预成形微粒、单层、中间体微粒、表面改性的微粒、所述结构的部分(例如外表面、内表面)、所述结构及其部分之间的结构域、以及其中两种或多种的组合。各种可逆或不可逆、迁移性或非迁移性的结合可以单独存在或作为其中两种或多种的组合存在。非限制性结合包括但不限于共价和/或非共价结合(例如共价键、离子相互作用、静电相互作用、偶极-偶极相互作用、氢键键合、范德华力、交联、和/或任何其它相互作用)、包封在层/膜中，划分在中心或小泡或两个层/膜之间、均匀整合在整个微粒或其部分内(例如包含在、粘合至、和/或附加至中心或层或小泡、或其内表面和/或外表面；在不同材料之间散布、共轭、和/或络合)。
“组织”通常指单个细胞或特定细胞的集合或聚集，其能够实施一种或多种具体功能。非限制性组织的例子包括膜组织(例如内皮、上皮)、血液、板层、结缔组织(例如间质组织)、器官(例如心肌组织、心肌细胞、心肌细胞(cardiomyocite))、异常细胞(例如肿瘤)。
“受体”指细胞内或其表面上的分子结构，通常特性是可选择性地结合特定物质，例如配体。非限制性受体包括肽激素、神经递质、抗原、补体片段、和免疫球蛋白的细胞表面受体、以及甾体激素的胞质受体。
“控制释放”指与活性剂天然形式的释放曲线相比，活性剂的预定体内和/或体外释放(例如溶出)曲线。活性剂优选与本文公开的微粒或包含所述微粒的组合物或制剂结合，从而提高、降低、缩短、延长和/或以其它方式按需改良其释放动力学的一个或多个方面(例如初始突释、在特定时间段或相内的数量和/或速率、在特定时间段内的累积数量、总释放的时间长度、模式和/或曲线等)。控制释放的非限制性例子包括迅速/瞬间释放(即初始突释或速释)、延长释放、持续释放、长期释放、延迟释放、改良释放、和/或靶向释放，独立发生、两种或多种组合发生、或在缺少其中一种或多种的情况下发生(例如在缺少初始突释的情况下延长或持续释放)。
“延长释放”指活性剂的释放时间段长于活性剂天然形式的自由水扩散时间段，该活性剂优选与本文公开的微粒或包含所述微粒的组合物或制剂结合。该延长释放期可以为几小时(例如至少约1、2、5或10小时)、几天(例如至少约1、2、3、4、5、6、7、8、10、15、20、30、40、45、60、或90天)、几周(至少约1、2、3、4、5、6、10、15、20、30、40、或50周)、几个月(至少约1、2、3、4、6、9、或1 2个月)、约1年或多年、或任何两个时间段内的范围。延长释放的模式可以是连续的、周期的、零星的、或其组合。
“持续释放”指活性剂的延长释放，从而使得功能显著水平的活性剂(即该水平能够带来活性剂的所需功能)存在于延长释放期内的任何时间点，优选具有连续和/或均匀释放模式。持续释放曲线的非限制性例子包括如下，当出现在释放时间(x-轴)对累积释放(y-轴)图形中时，在1小时或更长的时间段内，显示至少一个线型、逐级、之字形、曲线、和/或波浪形的向上片段。
除了在运行的实施例外，或者除非另有清楚地说明，所有数字范围、量、值和百分比例如用于定量材料、时间、温度、反应条件、量比率、分子量值(无论是数均分子量Mn还是重均分子量Mw)、和本文公开的其它内容的那些应理解为在所有情况下由术语“约”修饰。因此，除非有反面说明，本公开和所附权利要求书中所列的数字参数是可以按需变化的约数。最起码，每个数字参数应至少根据所报告的有效位数数字并通过应用普通四舍五入法来理解。
尽管列出本公开广阔范围的数字范围和参数是约数，但尽可能精确地报告了在具体实施例中列出的数值。然而，任何数值本身均包含由在其各自检测中发现的标准偏差所必然导致的某些误差。而且，当本文给出可变范围的数字范围时，预期可以使用由所述数值包括的这些数值的任何组合。
“由…形成”和“由…制成”指开放语言。同样，预期由一列引用组分“形成”或“制成”的组合物是包括至少这些引用组分的组合物，而且在配制组合物的过程还能够包括其它未引用的组分。
认为本文提供的实施例、包括在“例如”和“诸如”后面的那些仅仅用于说明本发明及其实施方案的各个方面，并非对其做具体限制。本领域技术人员已知和/或可利用的任何适当的等价物、替代物、及其修改(包括材料、物质、构建体、组合物、制剂、手段、方法、条件等)均可以使用或用来代替本文公开的那些或与其组合，认为这些也落在本公开的范围内。
在一个实施例中，本公开的每种表面改性微粒优选包含无定形(例如不含晶体结构)的固体预成形微粒，至少在其外表面上结合有包含至少一种带电化合物的至少一个单层。预成形微粒包含分子量为4,500道尔顿或更大的至少一种活性剂和/或至少一种大分子。大分子可以是活性剂，或者可以不同于活性剂。大分子可以是载体、稳定剂、或络合剂(例如蛋白质化合物、聚电解质)。活性剂和/或大分子可以占预成形微粒重量的40％至100％或更少，通常为至少80％，例如90％或更多或95％或更多。优选地，活性剂和/或大分子均匀分布在整个核心微粒上。预成形微粒的外表面携带净表面电荷，它可以至少部分、更典型为大部分来自活性剂和/或大分子，尤其当外表面由活性剂和/或大分子形成时。预成形微粒可以不含共价交联、水凝胶、脂质、和/或包封。作为替代，预成形微粒可以包含一种或多种带电化合物、共价交联、和/或包封。预成形微粒内的一种或多种带电化合物可以均匀散布在整个预成形微粒中，或者划分在其具体部分内，例如在层内。预成形微粒的优选粒度为10μm或更小，可以具有单分散或多分散尺寸分布。
预成形微粒的预成形方法没有具体限制，包括美国专利6,458,387号和美国专利公开2005/0142206号公开的那些，它们被全文纳入本文以供参考。在一个实施例中，配制单个可流动的连续相体系(例如液体、气体、或等离子体，优选为溶液或悬浮体)，以包含一种或多种活性剂、介质、和一种或多种相分离促进剂(PSEA)。介质优选为液体溶剂(例如亲水或疏水有机溶剂、水、缓冲液、水混溶性有机溶剂、及其中两种或多种的组合)，更优选水性或水混溶性溶剂。合适的有机溶剂包括但不限于二氯甲烷、氯仿、乙腈、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、戊烷等、及其中两种或多种的组合(例如二氯甲烷与丙酮的1∶1混合物)。活性剂和PSEA可以独立溶解、悬浮或以其它方式均匀分布在介质内。当使可流动的体系面临某些条件时(例如低于活性剂在介质中的相变温度的温度)，活性剂发生液-固相分离并形成不连续的相、优选固相(例如悬浮在介质中的多个核心微粒)，而PSEA保留在连续相中(例如溶解在介质中)。
介质可以是有机物，包括有机溶剂或两种或多种彼此混溶有机溶剂的混合物，它们可以独立地与水混溶或与水不混溶。溶液还能够是基于水的溶液，其中包含水性介质、或水混溶性有机溶剂、或水混溶性有机溶剂的混合物、或其组合。水性介质可以是水、缓冲液(例如生理盐水、缓冲溶液、缓冲盐水)等。合适的水混溶性有机溶剂可以是单体或聚合物，包括但不限于：N-甲基-2-吡咯啶酮(N-甲基-2-吡咯烷酮)、2-吡咯啶酮(2-吡咯烷酮)1，3-二甲基-2-咪唑烷酮(DMI)、二甲亚砜、二甲基乙酰胺、乙酸、乳酸、丙酮、甲基·乙基酮、乙腈、甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、3-戊醇、苯甲醇、甘油、四氢呋喃(THF)、聚乙二醇(PEG，例如PEG-4、PEG-8、PEG-9、PEG-12、PEG-14、PEG-16、PEG-120、PEG-75、PEG-150)、PEG酯(例如PEG-4二月桂酯、PEG-20二月桂酯、PEG-6异硬脂酸酯、PEG-8棕榈酰硬脂酸酯、PEG-150棕榈酰硬脂酸酯)、PEG山梨聚糖(例如PEG-20山梨聚糖异硬脂酸酯)、PEG醚(例如单烷基醚和二烷基醚，例如PEG-3二甲醚、PEG-4二甲醚、和四氢呋喃聚乙二醇醚)、聚丙二醇(PPG)、PPG酯(例如聚丙二醇藻酸酯(PGA)、PPG二辛酸酯、PPG二癸酸酯、PPG月桂酯)、烷氧基化的线性烷基二醇(例如PPG-10丁二醇)、烷氧基化的烷基葡萄糖醚(例如PPG-10甲基葡萄糖醚、PPG-20甲基葡萄糖醚)、PPG烷基醚(例如PPG-15硬脂醚)、烷烃(例如丙烷、丁烷、戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷)和其中两种或多种的组合。
在优选实施例中，提供了PSEA的第一溶剂溶液，其中PSEA可溶于或可与第一溶剂混溶。将活性剂直接混合于第一溶液中，或作为第二溶剂的第二溶液与第一溶液混合。第一和第二溶剂可以相同或至少彼此混溶。优选活性剂的添加温度等于或低于环境温度，尤其当活性剂是热不稳定的分子，例如某些蛋白质化合物。然而，可以将体系加热以提高活性剂在体系中的溶解度，只要不会损害活性剂的活性。
当混合物面临相分离条件时，尽管PSEA保留在液体连续相中，但仍能增强和/或诱导活性剂从溶液中的液-固相分离(例如通过减少活性剂的溶解度)，从而形成核心微粒(固体不连续相)，它可以优选为微球。合适的PSEA化合物包括但不限于：天然和合成聚合物、线性聚合物、分枝聚合物、环状聚合物、共聚物(无规、嵌段、接枝，例如poloxamer，尤其是PLURONICF127和F68)、三聚体、两亲性聚合物、基于碳水化合物的聚合物、聚脂肪醇、聚(乙烯基)聚合物、聚丙烯酸、聚有机酸、聚氨基酸、聚醚、聚酯、聚酰亚胺、聚醛、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)、和表面活性剂。合适的或示例的PSEA包括但不限于可接受作为药用添加剂的聚合物，例如PEG类(例如PEG 200、PEG 300、PEG 3350、PEG8000、PEG 10000、PEG 20000等)、poloxamer、PVP、羟乙基淀粉、两亲性聚合物、以及非聚合物(例如丙二醇和乙醇的混合物)。
能够增强、诱导、促进、控制、抑制、延迟、或以其它方式影响液-固相分离的条件包括但不限于改变溶液的温度、压力、pH、离子强度和/或重量克分子渗透压浓度、活性剂和/或PSEA的浓度等、以及所述变化的速率、和其中两种或多种的组合。可以希望就在相分离之前和直至相分离、或者甚至在相分离过程中应用所述条件。在一个实施例中，单独将体系暴露至低于其中活性剂相变温度的温度，或者同时调整活性剂和/或PSEA的浓度，如美国专利申请公开2005/0142206中所述，该文献的全部内容被纳入本文以供参考。温度下降的速率可以保持稳定或以任何受控方式变化，只要它在0.2℃/分钟至50℃/分钟的范围内，优选0.2℃/分钟至30℃/分钟。可以将单独使用冰点抑制剂(FPDA)，或使用两种或多种的组合，直接在体系中或其溶液中(例如水溶液)混合，尤其对于其中冰点高于活性剂相变温度的体系。合适的FPDA包括但不限于丙二醇、蔗糖、乙二醇、醇类(例如乙醇、甲醇)、及其水混合物。
在一个实施例中，预成形微粒还可以包括几乎不影响相分离的一种或多种赋形剂。赋形剂可以浸透核心微粒和/或其中的化合物(例如活性剂、任选的载体)，以提供额外的性质如提高稳定性、活性剂从预成形微粒中的控制释放、和/或改良活性剂穿越生物组织的渗透性。合适的赋形剂包括但不限于碳水化合物(例如海藻糖、蔗糖、甘露醇)、多价阳离子(优选金属阳离子，例如Zn2+、Mg2+、Ca2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+)、阴离子(例如CO3 2-、SO4 2-)、氨基酸(例如甘氨酸)、脂质、磷脂、脂肪酸及其酯、表面活性剂、甘油三酯、胆酸及其共轭物和盐(例如胆酸、脱氧胆酸、甘胆酸盐、牛磺胆酸、胆酸钠)、和本文公开的任何聚合物。
可以任选地将预成形微粒从溶液中分离并洗涤，然后进行本文公开的表面改性，或者不进行分离或洗涤而进行表面改性。分离手段包括但不限于离心、透析、沉降(乳化)、相分离、色谱法、电泳、沉淀、萃取、亲和结合、过滤、和透滤。对于具有相对低水溶性的活性剂，洗涤介质可以为水性的，任选地包含一种或多种降溶剂(SRA)和/或本文公开的赋形剂。优选的SRA能够与微粒中的活性剂和/或载体形成不溶性络合物，包括但不限于化合物如包括二价或多价阳离子的盐(例如本文公开的那些)。对于具有相对高水溶性的活性剂(例如蛋白质化合物)，洗涤介质可以是有机物，或者是水性的，但至少包含一种SRA或沉淀剂(例如硫酸铵)。在一个实施例中，洗涤介质是用于相分离反应的相同溶液，例如包括约16％(w/v)PEG和0.7％(w/v)NaCl的水溶液。
优选洗涤介质具有低沸点，使得其易于通过例如冻干、蒸发、或干燥除去。洗涤介质可以是超临界流体或接近其超临界点的流体，单独使用或与共溶剂组合使用。超临界流体可以是PSEA的溶剂，但不是预成形微粒的溶剂。超临界流体的非限制性例子包括液体CO2、乙烷、和氙。共溶剂的非限制性例子包括乙腈、二氯甲烷、乙醇、甲醇、水和2-丙醇。
如上所述，具有不同水溶性的活性剂均可用于本文所述的微粒中。尽管可以使用水不溶性活性剂，但优选水溶性活性剂。
活性剂可以是药用试剂。根据其效果和/或应用，药用试剂包括但不限于：辅药、肾上腺素能药物、肾上腺素能阻断药、肾上腺皮质类固醇、抗肾上腺素药、拟肾上腺素药、生物碱、烷化剂、变构抑制剂、合成代谢甾体、兴奋药、止痛药、麻醉药、食欲抑制药、抗酸药、驱虫药、抗过敏药、抗血管发生药、抗心律失常药、抗菌药、抗生素、抗体、抗癌药、抗胆碱能药、抗胆碱酯酶药、抗凝血药、抗惊厥药、抗痴呆药、抗抑郁药、抗糖尿病药、抗腹泻药、解毒药、抗癫痫药、抗叶酸药、抗真菌药、抗原、驱虫药(antihelmintics)、抗组胺药、抗高血脂药、抗高血压药、抗感染药、抗炎药、抗疟药、抗代谢药、抗毒蕈碱药、抗分枝杆菌药、抗肿瘤药、抗骨质疏松药、抗病原药、抗原虫药、粘合分子、退热药、抗风湿药、防腐剂、抗甲状腺药、抗溃疡药、抗病毒药、抗焦虑镇定药、收敛药剂、β-肾上腺素受体阻断药、生物杀灭药、血液凝结因子、降钙素、强心药、化学药、降胆固醇药、辅因子、皮质类固醇、镇咳药、细胞因子、利尿药、多巴胺能药、雌激素受体调节药、酶及其辅因子、酶抑制剂、生长分化因子、生长因子、造血药、生血药、血红蛋白调节药、止血药、激素和激素类似物、催眠药、低血压利尿药、免疫药、免疫刺激药、免疫抑制药、抑制剂、配体、脂质调节药、淋巴因子、拟毒蕈碱药、肌肉松弛药、神经阻断药、亲神经药、紫杉醇及衍生化合物、拟副交感神经药、副甲状腺激素、促进剂、前列腺素、心理治疗药、精神治疗药、放射性药物、受试者、镇定药、性激素、消毒药、刺激药、血小板生成药、营养因子、拟交感神经药、甲状腺药、疫苗、血管扩张药、维生素、黄嘌呤、以及其结合物、复合物、前体和代谢物。活性剂可以单独使用或将其中两种或多种组合使用。在一个实施例中，活性剂为预防和/或治疗剂，包括但不限于肽、碳水化合物、核酸、其它化合物、其前体和衍生物、和其中两种或多种的组合。
如上所述，活性剂可以是化妆剂。其中非限制性化妆剂包括润肤剂、湿润剂、自由基抑制剂、抗炎剂、维生素、脱色素剂、抗痤疮剂、抗皮脂溢药、角质层分离剂、减肥药、皮肤着色剂和防晒剂。可用作化妆剂的非限制性化合物包括亚油酸、视黄醇、视黄酸、抗坏血酸烷基酯、聚不饱和脂肪酸、烟酸酯、生育酚烟酸酯、米、大豆或牛油树的不可皂化物、神经酰胺、羟基酸如乙醇酸、硒衍生物、抗氧化剂、β-胡萝卜素、γ-阿魏酸酯和硬脂基甘油酸酯。化妆剂可以是市售的和/或通过已知技术制得。
如上所述，活性剂可以是营养补充剂。非限制性营养补充剂包括蛋白质、碳水化合物、水溶性维生素(例如维生素C、B-复合维生素等)、脂溶性维生素(例如维生素A、D、E、K等)和植物提取物。营养补充剂可以是市售的和/或通过已知技术制得。
如上所述，活性剂可以是分子量为2kD或更小的化合物。所述化合物的非限制性例子包括甾体、β-激动剂、抗微生物药、抗真菌药、紫杉烷类(抗有丝分裂和抗微管药)、氨基酸、脂族化合物、芳族化合物和脲化合物。
在一个实施例中，活性剂可以是用于预防和/或治疗肺部病变的治疗剂。所述试剂的非限制性例子包括甾体、β-激动剂、抗真菌药、抗微生物化合物、支气管扩张药、抗哮喘药、非甾类抗炎药(NSAIDS)、AAT、和用于治疗囊性纤维化的药。甾体的非限制性例子包括倍氯米松(例如倍氯米松二丙酸酯)、氟替卡松(例如丙酸氟替卡松)、布地奈德、雌二醇、氟氢可的松、氟氯奈德、曲安西龙(例如曲安西龙丙酮化物)、氟尼缩松及其盐。β-激动剂的非限制性例子包括沙美特罗、昔奈酸盐、富马酸福莫特罗、左沙丁胺醇、班布特罗、妥洛特罗及其盐。抗真菌药的非限制性例子包括伊曲康唑、氟康唑、两性霉素B及其盐。
如上所述，活性剂可以是诊断试剂。非限制性诊断试剂包括X-射线成像剂和造影介质。X-射线成像剂的非限制性例子包括3，5-二乙酰氨基-2，4，6-三碘苯甲酸乙酯(WTN-8883，泛影酸(diatrazoic acid)的乙酯)；6-乙氧基-6-氧代己基-3，5-二(乙酰氨基)-2，4，6-三碘苯甲酸酯(WIN67722)；2-(3，5-二(乙酰氨基)-2，4，6-三碘苯甲酰氧基)-丁酸乙酯(WIN16318)；泛影酸基乙酸乙酯(WIN 12901)；2-(3，5-二(乙酰氨基-2，4，6-三碘苯甲酰氧基)丙酸乙酯(WIN 16923)；N-乙基2-(3，5-二(乙酰氨基)-2，4，6-三碘苯甲酰氧基-乙酰胺(WIN 65312)；异丙基2-(3，5-二(乙酰氨基)-2，4，6-三碘苯甲酰氧基)乙酰胺(WIN 12855)；2-(3，5-二(乙酰氨基)-2，4，6-三碘苯甲酰氧基丙二酸二乙酯(WIN 67721)；2-(3，5-二(乙酰氨基)-2，4，6-三碘苯甲酰氧基)苯基-乙酸乙酯(WIN 67585)；丙二酸，[[3，5-二(乙酰氨基)-2，4，5-三碘苯甲酰基]氧]二(1-甲基)酯(WIN 68165)；和苯甲酸，3，5-二(乙酰氨基)-2，4，6-三碘-4-(乙基-3-乙氧基-2-丁烯酸)酯(WIN68209)。希望优选的造影剂在生理条件下相对快速地分解，从而使任何微小的相关炎性反应最小化。酶水解、羧酸在生理pH的溶解、或其它机理可导致分解。因此，微溶性碘化羧酸如胆影酸、泛影酸和甲泛影酸以及易水解的碘化物种类如WIN 67721、WIN 12901、WIN 68165和WIN 68209可能是优选的。
如上所述，可以将两种或多种活性剂组合使用。非限制性例子包括甾体和β-激动剂，例如丙酸氟替卡松与沙美特罗、布地奈德与福莫特罗等。
预成形微粒可以基本上不含内部空隙和/或空穴(例如不含小泡)、基本上没有包封、基本上不含脂质、基本上不含水凝胶或溶胀、基本上是无孔无定形的固体、和/或球形，如本文所定义的那些术语。预成形微粒可以具有多个表面通道开口，开口直径通常为100nm或更少，优选10nm或更少，更优选5nm或更少，最优选1nm或更少。预成形微粒的总体密度为0.5g/cm3或更大，优选0.75g/cm3或更大，更优选0.85g/cm3或更大。密度通常高至约2g/cm3，优选1.75g/cm3或更小，更优选1.5g/cm3或更小。
预成形微粒可以显示具有高载量的至少一种活性剂。根据配方和化合物的物理/化学性质，每个预成形微粒中通常存在至少1000个或更多、例如几百万至几千万个活性剂分子。预成形微粒中活性剂的重量百分比可以为下列任何量或更大，或者其间的任何范围，但小于100％：10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％。尽管不需要在预成形微粒中掺入明显量的填充剂和/或其它赋形剂，但其中可以存在一种或多种所述化合物。在任何情况下，大多数(50％或更多，优选75％或更多，更优选90％或更多，最优选95％或更多)或者100％活性剂保留着所需的完整性和/或活性。
通过但不限于如下方法进行预成形微粒的表面改性：以受控的方式，围绕着预成形微粒形成包含至少一种带电化合物的至少一个单层。当形成两个或多个所述单层时，它们分别包含带不同电荷的化合物，优选在其外表面上分别携带符号和/或值不同于前一层和/或后一层(如果存在)的净表面电荷。一次沉积所述一个单层可优化控制所得微粒的各种性质，从而允许定制或“微调”微粒以获得所需结果。
优选地，直接围绕预成形微粒的单层(“成形单层”)包含一种或多种带电化合物，每种化合物独立地具有与核心微粒的净表面电荷符号相反的净电荷。预成形微粒可以至少部分地可被成形单层内的带电化合物渗透。成形单层外表面携带的净表面电荷与预成形微粒外表面的净表面电荷不同、优选符号相反，尤其当成形单层是本文定义的饱和单层时。带电化合物可以包括聚电解质、带电的聚氨基酸、带电的多糖、聚离子聚合物、带电的蛋白质化合物、带电的肽、任选与不带电脂质组合的带电脂质、带电的脂质结构、及其衍生物中的一种或多种。
表面改性的微粒还可以包含一种或多种额外的正负电荷交替的带电的单层，从而使得表面改性的微粒具有所需的活性剂释放曲线。层数没有具体限制，但可以通常为1至7，例如2、3、4、5、或6。任选地，一种或多种所述带电单层可以独立地具有与其共价和/或非共价结合的一种或多种相同或不同的活性剂，例如亲和分子，尤其是靶向配体，优选位于它们各自的外表面上。作为替代或组合，核心微粒可以具有一个或多个部分，例如中心或下层(例如带电单层)，优选在部分的外表面上包含至少一种所述活性剂。
预成形微粒、表面改性的微粒、和其间的任何中间体(如果有的话)可以是和/或具有一种或多种下列性质：如本文所定义的球形、不含共价交联、不含水凝胶和/或溶胀、具有多分散或者优选单分散尺寸分布。预成形微粒可以不含脂质和/或包封。
优选地，表面改性微粒能够控制释放、尤其是持续释放活性剂，具有非限制性释放曲线，如初始突释和线性释放曲线，可以提供作为组合物或制剂中的悬浮体和/或干粉，用于药用、治疗、诊断、化妆、和/或营养应用。如上所述，控制释放可以在经选择的pH环境内发生。在这点上，优选控制释放可以发生在约2至10的pH范围内，更优选约5至7.5，例如7至7.4的生理pH或5至6.5的内体pH。
通过受控操纵一种或多种条件，例如改变反应介质的温度、压力、pH、离子强度和/或重量克分子渗透浓度、反应介质内部组分的浓度等、以及所述改变的速率、及其中两种或多种的组合，受控沉积一种或多种单层可以进一步改变微粒的净表面电荷(例如上面已经沉积有一种或多种单层的预成形微粒)。可能希望就在沉积一种或多种单层之前和直至沉积时、或者甚至在单层形成的过程中进行这种受控操作。在一个实施例中，微粒的净表面电荷能够是正的、中性的和负的。通过例如受控改变上述一种或多种条件，例如受控改变pH，来选择净表面电荷。在一个实施例中，选择溶液的pH，从而使微粒的净表面电荷为负，溶液pH与微粒表面中性点之间的差值小于0.3，或者等于或大于0.3，优选0.5或更大，更优选0.8或更大，最优选1或更大。
图1说明用于提供本公开的表面改性微粒的一种示例方法。首先提供多种预成形微粒的悬浮体用作沉积的三维基材。形成预成形微粒的非限制性方法包括本文公开的那些和本领域技术人员已知的任何其它方法。一种所述方法说明于图24的顶部，该方法涉及：提供包含活性剂和相分离促进剂的溶液，通过例如受控冷却诱导液-固相分离，并形成预成形微粒。在一个实施例中，用于形成预成形微粒的任何一种、两种、或多种、或全部化合物可以优选均匀分布遍及每个预成形微粒(例如，以类似的浓度存在于中心内、表面上、和其中的任何其它地方)。将理解本文公开的表面改性方法可以全部或部分包含在用于构造预成形微粒的潜在方法中或作为其延续，如图24所示。在预先制备未改性的微粒和表面改性之间，优选在相分离促进剂存在的情况下，从液相中分离预成形微粒，并任选地洗涤。例如，洗涤介质可以是在相分离过程中使用的相同溶液，其中包含相分离促进剂。作为替代，没有从液相中分离预成形微粒或洗涤。在任何情况下，如图1和24所示，将预成形微粒的悬浮体或再悬浮体与包括至少一种适当带电化合物的溶液合并并混合。
如上所述，预成形微粒可以包含重量百分比(wt.％)载量为40％或更多、优选60％或更多、或80％或更多、或90％或更多、或95％或更多、和小于100％、通常为98％或更少的活性剂。预成形微粒还可以具有、或能够被诱导(例如从中性状态)以具有净表面电荷。在一个实施例中，净表面电荷主要或本质上来自预成形微粒中存在的活性剂和/或载体(如果有的话)；化合物可以优选均匀分布在其中。作为替代，活性剂可以划分在预成形微粒的一个或多个部分内，例如中心或下层(例如带电单层)，优选基本上均匀分布在部分内或主要在其外表面上。预成形微粒可以暴露于(例如混合)具有或能够具有净电荷的至少一种带电化合物，其优选电荷符号与预成形微粒的净表面电荷符号相反，从而围绕预成形微粒形成带电化合物的成形单层。成形单层或表面改性微粒的净表面电荷符号可以与预成形微粒的净表面电荷符号相同、为零或优选与预成形微粒的净表面电荷符号相反。换句话说，如果预成形微粒的外表面具有负净表面电荷(例如由ζ电位测量确定)，则成形单层的外表面上优选具有正净表面电荷。作为替代，如果预成形微粒具有正净表面电荷，则成形单层优选具有负净表面电荷。单层的沉积可以发生在水介质中(例如水、缓冲液、或包含上述种类的一些水混溶性有机溶剂的水溶液，或者可以出现在制造预成形微粒的介质中)。
为了制备表面改性的微粒，非限制性方法包括：预成形或以其它方式提供未改性的微粒，将它暴露至一种或多种带电化合物，该化合物可以在微粒可以浸入的溶液中提供，和形成单层。溶液可以包含水、缓冲液、和水混溶性有机溶剂中的一种或多种，和一种或多种降溶剂(例如醇、碳水化合物、非离子型水混溶性聚合物、和/或包含单价或多价阳离子的无机离子化合物)，其重量-体积百分比浓度为5％至50％，优选10％至30％。溶液的非限制性例子包含约16％(w/v)聚乙二醇和0.7％(w/v)NaCl。溶液的pH通常在4至10的范围内，可以将它调整至与核心微粒的表面中性点相同或接近(例如差值为0至小于0.3)，或者远离该点(例如差值为0.3pH单位或更大)。带电化合物在溶液中的浓度可以为0.05mg/mL至10mg/mL。优选在2℃至5℃或高至环境温度的温度下，将预成形微粒和带电化合物在溶液中共同培育1秒至10小时。可以以受控方式形成单层。可以从溶液中分离所得表面改性的微粒或其中间体，并任选地洗涤。洗涤介质可以与上述溶液相同。如果需要，可以用正负电荷交替的带电的化合物重复该程序以形成交替正负电荷带电的单层。
如上所述，反应体系能够包括一种或多种降溶剂和/或增粘剂(SRA/VIA)、以及一种或多种PSEA。合适的SRA/VIA和PSEA包括但不限于本领域技术人员已知的那些和本文公开的那些，例如醇(例如乙醇、甘油)、碳水化合物(例如蔗糖)、非离子型水混溶性聚合物(例如PEG、PVP、聚氧乙烯和聚氧丙烯的嵌段共聚物(poloxamer)、羟乙基淀粉、葡聚糖等)、和包含多价(例如二价、三价)阳离子(例如金属和有机阳离子，例如本文公开的那些)的无机可离子化化合物，例如ZnCl2。
因此，在一个实施例中，成形单层的沉积可以在溶液中发生，该溶液包括缓冲盐水(即0.7％NaCl缓冲液)和8％或更多重量比或体积比的SRA/VIA如PEG，优选12％或更多，更优选15％或更多；通常为30％或更少，优选25％或更少，更优选20％或更少，最优选约16％或更多。溶液中所需的SRA/VIA量将部分取决于活性剂的稳定性、以及单层的溶出曲线。某些带电化合物(例如聚阳离子明胶B和壳聚糖)可以在包含16％或更少SRA/VIA的溶液中工作。
微粒净表面电荷为零时的溶液pH在本文中称为微粒在具体溶液中的表面中性点。在某些实施例中，可以将溶液的pH调整至处于或接近溶液中微粒的表面中性点，其间的差值小于0.3(pH单位)，优选0.25或更少，更优选0.2或更少。在其它实施例中，优选将溶液的pH调整至远离溶液中微粒的表面中性点，其间的差值为0.3(pH单位)或更大，优选0.5或更大，更优选0.8或更大，最优选1或更大。已经观察到在某些实施例中，将溶液pH调整到远离微粒的表面中性点能够影响其中活性剂的溶出动力学。能够在环境温度下、或优选在低于环境温度下，在溶液中培育微粒，但优选高于溶液的冰点温度，以使微粒的崩解最小化。当使用本文公开的一种或多种FPDA时，培育温度甚至可以低于溶液的冰点温度。例如，培育温度可以为0℃至15℃，优选1℃至10℃，更优选2℃至5℃，最优选小于5℃。通常，在用于构造各单层时带电化合物在溶液中的浓度可以等于、小于、和/或大于下列之一、或者在其中任何两个之间的范围内：0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、10mg/mL、5mg/mL、3mg/mL。当在溶液中将预成形微粒和带电化合物共同培育时，预成形微粒与带电化合物的重量比可以为1∶1或更大，优选2∶1至10∶1，更优选2.5∶1至7∶1。
可以调整培育时间以获得所需的电荷改变(例如中性化或电荷反转)、单层覆盖、和/或单层厚度。根据具体的反应(例如成分和/或条件)，培育时间可以等于、短于、和/或长于下列之一，或在其中任何两个之间的范围内：10小时、5小时、3小时、10分钟、30分钟、100分钟、75分钟、60分钟、15分钟、5分钟、1分钟、30秒、10秒、5秒、1秒。各单层的厚度可以等于、小于、和/或大于下列之一，或在其中任何两个之间的范围内：100nm、50nm、20nm、5nm、1nm、0.5nm、0.1nm、2nm、10nm。本公开的典型单层的厚度小于100nm，优选小于10nm。
不希望受任何具体理论的束缚，相信控制活性剂从微粒中释放的因素可能是在预成形微粒外表面上或其邻近处(例如与成形单层之间的界面)发生的相互作用和/或结合(例如非共价结合、离子络合)的类型和/或程度，如果存在的话，该因素可能涉及活性剂、带电化合物、和/或其它组分。在一些情况下，在该界面处的强相互作用或结合会减缓、延迟、和/或以其它方式阻滞活性剂的溶出，相信这样可以稳定表面改性的微粒并有利于构造额外的正负电荷交替的带电单层(如果需要)。此外，如下面的详述，相互作用还受到随后形成的额外正负电荷交替的带电单层的影响。
因此，简单参考图2，优选在溶液中共同培育预成形微粒10和带电化合物20以得到中间体微粒40，其中至少在预成形微粒10的外表面上形成并结合有带电化合物20的单个单层。在培育后，然后可以通过离心、过滤、透滤、和/或其它分离方法，从溶液中分离中间体微粒40的悬浮体。任选地用洗涤溶液洗涤中间体微粒40(优选水性介质，例如上述包含SRA的缓冲液，如图1的总体显示)。基于活性剂和带电化合物20的溶解度优化培育和任选的洗涤过程中的温度。
如果希望或需要进一步的表面改性，在任选的洗涤后，可以优选在溶液中，将中间体微粒40进一步暴露于(例如混合)带不同电荷的化合物30，以围绕并结合中间体微粒40的成形单层形成带电化合物30的后续单层。带电化合物30的净电荷符号优选与带电化合物20的净电荷符号相反。可以紧密围绕着成形单层形成后续单层。中间体微粒50的净表面电荷符号可以与中间体微粒40的净表面电荷符号相同、是中性的、或优选与中间体微粒40的净表面电荷符号相反。如图1所示，可以按前面的循环重复单层成形程序，以形成微粒50和60，它们具有额外的、优选但不必需的，相邻的正负电荷交替的带电单层，这些单层分别与前面的单层结合(图2)。可以选择或预定要形成的单层总数，从而可以在表面改性的微粒中获得具有所需释放曲线的活性剂的控制释放。如上所述，该数目可以为1、2、3、4、5、6、7或更大的整数，优选100或更少，更优选20或更少，最优选10或更少。
在另一个实施例中，形成单层的一种或多种带电化合物可以是与预成形微粒中相同或不同的活性剂。例如，一种或多种奇数(例如第一、第三)单层可以独立地由带相同或不同电荷的活性剂形成，其净电荷符号与预成形微粒的净表面电荷相反。作为替代或组合，一种或多种偶数(例如第二、第四)单层可以独立地由带相同或不同电荷的活性剂形成，其净电荷符号与预成形微粒的净表面电荷相同。参考图2，带电化合物20或30可以是与预成形微粒10中相同或不同的活性剂，而带电化合物30或20可以分别是与预成形微粒中不同的惰性带电化合物或带电活性剂。
在另一个实施例中，可以通过共价和/或非共价结合将带电和/或不带电的一种或多种活性剂掺入一种或多种单层中。所述与单层结合的活性剂可以与预成形微粒中的相同或不同。所述构造可以允许控制释放(例如延长释放、持续释放)与单层结合的活性剂。作为替代或组合，一种或多种所述与单层结合的活性剂可以是亲和分子，例如靶向配体，它们可以选择性地将位于其下面的微粒带入预定区域，以实现靶向递送核心微粒内的活性剂。
在另外的实施例中，上述表面改性微粒优选在悬浮体中具有一种或多种带电化合物单层，可以对它们进行一种或多种物理和/或化学处理，以进一步改良表面改性微粒的一种或多种性质，例如但不限于其中活性剂的释放曲线。可以紧接在形成表面改性微粒后和任何任选的洗涤前、或者紧接在任选的洗涤后进行处理。处理可以涉及操纵反应混合物的一个或多个参数，例如但不限于温度、pH、和/或压力。通常，可以将一个或多个参数从初始值调整(例如提高或降低)至第二值并保持一段时间，然后调整(例如降低或提高)到第三值或返回、或允许返回初始值并保持另一段时间。
例如，热处理可以涉及加热阶段和冷却阶段。在额外的处理前，可以将悬浮体保持在低于环境温度的相对低温下，以至少使其中微粒的溶出最小化，优选温度处于表面改性微粒的形成温度，更优选2℃至10℃，例如4℃。在加热阶段中，可以将悬浮体加热到一定温度并在该升高的温度下培育1分钟至5小时，优选15分钟至1小时，例如30分钟。该升高的温度可以高于在额外处理前保存悬浮体的相对低温，并低于悬浮体中表面改性粒子的降解温度，优选5℃至40℃，更优选10℃至30℃。加热阶段后可以任选地立即冷却，在该过程中，可以在一定温度下，以受控方式迅速或逐步冷却悬浮体，并任选地在该低温下培育1分钟至5小时，优选15分钟至1小时，例如30分钟。在一个实施例中，通过用冷却的洗涤溶液洗涤来实现冷却。作为替代，可以将悬浮体返回或接近其初始温度，或者到达低于悬浮体加热温度的经选择温度。该降低的温度可以低于所述升高的温度，并高于悬浮体的冰点温度，优选处于或低于环境温度，任选地等于或不同于在额外处理前保存悬浮体的相对低温，更优选15℃或更低，最优选10℃或更低，例如4℃。可以按本文所述进一步对所得混合物进行任选的洗涤，以获得经额外处理的表面改性微粒。
适合上述额外处理的表面改性微粒包括由无定形、固体、和均匀的预成形微粒形成的那些，微粒具有重量比为40％至小于100％、或更通常为80％或更多的本文所述活性剂。合适的悬浮体的非限制性例子包括在缓冲液中的微粒(例如胰岛素微球)，缓冲液为例如包含16％PEG、0.7％NaCl、67mM乙酸钠的PEG缓冲液，其pH范围为5至8(例如5.7、5.9、6.5、7.0)。微粒在缓冲液中的浓度可以为0.01mg/ml至50mg/ml，优选0.1mg/ml至10mg/ml，例如1mg/ml。可以将带电化合物或其中两种或多种的混合物，例如硫酸鱼精蛋白、聚-L赖氨酸、和/或聚-L-精氨酸混合到悬浮体中，以提供0.01mg/ml至10mg/ml、优选0.1mg/ml至1mg/ml、例如0.3mg/ml的浓度。可以在相对低的温度如4℃下培育混合物，伴随着搅拌培育10秒至5小时，例如1小时，以保证在各预成形微粒的外表面上形成带电化合物的单层。然后可以对悬浮体进行上述热处理。可以在额外的处理前对悬浮体进行任选的洗涤。
可以紧接在形成本文公开的任何一种或多种单层后进行额外的处理。在一个实施例中，可以紧接在在预成形微粒上形成单个单层后进行额外的处理，所述单层由带正电的化合物或带负电的化合物组成。当在第一单层上任选地形成一种或多种额外单层时，可以或可不在形成所述额外单层后紧接进行额外的处理。在另一个实施例中，可以在核心微粒上依次形成两种或多种单层，只能紧接在形成单个预定的单层(例如最后的单层、第一单层、或其间的任何其它单层)后进行额外的处理。在另外的实施例中，可以在核心微粒上依次形成两种或多种单层，可以紧接在形成各单层后进行额外的处理，每个单层均具有一种或多种预定的性质，例如包含带正电或带负电的化合物，或者包含特定的化合物(例如活性剂、亲和分子、衍生物)或部分(例如官能团、标记)，或者是从核心开始的特定单层(例如第一、第二、第三、第四、第五单层)。在另外的实施例中，可以紧接在形成预定组的各单层后进行额外的处理，它们可以是全部的单层或其亚组。
如下面的实施例16所述，经额外处理后的表面改性微粒可以改变净表面电荷(ζ电位)和/或其中活性剂的释放曲线。对于某些带电化合物(例如PLL和PLA，但除了硫酸鱼精蛋白)，可以观察到表面改性微粒的表面电荷变化(例如增加)。当进行本文公开的体外释放方案时，与未进行额外处理的表面改性微粒相比，经额外处理的表面改性微粒能够减少其中活性剂的1小时累积释放百分比(％CR1h)。因为相信活性剂的初始突释通常发生在第一小时内，所以该实施例证明额外处理可以明显减少活性剂的初始突释。经额外处理的相同表面改性微粒可能能够在超过1小时、优选超过24小时、更优选超过48小时、最优选超过7天连续、优选持续释放，其24小时累积释放百分比(％CR24h)大于％CR1h。作为额外处理的结果，当在37℃的释放缓冲液(10mM Tris、0.05％Brij35、0.9％NaCl，pH7.4，不含二价阳离子)中进行体外释放时，本公开表面改性微粒的％CR1h可能能够为50％或更小，和/或％CR24h与％CR1h的比率大于1∶1。％CR1h可以优选为40％或更少，更优选30％或更少，进一步优选20％或更少，最优选10％或更少。％CR24h与％CR1h的比率可以优选为1.05∶1或更大，更优选1.1∶1或更大，但不大于10∶1，优选5∶1或更小，更优选2∶1或更小，最优选1.5∶1或更小。
不受任何具体理论的约束，相信如本文所述在单层形成后进行额外的处理使得单层内的带电化合物和构成基材(例如预成形微粒、前面单层)外表面的分子(例如活性剂、预成形微粒内的任选载体分子、前面单层内的带电化合物)重排并形成结合，该结合远远强于在额外处理前单层与底物外表面之间的静电相互作用。相信通过额外的处理，可在表面改性微粒的外表面上形成经改良的壳，所述经改良的壳包含带电化合物与形成基材外表面的分子的均匀混合物。
其中，在成形单层外沉积带电化合物的额外正负电荷交替的带电单层可以进一步影响预成形微粒中活性剂的释放曲线等。如上所述，根据预成形微粒和成形单层之间界面处的吸引力，可以观察到这两者之间的强结合。这可能导致阻碍活性剂释放的量和/或速率。通过围绕成形单层形成一种或多种额外的正负交替带电单层，可以进一步改良释放曲线。不受任何具体理论的约束，相信添加第二相反电荷单层可以减弱成形单层与预成形微粒之间的结合，从而增强活性剂的释放。如果需要，随后应用连续排列的正负交替带电单层，同时任选地插入活性剂层，这能够允许微调活性剂从表面改性微粒中的释放，如本文公开的一些实施例所示。
可用于本发明的合适带电化合物可以是能够优选但不限于通过非共价结合、更优选通过静电相互作用与任何基材结合的带电化合物。因此，合适的带电化合物包括带正电的、带负电的、或两性化合物，包括但不限于聚电解质、带电的聚氨基酸、多糖、聚离子聚合物、离子交联聚合物、带电的肽、带电的蛋白质化合物、任选地与未带电脂质结合的带电脂质、带电的脂质结构如脂质体、其前体和衍生物、及其中两种或多种的组合。非限制性例子包括带负电的聚电解质如聚苯乙烯磺酸盐(PSS)和聚丙烯酸(PAA)、带负电的聚氨基酸如聚天冬氨酸、聚谷氨酸、和藻酸、带负电的多糖如硫酸软骨素和硫酸葡聚糖、带正电的聚电解质如聚烯丙基胺盐酸盐(PAH)和聚(二烯丙基二甲基)氯化铵(PDDA)、带正电的聚氨基酸如聚(L-赖氨酸)盐酸盐、聚鸟氨酸盐酸盐和聚精氨酸盐酸盐、以及带正电的多糖如壳聚糖和硫酸壳聚糖。还可以用作本发明带电化合物者包括但不限于生物相容性聚离子聚合物(例如离子交联聚合物、聚阳离子聚合物如聚阳离子聚氨酯、聚醚、聚酯、聚酰胺；聚阴离子聚合物如聚阴离子聚氨酯、聚醚、聚酯、聚酰胺)、带电的蛋白质(例如鱼精蛋白、硫酸鱼精蛋白、黄芪胶、人血清白蛋白、玉米蛋白、泛素和明胶A&B)、以及带电的脂质(例如磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸)。还包括本文公开的带电化合物的衍生物(例如糖基化、高糖基化、PEG化、FITC标记、其盐)、共轭物和络合物。更具体地，合适的带正电的脂质(即聚阴离子脂质)、带负电的脂质(即聚阳离子脂质)和两性脂质包括1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-胆碱磷酸(DSPC)、1，2-二油酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-(羧基荧光素)(FITC-EA)、1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-[磷酸-rac-O(1-甘油)](钠盐)(DSPG)、1，2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸盐(一钠盐)(DPPA)、1，2-二油酰-3-二甲铵-丙烷。
此外，脂质结构(例如脂质体)能够用在带电化合物的正负电荷交替的沉积中。未带电的(例如非离子型)脂质可以与带电脂质组合使用，以形成一种或多种单层，可以优化它们之间的比率以使活性剂通过单层的渗透性最小。
本文公开的表面改性微粒通常包含预成形微粒和一种或多种单层，该微粒的活性剂释放曲线优选不同于核心微粒的释放曲线。释放曲线差异的非限制性例子包括减少初始突释、延长释放时间、在一定时间段内具有线性/恒定释放、和/或减少在延长时间段内的释放速率。表面改性微粒的含量优选为功能(例如治疗、药用、诊断)有效的量，作为液体或固体组合物或制剂中的悬浮体或干粉末，存在或不存在防腐剂、等渗剂、药用载体和稳定剂中的一种或多种。可以将有效量的所述组合物和制剂给药至受试者，用于预防或治疗症状或状态，或者作为营养补充剂，或者用于增强身体或改善心理状态。可以将所述组合物和制剂用于诊断方法、工具、或试剂盒中，用于体外和/或体内检查物质、症状、或病变存在或不存在，或者所述症状或病变的倾向。例如，在接触后，所述物质可以与表面改性微粒或其部分(例如核心微粒)形成结合(例如共轭物、络合物)，这种结合能够提供一种或多种检测信号。所述一种或多种信号可以是在结合的一个或多个部分上标记的部分(例如所述物质、所述微粒)，或者可以由于形成所述结合而引发(例如发光、释放另一种物质)。此外，可以将表面改性微粒用于营养和/或膳食补充剂或食用组合物中，或者用作食品添加剂，用于防止和/或治疗受试者体内的症状或病变。
下面描述根据本公开构建的表面改性微粒的分析方法和几个实施例。实施例中形成的所有带电单层据信均为本文所述的饱和单层。使用下述仪器和方法记录所报告的读数和测量结果。
石英晶体微量天平(QCM)测量
使用QCM法确认在包含SRA的溶液存在的情况下，带电化合物的逐层组装体的存在。将多个(例如2、3或4个)PAH/PSS双层(即每个双层包括紧密邻近PSS单层的PAH单层)的前体膜沉积到QCM的9MHz银共振腔(USI QCM System，Model 260303，Sanwa Tsusho Co.，Ltd，Japan)上。为了形成每个单层，在室温下将共振腔在带电化合物浓度为1.5mg/mL的0.25M NaCl水缓冲液中培育15分钟，用去离子(DI)水洗涤三次，干燥。作为水缓冲液的替代，还可以使用带电化合物浓度为3mg/mL的DI水溶液形成所述单层。
为了在前体膜上形成所需带电化合物的每个单层，在+2℃将经涂布的共振腔在包含每种带电化合物的水缓冲液中再培育约1小时，然后用DI水洗涤。对于聚电解质和带电蛋白质，带电化合物在缓冲液中的浓度范围为0.1mg/mL至3mg/mL，优选1mg/mL。对于带电脂质，带电化合物在缓冲液(悬浮体)中的浓度为0.1mg/mL至3mg/mL，优选0.25mg/mL至1mg/mL。使用了不同的缓冲液，包括(以w/v百分比表达)：a)16％PEG-0.7％NaCl，pH5.8；b)16％PEG-0.7％NaCl，pH7.0；c)0.16％乙酸-0.026％ZnCl2。可以改变PEG、NaCl和ZnCl2在用于组装体的缓冲液中的浓度以优化。
在形成单层后，将单层在氮气流中干燥。按照本领域技术人员所理解的，监测在形成各单层后共振腔的频率变化并转化为厚度，其结果示于图9。
微粒净表面电荷测量
对于微粒净表面电荷(ζ电位)测量，使用ζ电位分析仪(ModelZetaPALS，Brookhaven Instruments Corp.，Holtsville，NY)。将进行研究的40μL等份各样品添加到1.5mL相应的无盐PEG溶液中，混合，将所得悬浮体立即用于测量。将悬浮体的温度平衡在8℃，以使微粒崩解最小化。
体外释放(IVR)
为了产生活性剂(例如胰岛素)的IVR曲线，将10ml等份释放缓冲液(10mM Tris，0.05％Brij 35，0.9％NaCl，pH7.4)添加到包含0.5ml浓缩粒子悬浮体(相当于3mg胰岛素)的玻璃瓶中，混合并在37℃培育。以指定的时间间隔，将400μL IVR介质转移到微量离心管中并在13krpm离心2分钟。取出300μL等份上清液并在-80℃贮存，直至通过二辛可宁酸(BCA)分析测定，如本领域技术人员所理解的。将300μL等份新鲜释放介质添加到微量离心管中以重建小球。将400μL悬浮体转移回IVR中。在将微粒完全溶于包含二甲亚砜(DMSO)和表面活性剂的碱性水溶液中并中和pH后，通过BCA测量微粒的总活性剂含量。
实施例
实施例1A：具有聚苯乙烯磺酸盐单层的微粒
在0.3mg/mL聚离子PSS存在的情况下，在2℃和pH4.8下，将使用本文公开的相分离方法形成的胰岛素微球(即预成形微粒)在16％(w/v)PEG和0.7％(w/v)NaCl的水溶液中培育1hr。为了除去未结合的PSS，离心洗涤(3000rpm 15分钟)两次，分别使用上述初始体积的水溶液作为洗涤介质来再悬浮微球。比较未改性和经改性微球的ζ电位值，确证形成了PSS单层(图3)。
实施例1B：具有聚苯乙烯磺酸盐和聚烯丙基胺盐酸盐的多个交替单层的微球
使用实施例1A的PPS改性微粒作为中间体微粒，来形成聚阳离子PAH的后续单层。使用如实施例1A所述的相似形成和洗涤程序，除了使用相同浓度的PAH代替PSS。重复该程序，以形成所需数量的交替单层。图3示意在形成每个单层后，PSS/PAH双层组装体的四次连续沉积的ζ电位值。
实施例2A：在低于微球表面中性点的pH下表面改性的微球
在pH4.8(低于微球的表面中性点，观察到该点为约5.6)下，使用实施例1A的程序在胰岛素微球上形成聚阴离子单层。图4描绘了具有聚丙烯酸(模型聚阴离子)、硫酸葡聚糖、聚天冬氨酸、聚谷氨酸和藻酸盐单层的胰岛素微球的ζ电位值。在pH4.8处，预成形胰岛素微球的ζ电位显示正净表面电荷。在形成各聚阴离子单层后，所得表面改性微球的净表面电荷为负。
实施例2B：在高于微球表面中性点的pH下表面改性的微球
在pH7.0(高于微球的表面中性点)下，使用实施例1A&1B的程序在胰岛素微球上形成聚阳离子单层。图5描绘了具有聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDDA，模式聚阳离子)、硫酸鱼精蛋白(ProtS)、聚-L-精氨酸(PLA)和聚-L-赖氨酸(PLL)单层的胰岛素微球的ζ电位值。在pH7.0处，预成形胰岛素微球的ζ电位显示负净表面电荷。在形成各聚阳离子单层后，所得表面改性微球的净表面电荷为正。如图6所示，具有FITC标记鱼精蛋白单层的胰岛素微球的LSC显微图证明形成了聚阳离子单层。
实施例3A：具有多个带相反电荷的聚离子单层的微球
使用实施例1A&2A所得的微球作为中间体微球，在0.3mg/mL聚阳离子PLL存在的情况下，再悬浮于水溶液(16％PEG，0.7％NaCl，pH4.8)中，在2℃培育1hr，以在成形的聚阴离子单层上形成后续的PLL单层。图7所示微球净表面电荷的反转证实形成了聚离子单层。图8显示，具有成形PSS单层和后续FITC标记PLL单层的胰岛素微球的LSC显微图证明表面沉积了聚阳离子PLL。
使用上述QCM测量各聚离子单层的厚度。反应介质包含在16％PEG、0.7％NaCl中的1mg/mL PLL或硫酸软骨素。通过在包含聚离子的反应介质中将QCM共振腔依次分别培育15分钟、然后立即用DI水洗涤并用氮流干燥，来构造膜组装体。图9示意在形成各单层后的累积膜厚。根据所述聚离子，估计各单层的总厚度增加约1nm或更少，平均增加为约0.5nm。
实施例3B：具有带相反电荷的生物相容聚离子的多个单层的微球
在16％PEG&0.7％NaCl水溶液中，在pH4.8和2℃，使用硫酸软骨素和明胶A围绕预成形胰岛素微球形成带相反电荷的聚离子的多个单层。根据实施例1A的程序，形成硫酸软骨素单层，然后形成明胶A单层。重复该程序，以形成总共6个正负电荷交替带电的单层。图10显示在各单层形成后微球净表面电荷的反转。
实施例4A：在多价阳离子和PEG存在的情况下形成单层
使用实施例1B的程序，围绕预成形胰岛素微球形成硫酸鱼精蛋白和硫酸软骨素单层，除了水溶液的pH为6.4并且包含16％PEG、0.7％NaCl、0.16％(w/v)乙酸和0.026％(w/v)ZnCl2。使用不含Zn&不含乙酸盐的水溶液形成比较例，该溶液的pH为6.4并包含16％PEG和0.7％NaCl。图11显示所得微球的ζ电位。
实施例4B：在多价阳离子存在且PEG不存在的情况下形成单层
使用实施例1B的程序，围绕预成形胰岛素微球形成硫酸鱼精蛋白和硫酸软骨素单层，除了水溶液不包含PEG，pH为7.0并且包含0.7％NaCl、0.16％(w/v)乙酸和0.026％(w/v)ZnCl2。图12显示所得微球的ζ电位。
实施例5：用脂质体表面改性的微球
将60％阳离子型脂质1，2-二油酰-3-二甲基铵-丙烷(DAP)和20％两性1，2-二油酰-sn-甘油基-3-胆碱磷酸(DOPC)悬浮于pH为7.0的16％PEG、0.7％NaCl、0.16％(w/v)乙酸和0.026％(w/v)ZnCl2水溶液中，使用所得脂质体与预成形胰岛素微球(使用相同的水溶液预先洗涤)在2℃共同培育1hr。应用实施例4B的程序以形成后续的硫酸软骨素单层。
作为替代，使用实施例4B的程序，将包含阴离子型1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3[磷酸-rac-(1-甘油)])(DSPG，钠盐)、DOPC和胆固醇的脂质体沉积到用鱼精蛋白改性的胰岛素微球上。图13示意包含罗丹宁B标记的鱼精蛋白单层的微球(上右)、包含FITC标记的DAP的微球(上左)、和包含两者的微球(下左)的LSC显微图。图14显示在每次沉积后微球的ζ电位值。
实施例6：胰岛素从用鱼精蛋白改性的微球中的持续释放
使用实施例2B的程序，在反应介质中不同的聚离子浓度下，形成用鱼精蛋白改性的胰岛素微球。图15显示所得经鱼精蛋白改性的胰岛素微球的IVR曲线。聚离子浓度的增加减少了胰岛素从经表面改性的微球中的初始突释和后来的释放速率。
实施例7：用多个单层改良释放
使用实施例2B所得的微球作为中间体微粒，在反应介质中不同的浓度下，围绕它沉积羧甲基纤维素(CMC)。图16显示的IVR曲线证明后来的单层能够进一步改良活性剂从表面改性微球中的释放。沉积额外的鱼精蛋白单层能够部分或全部重建释放曲线(图17)。
实施例8：胰岛素从经鱼精蛋白改性的胰岛素微球中的体内释放
在化学诱导的SD大鼠体内研究胰岛素从经鱼精蛋白改性的胰岛素微球中的体内释放。将按照实施例2B制备的表面改性微球作为16％PEG 3350、pH7.0中的悬浮体形式给药。将不经表面改性的预成形胰岛素微球在PEG溶液中、或在pH7.4的磷酸盐缓冲盐水溶液中给药，作为对照。动物接受初始皮下剂量为1IU/kg的微球。使用ELISA测定确定所收集的样品中重组人胰岛素(rhINS)血清水平。结果如表1和图18A和18B所示，证明表面改性对给药剂量的药物代谢动力学有显著影响。具体地，表面改性提高了rhINS的最大血清浓度(Cmax)和到达Cmax的时间(tmax)、以及rhINS浓度-时间曲线下面积(AUC)和蛋白质的平均驻留时间(MRT)。血清葡萄糖抑制(图18B)也与相应的rhINS血清一致。如下所示，与未改性预成形微粒的Cmax和tmax相比，表面改性微粒的Cmax增加得更多。如该实施例所证明的，表面改性微粒的Cmax比预成形微粒的Cmax大2.5倍。在其它实施例中，表面改性微粒的Cmax可以比预成形微粒的Cmax提高1.1倍或更多、提高1.25或更多、提高1.5或更多、提高2.0倍或更多。
表1
参数 预成形微粒  改性微粒
AUC0-7h  203.3±46.5  780.9±81.3
MRT0-7h  1.7±0.2  2.9±0.2
Cmax  103.5±27.3  259.0±52.9
Tmax  0.55±0.41  2.60±0.55
实施例9：在各种降溶剂存在情况下的表面改性
用于培育预成形胰岛素微粒的硫酸鱼精蛋白水介质(0.15mg/mL)包含PLURONICF-68或F-127(10％或16％w/v)、甘油(20％、40％或60％v/v)、和乙醇(10％v/v)中的一种。使用如实施例1所述的程序。图19显示表面改性前和改性后的ζ电位值，暗示形成了鱼精蛋白单层。
实施例10：带电化合物浓度对表面改性微球的释放曲线的影响
使用实施例1A的程序，其中硫酸鱼精蛋白的浓度在0.1mg/mL至1.5mg/mL的范围内变化。图20A示意微球ζ电位与胰岛素48hr累积释放之间的关系。反应介质中鱼精蛋白浓度的增加对应胰岛素释放的减少，观察到的最大有效浓度为约0.3mg/mL。
用分别在0.05-1.2mg/mL或0.1-1.2mg/mL浓度范围内的聚阴离子羧甲基纤维素或硫酸软骨素，对以1.5mg/mL鱼精蛋白浓度制备的鱼精蛋白改性微球进行进一步改性。后续单层的形成明显反转了鱼精蛋白单层的释放减少的效果，如图20B和20C所示。该结果提示少数单层能够以受控方式微调微粒的释放曲线。
实施例11：hGH微球的表面改性
在分别包含0.3mg/mL硫酸鱼精蛋白和硫酸软骨素的水介质(16％PEG 3350，0.7％NaCl，pH6.0)中，在2℃，以交替顺序将预成形hGH微球分别培育1hr，以形成正负电荷交替带电的单层。图21A描绘了在沉积各单层后微球的ζ电位。在图21B中，将具有一个、两个或三个单层的表面改性hGH微球的IVR曲线与未改性预成形hGH微球的IVR曲线进行了比较。
实施例12：静脉内免疫球蛋白微球的表面改性
用硫酸软骨素和硫酸鱼精蛋白的交替单层对预成形的静脉免疫球蛋白(IVIG)微球进行改性。对于每个单层，在包含12.5％PEG 8000、50mM乙酸铵和0.15mg/mL各种聚离子的pH7.0水介质中，在4℃培育1hr。使用离心洗涤除去过量的聚离子。图22描绘了在沉积各单层后微球的ζ电位。
实施例13：微球在PEG水介质中的表面电荷性质
为了确定预成形胰岛素微球在包含16％PEG的减溶介质中的表面电荷性质，将介质的pH调整至4-7.5的范围内。在每种介质中确定微球的ζ电位，相对于相应的pH绘制曲线，如图23所示。估计预成形胰岛素微球的表面中性点为5.6。随着介质pH降至低于或增至高于表面中性点，预成形胰岛素微球的净表面电荷分别变得越来越正或越来越负。
实施例14：反应pH对表面改性微球的ζ电位和释放曲线的影响
在4℃，在下列pH值之一处，将使用本文公开的相分离方法形成的胰岛素微球(20mg)悬浮在19ml缓冲液中[包含16％(w/v)PEG、0.7％(w/v)NaCl和67mM乙酸钠]：5.7、5.9、6.5和7.0。按照本文上面所述，测量未改性微球在不同pH缓冲液内的ζ电位。将硫酸鱼精蛋白、聚-L-赖氨酸或聚-L-精氨酸作为在相同缓冲液中并与所述悬浮体pH相同的1ml 6mg/ml溶液添加到所述悬浮体中。所得各反应混合物的微球浓度为1mg/ml，聚阳离子浓度为0.3mg/ml。将反应混合物在4℃培育一小时，然后用处于各反应混合物pH值的20ml新鲜等份缓冲液离心洗涤(3000rpm 15分钟)三次。如上所述测量最后洗涤的再悬浮物中所得表面改性微球的ζ电位。然后按照本文公开的方案对表面改性微球进行体外释放。
如图25所示，在上述不同反应pH值下，形成聚阳离子单层能够定性反转(从负到正)胰岛素微球的表面电荷。表面改性微球的ζ电位和电荷反转的幅度似乎至少部分地取决于反应pH和/或聚阳离子。具体地，在接近未改性胰岛素微球表面中性点(胰岛素SNP核心约5.6)的反应pH值(例如5.9、5.9)下，PLL改性胰岛素微球的ζ电位较高(一般范围为15mV或更高，例如约20mV)，在远离胰岛素SNP核心的反应pH值(例如，6.5，7.0)下较低(一般范围为低于15mV，例如约8mV)。在所有上述不同反应pH值下，在形成PLL单层后电荷反转的幅度(约30mV)均相同。
在接近胰岛素SNP核心的反应pH值下，PLL改性胰岛素微球的ζ电位较高(高于20mV)，在远离胰岛素SNP核心的反应pH值下较低(低于20mV)。在形成PLL单层后，在接近胰岛素SNP核心的反应pH值下，电荷反转的幅度较小(约30mV)，在远离胰岛素SNP核心的反应pH值下较高(约40mV)。在所有上述不同反应pH值下，ProtS改性胰岛素微球的ζ电位(约20mV)均相同。在形成硫酸鱼精蛋白单层后，在接近胰岛素SNP核心的反应pH值下，电荷反转的幅度较小(约30mV或更少)，在远离胰岛素SNP核心的反应pH值下较高(约40mV或更多)。
如图26所示，胰岛素从表面改性胰岛素微球中的体外1小时累积释放百分比(％CR1h)受表面改性反应中所用的反应pH和/或聚阳离子的影响。具体地，与远离胰岛素SNP核心的反应pH值下的结果相比，在接近胰岛素SNP核心的反应pH值下的胰岛素％CR1h通常较高，它们之间的差值范围为大于5％至10％、至20％至小于30％。在相同的反应pH下，PLA改性的微球与ProtS改性的微球具有相当的胰岛素％CR1h，其水平小于PLL改性的微球，它们之间的差值范围通常为20％至30％或更多。
在可能希望％CR1h小于50％、优选40％或更小、更优选30％或更小、最优选20％或更小的情况下，可以在远离SNP核心的反应pH下，使用某些带电化合物(例如硫酸鱼精蛋白、PLA)表面改性本公开的预成形微粒(例如未改性的胰岛素微球)。在可能希望％CR1h为50％或更大、优选60％或更大、更优选70％或更大、最优选75％或更大的情况下，可以在接近SNP核心的反应pH下，使用某些带电化合物(例如PLL)表面改性本公开的预成形微粒(例如未改性的胰岛素微球)。
实施例15：表面改性的核酸微球
根据美国专利申请公开2006-0018971号和2006-0024240号的内容形成核酸微球，这些文献被全部纳入本文以供参考。各微球具有均匀的包含至少80％重量比(例如85％至90％)的CD40 siRNA和15％或更少(例如6％至10％)重量比的聚-L-赖氨酸的混合物。将核酸微球悬浮在包含1mg/ml罗丹宁B标记PLL(70 kD)的100μl无核酸酶去离子水中(pH7.0)。在4℃，在搅拌下将悬浮体培育45分钟，以形成经表面改性的微球，然后用无核酸酶的去离子水(pH7.0)离心洗涤它。测得未改性微球与经表面改性微球的ζ电位分别为-24mV和34mV。显然，通过形成聚阳离子单层，核酸微球的表面改性能够反转它们的表面电荷。图27显示罗丹宁B标记的PLL的激光扫描共焦显微图，证明成功地在核酸微球外表面上形成了单层。
实施例16：表面改性微粒的热处理
在pH7.0和4℃，将预成形的未改性胰岛素微球(12mg)、例如按本文公开的受控相分离法形成的那些悬浮在1.5ml缓冲液中，所述缓冲液包含16％(w/v)PEG、0.7％(w/v)NaCl和67mM乙酸钠。在6mg/ml的浓度下，将溶于相同缓冲液内的1.5ml聚阳离子(ProtS、PLL或PLA)水溶液与所述悬浮体混合，导致反应混合物的微球浓度为4mg/ml，聚阳离子浓度为3mg/ml。在连续搅拌下，将反应混合物在4℃培育30分钟，以形成具有各种聚阳离子单层的表面改性胰岛素微球。接下来，在4℃、15℃、28℃或37℃的温度下，将反应混合物进一步再培育30分钟。然后将经热处理的胰岛素微球离心(4℃ 3000rpm 10分钟)收集，并用pH7.0和4℃的新鲜等份缓冲液洗涤三次。按本文上面所述产生经热处理并经表面改性的胰岛素微球的ζ电位值和体外释放曲线。
意外地发现，上述某些热处理(例如在15℃、28℃或37℃的温度下培育，但不限于这些)能够选择性和区分性地改变表面改性微球的某些性质(例如ζ电位和释放曲线)，而不会损害它的其它性质(例如粒度、延长释放相)。如图28所示，在上述不同的升高温度下培育导致胰岛素从聚阳离子改性的胰岛素微球中的初始释放水平不同(与在15℃培育后相比，在28℃培育后的胰岛素％CR1h较低)，它们均小于在未升温(即4℃)下培育的结果。
如表2所示，与未经热处理的表面改性微粒(例如在第二次4℃温度下培育的那些)的结果相比，在经过热处理的表面改性微粒的体外释放曲线中，初始释放或“突释”相(由％CR1h表示)减少了。与对照相比，活性剂从经热处理的表面改性微粒中的体外释放％CR1h减少量可能为10％或更大，例如15％或更大、25％或更大、或40％或更大。
表2.PLL改性胰岛素微球的％CR1h减少百分比
样品(第2次培育温度) ％CR1h 减少％(与对照相比的％CR1h)
对照(4℃) 57.4
热处理1(15℃) 48.3  16
热处理2(28℃) 33.1  42
热处理3(37℃) 34.1  40
在上面检测的聚阳离子中稳定地观察到了热处理(28℃)对胰岛素体外释放的初始释放相的减少作用。意外的是，不同的聚阳离子对胰岛素的初始释放具有不同水平的减少。如图26和28所示和表3所总结的，在本公开的PLA改性胰岛素微球中观察到的减少作用大于PLL改性的胰岛素微球，而在ProtS改性胰岛素微球中观察到的减少作用小于在PLL改性胰岛素微球中观察到的减少作用。
表3.热处理(28℃)对表面改性胰岛素微球的％CR1h的影响
聚阳离子 未经热处理的％CR1h(实施例14) 经过热处理的％CR1h(实施例16) ％CR1h减少％
PLL  50.1  28.4  43
ProtS  28.9  15.1  48
PLA  19.5  5.1  74
实施例17：表面改性微粒的热处理
对预成形未改性hGH微球、如通过本文公开的受控相分离法形成的那些进行与实施例16所述相同的热处理。如本文上面所述产生所述经热处理的表面改性hGH微球的ζ电位数据和体外释放曲线。如表4所示，与在4℃培育的表面改性hGH微球相比，表面改性hGH微球在28℃培育后的％CR1h减少了。
表4.PLA改性hGH微球的％CR1h减少百分比
样品(第2次培育温度) ％CR1h 减少％(作为与对照相比的％CR1h)
对照(4℃) 24.9
热处理1(15℃) 10.8  57
热处理2(28℃) 9.6  61
热处理3(37℃) 13.0  48
实施例18：热处理的，表面改性微粒的体内影响
使用本文公开的受控相分离法制备未改性的胰岛素微球。根据实施例16所述的程序，用PLA对两部分未改性胰岛素微球进行表面改性，其中一部分经热处理(28℃)，而另一部分在4℃培育作为对照。制备可注射的组合物，所述组合物分别包含悬浮在缓冲液[16％(w/v)PEG、0.7％(w/v)NaCl，pH7.0]中的三种不同胰岛素微球中的一种。以4IU/kg的剂量将所述组合物皮下给药至正常SD大鼠。使用ELISA测定来确定胰岛素在所收集样品中的血清水平。结果示于表5以及图29A和29B中。如图29A所示，在热处理后CR1h同样减少了。
在4℃处理的PLA改性胰岛素微球提供了可比较的血清胰岛素浓度曲线、血清葡萄糖抑制曲线、Cmax和tmax。相反，在28℃处理的PLA改性胰岛素微球提供了平坦和右移的血清胰岛素浓度曲线、右移的血清葡萄糖抑制曲线、降低的Cmax和延长的tmax。
表5.胰岛素从不同胰岛素微球中的体内释放
 参数  未改性  PLA改性，4℃  PLA改性，28℃
 Cmax  479.1±147.0  463.5±136.9  256.8±95.8
 tmax  1.1±0.5  1.1±0.5  2.0±0.7
图29A显示在接受单次皮下注射未涂布的胰岛素微球、在28℃处理的PLA改性胰岛素微球、或在4℃处理的PLA改性胰岛素微球的大鼠体内，血清胰岛素浓度对时间的曲线(实施例18)；
图29B显示在接受单次皮下注射未涂布的胰岛素微球、在28℃处理的PLA改性胰岛素微球、或在4℃处理的PLA改性胰岛素微球的大鼠体内，血清葡萄糖抑制对时间的曲线(实施例18)。
将理解本文公开的实施方案仅仅是本公开方面的示例，所述公开的方面可由各种不同形式体现。因此，本文公开的具体细节和优选实施方案不应理解为限制，而仅仅作为权利要求书的基础并作为教导本领域技术人员以任何适当的方式来不同地使用本文公开的主题物质的代表性基础。已经描述的实施方案用于说明本公开原理的一些用途，可以对其进行修改，包括本文单独公开或主张的特征的那些组合。

Claims (55)

1.一种制备表面改性微粒的方法，该方法包括：
提供含有至少一种活性剂的固体无定形预成形微粒，所述微粒具有携带净表面电荷的外表面；
将所述预成形微粒的至少所述外表面暴露至具有净电荷的至少一种带电化合物，该净电荷的符号与所述净表面电荷的符号相反；和
形成包括所述至少一种带电化合物的单层，所述成形单层由此与所述外表面结合。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述成形单层外表面携带的净表面电荷不同于所述预成形微粒的净表面电荷。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述预成形微粒的所述外表面基本上由所述至少一种活性剂组成。
4.如权利要求2所述的方法，其中所述成形单层是饱和的单层，所述净表面电荷的符号与所述预成形微粒的净表面电荷的符号相反。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述预成形微粒包括重量比为约40％至小于100％的所述至少一种活性剂，该活性剂基本上均匀分布在整个所述预成形微粒中。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述预成形微粒包括重量比为80％或更多的所述至少一种活性剂，该活性剂基本上均匀分布在整个所述预成形微粒中。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述暴露还包括：
提供一种溶液，该溶液包括所述至少一种带电化合物，和水、缓冲液以及水混溶性有机溶剂中的一种或多种，以及一种或多种降溶剂；和
使所述预成形微粒与所述溶液接触。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述净表面电荷基本上来自所述至少一种活性剂。
9.如权利要求7所述的方法，其中所述一种或多种降溶剂包括如下的一种或多种：醇、碳水化合物、非离子型水混溶性聚合物、和包括多价阳离子的无机离子型化合物。
10.如权利要求7所述的方法，其中所述溶液包括重量-体积百分比为16％的聚乙二醇和0.7％的氯化钠，并具有4至10之间的pH。
11.如权利要求7所述的方法，其中所述溶液具有的pH与所述预成形微粒表面中性点之间的差值为0至小于0.3。
12.如权利要求7所述的方法，其中所述溶液具有的pH与所述预成形微粒表面中性点之间的差值为0.3或更大。
13.如权利要求1所述的方法，其中在2℃至5℃的温度下进行所述暴露。
14.如权利要求1所述的方法，还包括对所述表面改性微粒进行一种或多种处理，所述处理包括操纵温度、压力、pH或其组合。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述处理包括在升高温度下加热包括所述微粒的悬浮体。
16.如权利要求15所述的方法，还包括使所述悬浮体到达低于所述升高温度的降低温度。
17.如权利要求7所述的方法，还包括从所述溶液中分离所述表面改性微粒。
18.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种带电化合物包括如下的一种或多种：聚电解质、带电的聚氨基酸、带电的多糖、聚离子聚合物、带电的肽、带电的蛋白质化合物、任选与不带电脂质组合的带电脂质、带电的脂质结构、及其衍生物。
19.如权利要求1所述的方法，还包括：
将成形单层的至少所述外表面暴露至具有净电荷的至少一种带不同电荷的化合物，所述净电荷的符号与所述预成形单层的所述净表面电荷符号相反；和
形成包括所述至少一种带不同电荷的化合物的后续单层，其中所述后续单层与所述成形单层结合。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述后续单层外表面携带的净表面电荷符号与所述成形单层的净表面电荷符号相反。
21.如权利要求20所述的方法，还包括形成一至五个额外的正负电荷交替带电单层。
22.如权利要求20所述的方法，还包括形成奇数个额外的正负电荷交替带电单层。
23.如权利要求1所述的方法，还包括形成能够控制释放所述至少一种活性剂的所述表面改性微粒。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述控制释放包括初始突释和基本上线性的释放曲线。
25.如权利要求1所述的方法，其中所述预成形微粒为球形。
26.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种活性剂为蛋白质化合物。
27.如权利要求1所述的方法，其中所述预成形微粒不含共价交联并且不含水凝胶。
28.如权利要求1所述的方法，其中所述预成形微粒不含脂质并且不含包封。
29.一种制备表面改性微粒的方法，该方法包括：
提供包括至少一种溶剂、至少一种活性剂、至少一种相分离促进剂的液体连续相体系；
任选以控制的速率诱导所述体系的相变，以引起液-固相分离；
形成包括无定形固体微粒的固体相，所述微粒包括所述至少一种活性剂并具有携带净表面电荷的外表面，和包括所述溶剂和所述至少一种相分离促进剂的液相；
将所述成形微粒的至少所述外表面暴露至具有净电荷的至少一种带电化合物，该净电荷的符号与所述净表面电荷的符号相反；和
形成包括所述至少一种带电化合物的单层，其中所述成形单层与所述成形微粒的所述外表面结合。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述方法在所述暴露前不洗涤所述成形微粒。
31.如权利要求29所述的方法，还包括在所述暴露前，在至少一种相分离促进剂的存在下洗涤所述成形微粒。
32.如权利要求29所述的方法，其中在至少一种相分离促进剂的存在下进行所述暴露。
33.如权利要求29所述的方法，其中所述预成形微粒包括重量比为80％或更多的所述至少一种活性剂，该活性剂基本上均匀分布在整个所述预成形微粒中。
34.如权利要求34所述的方法，其中所述暴露包括：
提供一种溶液，该溶液包括所述至少一种带电化合物、任选的多价阳离子、和重量-体积百分比为16％的聚乙二醇和0.7％的氯化钠；和
在2℃至5℃的温度下，将所述成形微粒在所述溶液中培育1秒至10小时。
35.如权利要求29所述的方法，其中在溶液中提供所述至少一种带电化合物，该溶液的pH与所述成形微粒的表面中性点之间的差值为0至小于0.3。
36.如权利要求29所述的方法，其中在溶液中提供所述至少一种带电化合物，该溶液的pH与所述成形微粒的表面中性点之间的差值为0.3或更大。
37.如权利要求29所述的方法，还包括形成具有单分散或多分散尺寸分布的所述表面改性微粒。
38.一种制备表面改性微粒的方法，该方法包括：
提供包括至少一种活性剂的无定形固体预成形微粒，所述预成形微粒具有携带净表面电荷的外表面；
将所述预成形微粒的至少所述外表面暴露至具有净电荷的至少一种带电化合物，所述净电荷的符号与所述预成形微粒的所述净表面电荷的符号相反；
形成中间体微粒，该中间体微粒包括所述预成形微粒和含有所述至少一种带电化合物的成形单层，其中所述成形单层与所述预成形微粒的所述外表面结合；
将至少所述成形单层暴露至至少一种带不同电荷的化合物；
形成所述表面改性微粒，该表面改性微粒包括所述中间体微粒和含有所述至少一种带不同电荷化合物的后续单层，其中所述表面改性微粒释放所述至少一种活性剂的释放曲线不同于所述中间体微粒的释放曲线。
39.如权利要求38所述的方法，还包括对所述中间体微粒进行一种或多种处理，所述处理包括操纵温度、压力、pH或其组合。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述处理包括在升高温度下加热包括所述微粒的悬浮体。
41.一种微粒，包括：
包括重量比为80％或更多的至少一种活性剂的固体无定形核心微粒，所述核心微粒包括携带净表面电荷的外表面；和
包括至少一种带电化合物的单层，该单层至少通过静电相互作用与所述核心微粒的所述外表面结合，所述带电化合物具有的净电荷充分不同于所述核心微粒的所述净表面电荷。
42.如权利要求41所述的微粒，其中所述至少一种活性剂均匀分布在整个所述核心微粒中。
43.如权利要求41所述的微粒，其中所述核心微粒为球形。
44.如权利要求41所述的微粒，其中所述单层具有的厚度小于50nm。
45.如权利要求41所述的微粒，其中所述带电化合物的所述电荷符号与所述微粒外表面的所述净表面电荷符号相反。
46.如权利要求41所述的微粒，还包括含有至少一种带不同电荷的化合物的另一个单层，所述另一个单层携带的净电荷不同于与所述核心微粒结合的所述单层的所述净电荷。
47.如权利要求46所述的微粒，其中所述另一个单层的所述净表面电荷符号与和所述核心微粒结合的所述单层的净表面电荷符号相反。
48.如权利要求41所述的微粒，其中所述活性剂为胰岛素或人生长激素。
49.一种微粒，包括重量比为至少80％的至少一种活性剂，所述微粒为固体，并且所述微粒外表面包括与所述活性剂结合的至少一种带电聚合物，其中当在pH7.4和37℃的释放缓冲液中进行体外释放时，所述微粒显示的活性剂1小时累积释放百分比能够为50％或更小，所述释放缓冲液由10mM Tris、0.05％(w/v)Brij 35和0.9％(w/v)NaCl的水溶液组成。
50.一种用于体内给药的微粒，包括含有重量比为至少80％的至少一种蛋白质化合物的固体微粒，该蛋白质化合物均匀分布在整个所述微粒中，其中所述微粒的外表面包括与所述外表面结合的至少一种带电化合物，
其中在给药后，所述微粒提供的Cmax和tmax不同于所述核心微粒的Cmax和tmax。
51.如权利要求50所述的微粒，其中与所述微粒外表面结合的所述单层包括带正电的化合物，该化合物选自主要由带正电的聚电解质、带正电的聚氨基酸和带正电的多糖组成的组。
52.如权利要求50所述的微粒，其中与所述核心结合的所述单层包括带负电的化合物，该化合物选自主要由带负电的聚电解质、带负电的聚氨基酸和带负电的多糖组成的组。
53.如权利要求51所述的微粒，其中所述另一个单层包括带负电的化合物，该化合物选自主要由带负电的聚电解质、带负电的聚氨基酸和带负电的多糖组成的组。
54.如权利要求52所述的微粒，其中所述另一个单层包括带正电的化合物，该化合物选自主要由带正电的聚电解质、带正电的聚氨基酸和带正电的多糖组成的组。
55.如权利要求50所述的微粒，其中所述蛋白质化合物为胰岛素或人生长激素。
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