JP6300373B2 - 抗バソヒビン２抗体 - Google Patents

抗バソヒビン２抗体 Download PDF

Info

Publication number
JP6300373B2
JP6300373B2 JP2014513846A JP2014513846A JP6300373B2 JP 6300373 B2 JP6300373 B2 JP 6300373B2 JP 2014513846 A JP2014513846 A JP 2014513846A JP 2014513846 A JP2014513846 A JP 2014513846A JP 6300373 B2 JP6300373 B2 JP 6300373B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
antibody
vasohibin
angiogenesis
antigen
administration
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2014513846A
Other languages
English (en)
Other versions
JPWO2014087810A1 (ja
Inventor
佐藤　靖史
靖史 佐藤
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tohoku University NUC
Original Assignee
Tohoku University NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tohoku University NUC filed Critical Tohoku University NUC
Publication of JPWO2014087810A1 publication Critical patent/JPWO2014087810A1/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP6300373B2 publication Critical patent/JP6300373B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/16—Animal cells
    • C12N5/163—Animal cells one of the fusion partners being a B or a T lymphocyte
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/70—Mechanisms involved in disease identification
    • G01N2800/7014—(Neo)vascularisation - Angiogenesis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Rehabilitation Therapy (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)

Description

本発明は、抗バソヒビン２抗体に関する。より詳しくは、バソヒビン２に特異的なモノクローナル抗体又はその断片、該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、該抗体の遺伝子組換え抗体又はその断片、前記抗体又はその断片を含有する血管新生抑制剤、治療用医薬組成物、及びがんの治療用医薬組成物、ならびに、前記抗体又はその断片を用いた抗血管新生薬の薬効評価方法及び該方法を実施するためのキット、に関する。
血管新生とは、動物の組織又は器官において既存の細静脈、毛細血管からの血管内皮細胞の遊走、増殖及び管腔形成により新しい血管脈が形成される現象をいう。かかる現象は、動物の形態形成期や成長期のみならず、組織等の損傷の治癒、炎症の修復過程や月経周期に伴って生じるものであり、血管新生の促進因子と抑制因子の双方によりコントロールされ、該促進因子と抑制因子のバランスを保つことが血管の恒常性を保つのに重要である。
しかしながら、腫瘍組織においては、血管新生促進因子が過剰発現することにより血管新生が亢進し、その結果、腫瘍組織のさらなる増大に繋がる。従って、抗がん治療としては、血管新生抑制因子や血管新生促進因子の阻害剤を投与する方法等が考えられる。
バソヒビンは、本発明者らが見出したポリペプチドであり、バソヒビン１及びバソヒビン２がホモログ体として属する。これらのバソヒビンは、腫瘍細胞や間質細胞、マクロファージなどから分泌される血管新生促進因子(ＶＥＧＦ、ＦＧＦ−２等)の刺激により血管内皮細胞に発現し、内皮細胞自身にオートクライン的に作用して、血管新生を抑制する作用を有することが知られている（特許文献１、２参照）。
一方で、本発明者らは、特許文献２に開示のバソヒビン２、即ち、ＡＫ０２２５６７タンパク質、ならびに該タンパク質のスプライシングバリアントである、ＢＣ０５１８５６タンパク質、ＢＣ０５３８３６タンパク質、ＢＣ０２８１９４タンパク質、及びＡＹ８３４２０２タンパク質には、がんや脳血管障害等の病態と同じような低酸素状態において、血管新生を促進する作用があることも見出し、報告している（特許文献３参照）。
ＷＯ２００２／０９０５４６号パンフレット ＷＯ２００６／０７３０５２号パンフレット ＷＯ２００９／０９６４２５号パンフレット
本発明の課題は、バソヒビン２タンパク質に特異的な抗体又はその断片、該抗体を産生するハイブリドーマ、該抗体の遺伝子組換え抗体又はその断片、前記抗体又はその断片を含有する血管新生抑制剤及び治療用医薬組成物、ならびに、前記抗体又はその断片を用いた抗血管新生薬の薬効評価方法及び該方法を実施するためのキットを提供することにある。
本発明者らは、鋭意検討した結果、バソヒビン２タンパク質の活性中心を特定するに至った。そしてバソヒビン２タンパク質のこの活性中心を含む特定エピトープに対するモノクローナル抗体を調製したところ、該モノクローナル抗体がバソヒビン２タンパク質と特異的に結合して、バソヒビン２タンパク質の有する血管新生作用を抑制することを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は下記〔１〕〜〔８〕に関する。
〔１〕 配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２６９〜２８８を認識する、抗バソヒビン２抗体又はその抗原結合断片であって、該抗バソヒビン２抗体が、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−１４７４で示されるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体である、抗体又はその抗原結合断片。
〔２〕 配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２６９〜２８８を認識する抗バソヒビン２モノクローナル抗体を産生する、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−１４７４で示されるハイブリドーマ。
〔３〕 前記〔１〕記載の抗体又はその抗原結合断片を含有してなる、血管新生抑制剤。
〔４〕 前記〔１〕記載の抗体又はその抗原結合断片を含有してなる、医薬組成物。
〔５〕 前記〔３〕記載の血管新生抑制剤を含有してなる、血管新生の抑制を要する疾患の治療用医薬組成物。
〔６〕 工程(Ａ)：抗血管新生薬の候補化合物の投与後における被検個体由来の生体試料と、前記〔１〕記載の抗体又はその抗原結合断片とを接触させて複合体を形成させて、該複合体の存在量を測定する工程
工程(Ｂ)：前記工程(Ａ)で測定された存在量を、投与前における存在量と比較する工程、ならびに
工程(Ｃ)：前記工程(Ｂ)で行った比較において、該候補化合物の投与前に比べて投与後の方が該複合体の存在量が少ないと認められる場合に該候補化合物が抗血管新生薬として薬効を示している可能性が高いと判定する工程
を含む、抗血管新生薬の薬効評価方法。
〔７〕 前記〔１〕記載の抗体又はその抗原結合断片を含有してなる、抗血管新生薬の薬効評価用キット。
〔８〕 血管新生の抑制を要する疾患の治療または予防するための、前記〔１〕記載の抗体又はその抗原結合断片。
本発明の抗バソヒビン２抗体又はその断片は、バソヒビン２タンパク質と良好な特異性で結合し、その血管新生促進作用を阻害できるという優れた効果を奏する。
図１は、バソヒビン２の内皮細胞の遊走能に対する効果を示す図である。 図２は、バソヒビン２の内皮細胞のチューブ形成に対する効果を示す図である。 図３は、モノクローナル抗体の内皮細胞の遊走能に対する効果を示す図である。 図４は、モノクローナル抗体の内皮細胞のチューブ形成に対する効果を示す図である。 図５は、モノクローナル抗体投与後のマウス腫瘍モデルにおける腫瘍形態を示す図である。左図がマウスＩｇＧ投与群、右図が抗ＶＡＳＨ２抗体（クローン１７６０）投与群である。 図６は、モノクローナル抗体投与後のマウス腫瘍モデルにおける腫瘍体積変化を示す図である。 図７は、モノクローナル抗体投与後のマウス腫瘍モデルにおける腫瘍の血管を示す図である。左図がマウスＩｇＧ投与群、右図が抗ＶＡＳＨ２抗体（クローン１７６０）投与群である。 図８は、モノクローナル抗体投与後のマウス腫瘍モデルにおける腫瘍の血管断面積の変化を定量的に示す図である。 図９は、マウスＩｇＧ、ベバシズマブ、又はモノクローナル抗体を投与後のマウス腫瘍体積を示す図である。 図１０は、マウスＩｇＧ、ベバシズマブ、又はモノクローナル抗体を投与後のマウス腫瘍モデルにおける腫瘍体積変化を示す図である。 図１１は、モノクローナル抗体投与後のマウス腫瘍モデルにおける腫瘍の血管を示す図である。(a)がマウスＩｇＧ投与群、(b)が抗ＶＡＳＨ２抗体（クローン１７６０）投与群、(c)がベバシズマブ投与群である。 図１２は、マウスＩｇＧ、ベバシズマブ、又はモノクローナル抗体を投与後のマウス腫瘍モデルにおける腫瘍の血管断面積の比率を定量的に示す図である。
本発明の抗バソヒビン２抗体(以下、本発明の抗体ともいう)は、特定のアミノ酸配列を認識することによって、バソヒビン２タンパク質に特異的に結合するという特徴を有する。
バソヒビン(Vasohibin)としては、バソヒビン１(Vasohibin-１)及びバソヒビン２(Vasohibin-２)が挙げられるが、本発明におけるバソヒビンとしては、バソヒビン２のことを指す。なお、特許文献１、２等に開示されているようにバソヒビン１とバソヒビン２は、異なる染色体上に存在する別の遺伝子であるが、それらの遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は５８％の相同性を有している。バソヒビン２としては、配列番号１で表される塩基配列からなるＡＹ８３４２０２ポリヌクレオチドによりコードされるバソヒビン２タンパク質、及び配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるＡＹ８３４２０２ポリペプチドのことをいう。
本発明におけるエピトープ（抗原における決定基）としては、バソヒビン２タンパク質のアミノ酸番号２６９番目（Leu）から２８８番目（Arg）までの部分ペプチド、又はその一部を用いることができる。該部分ペプチドにおいて、例えば、２８１番目（Lys）から２８５番目（Lys）までの連続したアミノ酸５個をアラニン（Ala）４個に置換したバソヒビン２変異体を作製して細胞に発現させた場合、血管新生の促進が認められなかった。従って、前記アミノ酸番号２８１〜２８５のアミノ酸を含む部分ペプチドは、血管新生を促進する作用の発現に関与すると考えられる。このため、バソヒビン２タンパク質の血管新生促進作用の中和抗体を作製するには、バソヒビン２タンパク質のアミノ酸番号２８１〜２８５のアミノ酸を含む部分ペプチドをエピトープとすることが好ましい。ここで、抗体の作製に使用する抗原は、本発明の抗体が調製できる範囲で制限されず、前述の本発明におけるエピトープのいずれかを含むペプチドであればよい。すなわち、抗原は、本発明におけるエピトープよりも長いバソヒビン２タンパク質の部分ペプチドであっても、あるいは、本発明におけるエピトープのカルボキシル末端又はアミノ末端にバソヒビン２タンパク質と関連しないペプチドが結合したペプチドであってもよく、KLH、OVA、BSAのようなキャリアタンパクやIgGのFc領域と結合していてもよい。
なお、本明細書において「血管新生」とは、既存の血管から血管内皮細胞が出芽し、組織に進入する形で毛細血管が形成される現象を意味する。形成過程は１）プロテアーゼによる血管基底膜の消化、２）血管内皮細胞の遊走・増殖、３）管腔形成の順に進行する。
本発明の抗体としては、配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２６９〜２８８を認識するものであればよい。即ち、アミノ酸番号２６９〜２８８の部分ペプチドの全長に対し結合性を有するものであっても、その一部のアミノ酸に対し結合性を有するものであってもよいが、バソヒビン２タンパク質の血管新生促進作用を中和するための中和抗体としては、アミノ酸番号２８１〜２８５のアミノ酸を含むエピトープに結合性を有するものが好ましい。なお、本発明の抗体は、配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２６９〜２８８を認識する範囲で、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよいが、好ましい態様としてはモノクローナル抗体が挙げられる。本発明の抗体は、本明細書で説明する適切な抗原を使用し、当業者に周知の方法で取得することができる。例えば、ハイブリドーマにより産生されるバソヒビン２モノクローナル抗体又はその断片が挙げられる。
ハイブリドーマを用いたモノクローナル抗体は、例えば以下に詳述する方法で調製できる。
先ず、抗原を調製する。具体的には、バソヒビン２タンパク質の部分ペプチドLeu269-Arg288（以降、バソヒビン２部分ペプチドという）について、アミノ末端又はカルボキシル末端にシステイン残基を付加したペプチドを、公知の方法に従って合成する。得られたペプチドについて、マレイミド化したKLH〔Keyhole Limpet Hemocyanin、Imject(登録商標)Maleimide Activated mcKLH、ピアス社製〕を用いて、ペプチドのSH基を介してハプテン抗原を調製する。
またさらに、家兎IgGのFc領域とバソヒビン２部分ペプチドとの融合タンパク(Fc融合バソヒビン２タンパク質)も、抗原として用いることができる。この融合タンパクは公知の方法に従って調製することができるが、例えば、Fc融合バソヒビン２タンパク質は、バソヒビン２部分ペプチドのアミノ末端又はカルボキシル末端にFcを付加したポリヌクレオチド配列を導入したプラスミドベクターを、例えば、Freestyle 293-F Cells(Invitrogen)に導入して一過的に発現させた後、プロテインＡカラムを用いて精製することにより調製することができる。なお、Fc融合バソヒビン２タンパク質の発現及び精製は、特に限定はなく公知の方法に従って行うことができる。
次に、上記により得られた抗原を用いて哺乳動物を免疫する。哺乳動物としては、特に制限はないが、一般には、マウス、ラット、ウシ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、モルモット等を用いることができる。なかでも、マウス及びラットが好ましく、マウスがより好ましく、かかるマウスとしては、A/J系、BALB/C系、DBA/2系、C57BL/6系マウスが例示される。また、該哺乳動物の齢は、用いる動物種により異なり特に限定されないが、マウス又はラットの場合、通常約4〜12週齢、好ましくは約5〜10週齢である。なお、これらの哺乳動物は、本発明のモノクローナル抗体の製造のために、細胞融合される形質細胞との適合性を考慮して選択することができる。
抗原は、免疫応答を増強させるためにアジュバントと混合して免疫原として使用される。アジュバントとしては、特に限定はなく公知のものを使用することができる。また、該アジュバントと抗原との混合は、用いるアジュバントについて当該分野で公知の方法に従うことができる。
哺乳動物の免疫は、当該分野で公知の方法に従って行われる。例えば、免疫原を哺乳動物の皮下、皮内、静脈又は腹腔内に注射投与することによって行われる。また、免疫原の投与は、最初の免疫後に何回か繰り返して行われ、その投与間隔は適宜調整され得る。なお、免疫応答は、免疫される哺乳動物の種類及び系統によって異なるので、免疫スケジュール及び免疫原の投与量は、使用される動物に合わせて適切に設定され得る。
かくして、免疫された哺乳動物体内において所望の抗体産生細胞を調製することができる。かかる抗体産生細胞としては、免疫原の最終投与の3〜5日後に摘出した脾細胞が好ましい。なお、免疫された哺乳動物の脾臓を肥大させるために、ブースト(免疫原の追加注射)を行ってもよい。ブーストで投与される免疫原の量は、最初に投与される免疫原の量の約4〜5倍とするのが望ましいが、これを目安として適宜増減することができる。
得られた抗体産生細胞は、骨髄腫由来の細胞(ミエローマ細胞)と細胞融合させて、ハイブリドーマを調製する。
ハイブリドーマの増殖能力は細胞融合に用いられるミエローマ細胞の種類に依存するので、ミエローマ細胞としては増殖能力の優れた細胞が好ましい。また、ミエローマ細胞は、融合させる抗体産生細胞の由来する哺乳動物と適合性があることが好ましい。かかる例としては、マウスミエローマP3U1、X63-Ag8.653等の骨髄腫細胞が例示される。
細胞融合の方法は、当該分野で公知の方法を用いることができ、例えばポリエチレングリコール(PEG)を用いる方法、センダイウイルスを用いる方法、電気融合装置を用いる方法等が例示される。
得られたハイブリドーマは、公知の方法に従って選択培地で培養することにより分離することができる。なお、選択されたハイブリドーマが所望の抗体を産生しているかどうかを確認するために、培養上清を採取して抗体価アッセイを公知の方法、例えば、DELFIA法に基づいて行うことができる。
かくして、所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが得られる。該ハイブリドーマは、通常の培地で継代培養することができ、また液体窒素中で半永久的に保存することができる。
ハイブリドーマから所望のモノクローナル抗体を取得するにあたっては、インビボ及びインビトロにおける培養法により大量調製することができる。インビトロ培養法は、ハイブリドーマを適当な血清培地若しくは無血清培地中で培養することにより実施でき、所望のモノクローナル抗体は培地中に産生される。この培養法によれば、比較的高純度の所望抗体を培養上清として得ることができる。また、インビボ培養法は、ハイブリドーマと適合性のある哺乳類動物、例えばマウスなどの腹腔内に、ハイブリドーマを注射接種して増殖することにより実施でき、所望抗体はマウス腹水として大量に回収することができる。
なお、得られた培養上清及びマウスなどの腹水は、そのまま粗製抗体液として用いることができる。また、これらは常法に従って、例えば、DEAE陰イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、硫安分画法、PEG分画法、エタノール分画法などを適宜組合せることにより精製して、精製抗体とすることができる。
かくして、配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２６９〜２８８を認識するモノクローナル抗体を得ることができる。
本発明では、前記方法により特定の抗体を産生するハイブリドーマを調製して用いてもよいが、例えば、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２丁目５番地８）に下記受託番号のもとで寄託された細胞を好適に使用することもできる。
ＮＩＴＥ ＢＰ−１４７４ (表示１７６０、受託日２０１２年１１月２９日)
前記抗体の断片としては、前記エピトープ、即ち、バソヒビン２タンパク質の２６９番目（Leu）から２８８番目（Arg）までの部分ペプチド、又はその一部に対する抗原結合断片を有するものであればよい。ここで、バソヒビン２タンパク質の血管新生促進作用を中和するための断片としては、アミノ酸配列２８１〜２８５を含むエピトープに対する抗原結合断片を有するものが好ましい。その形態は特に限定されず、例えば、Fab、F(ab')2、Fab'、scFv、diabody、dsFv、及びCDRを含むペプチドなどが挙げられる。これらの抗体断片は、公知の技術に従って調製することができ、例えばパパイン（Fab断片の製造）やペプシン（F(ab')2断片の製造）などの酵素によるタンパク質分解酵素切断によって調製され得る。
また、本発明の一態様として、本発明の抗体の遺伝子組換え抗バソヒビン２抗体又はその断片も提供される。
遺伝子組換え抗体としては、配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２６９〜２８８を認識するのであれば特に限定はなく、例えば、アミノ酸配列２６９〜２８８の部分ペプチドの全長に対し結合性を有するものであっても、その一部のペプチドに対し結合性を有するものであってもよい。なお、バソヒビン２タンパク質の血管新生促進作用を中和するための中和抗体としては、アミノ酸配列２８１〜２８５を含むエピトープに結合性を有するものが好ましい。遺伝子組換え抗体としては、例えば、抗体の投与対象個体において抗原性を低減できるように、抗体の投与対象がヒトの場合には、ヒト化抗体、ヒト抗体などが例示される。なお、本発明における遺伝子組換え抗体は、前記ハイブリドーマにより得られたモノクローナル抗体又はその断片を、公知の遺伝子組換え技術を用いて改変して取得することができる。
ヒト化抗体としては、ヒト型キメラ抗体及びヒト型CDR（Complementarity Determining Region、相補性決定領域）移植抗体が挙げられる。ヒト型キメラ抗体は、例えば、前記モノクローナル抗体の重鎖可変領域（以下、VHと記す）と軽鎖可変領域（以下、VLと記す）、ヒト抗体の重鎖定常領域（以下、CHと記す）と軽鎖定常領域（以下、CLと記す）をコードする遺伝子を発現させることで調製することができる。ヒト型CDR移植抗体は、例えば、本発明の抗体のVH及びVLに対するCDRのアミノ酸配列をヒト抗体のVH及びVLの適切な位置に移植することで調製することができる。
ヒト抗体としては、ヒト抗体ファージライブラリーやヒト抗体産生トランスジェニック動物から得られる抗体が挙げられる。なお、ヒト抗体ファージライブラリー及びヒト抗体産生トランスジェニック動物は公知の方法に従って調製することができる。
また、遺伝子組換え抗体の断片としては、前記遺伝子組換え抗体の断片であればよく、本発明の抗体の断片と同様に、配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２６９〜２８８からなる部分ペプチド、又はその一部に対する抗原結合断片を有するのであれば、その形態及び調製方法に特に限定はない。ここで、バソヒビン２タンパク質の血管新生促進作用を中和するための断片としては、アミノ酸配列２８１〜２８５を含むエピトープに対する抗原結合断片を有するものが好ましい。
本発明の抗体又は断片は、配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２６９〜２８８を認識する範囲で、マンノース、フコース、ガラクトース、Ｎアセチルグルコサミン、Ｎアセチルノイラミン酸等の糖鎖で修飾されていてもよい。
かくして、本発明の抗体又はその断片、及び、該抗体の遺伝子組換え抗体又はその断片が得られる。これらの抗体又はその断片は、ＡＹ８３４２０２ポリペプチドのアミノ酸配列のアミノ酸番号２６９〜２８８を特異的に認識することから、バソヒビン２タンパク質と良好な結合性を示す。なお、本明細書において、これらの抗体又はその断片をまとめて、本発明の抗体又はその断片と記載することもある。
本発明は、本発明の抗体又はその断片を含有する医薬組成物を提供する。本医薬組成物は、以下に説明するような血管新生抑制剤をはじめとした薬剤や治療用医薬組成物を一つの態様として含む。
本発明はまた、本発明の抗体又はその断片を含有する血管新生抑制剤を提供する。
本発明の血管新生抑制剤は、実質的に、本発明の抗体又はその断片により構成され、循環血中を介して送達された部位において、バソヒビン２タンパク質と結合することにより、バソヒビン２タンパク質が有する血管新生促進作用の発現を抑制するという効果を奏する。
本発明の血管新生抑制剤は、循環血中に移行するのであれば、その投与形態は限定されない。
また、本発明は、本発明の血管新生抑制剤を含有する、血管新生の抑制を要する疾患の治療用医薬組成物、即ち、治療剤を提供する。
血管新生の抑制を要する疾患としては、血管新生を抑制することにより治療効果がみられる疾患であれば特に限定はないが、例えば、血管性疾患、炎症性疾患、眼内血管新生性疾患、生殖器官系疾患、中枢神経系疾患、がん等が挙げられる。具体的には、動脈硬化、高血圧、狭心症、閉塞性動脈硬化症、心筋梗塞、脳梗塞、糖尿病性血管障害、血管奇形、肝炎、肺炎、糸球体腎炎、甲状腺炎、骨髄炎、滑膜炎、骨破壊、軟骨破壊、リュウマチ、喘息、サルコイドーシス、クロウー深瀬症候群、パンヌス、アレルギー性浮腫、潰瘍、腹水、腹膜硬化、組織癒着、糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症、加齢黄斑変性症、子宮機能不全、胎盤機能不全、卵巣機能過亢進、濾胞性嚢胞、網膜症、脳卒中、血管性痴呆、アルツハイマー病、固形癌（例えば、卵巣癌、大腸癌）、血管腫、血管内皮腫、肉腫、カポジ肉腫及び造血器腫瘍等の悪性新生物が例示される。
本発明の治療用医薬組成物としては、本発明の血管新生抑制剤を公知の医薬用担体と組み合わせて製剤化したものが挙げられる。また、本発明の治療用医薬組成物としては、本発明の抗体又はその断片以外に、本発明の抗体又はその断片と同じ用途に使用可能な他の成分、例えば公知の血管新生抑制作用を有する成分と配合することもできる。
本発明の治療用医薬組成物の製造は、本発明の抗体又はその断片が循環血中を介して血管新生の抑制を要する部位に到達できるような剤型に製造できるのであれば、通常、本発明の血管新生抑制剤を薬学的に許容できる液状又は固体状の担体と配合することにより行われ、所望により溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等を加えて、錠剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、カプセル剤等の固形剤や、通常液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤とすることができる。また、使用前に適当な担体の添加によって液状となし得る乾燥品や、その他、外用剤とすることもできる。なお、医薬用担体は、治療剤の投与形態及び製剤形態に応じて選択することができ、特に限定はない。本明細書において、血管新生の抑制を要する部位とは、上記血管新生の抑制を要する疾患の発症部位を意味する。
上記のような各種製剤形態での治療用医薬組成物は、それぞれ公知の医薬用担体などを利用して、適宜、常法により製造することができる。また、かかる治療用医薬組成物における本発明の抗体又はその断片の含有量は、その投与形態、投与方法などを考慮し、本発明の所望の効果の発現が得られ得るような量であればよく、特に限定されるものではない。本発明の治療用医薬組成物中の本発明の抗体又はその断片の含有量としては通常１〜１００重量％程度である。なお、ここでいう本発明の抗体又はその断片の含有量とは、本発明の抗体及びその断片を複数種類含有する場合には合計含有量のことを意味する。
本発明の治療用医薬組成物は、製剤形態に応じた適当な投与方法で投与される。投与方法も本発明の抗体又はその断片を循環血中を介して送達できるのであれば特に限定はなく、例えば内用、外用及び注射により投与することができる。本発明の治療用医薬組成物を注射により投与する場合は、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、皮内などに投与し得、外用により投与する場合は、例えば、座剤等の外用剤として、その適する投与方法により投与すればよい。
本発明の治療用医薬組成物の投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的及び当該医薬組成物の投与対象である患者又は患獣の年齢、体重、症状によって適宜設定され一定ではない。また、投与は、所望の投与量範囲内において、１日内において単回で、又は数回に分けて行ってもよい。投与期間も任意である。
本発明はまた、被験個体に、有効量の本発明の抗体又はその断片を投与することを含む、血管新生の抑制を要する疾患の治療方法を提供する。
本明細書中において被験個体とは、好ましくは血管新生の抑制を必要とするヒトであるが、バソヒビン２タンパク質により血管新生が促進される哺乳動物であればよく、ウシ、ウマ、ヤギ等の家畜動物、イヌ、ネコ、ウサギ等のペット動物、又は、マウス、ラット、モルモット、サル等の実験動物であってもよい。
また、本明細書中において有効量とは、本発明の抗体又はその断片を上記被験個体に投与した場合に、投与していない被験個体と比較して、血管新生が抑制される抗体又はその断片の量である。具体的な有効量としては、投与形態、投与方法、使用目的及び被験個体の年齢、体重、症状等によって適宜設定され一定ではない。
本発明の血管新生の抑制を要する疾患の治療方法においては、有効量の本発明の抗体又はその断片をそのまま上記被験個体に投与してもよく、また、上記のような治療用医薬組成物等の医薬として投与してもよい。また、投与方法にも限定はなく、例えば、上記の治療用医薬組成物と同様に、経口投与や注射等により投与すればよい。
本発明の治療方法によれば、前記の本発明の治療用医薬組成物の対象となる疾患を治療することができ、例えば、血管新生によって進展する疾患の治療を行う効果が発揮され得る。
本発明は、本発明の抗体又はその断片を含有する、診断薬を提供する。本診断薬を用い、前記本発明の治療用医薬組成物の対象となる疾患を診断することができる。
本発明者らは、バソヒビン２タンパク質ががん細胞で発現することを報告している（Xue et al. Oncogene. 2012 [Epub ahead of print], Takahashi et al. Mol. Cancer Res. 10 (2012), 1135-1146.参照）。従って、本発明の診断薬を用いることで、被験個体から採取した生体試料、例えば、血液、血漿、組織等においてバソヒビン２タンパク質の検出を行うことができ、検出されたバソヒビン２タンパク質の有無又はバソヒビン２タンパク質の量に基づいて、被験個体ががんをはじめとするバソヒビン２タンパク質２による血管新生によって進展する疾患に罹患しているか否かを診断することができる。例えば、被験個体から採取した生体試料において、本発明に係る診断薬を用いて検出したバソヒビン２タンパク質量と、健常対照個体から採取した生体試料において本発明に係る診断薬を用いて検出したバソヒビン２タンパク質量とを比較し、健常対照個体よりも、被験個体において有意にバソヒビン２タンパク質量が多い時に、被験個体が血管新生によって進展する疾患に罹患していると診断することができる。なお、本診断薬を使用した診断方法において、バソヒビン２タンパク質の検出方法、定量方法は当業者に周知の方法を用いることができる。
また、本発明の一態様として、抗血管新生薬の薬効評価方法が提供される。
本発明者らは、バソヒビン２タンパク質ががん細胞から分泌され、バソヒビン２をノックダウンすることで腫瘍血管新生と腫瘍増殖が抑制されることを報告している（Xue et al. Oncogene. 2012 [Epub ahead of print], Takahashi et al. Mol. Cancer Res. 10 (2012), 1135-1146.参照）。従って、抗血管新生薬が投与された個体では、腫瘍組織における血管新生が抑制されて、腫瘍組織の増殖が抑制されるためにバソヒビン２の分泌量が減少し、血中バソヒビン２量が変化する可能性があると考えられる。各個体におけるがん細胞に対する抗血管新生薬の反応性は個体によって異なることが予想されるが、その反応性はまさにそれらの薬剤の持つ抗血管新生効果に反映される。従って、本発明の薬効評価方法において、これらの薬剤の投与の前後での血中バソヒビン２タンパク質の変動量を測定することにより、各個体における薬剤への反応性を予測したり、実際に投与した後の薬効を評価したりすることが可能になると考えられる。
上記薬効評価方法は、具体的には、
工程(Ａ)：抗血管新生薬の候補化合物の投与後における被験個体由来の生体試料と、本発明の抗体又はその断片とを接触させて複合体を形成させて、該複合体の存在量を測定する工程
工程(Ｂ)：前記工程(Ａ)で測定された存在量を、投与前における存在量と比較する工程、ならびに
工程(Ｃ)：前記工程(Ｂ)で行った比較において、該候補化合物の投与前に比べて投与後の方が該複合体の存在量が少ないと認められる場合に該候補化合物が抗血管新生薬として薬効を示している可能性が高いと判定する工程
を含む。
上記薬効評価方法の工程(Ａ)における複合体の存在量の測定は、本発明の抗体又はその断片を用いる方法であれば、当業者においては周知の方法を用いることができるが、サンドイッチELISA法が好ましい。なお、ここでいう複合体とは、本発明の抗体又はその断片とバソヒビン２タンパク質との複合体を意味する。また、被検個体としては、前記と同様のものが例示されるが、特に、新規抗血管新生薬候補物質の薬効を評価し、有効な物質を選別する場合は、ヒト以外の実験動物を被験個体とすることが好ましい。一方、本薬効評価方法によって、抗血管新生薬がその個体において有効か否かを判断する場合には、ヒトを被験個体とすることが好ましい。
工程(Ｂ)において、上記により得られた存在量について、候補化合物の投与前における該存在量に基づいて統計学的な解析を行って比較を行う。解析方法としては、特に限定はなく、公知の方法を用いることができる。また、その後の工程(Ｃ)における判定は、例えば、該候補化合物の投与後の試料における複合体存在量が投与前の試料における複合体存在量と比べて少ない場合に、該候補化合物が抗血管新生薬として血管新生を抑える効果を示している可能性が高いと判断される。
本発明の別の態様では、抗血管新生薬の薬効評価を行うためのキットが提供される。
本発明のキットには、本発明の抗体又はその断片を含有するものが挙げられ、サンプル中のバソヒビン２タンパク質を検出する際に本発明の抗体又はその断片を用いる検出方法であれば、前記キットを用いることができる。本発明の抗体又はその断片は生体内バソヒビン２タンパク質を良好な特異性で認識することが可能であることから、該キットの使用は抗血管新生薬の薬効評価に大きな貢献をもたらすことができる。
以下、実施例及び比較例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実施例に制限されるものではない。
参考例１〔バソヒビン２の内皮細胞の遊走能に対する効果〕
ＭＬＴＣ−１細胞に、Ｍｏｃｋ遺伝子、野生型バソヒビン２（野生型ＶＡＳＨ２）としてＡＹ８３４２０２ポリペプチドをコードする遺伝子、変異型バソヒビン２（変異型ＶＡＳＨ２）としてＡＹ８３４２０２ポリペプチドのアミノ酸番号２８１〜２８５のアミノ酸５個をアラニン４個に置換したポリペプチドをコードする遺伝子をそれぞれ導入し、得られた細胞（ＭＬＴＣ−１／Ｍｏｃｋ、ＭＬＴＣ−１／野生型ＶＡＳＨ２、ＭＬＴＣ−１／変異型ＶＡＳＨ２）を２４穴プレートに１×１０５個／ウェルずつ播種し、０．５％血清を含む培地で２４時間培養した。その後、低血清培地で１７時間培養した臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）５×１０４個をポアサイズ８μｍのインサートに添加し、３７℃で４時間インキュベートした後、メンブレンの下面に移動したＨＵＶＥＣをギムザ染色で染色した。下面に移動したＨＵＶＥＣを光学顕微鏡下に２００倍でランダムに５視野カウントしその平均値および標準偏差を算出した。結果を図１に示す。なお、内皮細胞の遊走能検査は、in vitroでの代表的な血管新生のアッセイ法の１つである。
ＭＬＴＣ−１／野生型ＶＡＳＨ２の培養上清は、Ｍｏｃｋと比較して有意にＨＵＶＥＣの遊走を促進した（ｐ＜０．０１）が、ＭＬＴＣ−１／変異型ＶＡＳＨ２の培養上清ではＭｏｃｋと比較して遊走促進効果が観察されなかった。
参考例２〔バソヒビン２の内皮細胞のネットワーク形成に対する効果〕
２４穴プレートの各ウェルに、５００μＬの成長因子非添加Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加してゲル化させ、その上に低血清培地で１７時間培養したＨＵＶＥＣ ７．５×１０４個（５００μＬに懸濁）を播種し、参考例１で得られたＭＬＴＣ−１／Ｍｏｃｋ、ＭＬＴＣ−１／野生型ＶＡＳＨ２、ＭＬＴＣ−１／変異型ＶＡＳＨ２の培養上清５００μＬをそれぞれ添加して３７℃で５時間インキュベートした。形成されたネットワークの分岐点を位相差顕微鏡下に４０倍でランダムに５視野カウントしその平均値および標準偏差を算出した。ＰＢＳ添加群を陰性コントロール、ＶＥＧＦ ２０ｎｇ／ｍＬ添加群を陽性コントロールとした。結果を図２に示す。なお、内皮細胞のネットワーク形成能検査は、in vitroでの代表的な血管新生のアッセイ法の１つである。
ＭＬＴＣ−１／野生型ＶＡＳＨ２の培養上清を添加するとＨＵＶＥＣによるネットワーク形成はＭｏｃｋと比較して有意に促進されたが（ｐ＜０．０１）、ＭＬＴＣ−１／変異型ＶＡＳＨ２の培養上清を添加するとネットワーク形成促進効果が観察されなかった。
これらより、ＡＹ８３４２０２ポリペプチドのアミノ酸番号２８１〜２８５のアミノ酸は、ＨＵＶＥＣの遊走を促進する活性に関連することが明らかとなった。
調製例１〔モノクローナル抗体の調製〕
(抗原の調製)
バソヒビン２タンパク質として、ＡＹ８３４２０２ポリペプチドのアミノ酸番号２８１〜２８５のアミノ末端あるいはカルボキシル末端にシステイン残基を付加したペプチドをシグマアルドリッチ社にて合成し、それぞれをクローン７１、１６９４、１７６０、２３５６とした。得られた各ペプチドについて、マレイミド化したKLH〔Keyhole Limpet Hemocyanin、Imject(登録商標)Maleimide Activated mcKLH、ピアス社製〕を用いて、ペプチドのSH基を介してハプテン抗原を調製した。なお、ＡＹ８３４２０２ポリペプチドは、特許文献３に記載の方法に従って作製した。
(モノクローナル抗体の調製)
バソヒビン２のハプテン抗原を、初回免疫には完全アジュバントと、２回目以降は不完全アジュバントと等量混和することにより、免疫原としての乳剤を調製した。
モノクローナル抗体は以下のようにして作成した。５週齢の雌Ｂａｌｂ／c系マウスに、投与１回につき、一匹当り５０μｇのハプテン抗原をＦＣＡ等のアジュバントと混合し、腹腔内に投与した。２週間以上の間隔をおいて免疫を繰り返し、抗原ペプチドに対して抗体価の上昇したマウスに対して最終のブースターとして５０μｇのハプテン抗原を尾静脈より投与した。最終ブースト３日後にマウスより脾臓を摘出し、脾細胞を調製した。脾細胞とミエローマ細胞（ｐ３．ｘ６３．Ａｇ８．６５３)とをＰＥＧ法を用いて細胞融合を行い、ハイブリドーマを作製した。
各モノクローナル抗体は、抗体産生ハイブリドーマの無血清培地あるいはハイブリドーマをマウスに投与して得られた腹水より、プロテインＡカラム（ＭＡＰＳ ＩＩキット、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）を用いて精製した。
実施例１〔モノクローナル抗体の内皮細胞の遊走能に対する効果〕
ＭＬＴＣ−１／野生型ＶＡＳＨ２を２４穴プレートに１×１０５個／ウェルずつ播種し、０．５％血清を含む培地で２４時間培養した後、低血清培地で１７時間培養したＨＵＶＥＣ ５×１０４個をポアサイズ８μｍのインサートに添加した。この時マウスＩｇＧ、マウス抗血清（ポリクローナル抗体）、抗ヒトＶＡＳＨ２モノクローナル抗体のクローン７１、１６９４、１７６０、２３５６をそれぞれ５μｇ／ｍＬの濃度でｌｏｗｅｒ ｃｈａｍｂｅｒに添加した。３７℃で４時間インキュベートした後、メンブレンの下面に移動したＨＵＶＥＣをギムザ染色で染色した。下面に移動したＨＵＶＥＣを光学顕微鏡下に２００倍でランダムに５視野カウントしその平均値および標準偏差を算出した。ＭＬＴＣ−１／Ｍｏｃｋを播種した群を陰性コントロールとした。結果を図３に示す。
図３より、ポリクローナル抗体と各モノクローナル抗体を添加した群は、いずれもマウスＩｇＧ添加群と比較して有意に内皮細胞の遊走を抑制したが、クローン１７６０が最も抑制効果が強かった（ｐ＜０．０１）。
実施例２〔モノクローナル抗体の内皮細胞のネットワーク形成に対する効果〕
２４穴プレートの各ウェルに、５００μＬの成長因子非添加Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加してゲル化させ、その上に低血清培地で１７時間培養したＨＵＶＥＣ ７．５×１０４個（５００μＬに懸濁）を播種し、ＭＬＴＣ−１／野生型ＶＡＳＨ２の培養上清５００μＬを添加した。この時マウスＩｇＧ、マウス抗血清（ポリクローナル抗体）、抗ヒトＶＡＳＨ２モノクローナル抗体のクローン７１、１７６０、あるいは以前にＡＹ８３４２０２ポリペプチドのアミノ酸番号２０７（セリン）〜２１９（リジン）までの部分ペプチドを抗原として作成したモノクローナル抗体５Ｅ３をそれぞれ５μｇ／ｍＬの濃度でｌｏｗｅｒ ｃｈａｍｂｅｒに添加した。３７℃で５時間インキュベートした後、形成されたネットワークの分岐点を位相差顕微鏡下に４０倍でランダムに５視野カウントしその平均値および標準偏差を算出した。ＭＬＴＣ−１／Ｍｏｃｋを播種した群を陰性コントロールとした。結果を図４に示す。
図４より、クローン７１、１７６０、５Ｅ３を添加した群は、いずれもマウスＩｇＧ添加群と比較して有意にネットワーク形成を抑制したが、遊走実験と同様、クローン１７６０が最も抑制効果が高かった（ｐ＜０．０１）。なお、以前に作成していた別のアミノ酸配列を認識する抗ＶＡＳＨ２モノクローナル（５Ｅ３）には中和活性は認められなかった。
以上の結果から、作製したモノクローナル抗体はバソヒビン２タンパク質に対する中和活性を有しており、このうちクローン１７６０が最も中和活性が高いことが明らかとなった。
実施例３〔マウス腫瘍モデル−１〕
６〜８週齢、雌のＢＡＬＢ−ｃヌードマウスの背部皮下に、ヒト卵巣漿液性腺癌細胞株（ＳＫＯＶ−３）１×１０６個を１００μＬのＰＢＳに懸濁して移植した（ｎ＝４）。腫瘍が計測可能になった時点（直径５ｍｍ程度）よりマウスＩｇＧ（５ｍｇ／ｋｇ）あるいは抗ヒトＶＡＳＨ２モノクローナル抗体のクローン１７６０（５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与した。また、抗体投与時に腫瘍径を計測し、長径×短径×短径×１／２より腫瘍体積を算出し、平均値を算出した。抗体投与は計６回(０日目、４日目、７日目、１２日目、１５日目、１９日目)行い、治療開始２２日目に腫瘍を摘出した。腫瘍摘出直前の代表的な写真を図５に、腫瘍体積の変化を図６に示す。
図５及び６より、クローン１７６０投与群では、マウスＩｇＧ投与群と比較して有意に腫瘍増殖が抑制され（ｐ＜０．０５）、３３％の腫瘍体積減少を認めた。
また、摘出した腫瘍の血管を免疫染色で可視化し、腫瘍面積における血管断面積比率を算出した。腫瘍血管の代表的な写真を図７に、その断面積の比較を図８に示す。
図７及び８より、クローン１７６０投与群では、マウスＩｇＧ投与群と比較して有意な腫瘍の血管断面積の減少が認められ（ｐ＜０．０１）、個体レベルでの腫瘍血管新生抑制効果が確認された。
実施例４〔マウス腫瘍モデル−２〕
６〜８週齢、雌のＢＡＬＢ−ｃヌードマウスの背部皮下に、実施例３と同様にして、ヒト卵巣漿液性腺癌細胞株（ＳＫＯＶ−３）１×１０６個を移植した（ｎ＝８）。腫瘍が計測可能になった時点（直径５ｍｍ程度、約１週間後）よりマウスＩｇＧ（５ｍｇ／ｋｇ）あるいは抗ヒトＶＡＳＨ２モノクローナル抗体のクローン１７６０（１０、１５、２５、５０ｍｇ／ｋｇ）、血管新生阻害薬であるベバシズマブ（中外製薬社製、５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与した。また、抗体投与時に腫瘍径を計測し、長径×短径×短径×１／２より腫瘍体積を算出し、平均値を算出した。抗体投与は計５回(０日目、４日目、７日目、１１日目、１４日目)行い、治療開始１８日目に腫瘍を摘出した。１８日目の腫瘍体積を図９に示す。
図９より、ベバシズマブ（５ｍｇ／ｋｇ）投与群とクローン１７６０（２５ｍｇ／ｋｇ）投与群はほぼ同程度の腫瘍増殖抑制効果を示すことが分かる。
また、マウスＩｇＧ（５ｍｇ／ｋｇ）投与群、クローン１７６０（２５ｍｇ／ｋｇ）投与群、ベバシズマブ（５ｍｇ／ｋｇ）投与群の腫瘍体積の変化を図１０に示す。
図１０より、ベバシズマブ投与群はマウスＩｇＧ投与群に対して腫瘍増殖がｐ＜０．０１６で抑制されたのに対し、クローン１７６０投与群では腫瘍増殖がｐ＜０．０１０で抑制されており、その抑制効果の推移もほぼ同じであることが分かる。
さらに、摘出した腫瘍の血管を免疫染色で可視化し、腫瘍面積における血管断面積比率を算出した。マウスＩｇＧ（５ｍｇ／ｋｇ）投与群、クローン１７６０（２５ｍｇ／ｋｇ）投与群、ベバシズマブ（５ｍｇ／ｋｇ）投与群の代表的な写真を図１１に、その断面積の比較を図１２に示す。
図１１及び１２より、クローン１７６０投与群では、ベバシズマブ（５ｍｇ／ｋｇ）投与群と同様に、マウスＩｇＧ投与群と比較して有意な腫瘍の血管断面積の減少が認められ（ｐ＜０．０１）、個体レベルでの腫瘍血管新生抑制効果が確認された。
本発明者らは、バソヒビン２がヒトの肝癌や卵巣癌に発現し、そのバソヒビン２の発現をノックダウンすることで腫瘍血管新生や腫瘍の発育が抑制できることを明らかにしている。また、本発明者らは以前にＡＹ８３４２０２ポリペプチドのアミノ酸番号２０７〜２１９までを認識するモノクローナル抗体５Ｅ３を樹立していたが、中和活性を報告されている抗バソヒビン２抗体はないことから、本発明において、本発明の抗バソヒビン２抗体が腫瘍の発育を抑制できる事を初めて明らかにした。以上より、本発明の抗体は、病的な血管新生の制御を目的としたがん治療や眼科疾患への応用が期待される。
本発明の抗バソヒビン２抗体は、バソヒビン２タンパク質を良好な特異性で認識し、バソヒビン２タンパク質の有する血管新生促進作用を抑制することができることから、抗バソヒビン２抗体を含有する医薬組成物は、例えば、がんなどの血管新生の抑制を要する疾患の治療などに好適に用いられる。
配列表の配列番号１は、ＡＹ８３４２０２ポリヌクレオチドである。
配列表の配列番号２は、ＡＹ８３４２０２ポリペプチドである。

Claims (9)

  1. 配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２６９〜２８８を認識する、抗バソヒビン２抗体又はその抗原結合断片であって、該抗バソヒビン２抗体が、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−１４７４で示されるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体である、抗体又はその抗原結合断片。
  2. 配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２６９〜２８８を認識する抗バソヒビン２モノクローナル抗体を産生する、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−１４７４で示されるハイブリドーマ。
  3. 請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片を含有してなる、血管新生抑制剤。
  4. 請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片を含有してなる、医薬組成物。
  5. 請求項３に記載の血管新生抑制剤を含有してなる、血管新生の抑制を要する疾患の治療用医薬組成物。
  6. 血管新生の抑制を要する疾患が、がんであることを特徴とする請求項５に記載の治療用医薬組成物。
  7. 工程(Ａ)：抗血管新生薬の候補化合物の投与後における被検個体由来の生体試料と、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片とを接触させて複合体を形成させて、該複合体の存在量を測定する工程
    工程(Ｂ)：前記工程(Ａ)で測定された存在量を、投与前における存在量と比較する工程、ならびに
    工程(Ｃ)：前記工程(Ｂ)で行った比較において、該候補化合物の投与前に比べて投与後の方が該複合体の存在量が少ないと認められる場合に該候補化合物が抗血管新生薬として薬効を示している可能性が高いと判定する工程
    を含む、抗血管新生薬の薬効評価方法。
  8. 請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片を含有してなる、抗血管新生薬の薬効評価用キット。
  9. 血管新生の抑制を要する疾患の治療または予防するための、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
JP2014513846A 2012-12-03 2013-11-11 抗バソヒビン２抗体 Active JP6300373B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2012264350 2012-12-03
JP2012264350 2012-12-03
PCT/JP2013/080450 WO2014087810A1 (ja) 2012-12-03 2013-11-11 抗バソヒビン２抗体

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPWO2014087810A1 JPWO2014087810A1 (ja) 2017-01-05
JP6300373B2 true JP6300373B2 (ja) 2018-03-28

Family

ID=50883235

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2014513846A Active JP6300373B2 (ja) 2012-12-03 2013-11-11 抗バソヒビン２抗体

Country Status (4)

Country Link
US (1) US9701744B2 (ja)
EP (1) EP2927243A4 (ja)
JP (1) JP6300373B2 (ja)
WO (1) WO2014087810A1 (ja)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019045025A1 (ja) 2017-08-31 2019-03-07 国立大学法人東北大学 ワクチン組成物
JP2021500371A (ja) * 2017-10-26 2021-01-07 レ ラボラトワール セルヴィエ チューブリンカルボキシペプチダーゼ関連疾患を処置するための方法及び医薬組成物

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002090546A1 (en) 2001-05-07 2002-11-14 Shionogi & Co., Ltd. Polypeptide serving as angiogenic marker and dna thereof
EP1839669A4 (en) 2005-01-05 2012-12-12 Shionogi & Co NEW ANGIOGENESEHEMMER
JP5309038B2 (ja) * 2008-01-31 2013-10-09 国立大学法人東北大学 血管新生促進因子
WO2010024293A1 (ja) * 2008-08-27 2010-03-04 塩野義製薬株式会社 抗バソヒビンモノクローナル抗体のセット

Also Published As

Publication number Publication date
EP2927243A1 (en) 2015-10-07
EP2927243A4 (en) 2016-08-03
WO2014087810A1 (ja) 2014-06-12
US9701744B2 (en) 2017-07-11
US20160009790A1 (en) 2016-01-14
JPWO2014087810A1 (ja) 2017-01-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7061875B2 (ja) アミロイドベータタンパク質に対するモノクローナル抗体及びその使用
US11078269B2 (en) IL-11Rα antibodies
EP3555131B1 (en) Il-11 antibodies
JP7112659B2 (ja) 抗ｐｃｓｋ９抗体およびその使用
JP6900051B2 (ja) Ｃｌａｕｄｉｎ ５抗体、及びその抗体を含有する医薬
KR102608028B1 (ko) 인간 원형질막 소포 관련 단백질 pv-1에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 이의 제조방법과 용도
JP2013135667A (ja) 抗体及びその利用
KR20120118918A (ko) 인간화 항-ｅｍａｐｉｉ 항체 및 이의 용도
US8470325B2 (en) Method of treating amykloidosis comprising administering an anti-HMGB-1 antibody
WO2010063138A1 (zh) 特异结合vegf的单克隆抗体及分泌它们的杂交瘤细胞系与用途
JP6300373B2 (ja) 抗バソヒビン２抗体
RU2741802C2 (ru) АНТИТЕЛО К Myl9
JP4852773B2 (ja) 肝再生・修復制御剤
JP2015196665A (ja) 中和活性を有する抗ｌｒ１１モノクローナル抗体、及びそれを含有してなる医薬
US20240199735A1 (en) Microfibrillar-Associated Protein 5 (MFAP5)-Targeting Monoclonal Antibodies and Methods for Use in Treating Cancer
US20210309726A1 (en) Treatment of melanoma brain metastasis by inhibition of amyloid precursor protein cleavage
JP6714263B2 (ja) 免疫調節剤及びスクリーニング方法
JP2015199725A (ja) 中和活性を有する抗ｌｒ１１モノクローナル抗体、及びそれを含有してなる医薬
CN118791606A (zh) 双特异性抗体及其应用
CN118791607A (zh) 双特异性抗体及其应用
EA041243B1 (ru) Антитела к бета-амилоидному пептиду n3pglu и их применение
KR20130135869A (ko) 항 단쇄 제4형 콜라겐 폴리펩타이드 항체 및 이를 포함하는 종양의 진단, 예방 또는 치료용 약제
JP2015196666A (ja) 中和活性を有する抗ｌｒ１１モノクローナル抗体、及びそれを含有してなる医薬
JP2015199724A (ja) 中和活性を有する抗ｌｒ１１モノクローナル抗体、及びそれを含有してなる医薬
JP2015196667A (ja) 中和活性を有する抗ｌｒ１１モノクローナル抗体、及びそれを含有してなる医薬

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20161101

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20170830

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20171027

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20180202

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20180223

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6300373

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250