CN101137390A - 新型血管生成抑制因子 - Google Patents

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Abstract

AK022567具有血管生成抑制作用，由此可作为血管生成抑制剂使用。并且，由相同基因得到的四种剪接变体也同样可用作血管生成抑制剂。这五种多肽、编码该多肽的多核苷酸、该多肽的抗体可用于筛选血管生成抑制剂和血管生成诱导剂的候选物质。由该筛选得到的物质可用作药物，可作为血管生成相关疾病的预防或治疗药使用。

Description

新型血管生成抑制因子
技术领域
本发明涉及血管生成抑制剂以及血管生成诱导剂。本发明还涉及血管生成抑制剂以及血管生成诱导剂的筛选方法和试剂盒。
背景技术
血管生成是指动物的组织或器官中，来自已有的微静脉、毛细血管的血管内皮细胞的游走、增殖以及管腔形成，生成新的血管的现象。通常，在胚胎期、幼儿期和生长期形成新的血管并伸长，但是在过了生长期后，体内发生血管生成的情形是有限定的。即，血管生成可在黄体形成、排卵、胚胎发生、胎盘形成等通常的生理条件下观察到，在损伤的治愈、炎症的修复过程中也发生。如上所述，血管生成在健康状态下发生，在组织的恢复中起重要作用。另外已明确，在心肌梗塞等缺血性心脏病或闭塞性动脉硬化、Buerger病(血栓闭塞性脉管炎)等末梢性血管疾病的治疗中，促进血管生成对治疗有效。除此之外，还有报道指出：通过骨髓细胞的移植诱导血管生成，可进行动脉硬化的治疗(参照非专利文献1)。诱导血管生成对于这些疾病的预防和治疗是重要的。
相反，已知在糖尿病等很多慢性疾病中，毛细血管增加会导致组织严重损伤。另外，在恶性肿瘤增殖时，为了获得肿瘤细胞增殖所必须的营养或氧，肿瘤细胞本身诱导血管生成促进因子进行血管的生成，通过生成的血管获得养分，肿瘤细胞进一步增殖。并且肿瘤细胞向其它器官或部位的转移时也诱导血管生成，肿瘤细胞随着血流移动。作为上述血管生成作为病因或参与病态恶化的疾病，报道有血管性疾病、炎症性疾病、眼内血管生成性疾病、生殖系统疾病、中枢神经系统疾病或恶性肿瘤等(参照非专利文献2)。抑制血管生成对于这些疾病的预防和治疗是重要的。
AK022567(SEQ ID No.1)、BC051856(SEQ ID No.3)、BC053836(SEQ ID No.5)和BC028194(SEQ ID No.7)与其所编码的蛋白质一起已在GenBank的数据库中公开。但是，关于这些基因与血管生成的相关性并未见报道。
非专利文献1：Tateishi-Yuyama，E等人.，The LANCET，360卷，427-435页(2002)
非专利文献2：Carmeliet，P等人.，Nature，407卷，249～257页(2000)
发明内容
发明所要解决的课题
本发明提供新型血管抑制因子相关的血管生成抑制剂和血管生成诱导剂。本发明的目的还在于提供使用新型血管生成抑制因子进行的血管生成抑制剂和血管生成诱导剂的有效的筛选方法，以及可简便且迅速地进行上述筛选方法的筛选用试剂盒。
解决课题的方法
本发明人等经过深入研究，结果发现：AK022567蛋白质是新型的血管生成抑制因子。还发现：由与AK022567蛋白质相同的基因得到的三个剪接变体、BC051856蛋白质(SEQ ID No.4)、BC053836蛋白质(SEQ ID No.6)和BC028194蛋白质(SEQ ID No.8)也具有血管生成抑制作用。又发现了新型剪接变体(SEQ ID No.10)。并发现：上述五种蛋白质、编码该蛋白质的多核苷酸、它们的中和抗体等可用作血管生成抑制剂或血管生成诱导剂，从而完成了本发明。
AK022567蛋白质(SEQ ID No.2)与已知的血管生成抑制因子一Vasohibin蛋白质(SEQ ID No.12：国际公开第02/090546号小册子)具有58％的同源性。
AK022567蛋白质与Vasohibin蛋白质有以下差异。
即，Vasohibin蛋白质在血管内皮细胞中可见表达，而AK022567蛋白质在血管内皮细胞中未见表达；Vasohibin蛋白质在人胚胎和人成体的脑、胎盘中可见表达，而AK022567蛋白质在人胚胎中可见表达，但在人成体的脑、胎盘等组织中未见表达。
本发明包含以下内容：
(1)血管生成抑制剂，该血管生成抑制剂含有具有选自SEQ IDNo.2、4、6、8和10的氨基酸序列的蛋白质、具有该氨基酸序列中有1或多个氨基酸缺失、置换或附加得到的氨基酸序列且具有血管生成抑制作用的蛋白质、具有血管生成抑制作用的这些蛋白质的部分肽或它们的盐。
(2)用于抑制血管生成的表达载体，该表达载体含有多核苷酸或编码具有血管生成抑制作用的蛋白质的片段，其中，所述多核苷酸编码具有选自SEQ ID No.2、4、6、8和10的氨基酸序列的蛋白质、具有该氨基酸序列中有1或多个氨基酸缺失、置换或附加得到的氨基酸序列且具有血管生成抑制作用的蛋白质、或具有血管生成抑制作用的这些蛋白质的部分肽。
(3)用于诱导血管生成的表达载体，该表达载体含有多核苷酸或编码具有血管生成抑制作用的蛋白质的片段，其中，所述多核苷酸与编码具有选自SEQ ID No.2、4、6、8和10的氨基酸序列的蛋白质、具有该氨基酸序列中有1或多个氨基酸缺失、置换或附加得到的氨基酸序列的蛋白质、或具有血管生成抑制作用的这些蛋白质的部分肽的多核苷酸在严格条件下杂交，且编码具有血管生成抑制作用的蛋白质。
(4)血管生成诱导剂，该血管生成诱导剂含有中和抗体，该中和抗体是具有选自SEQ ID No.2、4、6、8和10的氨基酸序列的蛋白质、具有该氨基酸序列中有1或多个氨基酸缺失、置换或附加得到的氨基酸序列且具有血管生成抑制作用的蛋白质、具有血管生成抑制作用的这些蛋白质的部分肽或它们的盐的中和抗体。
(5)血管生成抑制剂的筛选方法，其特征在于：选择促进具有选自SEQ ID No.2、4、6、8和10的氨基酸序列的蛋白质、具有该氨基酸序列中有1或多个氨基酸缺失、置换或附加得到的氨基酸序列且具有血管生成抑制作用的蛋白质、具有血管生成抑制作用的这些蛋白质的部分肽或它们的盐的血管生成抑制活性的化合物或其盐。
(6)血管生成抑制剂的筛选方法，其特征在于：选择促进具有选自SEQ ID No.2、4、6、8和10的氨基酸序列的蛋白质、具有该氨基酸序列中有1或多个氨基酸缺失、置换或附加得到的氨基酸序列且具有血管生成抑制作用的蛋白质、或具有血管生成抑制作用的这些蛋白质的部分肽的基因的表达的化合物或其盐。
(7)血管生成诱导剂的筛选方法，其特征在于：选择抑制具有SEQID No.2、4、6、8和10的氨基酸序列的蛋白质、具有该氨基酸序列中有1或多个氨基酸缺失、置换或附加得到的氨基酸序列且具有血管生成抑制作用的蛋白质、具有血管生成抑制作用的这些蛋白质的部分肽、或它们的盐的血管生成抑制活性的化合物或其盐。
(8)血管生成诱导剂的筛选方法，其特征在于：选择抑制具有选自SEQ ID No.2、4、6、8和10的氨基酸序列的蛋白质、具有该氨基酸序列中有1或多个氨基酸缺失、置换或附加得到的氨基酸序列且具有血管生成抑制作用的蛋白质、或具有血管生成抑制作用的这些蛋白质的部分肽的基因的表达的化合物或其盐。
(9)在权利要求5～8中任一项的方法中使用的筛选用试剂盒，该试剂盒含有具有选自SEQ ID No.2、4、6、8和10的氨基酸序列的蛋白质、具有该氨基酸序列中有1或多个氨基酸缺失、置换或附加得到的氨基酸序列且具有血管生成抑制作用的蛋白质、具有血管生成抑制作用的这些蛋白质的部分肽或它们的盐。
(10)在权利要求5～8中任一项的方法中使用的筛选用试剂盒，该试剂盒含有编码具有选自SEQ ID No.2、4、6、8和10的氨基酸序列的蛋白质、具有该氨基酸序列中有1或多个氨基酸缺失、置换或附加得到的氨基酸序列且具有血管生成抑制作用的蛋白质、或具有血管生成抑制作用的这些蛋白质的部分肽的多核苷酸。
(11)血管生成抑制方法，其特征在于：该方法使用权利要求1或4的血管生成抑制剂或权利要求2或3的用于抑制血管生成的表达载体。
(12)血管生成、血管性疾病、炎症性疾病、眼内血管生成性疾病、生殖系统疾病、中枢神经系统疾病或恶性肿瘤的治疗方法，其特征在于：给予权利要求1或4的血管生成抑制剂、或权利要求2或3的用于抑制血管生成的表达载体。
(13)具有选自SEQ ID No.2、4、6、8和10的氨基酸序列的蛋白质、具有该氨基酸序列中有1或多个氨基酸缺失、置换或附加得到的氨基酸序列且具有血管生成抑制作用的蛋白质、具有血管生成抑制作用的这些蛋白质部分肽或它们的盐在制备血管生成、血管性疾病、炎症性疾病、眼内血管生成性疾病、生殖系统疾病、中枢神经系统疾病或恶性肿瘤的预防药或治疗药中的应用。
(14)编码具有选自SEQ ID N0.2、4、6、8和10的氨基酸序列的蛋白质、该氨基酸序列中有1或多个氨基酸缺失、置换或附加得到的氨基酸序列且具有血管生成抑制作用的蛋白质、或具有血管生成抑制作用的这些蛋白质的部分肽的多核苷酸，或者编码具有血管生成抑制作用的蛋白质的该片段在制备血管生成、血管性疾病、炎症性疾病、眼内血管生成性疾病、生殖系统疾病、中枢神经系统疾病或恶性肿瘤的预防药或治疗药中的应用。
发明效果
具有选自SEQ ID No.2、4、6、8和10的氨基酸序列的蛋白质具有血管生成抑制作用。因此，该蛋白质、编码该蛋白质的多核苷酸等可作为血管生成抑制剂使用。该蛋白质和该多核苷酸的中和抗体可作为血管生成诱导剂使用。使用该蛋白质、多核苷酸、中和抗体等，可以筛选血管生成抑制剂或血管生成诱导剂。通过筛选得到的化合物可作为血管生成相关疾病的预防药或治疗药安全地使用。
附图简述
图1是编码本发明的蛋白质的基因的5个变体
图2是变体5与Vasohibin的氨基酸同源性
图3是通过杆状病毒进行的变体1的表达和纯化
图4是变体1对体内血管生成的抑制效果
实施发明的最佳方式
除特别说明之外，本说明书中使用的术语以该领域中通常使用的含义使用。以下，对于本说明中使用的术语进行说明。
“血管生成”是指由已有的血管中形成血管内皮细胞，以深入到组织中的形式形成毛细血管的现象。形成过程按照1)通过蛋白酶进行血管基底膜的消化、2)血管内皮细胞游走、增殖、3)管腔形成的顺序进行。
“血管生成相关疾病”可例举有：动脉硬化、高血压、心绞痛、闭塞性动脉硬化、心肌梗塞、脑梗塞、糖尿病性血管障碍、血管畸形等血管性疾病，肝炎、肺炎、肾小球肾炎、甲状腺炎、骨髓炎、滑膜炎、骨坏死、软骨坏死、类风湿、哮喘、结节病、克-深濑综合征、血管翳、变应性水肿、溃疡、腹水、腹膜硬化、组织粘连等炎症性疾病，糖尿病性视网膜病、视网膜静脉闭塞、老年黄斑变性等眼内血管生成性疾病，子宫功能不全、胎盘功能不全、卵巢功能亢进、滤泡囊肿等生殖系统疾病，视网膜病、脑卒中、血管性痴呆、早老性痴呆等中枢神经系统疾病，实体癌、血管瘤、血管内皮瘤、肉瘤、卡波济氏肉瘤以及造血器官肿瘤等恶性肿瘤。
“血管生成抑制剂”通过利用或促进新型的具有血管生成抑制作用的、具有选自SEQ ID No.2、4、6、8和10的氨基酸序列的蛋白质的功能，以拥有抑制血管生成的作用。可以是具有选自SEQ ID No.2、4、6、8和10的氨基酸序列的蛋白质、含有编码该蛋白质的多核苷酸等的制剂、以及含有通过使用该蛋白质等进行筛选得到的、具有促进该蛋白质的血管生成抑制作用功能的化合物或其盐等的制剂。在上述疾病中，该血管生成抑制剂可作为由于发生血管生成而使症状严重的疾病的预防药或治疗药使用。该血管生成抑制剂发挥效周的疾病有：血管性疾病、炎症性疾病、眼内血管生成性疾病、生殖系统疾病、中枢神经系统疾病或恶性肿瘤等。
“血管生成诱导剂”通过抑制新型的具有血管生成抑制作用的、具有选自SEQ ID No.2、4、6、8和10的氨基酸序列的蛋白质的功能，以拥有诱导血管生成的作用。可以是：含有中和抗体的制剂，该中和抗体识别该蛋白质等或编码该蛋白质的多核苷酸等；含有通过使用该蛋白质等进行筛选获得的、具有抑制该蛋白质的血管生成抑制作用的功能的化合物或其盐等的制剂。在上述疾病中，该血管生成诱导剂可作为通过发生血管生成来使症状减轻的疾病的预防药或治疗药使用。该血管生成诱导剂发挥效周的疾病有：损伤的治愈、炎症的修复、缺血性心脏病或末梢性血管疾病、动脉硬化等。
“具有选自SEQ ID No.2、4、6、8和10的氨基酸序列的蛋白质”(以下也称为“本发明的蛋白质”)可以是来自人或温血动物(例如豚鼠、大鼠、小鼠、鸡、兔、猪、绵羊、牛、猴子等)的细胞(例如肝脏细胞、脾脏细胞、神经细胞、神经胶质细胞、胰腺β细胞、骨髓细胞、肾小球膜细胞、朗格罕氏细胞、表皮细胞、上皮细胞、杯状细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、纤维细胞、肌细胞、脂肪细胞、免疫细胞(例如巨噬细胞、T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、肥大细胞、中性白细胞、嗜碱白细胞、嗜酸白细胞、单核细胞)、巨核细胞、滑膜细胞、软骨细胞、骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、乳腺细胞、肝细胞或间质细胞、或者这些细胞的前体细胞、干细胞或癌细胞等)或者这些细胞所存在的所有的组织例如来自脑、脑的各部位(例如嗅球、扁桃核、大脑基底神经节、海马体、丘脑、下丘脑、大脑皮质、延髓、小脑)、脊髓、垂体、胃、胰腺、肾脏、肝脏、生殖腺、甲状腺、胆囊、骨髓、肾上腺、皮肤、肌肉、肺、消化管(例如大肠、小肠)、血管、心脏、胸腺、脾脏、下颌下腺、末梢血、前列腺、睾丸、卵巢、胎盘、子宫、骨、关节、骨骼肌等的蛋白质。
“1或多个氨基酸缺失、置换或附加得到的氨基酸序列”例如可以是含有以下的氨基酸序列的蛋白质：(勾选自SEQ ID No.2、4、6、8和10的氨基酸序列中的1或多个(优选1～30个左右、更优选1～10个左右、进一步优选数个(1～5个))氨基酸缺失的氨基酸序列；(B)选自SEQID No.2、4、6、8和10的氨基酸序列中的1或多个(优选1～30个左右、更优选1～10个左右、进一步优选数个(1～5个))氨基酸被其它氨基酸置换得到的氨基酸序列；(C)选自SEQ ID No.2、4、6、8和10的氨基酸序列中附加1个或多个(优选1～30个左右、更优选1～10个左右、进一步优选数个(1～5个))氨基酸得到的氨基酸序列；或者(D)它们组合而成的氨基酸序列。氨基酸序列缺失、置换或附加时，对其缺失、置换或附加的位置没有特别限定。本发明中使用的蛋白质是即使进行了缺失、置换或附加，也具有血管生成抑制作用的多肽。可以是与选自SEQID No.2、4、6、8和1O的氨基酸序列至少具有60％以上同源性的多肽、优选具有80％以上同源性的多肽、进一步优选具有95％以上的同源性的多肽。
“蛋白质的部分肽”是指上述本发明蛋白质的部分肽，优选只要与上述本发明的蛋白质具有同样的性质的多肽即可。例如可以使用具有本发明蛋白质的构成氨基酸中的至少20个以上、优选50个以上、进一步优选70个以上、更优选100个以上、最优选具有200个以上的氨基酸序列的肽等。
“部分肽”只要具有血管生成抑制作用即可，可以是该氨基酸序列中有1或多个(优选1～10个左右、进一步优选数个(1～5个))氨基酸缺失，或者该氨基酸序列上有1或多个(优选1～20个左右、更优选1～10个左右、进一步优选数个(1～5个))氨基酸置换，或者该氨基酸序列附加有1或多个(优选1-20个左右、更优选1～10个左右、进一步优选数个(1～5))氨基酸。可以是与选自SEQ ID No.2、4、6、8和10的氨基酸序列至少具有60％以上同源性的多肽，优选具有80％以上同源性的多肽，进一步优选具有95％以上同源性的多肽。
“蛋白质或部分肽的盐”可使用与生理学上可接受的酸(例如无机酸、有机酸)或碱(例如碱金属盐)等形成的盐，尤其优选生理学上可接受的酸加成盐。所述盐例如可使用与无机酸(例如盐酸、磷酸、氢溴酸、硫酸)形成的盐，或者与有机酸(例如乙酸、甲酸、丙酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸、苯磺酸)形成的盐等。
“在严格条件下杂交的多核苷酸”，是以编码本发明蛋白质的多核苷酸的片段作为探针，使用本领域周知的常用方法例如菌落杂交法、噬菌斑杂交法或者DNA印迹杂交法等获得的多核苷酸，具体来说，是指使用固定有来自菌落或噬菌斑的多核苷酸的膜，在0.7-1.0MNaCl存在下、在65℃下进行杂交，然后使用0.1～2倍浓度的SSC(柠檬酸钠盐：150mM氯化钠、15mM柠檬酸钠)溶液，在65℃下清洗膜，从而可以进行鉴定的多核苷酸。杂交可按照Molecular Cloning：Laboratory Manual，第二版(1989)(cold Spring Harbor LaboratoryPress)、Current Protocols in Molecular Biology(1994)(Wiley-Interscience)、DNA Cloning 1：Core Techniques，A practical Approach，第二版(1995)(Oxford University Press)等记载的方法进行。这里，严格条件下杂交的序列中，优选只含有A(腺嘌呤)或T(胸腺嘧啶)的序列除外。“多核苷酸的片段”是SEQ ID No.1、3、5、7和9的碱基序列中的连续的碱基序列，例如是包括含5个、8个、10个、12个、15个、20个、25个、30个、50个、100个、500个、1000个等的碱基序列的多核苷酸。
本说明书中，“可杂交的多核苷酸”是指可在上述严格条件下可与其它多核苷酸杂交的多核苷酸。具体来说，所述多核苷酸可以是与编码本发明蛋白质的DNA碱基序列至少具有60％以上同源性的多核苷酸，优选具有80％以上同源性的多核苷酸，进一步优选具有95％以上同源性的多核苷酸。这里，同源性例如通过使用由Altschul等人(TheJournal of Molecular Biology，215，403～410(1990))开发的使用算法的检索程序BLAST，以分数表示类似度。
“抗体”以该领域中通常使用的含义使用，也包含抗体的全部或其片段、衍生物、接合体、修饰体等。优选为识别本发明的蛋白质或其部分肽的抗体，更优选特异性识别该蛋白质的抗体，进一步优选单一特异性识别的抗体。进一步优选具有抑制本发明蛋白质的血管生成抑制作用的中和抗体。上述抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。所述抗体或其片段可用常用的酶(例如过氧化物酶等)、荧光染料、放射性物质、抗生物素蛋白或生物素等标记。
以下，具体描述编码本发明蛋白质的多核苷酸(以下称为“本发明的基因”)的获得方法、该蛋白质的制备方法、该蛋白质的中和抗体的制备方法等。
(1)本发明的基因的获得方法
按照常规方法，由人脑、心脏、骨骼肌、脾脏、肾脏、肝脏、小肠、胎盘、来自这些组织的人正常细胞、人脐带静脉肉皮细胞中制备cDNA文库，由此可获得本发明的基因，特别优选从人胎盘或人脐带静脉内皮细胞中获得。
cDNA文库的制备方法有：按照Molecular Cloning：A LaboratoryManual，第二版(1989)(Cold Spring Harbor Laboratory Press)、CurrentProtocols in Molecular Biology(1994)(Wiley-Interscience)、DNACloning 1：Core Techniques，A Practical Approach，第二版(1995)(Oxford UniVersity Press)等记载的方法，或者使用市售的试剂盒例如Superscript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning(Invitrogen)或ZAP-cDNA合成试剂盒(STRATAGENE)等的方法进行。
由该方法获得的cDNA例如有：编码具有选自SEQ ID No.2、4、6、8和10的氨基酸序列的蛋白质的DNA等，具体有：具有选自SEQ IDNo.1、3、5、7和9的碱基序列的DNA等。该cDNA可以在将本发明的基因整合到适当的表达载体中、制备表达用质粒时使用。表达载体、表达用质粒的使用方法等在“本发明的蛋白质的制备方法”中叙述。上述表达用质粒例如有后述实施例2中记载的质粒。
根据氨基酸序列，化学合成编码本发明蛋白质的DNA，也可以制备DNA。DNA的化学合成可使用以下的仪器进行：利用硫代磷酸法的岛津制作所制造的DNA合成仪、利用亚磷酰胺法的PerkinElmer公司制造的DNA合成仪(型号392)等。
并且，使用后述的寡核苷酸作为有义引物(SEQ ID No.13)和反义引物(SEQ ID No.14)，以cDNA为模板，进行PCR，可以制备目标DNA。其中，所述cDNA由表达与这些DNA互补的mRNA的细胞的mRNA制备。
(2)本发明的蛋白质的制备方法
本发明的蛋白质可采用Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版(1989)(Cold Spring Harbor Laboratory Press)、Current Protocolsin Molecular Biology(1994)(Wiley-InterScience)等记载的方法等，例如按照以下方法，使本发明的基因在宿主细胞中表达来制备。
以编码本发明蛋白质的全长DNA为基础，根据需要，制备含有编码该蛋白质的部分的适当长度的DNA片段。为了使编码该蛋白质的部分的碱基序列形成最适合宿主的表达的密码子，可制备置换了碱基的DNA。该DNA在提高该蛋白质的产率方面有用。将该DNA片段或全长DNA插入到适当的表达载体的启动子下游，可制备重组DNA(表达用质粒)。将该表达用质粒导入到适合该表达载体的宿主细胞中，可得到生产本发明蛋白质的转化体。
宿主细胞可以使用原核细胞、酵母、动物细胞、植物细胞、昆虫细胞等，只要是可表达目标基因的细胞均可使用。作为表达载体，可以使用在上述宿主细胞中可自主复制、或者可插入到染色体中，在适合本发明蛋白质的基因转录的位置上含有启动子的表达载体。
(i)使用原核生物作为宿主时
本发明蛋白质的表达载体优选在原核生物中可自主复制，同时由启动子、核糖体结合序列、本发明的基因、转录终止序列构成。也可含有控制启动子的基因。
表达载体可例举：pBTrp2、pBTac1、pBTac2(Roche Diagnostics)、Bluescript II SK(+)、pBluescript II SK(-)(STRATAGENE)、pSTV28、pUC118、pUC19(TaKaRa)、pKK233-2(Amersham Biosciences)、pSE280、pSupex、pLIB11O、pTP5、pC194、pTrxFus(Invitrogen)、pGEMEX-1(Promega)、pQE-8(QIAGEN)、pGEX(Pharmacia)、pETsystem(Novagen)、pMAL-c2(New England BioLabs)、pKYP10(日本特开昭58-110600)、pKYP200(Agricultural Biological Chemistry，48，669(1984))、pLSA1(Agricultliral Biological Chemistry，53,277(1989))、pGEL1(Proceedings of the National Academy of Sciences USA，82，4306(1985))、pEG400(Journal of Bacteriology,172，2392(1990))、pTrs30(FERM BP-5407)、pTrs32(FERM BP-5408)、pGHA2(FERM BP-400)、pGKA2(FERM BP-6798)、pPA1(日本特开昭63-233798)、pTerm2(日本特开平3-22979、US4686191、US4939094、Us5160735)等。
启动子只要是可在大肠杆菌等宿主细胞中表达的启动子即可，均可使用。例如有trp启动子(Ptrp)、lac启动子(Plac)、PL启动子、PR启动子、PSE启动子等来自大肠杆菌或噬茵体的启动子，SPO1启动子、SPO2启动子、penP启动子等。还可以使用将Ptrp两个串联连接的启动子(Ptrpx2)、tac启动子、lacT7启动子、letI启动子等人为设计改变的启动子等。
优选使用核糖体结合序列一Shine-DaLgarno序列与起始密码子之间调节成适当的距离、例如6～18个碱基的质粒。本发明的基因表达中，转录终止序列未必需要，不过优选在结构基因下紧接着配置转录终止序列。
宿主细胞有埃希氏杆菌属(Escherichia)、沙雷氏茵属(Serratia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、短杆菌属(Brevibacterium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、微杆菌属(Microbacterium)、假单胞茵属(Pseudomonas)等原核生物，埃希氏杆菌属可例举大肠的XL1-Blue菌株、XL2-Blue菌株、DH1菌株、MC1000菌株、KY3276菌株、W1485菌株、JM109菌株、HB101菌株，No.49菌株、W3110菌株、NY49菌株、BL21(DE3)菌株、BL21(DE3)pLysS菌株、HMS174(DE3)菌株和HMS174(DE3)pLysS菌株，沙雷氏菌属可例举无花果沙雷氏菌(S.ficaria)菌株、居泉沙雷氏菌(S.fonticola)菌株、液化沙雷氏菌(S.liquefaciens)菌株、粘质沙雷氏茵(S.marcescens)菌株等，芽孢杆菌属可例举枯草芽孢杆菌(B.subtilis)菌株、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)菌株等，短杆菌属可例举产氨短杆菌(B.ammoniagenes)菌株、B.Immariophilum(ATCC：14068)菌株、解糖短杆菌(B.saccharolyticum)(ATCC：14066)菌株等，棒状杆茵属可例谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)(ATCC：13032)菌株、谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)(ATCC：14067)菌株、谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)(ATCC：13869)菌株、嗜乙酰乙酸棒状杆菌(C.acetoacidophilum)(ATCC：13870)菌株等，微杆菌属可例举嗜氨微杆菌(M.ammoniaphilum)(ATCC：15354)菌株，假单胞菌属可例举臭味假单胞茵(P.mephitica)菌株。
表达用质粒的导入方法只要是向上述宿主细胞导入DNA的方法即可使用，例如有电穿孔法(Nucleic Acids Research，16，6127(1988))、磷酸钙法(Proceedings of the National Academy of Sciences USA，69，2110(1972))、原生质体法(日本特开昭-2483942)、Gene，17,107(1982)或Molecular & General Genetics,168,111(1979)中记载的方法等。
(ii)使用酵母作为宿主时
使用酵母作为宿主时，表达载体例如有YEp13(ATCC：37115)，YEp24(ATCC：37051)，YCp50(ATCC：37419)，pHS19、pHS15等。
启动子只要是可在酵母中表达的均可使用，例如有ADH1(醇脱氢酶)启动子、PHO5(酸性磷酸酶)启动子、PGK1(磷酸甘油酸激酶)启动子、GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)启动子、GAL1(半乳糖激酶)启动子、GAL10(LIDP半乳糖4-差向异构酶)启动子、MFα1(α信息素)启动子、CUP1(金属硫蛋白)启动子等。
宿主例如有酵母属(Saccharomyces)的种名：酿酒酵母(S.cerevisiae)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)的种名：粟酒裂殖酵母(S.pombe)、克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)的种名：乳酸克鲁维氏酵母(K.lactis)、丝孢酵母属(Trichosporon)的种名：丛生丝孢酵母(T.pullulans)、许旺氏酵母属(Schwanniomyces)的种名：河岸许旺氏酵母(S.alluvius)以及毕赤氏酵母属(Pichia)的种名：巴斯德毕赤氏酵母(P.pastoris)等。
表达用质粒的导入方法只要是向宿主中导入DNA的方法均可使用，例如有电穿孔法(methods in Enzymology,194,182(1990))、原生质体法(Proceedings of the National Academy of Sciences USA，84，1929(1978))、乙酸锂法(Journal of Bacteriology,153,163(1983)、以及Proceedings of the National Academy of Sciences USA，75，1929(1978))中记载的方法等。
(iii)使用动物细胞作为宿主时
使用动物细胞作为宿主时，表达载体例如可使用pcDNA1/Amp、pcDNA1、pCDM8、pREP4(Invitrogen)、pHM6(Roche Diagnostics)、pKK223-3、pGEX(Amersham Biosciences)、pAGE107(Cytotechnology，3，133(1990))、pAGE103(The Journal of Biochemistry，101，1307(1987))、pAMo、pAMoA(pAMoPRSA)(The Journal of BiologicalChemistry，268，22782～22787(1993))、pAS3-3(日本特开平2-22705)等。
启动子只要是可在宿主中表达的启动子均可使用，例如有：人巨细胞病毒(hCMV)的IE(早早期)基因的启动子、SV40的早期启动子、莫洛尼鼠白血病毒的长末端重复序列的启动子、反转录病毒的启动子、HSP启动子、SRα启动子以及金属硫蛋白的启动子等。还可以将hCMV的IE基因的增强子与启动子一起使用。
用作宿主的动物细胞可例举：来自人的株化细胞HEK293(人胚胎肾细胞、ATCC：CRL-1573)、Namalwa(伯基特淋巴瘤、ATCC：CRL-1432)、HeLa(子宫颈癌细胞、ATCC：CCL-2)、HBT5637(白血病细胞、日本特开昭63-299)、BALL-1(白血病细胞)以及HCT-15(结肠癌细胞)，来自小鼠的株化细胞Sp2/0-Ag14(小鼠骨髓瘤细胞、ATCC：CRL-1581)和NSO(小鼠骨髓瘤细胞)，来自猴子的株化细胞COS-1(非洲绿猴肾细胞(SV40转化细胞)、ATCC：CRL-1650)和COS-7(非洲绿猴肾细胞(SV40转化细胞)、ATCC：CRL-1651)，来自仓鼠的株化细胞(中国仓鼠卵巢细胞、ATCC：CCL-61)和BHK-21(C-13)(Sicilian hamster仔肾细胞、ATCC：CCL-10)，来自大鼠的株化细胞(肾上腺褐色细胞瘤、ATCC：CRL-1721)和YB2/0(大鼠骨髓瘤细胞、ATCC：CRL-1662)等。
表达用质粒的导入方法只要是向宿主中导入DNA的方法均可使用，例如有电穿孔法(Cytotechnology，3,133，(1990))、磷酸钙法(日本特开平2-22705)、脂转染法(Proceedings of the National Academy ofSciences USA，84，7413(1987)、Vir010gy，52,456(1973))。
(iv)使用植物细胞作为宿主时
使用植物细胞或植物个体作为宿主时，可按照公知的方法(组织培养，20(1994)、组织培养，21(1995)、Trends in Biotechnology，15，45(1997))生产本发明的蛋白质。表达载体例如有：Ti质粒、烟草花叶病毒载体等。用作基因表达的启动子只要是可在植物细胞中表达的启动子均可使用，例如有花椰菜花叶病毒(caMV)的35S启动子、水稻Actinl启动子等。另外，通过在启动子与要表达的基因之间插入玉米的醇脱氢酶基因的内含子1等，可以提高基因的表达效率。
宿主可以列举马铃薯、烟草、玉米、水稻、油菜、大豆、番茄、胡萝卜、小麦、大麦、黑麦、紫花苜蓿、亚麻等的植物细胞。
表达用质粒的导入方法只要是向宿主中导入DNA的方法均可采用，例如有：使用农杆菌属(Agrobacterium)的方法(日本特开昭59-140885、日本特开昭60-70080、WO94/00977)、电穿孔法(日本特开昭60-251887)、粒子枪(基因枪)法(日本特许第2606856号、日本特许第2517813号)等。
(v)使用昆虫细胞作为宿主时
使用昆虫细胞作为宿主时，表达载体例如有pVL1392、pVL1393、pBlueBacIII(Invitrogen)等，作为感染用病毒，例如有感染夜蛾科昆虫的杆状病毒—苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)、Bac-N-Blue DNA等。昆虫细胞的转化方法例如可参照Baculovirus ExpressionVector：A Laboratory Manual(1992)(W.H.Freeman and Company)、Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版(1989)(Cold SpringHarbor Laboratory Press)、Current Protocols in Molecular Biology(1994)(Wiley-InterScience)、Biotechnology，6，47(1988)等记载的方法进行。
向昆虫细胞培养液中添加含有目标基因的表达载体和感染昆虫细胞用的杆状病毒DNA，通过表达重组制备的目标基因的病毒感染昆虫细胞，可表达本发明的蛋白质。
宿主中使用的昆虫细胞有来自草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的株化细胞、来自粉纹夜蛾(Trichoplusia ni.)的株化细胞等，具体来说，来自草地贪夜蛾的细胞有：Sf9(ATCC：CRL-1711、卵巢细胞)、sf21(卵巢细胞)等，来自粉纹夜蛾的细胞有：High FiVe，BTI-TN-581-4(卵细胞，Invitrogen)等，。
表达用质粒的导入方法只要是可导入宿主的方法均可采用，例如有磷酸钙法(日本特开平2-22705)、脂转染法(Proceedings of theNational Academy of Sciences USA，84，7413(1987))等。还与动物细胞同样，也可以使用电穿孔法(Cytotechnology，3，133(1990))等。
(vi)培养方法
保有插入了编码本发明蛋白质的DNA的表达用质粒的转化体为大肠杆菌、酵母、动物细胞或植物细胞等细胞时，可按照适合各种宿主的常规培养方法进行培养，产生并蓄积该蛋白质，从转化体或培养液中回收该蛋白质，从而可制备该蛋白质。转化体为动物个体或植物个体时，可按照适合各种宿主的常规培育方法进行饲养或栽培，产生并蓄积该蛋白质，从该动物个体或植物个体中回收该蛋白质，从而制备该蛋白质。
宿主为动物个体时，例如饲养保有本发明的基因的非人转基因动物，将该质粒编码的本发明蛋白质在该动物中生产并蓄积，由该动物个体中回收该蛋白质，由此可制备本发明的蛋白质。动物个体中的生产、蓄积场所例如有该动物的乳、唾液、卵等。
宿主为植物个体时，例如栽培保有本发明的基因的转基因植物，将该质粒编码的本发明蛋白质在该植物个体中生产并蓄积，由植物个体中回收该蛋白质，从而可制备本发明的蛋白质。
宿主为大肠杆菌等原核生物或酵母等真核生物时，例如在培养基中培养保有本发明的基因的转化体，在培养液中生产并蓄积该质粒编码的本发明蛋白质，由该培养液中回收该蛋白质，从而制备本发明的蛋白质。
在培养基中培养本发明蛋白质的转化体的方法可按照宿主培养所采用的常规方法进行。
培养以大肠杆菌等原核生物或酵母等真核生物为宿主得到的转化体的培养基只要是含有该生物可同化的碳源、氮源、无机盐类等、可高效地进行转化体培养的培养基即可，可使用天然培养基、合成培养基任意形式。
转化体为大肠杆菌等原核生物或酵母等真核生物时，作为培养所得转化体的培养基，只要是含有宿主可同化的碳源、氮源、无机盐类等、可高效地进行转化体的培养的培养基即可，可以使用天然培养基、合成培养基任意形式。培养宿主为大肠杆菌的转化体时，培养基优选例如含有细菌用胰蛋白胨、酵母提取物和氯化钠的YT培养基。
碳源只要是可以各微生物可利用的即可，可以使用葡萄糖、果糖、蔗糖、含有这些糖的糖蜜、淀粉或淀粉水解物等碳水化合物，乙酸、丙酸等有机酸，乙醇、丙醇等醇类。
氮源可以使用氨、氯化铵、硫酸铵、乙酸按、磷酸铵等各种无机酸或有机酸的铵盐，其它含氮物质，以及蛋白胨、肉膏、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、大豆粕以及大豆粕水解物、各种发酵茵及其消化物等。
无机盐可以使用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、碳酸钙等。培养可在振荡培养或深层通气搅拌培养等有氧条件下进行。
培养温度优选15～40℃，培养时间通常为5小时～7天。培养中的pH保持在3.0～9.0。pH的调节使用无机或有机酸、碱溶液，尿素、碳酸钙、氨等进行。培养中可根据需要，在培养基中添加氨苄青霉素或四环素等抗生素。
在培养用使用诱导性启动子作为启动子的表达载体转化的微生物时，可根据需要在培养基中添加诱导物。例如，培养用使用lac启动子的表达载体所转化的转化体时，可以在培养基中添加异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷等，培养用使用trp启动子的表达载体所转化的转化体时，可以在培养基中添加吲哚丙烯酸等。导入了基因的植物的细胞或器官可以使用小型发酵罐进行大量培养。进行培养的培养基可使用通常使用的Murashige & Skoog(MS)培养基、怀特培养基、或者在这些培养基中添加8-羟基喹啉、细胞分裂素等植物激素的培养基等。
用于制备本发明蛋白质的转化体为动物细胞时，培养该细胞的培养基可以使用通常使用的RPMI1640培养基(The Journal of theAmerican Medical Association，199，519(1967))、MEM培养基(Science，130，432(1959))，D.MEM培养基(Virology，8，396(1959).)，199培养基(Proceedings of the Society for the Biological Medicine，73，1(1950))或这些培养基中添加胎牛血清(FCS)等所得的培养基等。
培养通常可在pH6～8、25～40℃、5％CO2存在下等条件下进行1～7天，在培养中，还可以根据需要在培养基中添加卡那霉素、青霉素、链霉素等抗生素。
转化体为昆虫细胞时，进行培养的培养基可使用通常使用的TNM-FH培养基(Pharmingen)、Sf-900II SFM培养基(Invitrogen)、ExCell400、ExCell405(JRH Biosciences Inc.)、Grace’s Insect培养基(Nature，195，788(1962))等。
(vii)制备方法
本发明的蛋白质可通过培养转化体、由培养液中分离并纯化本发明的蛋白质来制备。本发明蛋白质的分离、纯化方法可按照本领域所周知的常用方法进行，例如可使用酶的分离、纯化方法或Sandler等人的转葡糖基酶的纯化方法(Methods in Enzymology，83，458)。
本发明的蛋白质以溶解性多肽的形式生产并蓄积时，如上所述，通过例如离心等方法，将培养转化体的培养液分离成细胞或菌体和培养基。本发明的蛋白质存在于宿主细胞内时，可将采集的细胞或菌体用STE溶液等适当的缓冲液洗涤，然后通过超声波、弗氏细胞压碎器、Manton-Gaulin匀浆机、Dynomill等将细胞或菌体破碎，通过离心或过滤获得无细胞溶液。
本发明蛋白质的分离、纯化中使用的缓冲液可适量含有表面活性剂，例如可含有月桂基硫酸钠(SDS)或N-月桂酰基肌氨酸钠(salcosiyl)等。
所得粗制纯化物中所含的目标蛋白质的分离、纯化方法可将本身公知的各种分离、纯化方法组合进行。这些公知方法例如有溶剂萃取法、用硫酸铵等的盐析法、透析法、用有机溶剂的沉淀法、超滤法、凝胶过滤、二乙基氨基乙基(DEAE)-琼脂糖色谱法、DIAIONHPA-75(三菱化学制备)等使用赖氨酸的阴离子色谱法或离子交换层析、S-琼脂糖FF(Pharmacia)等使用赖氨酸的阴离子色谱、丁基琼脂糖等疏水性层析或亲和层析等各种色谱法，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法或等电点电泳法等各种电泳等。亲和层析通过使用本发明蛋白质的抗体进行。
本发明的蛋白质以不溶性多肽的形式生产并蓄积时，与上述同样，分离细胞或菌体，通过适当的方法破碎，然后回收含有该多肽的组分。回收的试样可用月桂基硫酸钠(SDS)或N-月桂酰基肌氨酸钠(salcosiyl)等表面活性剂等增溶剂增溶。将该增溶液稀释或透析至不含增溶剂或者几乎不含的浓度，将该多肽形成正常的立体结构，然后通过与上述同样的分离、纯化方法，可获得纯化标品。
将本发明的蛋白质与其它蛋白质以融合蛋白的形式生产，可利用对融合的蛋白质具有亲和性的物质进行亲和层析来纯化(山川彰夫，实验医学，13，469-474(1995))。融合蛋白中使用的附加蛋白质例如有蛋白A、FLAG等(Proceedings of the National Academy ofSciences USA，86，8227(1989)、Genes Development，4，1288(1990)、日本特开平5-336963、日本特开平6-823021)。使用蛋白A时，生产本发明的蛋白质与蛋白A的融合蛋白，使用免疫球蛋白G，通过亲和层析来纯化。使用FLAG肽时，生产本发明的蛋白质与FLAG的融合蛋白，使用抗FLAG抗体，通过亲和层析纯化。
本发明的蛋白质可按照公知的方法，使用体外转录、翻译系统进行生产(Journal of Biomolecular NMR，6，129-134(1995)、Science，242，1162-1164(1988)、The Joumal of Biochemistry，110，166～168(1991))。
本发明的蛋白质以该氨基酸序列为基础，可通过Fmoc法(芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁基氧基羰基法)等化学合成法或市售的肽合成仪例如APEX396(Advanced Chemtech)、433A(Applied Biosystems)、PS3(Protein Technologies)、9050(Perseptive)、PSSM-8(岛津制作所制造)等肽合成仪进行化学合成。
本发明的蛋白质结构分析可通过蛋白质化学中通常使用的方法例如用于基因克隆的蛋白质结构分析(平野久著、东京化学同人发行1993年)记载的方法实施。本发明的蛋白质活性可按照后述实施例3所述的方法测定。
(3)突变型多肽的制备方法
本发明蛋白质的氨基酸的缺失、置换或附加可通过申请前即已周知的技术—位点专一性诱变法实施。1或多个氨基酸缺失、置换或附加可按照Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版(1989)(Cold Spring Harbor Laboratory Press.)、Current Protocols in MolecularBiology(1994)(Wiley-InterScience)、Nucleic Acids Research，10，6487(1982)、Proceedings of the National Academy of Sciences USA，79，6409(1982)、Gene，34,315(1985)、Nucleic Acids Research，13，4431(1985)、Proceedings of the National Academy of Sciences USA，82，488(1985)、Proceedings of the National Academy of Sciences USA，81，5662(1984)、Science,224，1431(1984)、WO 85/00817或Nature,316，601(1985)等记载的方法制备。
(4)制备识别本发明蛋白质的中和抗体
(i)多克隆抗体的制备
使用本发明的蛋白质或具有其部分氨基酸序列的肽作为抗原，通过给予动物制备多克隆抗体。
给药动物可以使用兔、山羊、大鼠、小鼠、仓鼠等。该抗原的给药量优选每只动物为50-100μg。使用肽时，优选将肽与匙孔血蓝蛋白或牛含硫球蛋白等载体蛋白共价结合形成的肽作为抗原。作为抗原的肽可通过肽合成仪合成。该抗原的给药是在初次给药后间隔1～2周进行，共给药3-10次。给药后，在第3-7天由眼底静脉丛采血，通过酶联免疫测定法[酶联免疫测定法(ELISA法)：医学书院刊1976年、Antibodies-A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]等对该血清是否与用于免疫的抗原反应进行确认。
可从血清对于免疫中使用的抗原显示充分的抗体效价的非人哺乳动物中采集血清，按照下述方法，由该血清分离并纯化多克隆抗体。抗体的分离、纯化方法可以是将离心，用40-50％饱和硫酸铵的盐析，辛酸沉淀[Antibodies，A Laboratory manual，Cold Spring HarborLaboratory，(1988)]，或使用DEAE-琼脂糖柱、阴离子交换柱、蛋白A或G-柱或者凝胶过滤柱等的色谱等单独或组合进行处理的方法。
(ii)单克隆抗体的制备
(a)抗体生成细胞的制备
将血清对于免疫使用的本发明蛋白质的部分片段多肽显示足够的抗体效价的小鼠或大鼠作为抗体生成细胞的供给源供给。
对该显示抗体效价的大鼠在最终给予抗原物质后第3～7天，摘除脾脏，将该脾脏在MEM培养基(日水制药制备)中切细，用镊子搅散，以1,200 rpm离心5分钟，然后舍去上清。将所得沉淀组分的脾细胞用Tris-氯化铵缓冲液(pH 7.65)处理1～2分钟，除去红细胞，然后周MEM培养基清洗3次，使用所得脾细胞作为抗体生成细胞。
(b)骨髓瘤细胞的制备
骨髓瘤细胞使用由小鼠或大鼠获得的株化细胞。例如可使用8-氮杂胍抗性小鼠(来自BALB/c)骨髓瘤细胞株P3-X63Ag8-U1(以下简称为P3-U1)[Curr.Topics.Microbiol.Immunol.，81，1(1978)、Europ.J.Immunol.，6，5ll(1976)]、SP2/0-Ag14(SP-2)[Nature,276,269(1978)]、P3-X63-Ag8653(653)[Journal of Immunol.,123，1548(1979)]、P3-X63-Ag8(X63)[Nature,256,495(1975)]等。这些细胞株可在8-氮杂胍培养基[在RPMI-1640培养基中加入1.5mM谷氨酰胺、5×10-5 M2-巯基乙醇、10μg/ml庆大霉素和胎牛血清(FcS)(CSL公司制备、10％)的培养基(以下称为正常培养基)，再添加15μg/ml 8-氮杂胍的培养基]中继代，细胞融合之前3～4天，在正常培养基中培养，使用2×107个该细胞进行融合
(c)杂交瘤的制备
将(a)中获得的抗体生成细胞和(b)中获得的骨髓瘤细胞用MEM培养基或PBS(1.83g磷酸氢二钠、0.21g磷酸二氢钾、7.65g食盐、1L蒸馏水、pH7.2)充分洗涤，按照细胞数为抗体生成细胞∶骨髓瘤细胞＝5～10∶1混合，以1,200rpm离心5分钟，然后舍去上清。
将所得沉淀组分的细胞群充分搅散，边搅拌边在37℃向该细胞群中按照108个抗体生成细胞添加0.2～1ml将2g聚乙二醇-1000(PEG-1000)、2ml MEM和0.7ml二甲基亚砜(DMSO)混合所得的溶液进行添加，再每隔1～2分钟添加1～2ml MEM培养基多次。添加后，加入MEM培养基，制备成总量为50ml。将该制备液以900rpm离心5分钟，然后舍去上清。将所得沉淀组分的细胞缓慢搅散，然后用刻度吸管吹吸，缓慢地悬浮于100ml HAT培养基[正常培养基中加入10-4 M次黄嘌呤、1.5×10-5 M胸苷和4×10-7 M氨基喋呤所得的培养基]中。
将该悬浮液以100μL/孔分注到96孔培养板中，在5％CO2培养箱中、在37℃下培养7～14天。培养后，取一部分培养上清，通过Antibodies[Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Chapter 14(1988)]等中所述的酶联免疫测定法，选择与本发明蛋白质的部分片段多肽特异性反应的杂交瘤。
本发明还涉及血管生成抑制剂或血管生成诱导剂的筛选方法。该筛选方法的特征之一在于：在被检物一化合物或其盐存在下，检测或测定本发明的蛋白质或基因的动态。
即，通过研究被检物质对于具有血管生成抑制作用的本发明的蛋白质或基因的动态的影响，可以高效地进行作为血管生成抑制剂或血管生成诱导剂有效的物质的筛选。被检物质对于本发明的蛋白质或基因的动态的影响可以以不存在被检物质下该动态作为对照进行研究。
本发明的筛选方法还可用于血管生成抑制剂或血管生成诱导剂的侯选化合物的药理评价。
上述被检物质的化合物或其盐有：低分子化舍物、高分子化合物、多肽或其衍生物、核酸或其衍生物等。所述化合物或其盐可以是天然物质，也可以是非天然物质。多肽的衍生物有：附加修饰基团得到的修饰多肽、通过使氨基酸残基改变得到的突变体多肽等。核酸的衍生物还有：附加有修饰基团得到的修饰核酸、通过改变碱基得到的突变体核酸、肽核酸等。核酸也包含可诱发本发明基因的RNAi的siRNA、反义链RNA、核酶等。
本发明的筛选方法可以“本发明的蛋白质或基因的动态”作为检测或测定对象进行。
本发明的筛选方法中，检测或测定对象的“本发明的蛋白质或基因的动态”例如有：该蛋白质与其配体之间是否有结合；该基因的表达：具体来说，是否有该表达或该表达的变动情况等。
本发明的筛选方法可根据检测或测定对象的“本发明的蛋白质或基因的动态”，大致分为三种实施方案。
本发明的筛选方法的第一实施方案是包含以下步骤的方法：
(I)使本发明的蛋白质与被检物质接触的步骤；以及
(II)在上述步骤(I)后，检测该蛋白质与被检物质的结合，由此选择与该蛋白质结合的被检物质作为血管生成抑制剂或血管生成诱导剂的候选化合物的步骤。
根据所述方法，可以经由与上述蛋白质的结合，选择影响该蛋白质功能的物质，因此，所选择的候选化合物具有直接且特异性地与上述蛋白质结合并调节其功能的特征性性质。
这里所使用的本发明的蛋白质也包括该蛋白质本身或其部分肽；上述蛋白质的氨基酸序列中具有至少一个氨基酸的变异且具有与上述蛋白质同等作用的蛋白质或其部分肽等。
上述步骤(I)中，上述蛋白质与被检物质的接触例如可以在不妨碍该蛋白质原本的功能的溶液中，通过将上述蛋白质与被检物质混合、在适当的反应条件(例如反应温度、反应时间等)下保持(即，使两者反应)来进行。
上述“不妨碍蛋白质的原本的功能的溶液”例如有：磷酸缓冲生理盐水(PBS)、HEPES缓冲液、Tris缓冲液等溶液。
对步骤(I)中的反应条件没有特别限定，例如有：在上述溶液中，通常为pH6.0～10.0、优选pH7.0～9.0、更优选pH7.5～8.5、进一步优选pH8.0；通常为10℃～50℃、优选20℃～40℃、更优选25℃～37℃，进一步优选25℃；通常保持1分钟～1小时、优选3～30分钟、更优选5～20分钟，进一步优选10分钟等。
接着，在步骤(II)中，检测上述蛋白质与被检物质的结合，研究是否有该结合。
例如如上所述，结合可如下检测：在过量较多的非放射性被检物质的竞争下，对在步骤(I)中上述蛋白质与例如被放射性物质标记的被检物质反应后的溶液中所含的该蛋白质的放射活性进行分析。再在与本发明的蛋白质结合的状态下，测定细胞刺激活性例如促进或抑制插入BrdU(溴脱氧尿苷)的DNA合成的活性、细胞游走活性等，或者通过显微镜等视觉测定血管内皮细胞的管腔形成的方法等，可以检测本发明蛋白质的活性变化。检测出活性变化时，则选择所使用的被检物质作为血管生成抑制剂或血管生成诱导剂的候选化合物。
还可以通过连续进行步骤(I)和步骤(II)的步骤来实施。所述方案例如可利用对保持被检物质的载体进行结合鉴定等来实施。
本发明的筛选方法的第二实施方案是包含以下步骤的方法：
(I’)在本发明的蛋白质的结合物质存在下，使本发明的蛋白质与被检物质接触的步骤；以及
(II’)在上述步骤(I’)之后，检测该结合物质与蛋白质的结合量，由此选择使该结合物质与蛋白质的结合量发生改变的被检物质作为血管生成抑制剂或血管生成诱导剂的候选化合物。
根据所述方法，通过抑制或促进上述结合物质与蛋白质之间的结合，可以选择影响该蛋白质的功能的物质，因此，所选择的候选化合物参与上述结合物质与蛋白质之间的结合，具有调节该蛋白质的功能的特征性性质。所述选择的候选化合物例如有：(a)使经由结合物质与本发明蛋白质的结合的细胞刺激活性例如促进或抑制插入BrdU的DNA合成的活性、促进或抑制细胞游走活性等的活性等增强或减少的物质；(b)使结合物质与本发明蛋白质的结合力增强或减少的物质。
这里所使用的本发明蛋白质、反应条件等与上述第一实施方案相同。
例如如上所述，在步骤(I’)中，结合量可如下检测：在用放射性物质标记的上述结合物质存在下，在较多过量的非放射性被检物质的竞争下，对于本发明蛋白质与被检物质反应后的溶液中所含的该结合物质的放射活性进行分析。其特征在于：例如通过测定细胞刺激活性等进行比较。检测出结合量变化时，可以选择所使用的被检物质作为血管生成抑制剂或血管生成诱导剂的候选化合物。
本发明的筛选方法的第三方案是包含以下步骤的方法：
(I”)将本发明的基因导入细胞的步骤；
(II”)在被检物质存在下，使上述基因在上述步骤(I”)中得到的细胞中表达的步骤；以及
(III”)与不存在被检物质的情形相比，检测上述基因是否有表达，或者测定上述基因表达的变化情况，由此选择带来该基因的表达变化的被检物质作为血管生成抑制剂或血管生成诱导剂的侯选化合物。
上述步骤(I”)中，将本发明的基因导入细胞，这例如可在已知作为该基因的表达调节区域的表达调节性元件的下游且在其调控下，使用核酸构建物进行，该核酸构建物与该基因可动作性地连接。上述表达调节性元件例如记载于Oncogene,1996,13卷，143～149中。
上述“核酸构建物”通过将上述表达调节性元件以及本发明的基因插入到常用的表达载体的克隆位点而简便地构建。该载体例如有病毒载体、质粒载体等。
这里所使用的本发明的基因也包含该基因本身；在严格条件下与上述基因的反义链杂交，且编码与本发明的蛋白质具有同等作用的蛋白质的基因；在上述基因的碱基序列中，至少具有一个碱基的突变，且编码与上述蛋白质具有同等作用的蛋白质的基因；与上述基因的碱基序列至少具有60％、优选80％以上、更优选90％以上的同源性，且编码与本发明的蛋白质具有同等作用的蛋白质的基因等。
上述核酸构建物中，作为本发明的基因的替代物，可以使用氯霉素乙酰转移酶、β-半乳糖苷酶或者荧光素酶等已可以对它们的翻译产物的量进行定量的基因。
本发明的各种方案中，当其构成上必须有本发明的基因的表达时，该基因的表达中所使用的载体、导入核酸构建物的宿主细胞等只要通过它们的任意的组合可实现上述基因的表达即可，它们可以来自任何生物种。具体例子以及上述核酸构建物向细胞的导入方法、导入了上述核酸构建物的转化体的培养方法等与上述蛋白质的制备方法中转化体的相关记载相同。考虑到本发明的基因来自真核生物，以及本发明中提供的治疗药或预防药等可适合用于哺乳动物、特别是人，因此上述基因的表达中使用的宿主细胞优选动物细胞。
本实施方案中，使用导入了上述核酸构建物的稳定的细胞系时，步骤(I”)可以省略。
接着，在步骤(II”)中，在被检物质存在下，使本发明的基因在上述步骤(I”)中得到的细胞中表达。
该步骤如下进行：例如使用含有被检物质的培养基，将上述步骤(I”)中得到的细胞进行培养。培养条件与上述蛋白质的制备方法的转化体培养条件相同。
接着，在步骤(III”)中，与不存在被检物质的情形相比，检测是否有上述基因的表达，或者测定上述基因表达的变动情况，由此可以选择带来上述基因表达的变化的被检物质作为血管生成抑制剂或血管生成诱导剂的侯选化合物。
“不存在被检物质的情形”是指在步骤(II”)中，在不存在被检物质的条件下，使上述基因在步骤(I”)中得到的细胞中表达的情形，这是掌握上述基因在被检物质存在下的表达变化的基准。具体来说，使用上述情况的细胞或该细胞的提取液等作为对照。
检测上述基因是否表达、或者测定该表达的变动情况，结果，与对照相比可见该基因表达的变化时，例如如果在对照中可见上述基因的表达，而与对照相比，与上述被检物质接触的细胞中上述基因表达的表达水平上升时，即，与对照相比，上述基因的表达增加时，可以判定该被检物质是血管生成抑制剂的侯选化合物，可以选择该被检物质作为血管生成抑制剂的候选化合物。例如，如果对照中可见上述基因的表达，而与被检物质接触的细胞中未检测出上述基因的表达、或者与对照相比表达水平降低时，即，与对照比较，上述基因的表达减少时，可判定该被检物质是血管生成诱导剂的侯选化合物，可选择该被检物质作为血管生成诱导剂的侯选化合物。
可以认为，在细胞水平上，所选择的侯选化合物具有以转录水平促进或抑制上述基因的表达的特征性性质，发挥了可以特异性促进或抑制上述基因的表达的优异效果。
检测是否有基因的表达或者测定其表达的变动，这优选以该基因的mRNA量或蛋白质的量作为指标进行测定。只要是进行mRNA检测的分子生物学测定方法或进行蛋白质检测的免疫学测定方法即可，可以是任何方法。例如分子生物学测定方法有：聚合酶链反应法(PCR)、RNA印迹法、斑点印迹法、使用微阵列(microarray)或膜阵列(macroarray)的分析方法等。免疫学的测定方法例如有：使用微量滴定板的ELISA法、RIA法、荧光抗体法、蛋白质印迹法、免疫组织染色法等。以下详细描述。
(1)分子生物学的测定方法
使用由本发明的基因制备的寡核苷酸，通过RNA杂交法或RT-PCR法对mRNA进行定量，可以对编码本发明蛋白质的DNA的表达量进行定量。
对表达本发明蛋白质或其部分肽的转化体的mRNA进行定量时，也可按照该领域中众所周知的常用方法，从该转化体中提取mRNA，通过RT-PCR法或RNA印迹杂交法等，对mRNA进行定量、分析。
PCR中使用的“引物对”有：含有编码本发明蛋白质的核酸或含有该核酸的特征性序列部分的核酸的5’末端的有义序列所对应的引物以及3’末端的反义序列所对应的引物的引物对等。考虑到使用时的操作性，所述引物对可根据适当的Tm值、二级结构等进行适当选择。具体来说，优选可以扩增SEQ ID No.1、3、5、7和9的碱基序列的全部或其特征性部分序列的引物。更具体地说，例如选自具有SEQ IDNo.1、3、5、7和9的碱基序列的核酸的引物对等。对引物对的具体例子没有特别限定，例如有SEQ ID No.13和14的引物对等。所述引物可以是用常用的荧光染料、放射性物质等标记的引物。扩增产物的检测可如下进行：在常用的琼脂糖凝胶电泳等中，通过溴化乙锭或荧光物质可视化，基于标记引物进行检测等。
采用RNA印迹法时，可以使用检测核酸的探针，对来自被检对象的个体的被检试样测定杂种的形成或其量，与对照试样的结果进行比较，评价本发明蛋白质的基因的表达水平。其中所述核酸是编码具有选自上述SEQ ID No.2、4、6、8和10的氨基酸序列的蛋白质、或具有该氨基酸序列中有1或多个氨基酸缺失、置换或附加得到的氨基酸序列的蛋白质的核酸。
采用微阵列或膜阵列的分析方法时，可使用至少含有一个以上检测核酸的探针的微阵列或膜阵列，对来自被检对象个体的被检试样测定其杂种的形成或其量，以对照试样的结果进行比较，评价本发明蛋白质的基因表达水平。其中所述核酸是编码具有选自上述SEQID No.2、4、6、8和10的氨基酸序列的蛋白质、或具有该氨基酸序列中有1或多个氨基酸缺失、置换或附加得到的氨基酸序列的蛋白质的核酸。
RNA印迹法或微阵列或者膜阵列的分析方法中所使用的“探针”有：在检测含有选自SEQ ID No.1、3、5、7和9的碱基序列的核酸中使用的核酸。考虑到使用时的操作性，作为探针使用的核酸可根据适当的Tm值、二级结构等适当选择。所述核酸可用常用的荧光染料、放射性物质等标记。
(2)本发明的蛋白质的免疫学检测方法
本发明的蛋白质的免疫学检测方法可以是：使用将该蛋白质或其部分肽的抗体直接或间接与酶、荧光物质、放射性同位素、胶乳等结合所得的标记物，测定该蛋白质或其部分肽的方法。所述测定方法例如有：通过辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶等酶标记进行检测的ELISA法或化学发光法、检测鲁米诺或GEP(绿色荧光蛋白)等荧光标记的FITC法、检测125I等放射性同位素标记的RIA法、与胶乳结合的胶乳凝聚法等。
上述测定方法可列举蛋白质印迹法或免疫组织染色等。
还可以使用上述测定方法，对本发明蛋白质或其部分肽进行定量。
免疫学检测方法中使用的抗体可以固定在固相支持体上，也可以使用具有报道基团的二次抗体或试剂检测结合的多肽。本发明的蛋白质用报道基团标记可通过将抗体和试剂一起反应、然后与固定抗体结合的竞争法进行检测。试样中的本发明的蛋白质对于同样标记的多肽与抗体结合的抑制程度通过试样与固定抗体的反应性显示，可以计算试样中本发明蛋白质的浓度。固相支持体可以是可附着抗体的本领域所公知的任意物质，例如有微量滴定板、硝基纤维素膜等膜、珠、盘、例如玻璃、玻璃纤维、胶乳或聚苯乙烯或聚氯乙烯等塑性物质。还可以使用磁性颗粒或纤维光学传感器(US 5359681等)。抗体在支持体上形成固相的方法可以采用本领域公知的方法。本说明书中，“固相”是指通过吸附等物理学方法、或者抗体与支持体上的官能团通过共价键结合的化学方法固定。抗体与支持体上的官能团可以直接结合，也可以经由交联剂等结合。
物理方法的固定通过将在适当的缓冲液中适当稀释的抗体与支持体、优选微量滴定板或膜接触适当的时间来实现。接触时间根据温度而变化，代表性的为约1小时和一天之间。聚苯乙烯或聚氯乙烯等塑料制的微量滴定板的各孔中添加约10ng～约1μg、优选约100～200ng的抗体，进行抗体的固定。
化学方法的固定通过使与支持体和抗体的官能团例如羟基或氨基两者反应的双官能性试剂与支持体反应来实现。例如，通过使用苯醌、或者通过支持体上的醛基与结合对象上的氨和活性氢的缩合，抗体通过共价键固定在具有适当的聚合物涂层的支持体上。所述方法例如可参照Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook(1991)A12～A13进行。
为了抑制其它的多肽的物理性吸附，使抗体形成固相的支持体可按照本领域所公知的方法，通过适当的阻断剂例如牛血清白蛋白、吐温20(Sigma-Aldrich)等进行处理。
使抗体固相支持体与试样反应，使本发明的蛋白质与抗体结合。试样用可以适当的稀释液例如PBS等适当稀释。试样与抗体的反应时间是足以检测试样中本发明的蛋白质存在的时间，优选结合多肽和未结合多肽之间达到平衡的结合水平、达到至少95％结合水平的时间。达到平衡的时间可通过测定结合水平随时间的变化而容易地确定。结合多肽以外的物质可以用适当的缓冲液例如PBS(含有0.1％吐温20)等清洗固相支持体来除去。使标记的二次抗体与固相支持体反应。标记优选辣根过氧化物酶等酶、底物、辅助因子、抑制剂、染料、放射性同位素、显色物质、荧光物质等。抗体与标记的结合可按照本领域公知的方法进行。二次抗体以足以和固相抗体与本发明蛋白质的复合物结合的时间进行反应。适当的时间可通过测定结合水平随时间的变化而容易地确定。未结合的二次抗体可通过用适当的缓冲液例如PBS(0.1％吐温20)等洗涤固相支持体来除去。检测二次抗体的标记的方法根据标记的种类而不同。使用放射性同位素作为标记时，可采用闪烁计数器或放射自显影检测。使用染料、显色物质和荧光物质等作为标记时，可采用分光光度计检测。使用酶作为标记时，可对其添加底物，在反应一定时间后用分光光度计等检测生成物。标记与二次抗体之间可以直接结合，也可以使用抗生物素蛋白-生物素等间接结合。此时，可将一方与二次抗体结合，通过标记另一方进行检测。
本发明的“筛选试剂盒”中至少含有本发明的蛋白质或其一部分、本发明的基因或其一部分、保持该基因的核酸构建物、导入了该基因的细胞、本发明蛋白质的抗体等。
本发明的筛选用试剂盒具体有：
—含有本发明蛋白质的试剂盒、
—含有核酸构建物的试剂盒，该核酸构建物含有本发明的基因、
—含有导入了本发明基因的细胞的试剂盒、
—含有本发明蛋白质的抗体或其片段的试剂盒。
各试剂盒中可以根据需要含有可在本发明的筛选方法中使用的上述探针和/或引物对。并且，还可以根据需要含有用于检测的试剂、缓冲液、标准物质、实施本发明的筛选方法的说明书等。
含有至少一种选自用本发明的蛋白质、本发明的中和抗体或上述筛选方法或筛选用试剂盒得到的化合物等的血管生成抑制剂或血管生成诱导剂可以作为预防或治疗药单独给药，但通常优选与药理学上可接受的一种或一种以上的载体一起混合，以按照制剂学技术领域中已知的任意方法制造的药物制剂的形式提供。本发明的血管生成抑制剂或血管生成诱导剂对于血管生成相关疾病，经由本发明蛋白质的表达(具有血管生成抑制作用)或对该蛋白质表达的作用(例如对该表达发挥促进或抑制作用)，发挥治疗或预防效果。
本发明的血管生成抑制剂或血管生成诱导剂可以进一步含有可稳定保持上述蛋白质、中和抗体或化合物的各种助剂。具体来说，可以是在有效成分到达送达对象部位为止的期间显示抑制有效成分分解的性质的药学上可接受的助剂，例如赋形剂、粘合剂、稳定剂、缓冲剂、溶解助剂、等渗剂等。
可以与片剂、胶囊剂等混合的添加剂例如可使用明胶、玉米淀粉、西黄蓍胶、阿拉伯树胶等粘合剂，结晶纤维素等赋形剂，玉米淀粉、明胶、海藻酸等膨胀剂，硬脂酸镁等润滑剂，蔗糖、乳糖或糖精等甜味剂，薄荷、冬绿油或樱桃等香味剂等。制剂单位形态为胶囊时，上述类型的材料中可以进一步含有油脂等液体状载体。用于注射的无菌组合物可以是将活性物质溶解或悬浮于注射用水，芝麻油、椰油等天然植物油等载体中，按照通常的制剂方式进行配方。注射用的水性液体例如可使用生理盐水、含有葡萄糖或辅助试剂的D-山梨醇、D-甘露醇、氯化钠等等渗液等，可以结合使用适当的溶解助剂例如乙醇、丙二醇或聚乙二醇等醇类，聚山梨酯80或HCO-50等非离子性表面活性剂等。油性液体例如可使用芝麻油、大豆油等，也可以结合使用溶解助剂苯甲酸苄酯、苄醇等。
上述血管生成抑制剂或血管生成诱导剂例如可以配合磷酸盐缓冲液、乙酸钠缓冲液等缓冲液，苯扎氯铵、盐酸普鲁卡因等止痛剂，人血清白蛋白、聚乙二醇等稳定剂，苄醇、苯酚等防腐剂，抗氧化剂等。所制备的注射液通常填充在适当的安瓿中。上述得到的制剂安全、低毒性，例如可以给予人或大鼠、小鼠、兔、绵羊、猪、牛、猫、狗、猴等哺乳动物。
给药途径优选使用治疗时最有效的途径，可以是口服给药，或者是口腔内、气管内、直肠内、皮下、肌肉和静脉内等非口服给药。给药形态有喷雾剂、胶裳剂、片剂、颗粒剂、糖浆剂、乳剂、栓剂、注射剂、软膏、贴剂等。
适合口服给药的制剂形态是乳剂、糖浆剂、胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂等。例如，乳剂和糖浆剂等液体制备物可以使用水，蔗糖、山梨醇、果糖等糖类，聚乙二醇、丙二醇等二醇类，芝麻油、橄榄油、大豆油等油类，对羟基苯甲酸酯类等防腐剂，草莓香料、薄荷等香料类等作为添加剂制备。胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂等可使用乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露糖等赋形剂，淀粉、海藻酸钠等崩解剂，硬脂酸镁、滑石粉等润滑剂，聚乙烯醇、羟丙基纤维素、明胶等粘合剂，脂肪酸酯等表面活性剂，甘油等增塑剂等作为添加剂制备。
适合非口服给药的制剂有注射剂、栓剂、喷雾剂等。例如注射剂可以使用盐溶液、葡萄糖溶液或含有两者的混合物的载体等制备。栓剂可以使用可可脂、氢化脂肪或羧酸等载体制备。喷雾剂可使用该物质本身、以及不会对接受者的口腔和气管粘膜产生刺激且使该物质以微细颗粒分散并容易吸收的载体等制备。载体的具体例子有乳糖、甘油等。根据该物质以及所使用的载体的性质，可以制成气溶胶、干粉等制剂。这些非口服制剂中，可以添加口服制剂中作为添加剂所列举的成分。
本发明的血管生成抑制剂或血管生成诱导剂的给药量也根据有效成分的种类、给药对象的个体、器官、局部部位、组织，给药对象个体的年龄、体重等适当选择。对给药方法没有特别限定，每次的给药量范围如下：有效成分为低分子化合物或高分子化合物时，上述有效成分的量例如为0.0001～1000mg/kg体重，优选0.001～100mg/kg体重；为多肽或其衍生物时，例如为0.0001～1000mg/kg体重，优选0.001～100mg/kg体重；为核酸或其衍生物时，例如为0.00001～100mg/kg体重，优选0.0001～10mg/kg体重，每天一次或分多次给药。对给药期间没有特别限定。
本发明的血管生成抑制剂或血管生成诱导剂的药理评价例如可通过以下方法进行：对血管生成相关疾病模型小鼠给予本发明的血管生成抑制剂或血管生成诱导剂，与未给药动物相比，通过以给药动物中血管生成相关疾病的改善作为指标进行评价。
本发明的血管生成抑制剂或血管生成诱导剂可以添加到食品或饲料中使用。“食品”和“饲料”是指含有一种以上营养素的天然物及其加工品，也包含所有的食品和饮料。配合了本发明的血管生成抑制剂或血管生成诱导剂的食品和饲料可用作血管生成相关疾病的预防和/或治疗的健康辅助用功能性食品。
含有至少一种选自使用本发明的基因或上述筛选方法或筛选用试剂盒得到的化合物(核酸或其衍生物)等的、用于抑制血管生成的表达载体或用于诱导血管生成的表达载体可对与血管生成相关的疾病发挥治疗或预防效果。
本发明的表达载体的制备方法、在细胞中的表达方法等与上述“本发明的基因的获得方法”和“本发明蛋白质的制备方法”中所记载的表达载体相同。
本发明的表达载体安全、低毒性，因此可以给予例如哺乳动物(例如人、大鼠、小鼠、兔、绵羊、猪、牛、猫、狗、猴等)。在基因治疗中使用时，优选使用可以在包括人的哺乳动物的细胞内表达蛋白质、且安全性高的DNA或RNA病毒载体或质粒载体。基因治疗中优选的病毒载体有腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、反转录病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒、慢病毒属(HIV)、仙台病毒、埃-巴病毒(EBV)、牛痘病毒、脊髓灰质炎病毒、Sinbis病毒、SV40等。基因治疗中优选的质粒有：pCAGGS[Gene，108，193～200(1991)]、pBK-CMV、pcDNA3.1、pZeoSV(Invitrogen或Stratagene)等。
将本发明的表达载体向患者导入的方法有：将该载体直接导入体内的体内法；以及从人体取出某种细胞，将DNA在体外导入该细胞，在将该细胞返回体内的先体外后体内法[日经サィェンス，4月号，20～45(1994)、月间药事，36，23～48(1994)、实验医学增刊，12，15(1994)]。本发明中优选体内法。
通过体内法给药时，可通过与治疗目标的疾病、靶器官等对应的适当的给药途径给药。例如，直接局部给药到可见病变的组织，或通过静脉、动脉、皮下、肌内、腹腔内、内窥镜、气溶胶等给药。给药方法优选静脉内或腹腔内给药。还优选对可见病变的组织直接注射。也可以使用核磁共振摄影或计算机断层摄影等可在该技术领域中应用的任意的方法，对可见病变的组织进行摄影，然后通过例如定位注射给予本发明的载体。
通过在编码本发明蛋白质的DNA上附加信号序列，形成分泌蛋白，不必局部给药，在细胞内产生并分泌的蛋白质即可作用于远距离的靶器官，产生血管生成抑制作用。因此，可以对病理组织以外的正常组织内或正常细胞内给药。给予人时，优选静脉内给药或肌内给药。
本发明的载体的制剂(基因治疗药)形式可以采取符合上述各种给药形式的各种制剂形式。例如，制成含有作为有效成分的本发明的DNA的注射剂时，该注射剂可按照常规方法制备。基因治疗药中使用的基质(base ingredient)只要是通常注射剂所使用的基质即可，没有特别限定，可以是蒸馏水、氯化钠或氯化钠与无机盐等的混合物的盐溶液，甘露醇、乳糖、葡聚糖、葡萄糖等的溶液，甘氨酸、精氨酸等氨基酸溶液，有机酸溶液或盐溶液与葡萄糖溶液的混合溶液等。按照常规方法，在这些基质中使用渗透压调节剂，pH调节剂，芝麻油、大豆油等植物油或卵磷酯或者非离子性表面活性剂等表面活性剂等助剂，可以以溶液、混悬液、分散液的形式制备注射剂。将这些注射剂制成粉末，通过冷冻干燥等操作，可以制成使用时溶解的制剂。
制剂中的DNA含量可根据治疗目标的疾病、给药部位、给药次数、所希望的治疗期间、患者的年龄、体重等不同，可适当调节，通常患者(体重60kg)中，通常编码本发明蛋白质的DNA的重量约0.01～2000mg，优选0.1～100mg。
以下的实施例是用于举例而提供，并不限于此。如没有特别限定，基因操作的方法采用Molecular Cloing：A Laboratory Manual，2ndEdition(Cold Spring Harbor Laboratoy)记载的方法。
实施例1
血管生成抑制因子Vasohibin的同源基因的检索
为了探索目前我们已发现的血管生成抑制因子Vasohibin(J.Clin.Invest.，114(7)，898～907，2004)的结构性类似基因，将Vasohibin cDNA的碱基序列(KIAA1036、Acc#NM_014909、SEQ ID No.11)在EST聚类数据库(EST cluster data base)-AssEST(Maze，Inc.)中进行Blastx检索，进行相同序列可编码的氨基酸的同源性检索，表明Vasohibin蛋白质(SEQ ID No.12)与AK022567蛋白质(SEQ ID No.2)具有58％的同源性。并且，基于该AK022567基因的碱基序列(SEQ ID No.1)，在美国NCBI(国家生物技术信息中心)的数据库中进行同源性检索，发现了作为编码功能未知的蛋白质FLJ12505的基因登录的BC051856(SEQID No.3)、BC053836(SEQ ID No.5)以及BC028194(SEQ ID No.7)。将这三种基因以及AK022567基因的碱基序列用人类基因组数据库Ensembl进行检索，这些基因均存在于1号染色体长臂lq32.3处，为通过选择性剪接生成的四种变体，其中，AK022567为变体1、BC051856为变体2、BC053836为变体3、BC028194为变体4(图1)。
使用含有SEQ ID No.13和14的引物，通过RT-PCR确认本发明的基因是否与Vasohibin同样在HUVEC(人脐带静脉内皮细胞)中表达，结果从变体1、2、3和4中检测出比预想的更大的DNA片段。在确定该DNA片段的碱基序列时，表明受到了新的选择性剪接(SEQ IDNo.9)，将其称为变体5(图1)。5种变体内，变体5所编码的氨基酸序列(SEQ ID No.10)与Vasohibin的宴基酸序列同源性最高(图2)。
实施例2
通过杆状病毒表达和纯化本发明的蛋白质
将编码在变体1的C末端附加了3xFLAG序列所得的蛋白质的cDNA插入到昆虫细胞表达用载体pFASTBac1中(Invitrogen)，构建昆虫细胞表达用质粒pFASTBac1036。在昆虫细胞中的表达是使用Bac-To-Bac杆状病毒表达系统(Invitrogen)，操作等也按照所附说明进行。即，将构建的pFASTBac1036质粒转化DH10Bac大肠杆菌，得到重组BacmidDNA。接着，将该BacmidDNA通过CELLFECTIN试剂(Invitrogen)基因导入Sf9细胞中，得到重组杆状病毒。将0.5ml该病毒溶液以1.5×10-6个/ml的浓度感染50ml Sf9细胞。感染后培养96小时，通过离心回收细胞。
附加FLAG的本发明蛋白质在昆虫细胞中表达的确认是通过利用该Sf9细胞的提取液和HRP标记的抗FLAG M2 mAb抗体(Sigma)的蛋白质印迹进行。首先，将细胞用5ml磷酸缓冲生理盐水(PBS)清洗一次，然后用5ml Lysis溶液(含有0.15 M NaCl、0.1 mM EDTA、0.1mMEGTA、1 mM DTT、0.1 mM脒基苯基甲磺酰氟盐酸盐、0.1％NP-40的50 mM Tris-HCl，pH 7.4)悬浮，然后一边冰冷却一边用MICROCON(HEART SYSTEMS)超声波处理15秒钟，进行四次，然后以14,500×g离心20分钟，向上清中加入等量的Lysis溶液，将其作为溶胞溶液。蛋白质印迹是按照Laemli的方法，将0.5μl进行SDS-PAGE分离，电转印到硝基纤维素膜上，然后用含有5％脱脂乳的TBS进行封闭，与HRP标记的抗FLAG M2 mAb反应。用含有0.05％TritonX-100的TBS(含有0.15 M NaCl的Tris-HCl，pH 7.4)洗涤10分钟，洗涤三次，用ECL-Plus试剂(Amersham Pharmacia)使其化学发光，通过使其感光HyperfilmECL胶片(Amersham Pharmacia)来进行检测。
附加FLAG的本发明蛋白质的纯化是将溶胞溶液添加到用含有0.1％NP-40的TBS平衡的抗FLAG M2亲和凝胶柱(Sigma)中，然后用该溶液进行洗涤，用洗脱液(含有0.1％NP-40的GIy-HCl、pH 3.5)(1ml/组分)洗脱，立即用1 M Tris-HCl、pH 8.0中和(相对于1 ml洗脱液使用20μl)。纯化组分在蛋白质印迹或SDS-PAGE后进行Bio-Safe Coomassie(Bio-Rad)染色，可见约37 kDa的条带(图3)。在SDS-PAGE以及转印PVDF膜(BIO-RAD)后，洗脱该条带，使用氨基酸测序仪，对于BLase消化的肽片段分析该多肽的部分氨基酸序列，与SEQ ID No.2所含的氨基酸序列一致，由此可确认该蛋白质是本发明的蛋白质。
实施例3
本发明的蛋白质对体内血管生成的抑制效果
按照J.Immunol.170：5704-5711，(2003)和FASAB J.18：300～310，(2004)记载的方法，通过小鼠角膜微囊测定，探讨本发明的蛋白质是否具有与Vasohibin同样的血管生成抑制功能。将80 ng FGF-2蛋白质(成纤维细胞生长因子-2，BD Biosciences)与0.3μg hydron试剂(IFNSciences)混合，再加入5 ng Vasohibin或本发明的蛋白质，移植到BALB/c雄性小鼠的角膜中，7天后，对于在角膜中伸长的生成血管拍摄，通过图象分析软件National Institutes of Health(NIH)image对血管生成进行定量分析。结果可知，由FGF-2诱导的血管生成在本发明蛋白质的存在下显著被抑制，该效果与Vasohibin的血管生成抑制几乎同等(图4)。
实施例4
诱导本发明蛋白质的表达的低分子化合物的筛选方法
向市售的96孔板(例如Costar公司制备的96孔细胞培养板)中，用含有10％胎牛血清的DMEM培养基，以1.5～2.0×104细胞/孔(100μl/孔)铺人前列腺癌细胞株PC-3细胞，静置培养过夜。置换为100ml不含有胎牛血清的DMEM培养基，分别添加1-5μl用10％DMSO溶解的低分子化合物(终浓度1～5mg/ml)，再静置培养20小时。使用不舍有化合物的10％DMSO作为对照。反应后，回收培养上清，通过ELISA测定上清中本发明蛋白质的量，确认是否诱导表达。ELISA是在使本发明蛋白质的抗体为固相的免疫板(例如Nunc制备、Immunomodule)上添加50μl回收的培养上清和50μl测试缓冲液(例如含有0.5％BSA的100mM PBS溶液)，在4℃反应过夜。用清洗液(例如含有0.05％吐温20的生理盐水)清洗三次，然后以1μg/ml的浓度添加100μl识别本发明的蛋白质其它部位的抗体的辣根过氧化物酶(HRP)标记物，在室温下静置3小时。用清洗液清洗三次，然后添加100μl显色剂TMB溶液，在室温下反应30分钟。反应后，添加100μl 0.18N硫酸溶液，中止反应。测定450nm的吸光度，由同时测定的本发明蛋白质的重组体的吸光度计算上清中本发明蛋白质的量。与只加入10％DMSO的对照进行比较，判定加在大量检测出本发明蛋白质的样品中的低分子化合物为血管生成抑制剂的候选化合物。
产业实用性
本发明的蛋白质和基因等可作为血管生成抑制剂使用。该蛋白质等的抗体可作为血管生成诱导剂使用。使用该蛋白质、基因、抗体等，可以筛选血管生成抑制剂或血管生成诱导剂。
序列表自由文本
SEQ ID No.13表示AK022567(SEQ ID No.1)的RT-PCR正向引物。
SEQ ID No.14表示AK022567(SEQ ID No.1)的RT-PCR反向引物。
<110>    国立大学法人东北大学
         盐野义制药株式会社
<120>    新型血管生成抑制因子
<130>    04P00091
<160>    14
<170>    PatentIn version 3.1
<210>    1
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<223>    Primer of Vasohibin-2
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<212>    DNA
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<220>
<223>    primer of Vasohibin-2
<400>    14

Claims (10)

1.血管生成抑制剂，该血管生成抑制剂含有具有选自SEQ IDNo.2、4、6、8和10的氨基酸序列的蛋白质、具有该氨基酸序列中有1或多个氨基酸缺失、置换或附加得到的氨基酸序列且具有血管生成抑制作用的蛋白质、具有血管生成抑制作用的这些蛋白质的部分肽或它们的盐。
2.用于抑制血管生成的表达载体，该表达载体含有多核苷酸或编码具有血管生成抑制作用的蛋白质的片段，其中，所述多核苷酸编码具有选自SEQ ID No.2、4、6、8和10的氨基酸序列的蛋白质、具有该氨基酸序列中有1或多个氨基酸缺失、置换或附加得到的氨基酸序列且具有血管生成抑制作用的蛋白质、或具有血管生成抑制作用的这些蛋白质的部分肽。
3.用于抑制血管生成的表达载体，该表达载体含有多核苷酸或编码具有血管生成抑制作用的蛋白质的片段，其中，所述多核苷酸与编码具有选自SEQ ID No.2、4、6、8和10的氨基酸序列的蛋白质、具有该氨基酸序列中有1或多个氨基酸缺失、置换或附加得到的氨基酸序列的蛋白质、或具有血管生成抑制作用的这些蛋白质的部分肽的多核苷酸在严格条件下杂交，且编码具有血管生成抑制作用的蛋白质。
4.血管生成诱导剂，该血管生成诱导剂含有中和抗体，该中和抗体是具有选自SEQ ID No.2、4、6、8和10的氨基酸序列的蛋白质、具有该氨基酸序列中有1或多个氨基酸缺失、置换或附加得到的氨基酸序列且具有血管生成抑制作用的蛋白质、具有血管生成抑制作用的这些蛋白质的部分肽或它们的盐的中和抗体。
5.血管生成抑制剂的筛选方法，其特征在于：选择促进具有选自SEQ ID No.2、4、6、8和10的氨基酸序列的蛋白质、具有该氨基酸序列中有1或多个氨基酸缺失、置换或附加得到的氨基酸序列且具有血管生成抑制作用的蛋白质、具有血管生成抑制作用的这些蛋白质的部分肽或它们的盐的血管生成抑制活性的化合物或其盐。
6.血管生成抑制剂的筛选方法，其特征在于：选择促进具有选自SEQ ID No.2、4、6、8和10的氨基酸序列的蛋白质、具有该氨基酸序列中有1或多个氨基酸缺失、置换或附加得到的氨基酸序列且具有血管生成抑制作用的蛋白质、或具有血管生成抑制作用的这些蛋白质的部分肽的基因的表达的化合物或其盐。
7.血管生成诱导剂的筛选方法，其特征在于：选择抑制具有SEQID No.2、4、6、8和10的氨基酸序列的蛋白质、具有该氨基酸序列中有1或多个氨基酸缺失、置换或附加得到的氨基酸序列且具有血管生成抑制作用的蛋白质、具有血管生成抑制作用的这些蛋白质的部分肽、或它们的盐的血管生成抑制活性的化合物或其盐。
8.血管生成诱导剂的筛选方法，其特征在于：选择抑制具有选自SEQ ID No.2、4、6、8和10的氨基酸序列的蛋白质、具有该氨基酸序列中有1或多个氨基酸缺失、置换或附加得到的氨基酸序列且具有血管生成抑制作用的蛋白质、或具有血管生成抑制作用的这些蛋白质的部分肽的基因的表达的化合物或其盐。
9.在权利要求5～8中任一项的方法中使用的筛选用试剂盒，该试剂盒含有具有选自SEQ ID No.2、4、6、8和10的氨基酸序列的蛋白质、具有该氨基酸序列中有1或多个氨基酸缺失、置换或附加得到的氨基酸序列且具有血管生成抑制作用的蛋白质、具有血管生成抑制作用的这些蛋白质的部分肽或它们的盐。
10.在权利要求5～8中任一项的方法中使用的筛选用试剂盒，该试剂盒含有多核苷酸或编码具有血管生成抑制作用的蛋白质的片段，其中，所述多核苷酸编码具有选自SEQ ID No.2、4、6、8和10的氨基酸序列的蛋白质、具有该氨基酸序列中有1或多个氨基酸缺失、置换或附加得到的氨基酸序列且具有血管生成抑制作用的蛋白质、或具有血管生成抑制作用的这些蛋白质的部分肽。
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