WO2014087810A1 - 抗バソヒビン２抗体 - Google Patents

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vasohibin
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佐藤　靖史
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国立大学法人東北大学
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Definitions

  • the present invention relates to an anti-vasohibin 2 antibody. More specifically, a monoclonal antibody specific to vasohibin 2 or a fragment thereof, a hybridoma producing the monoclonal antibody, a recombinant antibody of the antibody or a fragment thereof, an angiogenesis inhibitor containing the antibody or a fragment thereof, and therapeutic use
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition, a pharmaceutical composition for treating cancer, a method for evaluating the efficacy of an anti-angiogenic drug using the antibody or a fragment thereof, and a kit for carrying out the method.
  • Angiogenesis refers to a phenomenon in which new blood vessels are formed by migration, proliferation and lumen formation of vascular endothelial cells from existing venules and capillaries in animal tissues or organs. Such a phenomenon occurs not only in the morphogenesis and growth phases of animals, but also in the healing of tissue damage, inflammation repair process and menstrual cycle, and is controlled by both angiogenesis promoting factors and inhibitory factors. Therefore, maintaining a balance between the promoter and the inhibitor is important for maintaining blood vessel homeostasis.
  • angiogenesis is promoted by overexpression of angiogenesis-promoting factor, resulting in further increase in tumor tissue. Therefore, as an anti-cancer treatment, a method of administering an angiogenesis inhibitor or an angiogenesis-promoting inhibitor or the like can be considered.
  • Vasohibin is a polypeptide found by the present inventors, and vasohibin 1 and vasohibin 2 belong as homologues. These vasohibins are expressed in vascular endothelial cells by stimulating angiogenesis-promoting factors (VEGF, FGF-2, etc.) secreted from tumor cells, stromal cells, macrophages, etc., and act on the endothelial cells themselves in an autocrine manner. Thus, it is known to have an action of suppressing angiogenesis (see Patent Documents 1 and 2).
  • VEGF angiogenesis-promoting factors
  • Vasohibin 2 disclosed in Patent Document 2 that is, AK022567 protein, and splicing variants of the protein, BC051856 protein, BC053836 protein, BC028194 protein, and AY833422 protein, include cancer and It has also been found and reported that it has an effect of promoting angiogenesis in a hypoxic state similar to a pathological condition such as cerebrovascular disorder (see Patent Document 3).
  • An object of the present invention is to provide an antibody specific to vasohibin 2 protein or a fragment thereof, a hybridoma producing the antibody, a recombinant antibody of the antibody or a fragment thereof, an angiogenesis inhibitor containing the antibody or a fragment thereof, and a treatment It is to provide a pharmaceutical composition for use, a method for evaluating the efficacy of an anti-angiogenic drug using the antibody or a fragment thereof, and a kit for carrying out the method.
  • the present inventors have identified the active center of Vasohibin 2 protein. And when a monoclonal antibody against a specific epitope containing this active center of the vasohibin 2 protein was prepared, it was found that the monoclonal antibody specifically binds to the vasohibin 2 protein and suppresses the angiogenic action of the vasohibin 2 protein, The present invention has been completed.
  • the present invention relates to the following [1] to [10].
  • An angiogenesis inhibitor comprising the antibody or fragment thereof according to [1] or [2].
  • a step of forming and measuring the abundance of the complex (B): a step of comparing the abundance measured in the step (A) with an abundance before administration, and a step (C): the step In the comparison performed in (B), the candidate compound shows a medicinal effect as an anti-angiogenic agent when it is recognized that the amount of the complex is small after administration compared to before administration of the candidate compound.
  • a method for evaluating the efficacy of an anti-angiogenic drug comprising a step of determining that the possibility is high.
  • a kit for evaluating the efficacy of an anti-angiogenic drug comprising the antibody or fragment thereof according to [1] or [2].
  • a disease requiring suppression of angiogenesis comprising a step of administering a therapeutically effective amount of the antibody or fragment thereof according to [1] or [2] to an individual in need of treatment of a disease requiring suppression of angiogenesis Treatment methods.
  • the anti-vasohibin 2 antibody or a fragment thereof of the present invention binds to the vasohibin 2 protein with good specificity and exhibits an excellent effect of inhibiting its angiogenesis promoting action.
  • FIG. 1 is a graph showing the effect of Vasohibin 2 on the endothelial cell migration ability.
  • FIG. 2 is a diagram showing the effect of Vasohibin 2 on tube formation of endothelial cells.
  • FIG. 3 is a graph showing the effect of monoclonal antibodies on the migration ability of endothelial cells.
  • FIG. 4 is a diagram showing the effect of monoclonal antibodies on tube formation of endothelial cells.
  • FIG. 5 is a diagram showing tumor morphology in a mouse tumor model after administration of a monoclonal antibody. The left figure is a mouse IgG administration group, and the right figure is an anti-VASH2 antibody (clone 1760) administration group.
  • FIG. 1 is a graph showing the effect of Vasohibin 2 on the endothelial cell migration ability.
  • FIG. 2 is a diagram showing the effect of Vasohibin 2 on tube formation of endothelial cells.
  • FIG. 3 is a graph showing the effect of monoclo
  • FIG. 6 shows changes in tumor volume in a mouse tumor model after monoclonal antibody administration.
  • FIG. 7 shows tumor blood vessels in a mouse tumor model after monoclonal antibody administration.
  • the left figure is a mouse IgG administration group, and the right figure is an anti-VASH2 antibody (clone 1760) administration group.
  • FIG. 8 is a diagram quantitatively showing changes in the vascular cross-sectional area of the tumor in the mouse tumor model after administration of the monoclonal antibody.
  • FIG. 9 shows mouse tumor volume after administration of mouse IgG, bevacizumab, or monoclonal antibody.
  • FIG. 10 is a diagram showing changes in tumor volume in a mouse tumor model after administration of mouse IgG, bevacizumab, or a monoclonal antibody.
  • FIG. 10 is a diagram showing changes in tumor volume in a mouse tumor model after administration of mouse IgG, bevacizumab, or a monoclonal antibody.
  • FIG. 11 shows tumor blood vessels in a mouse tumor model after monoclonal antibody administration.
  • (a) is a mouse IgG administration group
  • (b) is an anti-VASH2 antibody (clone 1760) administration group
  • (c) is a bevacizumab administration group.
  • FIG. 12 is a diagram quantitatively showing the ratio of the vascular cross-sectional area of a tumor in a mouse tumor model after administration of mouse IgG, bevacizumab, or a monoclonal antibody.
  • the anti-vasohibin 2 antibody of the present invention (hereinafter also referred to as the antibody of the present invention) has the characteristic of specifically binding to the vasohibin 2 protein by recognizing a specific amino acid sequence.
  • Vasohibin examples include Vasohibin-1 and Vasohibin-2, and Vasohibin 2 in the present invention refers to Vasohibin-2.
  • Vasohibin 1 and Vasohibin 2 are different genes existing on different chromosomes, but the amino acid sequences of the proteins encoded by these genes are 58% homologous. It has sex.
  • Vasohibin 2 refers to the vasohibin 2 protein encoded by the AY833422 polynucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the AY833422 polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • a partial peptide from amino acid number 269 (Leu) to 288 (Arg) of Vasohibin 2 protein, or a part thereof can be used.
  • the partial peptide for example, when a vasohibin 2 mutant in which five consecutive amino acids from 281 (Lys) to 285 (Lys) are replaced with 4 alanine (Ala) is expressed in a cell, No promotion of angiogenesis was observed. Therefore, the partial peptide containing amino acids 281 to 285 is considered to be involved in the expression of an action that promotes angiogenesis.
  • the antigen used for antibody production is not limited as long as the antibody of the present invention can be prepared, and may be any peptide containing any of the above-described epitopes of the present invention. That is, the antigen may be a partial peptide of Vasohibin 2 protein longer than the epitope in the present invention, or a peptide in which a peptide not related to Vasohibin 2 protein is bound to the carboxyl terminus or amino terminus of the epitope in the present invention. Alternatively, it may be bound to a carrier protein such as KLH, OVA, or BSA or an Fc region of IgG.
  • a carrier protein such as KLH, OVA, or BSA or an Fc region of IgG.
  • angiogenesis means a phenomenon in which capillary blood vessels are formed in such a manner that vascular endothelial cells sprouting from existing blood vessels and enter the tissue. The formation process proceeds in the order of 1) digestion of vascular basement membrane with protease, 2) migration and proliferation of vascular endothelial cells, and 3) lumen formation.
  • the antibody of the present invention may be any antibody that recognizes amino acid numbers 269 to 288 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. That is, it may be binding to the full length of the partial peptide of amino acid numbers 269 to 288, or may be binding to a part of the amino acids, but the angiogenesis promotion of Vasohibin 2 protein As a neutralizing antibody for neutralizing the action, an antibody having binding ability to an epitope containing amino acids of amino acid numbers 281 to 285 is preferable.
  • the antibody of the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody within the range of recognizing amino acid numbers 269 to 288 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, but a preferred embodiment is a monoclonal antibody.
  • the antibodies of the present invention can be obtained by methods well known to those skilled in the art using the appropriate antigens described herein.
  • a vasohibin 2 monoclonal antibody produced by a hybridoma or a fragment thereof can be mentioned.
  • a monoclonal antibody using a hybridoma can be prepared, for example, by the method described in detail below.
  • an antigen is prepared. Specifically, for the partial peptide Leu269-Arg288 (hereinafter referred to as “vasohibin 2 partial peptide”) of vasohibin 2 protein, a peptide in which a cysteine residue is added to the amino terminus or carboxyl terminus is synthesized according to a known method. A hapten antigen is prepared from the obtained peptide using maleimide KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin, Imject (registered trademark) Maleimide Activated mcKLH, manufactured by Pierce) through the SH group of the peptide.
  • KLH Keyhole Limpet Hemocyanin, Imject (registered trademark) Maleimide Activated mcKLH, manufactured by Pierce
  • a fusion protein of rabbit IgG Fc region and vasohibin 2 partial peptide can also be used as an antigen.
  • This fusion protein can be prepared according to a known method.
  • Fc fusion vasohibin 2 protein can be prepared by, for example, a plasmid vector having a polynucleotide sequence having Fc added to the amino terminus or carboxyl terminus of vasohibin 2 partial peptide. It can be prepared by introducing into Freestyle®293-F®Cells (Invitrogen) and expressing it transiently, followed by purification using a protein A column.
  • the expression and purification of the Fc fusion vasohibin 2 protein is not particularly limited and can be performed according to a known method.
  • a mammal is immunized with the antigen obtained as described above.
  • a mammal Generally, a mouse
  • the age of the mammal varies depending on the animal species used and is not particularly limited. In the case of a mouse or rat, it is usually about 4 to 12 weeks old, preferably about 5 to 10 weeks old. These mammals can be selected in consideration of compatibility with plasma cells to be cell-fused for the production of the monoclonal antibody of the present invention.
  • the antigen is used as an immunogen mixed with an adjuvant to enhance the immune response.
  • an adjuvant there is no limitation and a well-known thing can be used.
  • the adjuvant and the antigen can be mixed according to a method known in the art for the adjuvant to be used.
  • Mammal immunization is performed according to methods known in the art.
  • the immunogen is administered by injection into a mammal subcutaneously, intradermally, intravenously or intraperitoneally.
  • administration of the immunogen is repeated several times after the first immunization, and the administration interval can be adjusted as appropriate. Since the immune response varies depending on the type and strain of the mammal to be immunized, the immunization schedule and the dose of the immunogen can be appropriately set according to the animal to be used.
  • desired antibody-producing cells can be prepared in the immunized mammal.
  • Such antibody-producing cells are preferably splenocytes isolated 3 to 5 days after the final administration of the immunogen.
  • boost additional injection of immunogen
  • the amount of immunogen administered in boost is preferably about 4 to 5 times the amount of immunogen initially administered, but can be appropriately increased or decreased based on this.
  • the obtained antibody-producing cells are cell-fused with myeloma-derived cells (myeloma cells) to prepare hybridomas.
  • the myeloma cells are preferably compatible with the mammal from which the antibody-producing cells to be fused are derived. Examples thereof include myeloma cells such as mouse myeloma P3U1, X63-Ag8.653.
  • the cell fusion method a method known in the art can be used, and examples include a method using polyethylene glycol (PEG), a method using Sendai virus, and a method using an electrofusion device.
  • PEG polyethylene glycol
  • Sendai virus a method using Sendai virus
  • electrofusion device a method using an electrofusion device.
  • the obtained hybridoma can be separated by culturing in a selective medium according to a known method.
  • the culture supernatant can be collected and an antibody titer assay can be performed based on a known method, for example, the DELFIA method.
  • hybridoma producing the desired monoclonal antibody can be obtained.
  • the hybridoma can be subcultured in a normal medium and can be stored semipermanently in liquid nitrogen.
  • a desired monoclonal antibody from a hybridoma it can be prepared in large quantities by in vivo and in vitro culture methods.
  • the in vitro culture method can be performed by culturing the hybridoma in an appropriate serum medium or serum-free medium, and the desired monoclonal antibody is produced in the medium.
  • a desired antibody having a relatively high purity can be obtained as a culture supernatant.
  • the in vivo culture method can be carried out by inoculating the hybridoma with a hybridoma, for example, an intraperitoneal cavity of a mammal that is compatible with the hybridoma, such as a mouse, and proliferating, and the desired antibody can be recovered in large amounts as mouse ascites. .
  • the obtained culture supernatant and ascites fluid such as mouse can be used as a crude antibody solution as they are.
  • These are purified according to conventional methods, for example, by appropriately combining DEAE anion exchange chromatography, affinity chromatography, ammonium sulfate fractionation method, PEG fractionation method, ethanol fractionation method, etc. to obtain purified antibodies. be able to.
  • a hybridoma that produces a specific antibody may be prepared and used by the above-described method.
  • the National Institute for Product Evaluation Technology Patent Microorganism Depositary Center Keratsa-Kamazu 2-5-5 Kisarazu, Chiba Prefecture
  • the cells deposited under the following deposit number in 8) can also be suitably used.
  • NITE BP-1474 (Indication 1760, date of commissioning November 29, 2012)
  • the antibody fragment only needs to have the above-mentioned epitope, that is, a partial peptide from 269th (Leu) to 288th (Arg) of Vasohibin 2 protein, or an antigen-binding fragment thereof.
  • a fragment for neutralizing the angiogenesis promoting action of Vasohibin 2 protein one having an antigen-binding fragment for an epitope comprising amino acid sequences 281 to 285 is preferable.
  • the form is not particularly limited, and examples thereof include Fab, F (ab ′) 2, Fab ′, scFv, diabody, dsFv, and a peptide containing CDR.
  • These antibody fragments can be prepared according to a known technique, for example, by proteolytic cleavage with an enzyme such as papain (production of Fab fragment) or pepsin (production of F (ab ′) 2 fragment).
  • a recombinant anti-vasohibin 2 antibody of the antibody of the present invention or a fragment thereof is also provided.
  • the recombinant antibody is not particularly limited as long as it recognizes amino acid numbers 269 to 288 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and has, for example, binding to the full length of the partial peptide of amino acid sequences 269 to 288. Even if it is a thing, it may have binding property with respect to the one part peptide.
  • a neutralizing antibody for neutralizing the angiogenesis promoting action of Vasohibin 2 protein an antibody having binding ability to an epitope comprising amino acid sequences 281 to 285 is preferable.
  • the recombinant antibody include humanized antibodies and human antibodies when the antibody administration target is human so that the antigenicity of the individual can be reduced.
  • the gene recombinant antibody in the present invention can be obtained by modifying the monoclonal antibody obtained by the hybridoma or a fragment thereof using a known gene recombination technique.
  • humanized antibodies include human chimeric antibodies and human CDR (Complementarity Determining Region) grafted antibodies.
  • the human chimeric antibody includes, for example, the heavy chain variable region (hereinafter referred to as VH) and light chain variable region (hereinafter referred to as VL) of the monoclonal antibody, and the heavy chain constant region (hereinafter referred to as CH) of the human antibody. And a light chain constant region (hereinafter referred to as CL) gene.
  • the human CDR-grafted antibody can be prepared, for example, by grafting the CDR amino acid sequences for VH and VL of the antibody of the present invention to appropriate positions of VH and VL of the human antibody.
  • human antibodies include antibodies obtained from human antibody phage libraries and human antibody-producing transgenic animals.
  • a human antibody phage library and a human antibody-producing transgenic animal can be prepared according to known methods.
  • the fragment of the recombinant antibody may be any fragment of the aforementioned recombinant antibody, and, like the antibody fragment of the present invention, a portion consisting of amino acid numbers 269 to 288 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 As long as it has an antigen-binding fragment for a peptide or a part thereof, there is no particular limitation on its form and preparation method.
  • a fragment for neutralizing the angiogenesis promoting action of Vasohibin 2 protein one having an antigen-binding fragment for an epitope comprising amino acid sequences 281 to 285 is preferable.
  • the antibody or fragment of the present invention is modified with a sugar chain such as mannose, fucose, galactose, N-acetylglucosamine, N-acetylneuraminic acid and the like within the range that recognizes amino acid numbers 269 to 288 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. It may be.
  • a sugar chain such as mannose, fucose, galactose, N-acetylglucosamine, N-acetylneuraminic acid and the like within the range that recognizes amino acid numbers 269 to 288 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. It may be.
  • the antibody of the present invention or a fragment thereof and the gene recombinant antibody of the antibody or a fragment thereof can be obtained. Since these antibodies or fragments thereof specifically recognize amino acid numbers 269 to 288 of the amino acid sequence of AY833422 polypeptide, they show good binding properties to Vasohibin 2 protein. In the present specification, these antibodies or fragments thereof may be collectively referred to as the antibody of the present invention or fragments thereof.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition containing the antibody of the present invention or a fragment thereof.
  • the present pharmaceutical composition includes, as one embodiment, drugs and therapeutic pharmaceutical compositions including an angiogenesis inhibitor as described below.
  • the present invention also provides an angiogenesis inhibitor containing the antibody of the present invention or a fragment thereof.
  • the angiogenesis inhibitor of the present invention is substantially composed of the antibody of the present invention or a fragment thereof, and the Vasohibin 2 protein has by binding to the Vasohibin 2 protein at a site delivered through the circulating blood. It has the effect of suppressing the expression of angiogenesis promoting action.
  • the dosage form of the angiogenesis inhibitor of the present invention is not limited as long as it migrates into the circulating blood.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for treating a disease requiring angiogenesis inhibition, that is, a therapeutic agent, comprising the angiogenesis inhibitor of the present invention.
  • the disease requiring suppression of angiogenesis is not particularly limited as long as it has a therapeutic effect by suppressing angiogenesis.
  • vascular disease inflammatory disease, intraocular neovascular disease, reproduction Organ system diseases, central nervous system diseases, cancer and the like can be mentioned.
  • arteriosclerosis hypertension, angina pectoris, obstructive arteriosclerosis, myocardial infarction, cerebral infarction, diabetic vascular disorder, vascular malformation, hepatitis, pneumonia, glomerulonephritis, thyroiditis, osteomyelitis, synovium Inflammation, bone destruction, cartilage destruction, rheumatism, asthma, sarcoidosis, Crow Fukase syndrome, pannus, allergic edema, ulcer, ascites, peritoneal sclerosis, tissue adhesion, diabetic retinopathy, retinal vein occlusion, age-related macular degeneration, Uterine dysfunction, placental dysfunction, ovarian hyperactivity, follicular cyst, retinopathy, stroke, vascular dementia, Alzheimer's disease, solid cancer (eg ovarian cancer, colon cancer), hemangioma, hemangioendothelioma, sarcoma, Examples include malignant neoplasms such as Kaposi
  • the therapeutic pharmaceutical composition of the present invention examples include those prepared by combining the angiogenesis inhibitor of the present invention with a known pharmaceutical carrier.
  • the therapeutic pharmaceutical composition of the present invention has other components that can be used for the same use as the antibody of the present invention or a fragment thereof, such as a known angiogenesis inhibitory action. It can also be blended with ingredients.
  • Production of the therapeutic pharmaceutical composition of the present invention is usually carried out as long as the antibody of the present invention or a fragment thereof can be produced into a dosage form that can reach a site requiring angiogenesis inhibition through circulating blood. It is carried out by blending the angiogenesis inhibitor of the invention with a pharmaceutically acceptable liquid or solid carrier, and optionally, a solvent, a dispersant, an emulsifier, a buffer, a stabilizer, an excipient, a binder, a disintegrant. Further, by adding a lubricant, etc., it can be made into solid agents such as tablets, granules, powders, powders, capsules, etc., and liquid agents such as normal solutions, suspensions, emulsions and the like.
  • the pharmaceutical carrier can be selected depending on the administration form and formulation of the therapeutic agent, and is not particularly limited.
  • part which needs suppression of angiogenesis means the onset site
  • the therapeutic pharmaceutical composition in various preparation forms as described above can be appropriately produced by a conventional method using a known pharmaceutical carrier or the like.
  • the content of the antibody of the present invention or a fragment thereof in such a therapeutic pharmaceutical composition is an amount that can achieve the desired effect of the present invention in consideration of its administration form, administration method, etc.
  • the content of the antibody of the present invention or a fragment thereof in the therapeutic pharmaceutical composition of the present invention is usually about 1 to 100% by weight.
  • the content of the antibody of the present invention or a fragment thereof means the total content when a plurality of types of the antibody of the present invention and the fragment thereof are contained.
  • the therapeutic pharmaceutical composition of the present invention is administered by an appropriate administration method according to the preparation form.
  • the administration method is not particularly limited as long as the antibody of the present invention or a fragment thereof can be delivered via circulating blood, and can be administered by, for example, internal use, external use or injection.
  • the therapeutic pharmaceutical composition of the present invention is administered by injection, for example, it can be administered intravenously, intramuscularly, subcutaneously, intradermally, and when administered externally, for example, as an external preparation such as a suppository And may be administered by the appropriate administration method.
  • the dosage of the therapeutic pharmaceutical composition of the present invention is appropriately set according to the formulation form, administration method, purpose of use, and age, weight, and symptom of the patient or animal subject to administration of the pharmaceutical composition, and is not constant. Further, the administration may be performed once or divided into several times within one day within a desired dose range. The administration period is also arbitrary.
  • the present invention also provides a method for treating a disease requiring suppression of angiogenesis, comprising administering an effective amount of the antibody of the present invention or a fragment thereof to a test individual.
  • the test individual is preferably a human who needs to suppress angiogenesis, but may be any mammal whose angiogenesis is promoted by Vasohibin 2 protein, such as cattle, horses, goats and other livestock. It may be an animal, a pet animal such as a dog, a cat, or a rabbit, or a laboratory animal such as a mouse, rat, guinea pig, or monkey.
  • an effective amount means an antibody or fragment thereof in which angiogenesis is suppressed when the antibody or fragment thereof of the present invention is administered to the test individual as compared to a test individual not administered. Is the amount.
  • the specific effective amount is appropriately set according to the administration form, administration method, purpose of use and age, weight, symptom, etc. of the test individual, and is not constant.
  • an effective amount of the antibody of the present invention or a fragment thereof may be administered as it is to the test individual, and the therapeutic pharmaceutical composition as described above, etc. It may be administered as a pharmaceutical.
  • the administration method For example, what is necessary is just to administer by oral administration, injection, etc. similarly to said pharmaceutical composition for treatment.
  • the disease targeted by the therapeutic pharmaceutical composition of the present invention can be treated.
  • the effect of treating a disease that develops by angiogenesis can be exhibited.
  • the present invention provides a diagnostic agent containing the antibody of the present invention or a fragment thereof.
  • the diagnostic agent can be used to diagnose a disease that is a target of the therapeutic pharmaceutical composition of the present invention.
  • the present inventors have reported that Vasohibin 2 protein is expressed in cancer cells (Xue et al. Oncogene. 2012 [Epub ahead of print], Takahashi et al. Mol. Cancer Res. 10 (2012) , See 1135-1146). Therefore, by using the diagnostic agent of the present invention, it is possible to detect vasohibin 2 protein in a biological sample collected from a test individual, for example, blood, plasma, tissue, etc., and the presence or absence of the detected vasohibin 2 protein or vasohibin Based on the amount of 2 protein, it can be diagnosed whether the test individual suffers from a disease that develops by angiogenesis by Vasohibin 2 protein 2 including cancer.
  • the amount of vasohibin 2 protein detected using the diagnostic agent according to the present invention and the vasohibin 2 detected using the diagnostic agent according to the present invention in the biological sample collected from the healthy control individual By comparing the amount of protein and the amount of Vasohibin 2 protein in the test individual is significantly higher than that in the healthy control individual, it can be diagnosed that the test individual suffers from a disease that develops by angiogenesis.
  • a method well-known to those skilled in the art can be used for the detection method and quantification method of Vasohibin 2 protein.
  • a method for evaluating the efficacy of an anti-angiogenic drug is provided.
  • vasohibin 2 protein is secreted from cancer cells and knocking down vasohibin 2 suppresses tumor angiogenesis and tumor growth (Xue et al. Oncogene. 2012 [ Epub head of print], Takahashi et al. Mol. Cancer Res. 10 (2012), 1135-1146.). Therefore, in an individual administered with an anti-angiogenic drug, angiogenesis in the tumor tissue is suppressed, and the growth of the tumor tissue is suppressed, so that the secretion amount of vasohibin 2 decreases and the blood vasohibin 2 amount changes. There seems to be a possibility.
  • the responsiveness to the drug in each individual can be predicted or actually administered by measuring the amount of fluctuation of blood Vasohibin 2 protein before and after the administration of these drugs. It is considered possible to evaluate the later efficacy.
  • the drug efficacy evaluation method is as follows: Step (A): A biological sample derived from a test individual after administration of a candidate compound for an anti-angiogenic drug is brought into contact with the antibody of the present invention or a fragment thereof to form a complex, and the abundance of the complex is determined. Step (B) of measuring: In the step of comparing the abundance measured in the step (A) with the abundance before administration, and in the comparison performed in the step (C): step (B), the candidate A step of determining that the candidate compound is highly likely to have a medicinal effect as an anti-angiogenic agent when the amount of the complex present after administration is less than that after administration of the compound.
  • the complex here means a complex of the antibody of the present invention or a fragment thereof and Vasohibin 2 protein.
  • test individuals include those similar to those described above.
  • test non-human experimental animals when evaluating the efficacy of a novel anti-angiogenic drug candidate substance and selecting an effective substance, test non-human experimental animals. It is preferable to use an individual.
  • test non-human experimental animals when it is determined by the medicinal efficacy evaluation method whether or not an anti-angiogenic drug is effective in the individual, it is preferable to use a human as the test individual.
  • step (B) the abundance obtained as described above is compared by performing a statistical analysis based on the abundance before administration of the candidate compound.
  • a statistical analysis method There is no limitation in particular as an analysis method, A well-known method can be used.
  • the subsequent step (C) for example, when the complex abundance in the sample after administration of the candidate compound is small compared to the complex abundance in the sample before administration, the candidate compound It is judged that there is a high possibility of showing an effect of suppressing angiogenesis as a new drug.
  • kits for evaluating the efficacy of an anti-angiogenic drug is provided.
  • kits of the present invention include those containing the antibody of the present invention or a fragment thereof. If the detection method uses the antibody of the present invention or a fragment thereof when detecting the Vasohibin 2 protein in a sample, the kit may be used. Can be used. Since the antibody of the present invention or a fragment thereof can recognize in vivo vasohibin 2 protein with good specificity, the use of the kit can greatly contribute to the evaluation of the efficacy of anti-angiogenic drugs.
  • MLTC-1 / wild type VASH2 culture supernatant significantly promoted HUVEC migration compared to Mock (p ⁇ 0.01), but MLTC-1 / mutant VASH2 culture supernatant compared to Mock Thus, no migration promoting effect was observed.
  • Reference Example 2 [Effect of Vasohibin-2 on Endothelial Cell Network Formation] To each well of the 24-well plate, 500 ⁇ L of growth factor-free Matrigel (BD Biosciences) was added for gelation, and then 7.5 ⁇ 10 4 HUVECs cultured in low serum medium for 17 hours (suspended in 500 ⁇ L). The culture supernatants of MLTC-1 / Mock, MLTC-1 / wild type VASH2, and MLTC-1 / mutant type VASH2 obtained in Reference Example 1 were added and incubated at 37 ° C. for 5 hours. did. The branch points of the formed network were randomly counted 5 times under a phase contrast microscope at 40 times, and the average value and standard deviation were calculated.
  • BD Biosciences growth factor-free Matrigel
  • the PBS addition group was a negative control, and the VEGF 20 ng / mL addition group was a positive control.
  • the results are shown in FIG. Endothelial cell network-forming ability testing is one of the typical in vitro angiogenesis assays.
  • amino acids of amino acid numbers 281 to 285 of the AY833422 polypeptide are related to the activity of promoting HUVEC migration.
  • An emulsion as an immunogen was prepared by mixing the hapten antigen of Vasohibin 2 with the same amount of complete adjuvant for the first immunization and incomplete adjuvant for the second and subsequent immunizations.
  • Monoclonal antibody was prepared as follows. Five-week-old female Balb / c mice were mixed intraperitoneally with 50 ⁇ g of hapten antigen per mouse mixed with an adjuvant such as FCA for each administration. Immunization was repeated at intervals of 2 weeks or more, and 50 ⁇ g of hapten antigen was administered from the tail vein as a final booster to mice with an increased antibody titer against the antigen peptide. Three days after the final boost, the spleen was removed from the mouse and spleen cells were prepared. Spleen cells and myeloma cells (p3.x63.Ag8.653) were fused using the PEG method to prepare hybridomas.
  • Each monoclonal antibody was purified from a serum-free medium of antibody-producing hybridoma or ascites obtained by administering the hybridoma to mice using a protein A column (MAPS II kit, Bio-Rad Laboratories Inc.).
  • Example 1 [Effect of monoclonal antibody on endothelial cell migration ability] MLTC-1 / wild-type VASH2 was seeded in a 24-well plate at 1 ⁇ 10 5 cells / well, cultured for 24 hours in a medium containing 0.5% serum, and then cultured in a low serum medium for 17 hours. Four were added to an insert with a pore size of 8 ⁇ m. At this time, mouse IgG, mouse antiserum (polyclonal antibody), and anti-human VASH2 monoclonal antibody clones 71, 1694, 1760, and 2356 were added to the lower chamber at a concentration of 5 ⁇ g / mL, respectively. After incubation at 37 ° C.
  • HUVEC that migrated to the lower surface of the membrane was stained with Giemsa staining.
  • the HUVEC moved to the lower surface was randomly counted five times at 200 times under an optical microscope, and the average value and standard deviation were calculated.
  • the group inoculated with MLTC-1 / Mock served as a negative control. The results are shown in FIG.
  • Example 2 [Effect of Monoclonal Antibody on Endothelial Cell Network Formation] To each well of the 24-well plate, 500 ⁇ L of growth factor-free Matrigel (BD Biosciences) was added for gelation, and then 7.5 ⁇ 10 4 HUVECs cultured in low serum medium for 17 hours (suspended in 500 ⁇ L). Turbidity) was seeded, and 500 ⁇ L of culture supernatant of MLTC-1 / wild type VASH2 was added.
  • growth factor-free Matrigel BD Biosciences
  • mouse IgG, mouse antiserum (polyclonal antibody), anti-human VASH2 monoclonal antibody clones 71 and 1760, or a partial peptide from amino acid numbers 207 (serine) to 219 (lysine) of AY832022 polypeptide were used as antigens.
  • the monoclonal antibody 5E3 was added to the lower chamber at a concentration of 5 ⁇ g / mL. After incubating at 37 ° C. for 5 hours, the branch points of the formed network were randomly counted 5 times under a phase contrast microscope at 40 times, and the average value and standard deviation were calculated.
  • the group inoculated with MLTC-1 / Mock served as a negative control. The results are shown in FIG.
  • Mouse IgG (5 mg / kg) or anti-human VASH2 monoclonal antibody clone 1760 (5 mg / kg) was intraperitoneally administered from the time when the tumor became measurable (diameter about 5 mm). Moreover, the tumor diameter was measured at the time of antibody administration, the tumor volume was calculated from major axis ⁇ minor axis ⁇ minor axis ⁇ 1/2, and the average value was calculated.
  • Antibody administration was performed a total of 6 times (0th day, 4th day, 7th day, 12th day, 15th day, 19th day), and the tumor was excised on the 22nd day after the start of treatment.
  • a representative photograph immediately before tumor removal is shown in FIG. 5, and changes in tumor volume are shown in FIG.
  • tumor growth was significantly suppressed (p ⁇ 0.05) compared to the mouse IgG administration group, and a 33% decrease in tumor volume was observed.
  • FIG. 7 shows a representative photograph of a tumor blood vessel
  • FIG. 8 shows a comparison of the cross-sectional areas.
  • SKOV-3 human ovarian serous adenocarcinoma cell line
  • the tumor diameter was measured at the time of antibody administration, the tumor volume was calculated from major axis ⁇ minor axis ⁇ minor axis ⁇ 1/2, and the average value was calculated.
  • Antibody administration was performed 5 times in total (0th day, 4th day, 7th day, 11th day, 14th day), and the tumor was excised on the 18th day from the start of treatment. The tumor volume on day 18 is shown in FIG.
  • FIG. 9 shows that the bevacizumab (5 mg / kg) administration group and the clone 1760 (25 mg / kg) administration group show almost the same tumor growth inhibitory effect.
  • FIG. 10 shows changes in tumor volume in the mouse IgG (5 mg / kg) administration group, clone 1760 (25 mg / kg) administration group, and bevacizumab (5 mg / kg) administration group.
  • FIG. 11 A representative photograph of a mouse IgG (5 mg / kg) administration group, clone 1760 (25 mg / kg) administration group, and bevacizumab (5 mg / kg) administration group is shown in FIG. 11, and a comparison of the cross-sectional areas thereof is shown in FIG.
  • the present inventors have revealed that Vasohibin 2 is expressed in human liver cancer and ovarian cancer, and tumor angiogenesis and tumor growth can be suppressed by knocking down the expression of Vasohibin 2.
  • the present inventors have previously established a monoclonal antibody 5E3 that recognizes amino acid numbers 207 to 219 of the AY833422 polypeptide, but there is no anti-vasohibin 2 antibody that has been reported to have neutralizing activity.
  • the anti-vasohibin 2 antibody of the present invention can suppress tumor growth. From the above, the antibody of the present invention is expected to be applied to cancer treatment and ophthalmic diseases for the purpose of controlling pathological angiogenesis.
  • the anti-vasohibin 2 antibody of the present invention can recognize the vasohibin 2 protein with good specificity and suppress the angiogenesis promoting action of the vasohibin 2 protein
  • a pharmaceutical composition containing the anti-vasohibin 2 antibody is for example, it is suitably used for the treatment of diseases that require angiogenesis suppression such as cancer.
  • Sequence number 1 of a sequence table is AY833422 polynucleotide.
  • Sequence number 2 of a sequence table is AY833422 polypeptide.

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Abstract

　配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２６９～２８８を認識する抗バソヒビン２抗体、遺伝子組換え抗バソヒビン２抗体、又はそれらの断片。本発明の抗バソヒビン２抗体は、バソヒビン２タンパク質を良好な特異性で認識し、バソヒビン２タンパク質の有する血管新生促進作用を抑制することができることから、抗バソヒビン２抗体を含有する医薬組成物は、例えば、がんなどの血管新生の抑制を要する疾患の治療などに好適に用いられる。

Description

抗バソヒビン２抗体
　本発明は、抗バソヒビン２抗体に関する。より詳しくは、バソヒビン２に特異的なモノクローナル抗体又はその断片、該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、該抗体の遺伝子組換え抗体又はその断片、前記抗体又はその断片を含有する血管新生抑制剤、治療用医薬組成物、及びがんの治療用医薬組成物、ならびに、前記抗体又はその断片を用いた抗血管新生薬の薬効評価方法及び該方法を実施するためのキット、に関する。
　血管新生とは、動物の組織又は器官において既存の細静脈、毛細血管からの血管内皮細胞の遊走、増殖及び管腔形成により新しい血管脈が形成される現象をいう。かかる現象は、動物の形態形成期や成長期のみならず、組織等の損傷の治癒、炎症の修復過程や月経周期に伴って生じるものであり、血管新生の促進因子と抑制因子の双方によりコントロールされ、該促進因子と抑制因子のバランスを保つことが血管の恒常性を保つのに重要である。
　しかしながら、腫瘍組織においては、血管新生促進因子が過剰発現することにより血管新生が亢進し、その結果、腫瘍組織のさらなる増大に繋がる。従って、抗がん治療としては、血管新生抑制因子や血管新生促進因子の阻害剤を投与する方法等が考えられる。
　バソヒビンは、本発明者らが見出したポリペプチドであり、バソヒビン１及びバソヒビン２がホモログ体として属する。これらのバソヒビンは、腫瘍細胞や間質細胞、マクロファージなどから分泌される血管新生促進因子(ＶＥＧＦ、ＦＧＦ－２等)の刺激により血管内皮細胞に発現し、内皮細胞自身にオートクライン的に作用して、血管新生を抑制する作用を有することが知られている（特許文献１、２参照）。
　一方で、本発明者らは、特許文献２に開示のバソヒビン２、即ち、ＡＫ０２２５６７タンパク質、ならびに該タンパク質のスプライシングバリアントである、ＢＣ０５１８５６タンパク質、ＢＣ０５３８３６タンパク質、ＢＣ０２８１９４タンパク質、及びＡＹ８３４２０２タンパク質には、がんや脳血管障害等の病態と同じような低酸素状態において、血管新生を促進する作用があることも見出し、報告している（特許文献３参照）。
ＷＯ２００２／０９０５４６号パンフレット ＷＯ２００６／０７３０５２号パンフレット ＷＯ２００９／０９６４２５号パンフレット
　本発明の課題は、バソヒビン２タンパク質に特異的な抗体又はその断片、該抗体を産生するハイブリドーマ、該抗体の遺伝子組換え抗体又はその断片、前記抗体又はその断片を含有する血管新生抑制剤及び治療用医薬組成物、ならびに、前記抗体又はその断片を用いた抗血管新生薬の薬効評価方法及び該方法を実施するためのキットを提供することにある。
　本発明者らは、鋭意検討した結果、バソヒビン２タンパク質の活性中心を特定するに至った。そしてバソヒビン２タンパク質のこの活性中心を含む特定エピトープに対するモノクローナル抗体を調製したところ、該モノクローナル抗体がバソヒビン２タンパク質と特異的に結合して、バソヒビン２タンパク質の有する血管新生作用を抑制することを見出し、本発明を完成するに至った。
　即ち、本発明は下記〔１〕～〔１０〕に関する。
〔１〕　配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２６９～２８８を認識する、抗バソヒビン２抗体又はその断片。
〔２〕　配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２６９～２８８を認識する、遺伝子組換え抗バソヒビン２抗体又はその断片。
〔３〕　配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２６９～２８８を認識する抗バソヒビン２モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
〔４〕　前記〔１〕又は〔２〕記載の抗体又はその断片を含有してなる、血管新生抑制剤。
〔５〕　前記〔１〕又は〔２〕記載の抗体又はその断片を含有してなる、医薬組成物。
〔６〕　前記〔４〕記載の血管新生抑制剤を含有してなる、血管新生の抑制を要する疾患の治療用医薬組成物。
〔７〕　工程(Ａ)：抗血管新生薬の候補化合物の投与後における被検個体由来の生体試料と、前記〔１〕又は〔２〕記載の抗体又はその断片とを接触させて複合体を形成させて、該複合体の存在量を測定する工程
工程(Ｂ)：前記工程(Ａ)で測定された存在量を、投与前における存在量と比較する工程、ならびに
工程(Ｃ)：前記工程(Ｂ)で行った比較において、該候補化合物の投与前に比べて投与後の方が該複合体の存在量が少ないと認められる場合に該候補化合物が抗血管新生薬として薬効を示している可能性が高いと判定する工程
を含む、抗血管新生薬の薬効評価方法。
〔８〕　前記〔１〕又は〔２〕記載の抗体又はその断片を含有してなる、抗血管新生薬の薬効評価用キット。
〔９〕　前記〔１〕又は〔２〕記載の抗体又はその断片の治療有効量を血管新生の抑制を要する疾患の治療を必要とする個体に投与する工程を含む、血管新生の抑制を要する疾患の治療方法。
〔１０〕　血管新生の抑制を要する疾患の治療または予防するための、前記〔１〕又は〔２〕記載の抗体又はその断片。
　本発明の抗バソヒビン２抗体又はその断片は、バソヒビン２タンパク質と良好な特異性で結合し、その血管新生促進作用を阻害できるという優れた効果を奏する。
図１は、バソヒビン２の内皮細胞の遊走能に対する効果を示す図である。 図２は、バソヒビン２の内皮細胞のチューブ形成に対する効果を示す図である。 図３は、モノクローナル抗体の内皮細胞の遊走能に対する効果を示す図である。 図４は、モノクローナル抗体の内皮細胞のチューブ形成に対する効果を示す図である。 図５は、モノクローナル抗体投与後のマウス腫瘍モデルにおける腫瘍形態を示す図である。左図がマウスＩｇＧ投与群、右図が抗ＶＡＳＨ２抗体（クローン１７６０）投与群である。 図６は、モノクローナル抗体投与後のマウス腫瘍モデルにおける腫瘍体積変化を示す図である。 図７は、モノクローナル抗体投与後のマウス腫瘍モデルにおける腫瘍の血管を示す図である。左図がマウスＩｇＧ投与群、右図が抗ＶＡＳＨ２抗体（クローン１７６０）投与群である。 図８は、モノクローナル抗体投与後のマウス腫瘍モデルにおける腫瘍の血管断面積の変化を定量的に示す図である。 図９は、マウスＩｇＧ、ベバシズマブ、又はモノクローナル抗体を投与後のマウス腫瘍体積を示す図である。 図１０は、マウスＩｇＧ、ベバシズマブ、又はモノクローナル抗体を投与後のマウス腫瘍モデルにおける腫瘍体積変化を示す図である。 図１１は、モノクローナル抗体投与後のマウス腫瘍モデルにおける腫瘍の血管を示す図である。(a)がマウスＩｇＧ投与群、(b)が抗ＶＡＳＨ２抗体（クローン１７６０）投与群、(c)がベバシズマブ投与群である。 図１２は、マウスＩｇＧ、ベバシズマブ、又はモノクローナル抗体を投与後のマウス腫瘍モデルにおける腫瘍の血管断面積の比率を定量的に示す図である。
　本発明の抗バソヒビン２抗体(以下、本発明の抗体ともいう)は、特定のアミノ酸配列を認識することによって、バソヒビン２タンパク質に特異的に結合するという特徴を有する。
　バソヒビン(Vasohibin)としては、バソヒビン１(Vasohibin-１)及びバソヒビン２(Vasohibin-２)が挙げられるが、本発明におけるバソヒビンとしては、バソヒビン２のことを指す。なお、特許文献１、２等に開示されているようにバソヒビン１とバソヒビン２は、異なる染色体上に存在する別の遺伝子であるが、それらの遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は５８％の相同性を有している。バソヒビン２としては、配列番号１で表される塩基配列からなるＡＹ８３４２０２ポリヌクレオチドによりコードされるバソヒビン２タンパク質、及び配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるＡＹ８３４２０２ポリペプチドのことをいう。
　本発明におけるエピトープ（抗原における決定基）としては、バソヒビン２タンパク質のアミノ酸番号２６９番目（Leu）から２８８番目（Arg）までの部分ペプチド、又はその一部を用いることができる。該部分ペプチドにおいて、例えば、２８１番目（Lys）から２８５番目（Lys）までの連続したアミノ酸５個をアラニン（Ala）４個に置換したバソヒビン２変異体を作製して細胞に発現させた場合、血管新生の促進が認められなかった。従って、前記アミノ酸番号２８１～２８５のアミノ酸を含む部分ペプチドは、血管新生を促進する作用の発現に関与すると考えられる。このため、バソヒビン２タンパク質の血管新生促進作用の中和抗体を作製するには、バソヒビン２タンパク質のアミノ酸番号２８１～２８５のアミノ酸を含む部分ペプチドをエピトープとすることが好ましい。ここで、抗体の作製に使用する抗原は、本発明の抗体が調製できる範囲で制限されず、前述の本発明におけるエピトープのいずれかを含むペプチドであればよい。すなわち、抗原は、本発明におけるエピトープよりも長いバソヒビン２タンパク質の部分ペプチドであっても、あるいは、本発明におけるエピトープのカルボキシル末端又はアミノ末端にバソヒビン２タンパク質と関連しないペプチドが結合したペプチドであってもよく、KLH、OVA、BSAのようなキャリアタンパクやIgGのFc領域と結合していてもよい。
　なお、本明細書において「血管新生」とは、既存の血管から血管内皮細胞が出芽し、組織に進入する形で毛細血管が形成される現象を意味する。形成過程は１）プロテアーゼによる血管基底膜の消化、２）血管内皮細胞の遊走・増殖、３）管腔形成の順に進行する。
　本発明の抗体としては、配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２６９～２８８を認識するものであればよい。即ち、アミノ酸番号２６９～２８８の部分ペプチドの全長に対し結合性を有するものであっても、その一部のアミノ酸に対し結合性を有するものであってもよいが、バソヒビン２タンパク質の血管新生促進作用を中和するための中和抗体としては、アミノ酸番号２８１～２８５のアミノ酸を含むエピトープに結合性を有するものが好ましい。なお、本発明の抗体は、配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２６９～２８８を認識する範囲で、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよいが、好ましい態様としてはモノクローナル抗体が挙げられる。本発明の抗体は、本明細書で説明する適切な抗原を使用し、当業者に周知の方法で取得することができる。例えば、ハイブリドーマにより産生されるバソヒビン２モノクローナル抗体又はその断片が挙げられる。
　ハイブリドーマを用いたモノクローナル抗体は、例えば以下に詳述する方法で調製できる。
　先ず、抗原を調製する。具体的には、バソヒビン２タンパク質の部分ペプチドLeu269-Arg288（以降、バソヒビン２部分ペプチドという）について、アミノ末端又はカルボキシル末端にシステイン残基を付加したペプチドを、公知の方法に従って合成する。得られたペプチドについて、マレイミド化したKLH〔Keyhole Limpet Hemocyanin、Imject(登録商標)Maleimide Activated mcKLH、ピアス社製〕を用いて、ペプチドのSH基を介してハプテン抗原を調製する。
　またさらに、家兎IgGのFc領域とバソヒビン２部分ペプチドとの融合タンパク(Fc融合バソヒビン２タンパク質)も、抗原として用いることができる。この融合タンパクは公知の方法に従って調製することができるが、例えば、Fc融合バソヒビン２タンパク質は、バソヒビン２部分ペプチドのアミノ末端又はカルボキシル末端にFcを付加したポリヌクレオチド配列を導入したプラスミドベクターを、例えば、Freestyle 293-F Cells(Invitrogen)に導入して一過的に発現させた後、プロテインＡカラムを用いて精製することにより調製することができる。なお、Fc融合バソヒビン２タンパク質の発現及び精製は、特に限定はなく公知の方法に従って行うことができる。
　次に、上記により得られた抗原を用いて哺乳動物を免疫する。哺乳動物としては、特に制限はないが、一般には、マウス、ラット、ウシ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、モルモット等を用いることができる。なかでも、マウス及びラットが好ましく、マウスがより好ましく、かかるマウスとしては、A/J系、BALB/C系、DBA/2系、C57BL/6系マウスが例示される。また、該哺乳動物の齢は、用いる動物種により異なり特に限定されないが、マウス又はラットの場合、通常約4～12週齢、好ましくは約5～10週齢である。なお、これらの哺乳動物は、本発明のモノクローナル抗体の製造のために、細胞融合される形質細胞との適合性を考慮して選択することができる。
　抗原は、免疫応答を増強させるためにアジュバントと混合して免疫原として使用される。アジュバントとしては、特に限定はなく公知のものを使用することができる。また、該アジュバントと抗原との混合は、用いるアジュバントについて当該分野で公知の方法に従うことができる。
　哺乳動物の免疫は、当該分野で公知の方法に従って行われる。例えば、免疫原を哺乳動物の皮下、皮内、静脈又は腹腔内に注射投与することによって行われる。また、免疫原の投与は、最初の免疫後に何回か繰り返して行われ、その投与間隔は適宜調整され得る。なお、免疫応答は、免疫される哺乳動物の種類及び系統によって異なるので、免疫スケジュール及び免疫原の投与量は、使用される動物に合わせて適切に設定され得る。
　かくして、免疫された哺乳動物体内において所望の抗体産生細胞を調製することができる。かかる抗体産生細胞としては、免疫原の最終投与の3～5日後に摘出した脾細胞が好ましい。なお、免疫された哺乳動物の脾臓を肥大させるために、ブースト(免疫原の追加注射)を行ってもよい。ブーストで投与される免疫原の量は、最初に投与される免疫原の量の約4～5倍とするのが望ましいが、これを目安として適宜増減することができる。
　得られた抗体産生細胞は、骨髄腫由来の細胞(ミエローマ細胞)と細胞融合させて、ハイブリドーマを調製する。
　ハイブリドーマの増殖能力は細胞融合に用いられるミエローマ細胞の種類に依存するので、ミエローマ細胞としては増殖能力の優れた細胞が好ましい。また、ミエローマ細胞は、融合させる抗体産生細胞の由来する哺乳動物と適合性があることが好ましい。かかる例としては、マウスミエローマP3U1、X63-Ag8.653等の骨髄腫細胞が例示される。
　細胞融合の方法は、当該分野で公知の方法を用いることができ、例えばポリエチレングリコール(PEG)を用いる方法、センダイウイルスを用いる方法、電気融合装置を用いる方法等が例示される。
　得られたハイブリドーマは、公知の方法に従って選択培地で培養することにより分離することができる。なお、選択されたハイブリドーマが所望の抗体を産生しているかどうかを確認するために、培養上清を採取して抗体価アッセイを公知の方法、例えば、DELFIA法に基づいて行うことができる。
　かくして、所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが得られる。該ハイブリドーマは、通常の培地で継代培養することができ、また液体窒素中で半永久的に保存することができる。
　ハイブリドーマから所望のモノクローナル抗体を取得するにあたっては、インビボ及びインビトロにおける培養法により大量調製することができる。インビトロ培養法は、ハイブリドーマを適当な血清培地若しくは無血清培地中で培養することにより実施でき、所望のモノクローナル抗体は培地中に産生される。この培養法によれば、比較的高純度の所望抗体を培養上清として得ることができる。また、インビボ培養法は、ハイブリドーマと適合性のある哺乳類動物、例えばマウスなどの腹腔内に、ハイブリドーマを注射接種して増殖することにより実施でき、所望抗体はマウス腹水として大量に回収することができる。
　なお、得られた培養上清及びマウスなどの腹水は、そのまま粗製抗体液として用いることができる。また、これらは常法に従って、例えば、DEAE陰イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、硫安分画法、PEG分画法、エタノール分画法などを適宜組合せることにより精製して、精製抗体とすることができる。
　かくして、配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２６９～２８８を認識するモノクローナル抗体を得ることができる。
　本発明では、前記方法により特定の抗体を産生するハイブリドーマを調製して用いてもよいが、例えば、独立行政法人　製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２丁目５番地８）に下記受託番号のもとで寄託された細胞を好適に使用することもできる。
ＮＩＴＥ　ＢＰ－１４７４　(表示１７６０、受託日２０１２年１１月２９日)
　前記抗体の断片としては、前記エピトープ、即ち、バソヒビン２タンパク質の２６９番目（Leu）から２８８番目（Arg）までの部分ペプチド、又はその一部に対する抗原結合断片を有するものであればよい。ここで、バソヒビン２タンパク質の血管新生促進作用を中和するための断片としては、アミノ酸配列２８１～２８５を含むエピトープに対する抗原結合断片を有するものが好ましい。その形態は特に限定されず、例えば、Fab、F(ab')2、Fab'、scFv、diabody、dsFv、及びCDRを含むペプチドなどが挙げられる。これらの抗体断片は、公知の技術に従って調製することができ、例えばパパイン（Fab断片の製造）やペプシン（F(ab')2断片の製造）などの酵素によるタンパク質分解酵素切断によって調製され得る。
　また、本発明の一態様として、本発明の抗体の遺伝子組換え抗バソヒビン２抗体又はその断片も提供される。
　遺伝子組換え抗体としては、配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２６９～２８８を認識するのであれば特に限定はなく、例えば、アミノ酸配列２６９～２８８の部分ペプチドの全長に対し結合性を有するものであっても、その一部のペプチドに対し結合性を有するものであってもよい。なお、バソヒビン２タンパク質の血管新生促進作用を中和するための中和抗体としては、アミノ酸配列２８１～２８５を含むエピトープに結合性を有するものが好ましい。遺伝子組換え抗体としては、例えば、抗体の投与対象個体において抗原性を低減できるように、抗体の投与対象がヒトの場合には、ヒト化抗体、ヒト抗体などが例示される。なお、本発明における遺伝子組換え抗体は、前記ハイブリドーマにより得られたモノクローナル抗体又はその断片を、公知の遺伝子組換え技術を用いて改変して取得することができる。
　ヒト化抗体としては、ヒト型キメラ抗体及びヒト型CDR（Complementarity Determining Region、相補性決定領域）移植抗体が挙げられる。ヒト型キメラ抗体は、例えば、前記モノクローナル抗体の重鎖可変領域（以下、VHと記す）と軽鎖可変領域（以下、VLと記す）、ヒト抗体の重鎖定常領域（以下、CHと記す）と軽鎖定常領域（以下、CLと記す）をコードする遺伝子を発現させることで調製することができる。ヒト型CDR移植抗体は、例えば、本発明の抗体のVH及びVLに対するCDRのアミノ酸配列をヒト抗体のVH及びVLの適切な位置に移植することで調製することができる。
　ヒト抗体としては、ヒト抗体ファージライブラリーやヒト抗体産生トランスジェニック動物から得られる抗体が挙げられる。なお、ヒト抗体ファージライブラリー及びヒト抗体産生トランスジェニック動物は公知の方法に従って調製することができる。
　また、遺伝子組換え抗体の断片としては、前記遺伝子組換え抗体の断片であればよく、本発明の抗体の断片と同様に、配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２６９～２８８からなる部分ペプチド、又はその一部に対する抗原結合断片を有するのであれば、その形態及び調製方法に特に限定はない。ここで、バソヒビン２タンパク質の血管新生促進作用を中和するための断片としては、アミノ酸配列２８１～２８５を含むエピトープに対する抗原結合断片を有するものが好ましい。
　本発明の抗体又は断片は、配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２６９～２８８を認識する範囲で、マンノース、フコース、ガラクトース、Ｎアセチルグルコサミン、Ｎアセチルノイラミン酸等の糖鎖で修飾されていてもよい。
　かくして、本発明の抗体又はその断片、及び、該抗体の遺伝子組換え抗体又はその断片が得られる。これらの抗体又はその断片は、ＡＹ８３４２０２ポリペプチドのアミノ酸配列のアミノ酸番号２６９～２８８を特異的に認識することから、バソヒビン２タンパク質と良好な結合性を示す。なお、本明細書において、これらの抗体又はその断片をまとめて、本発明の抗体又はその断片と記載することもある。
　本発明は、本発明の抗体又はその断片を含有する医薬組成物を提供する。本医薬組成物は、以下に説明するような血管新生抑制剤をはじめとした薬剤や治療用医薬組成物を一つの態様として含む。
　本発明はまた、本発明の抗体又はその断片を含有する血管新生抑制剤を提供する。
　本発明の血管新生抑制剤は、実質的に、本発明の抗体又はその断片により構成され、循環血中を介して送達された部位において、バソヒビン２タンパク質と結合することにより、バソヒビン２タンパク質が有する血管新生促進作用の発現を抑制するという効果を奏する。
　本発明の血管新生抑制剤は、循環血中に移行するのであれば、その投与形態は限定されない。
　また、本発明は、本発明の血管新生抑制剤を含有する、血管新生の抑制を要する疾患の治療用医薬組成物、即ち、治療剤を提供する。
　血管新生の抑制を要する疾患としては、血管新生を抑制することにより治療効果がみられる疾患であれば特に限定はないが、例えば、血管性疾患、炎症性疾患、眼内血管新生性疾患、生殖器官系疾患、中枢神経系疾患、がん等が挙げられる。具体的には、動脈硬化、高血圧、狭心症、閉塞性動脈硬化症、心筋梗塞、脳梗塞、糖尿病性血管障害、血管奇形、肝炎、肺炎、糸球体腎炎、甲状腺炎、骨髄炎、滑膜炎、骨破壊、軟骨破壊、リュウマチ、喘息、サルコイドーシス、クロウー深瀬症候群、パンヌス、アレルギー性浮腫、潰瘍、腹水、腹膜硬化、組織癒着、糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症、加齢黄斑変性症、子宮機能不全、胎盤機能不全、卵巣機能過亢進、濾胞性嚢胞、網膜症、脳卒中、血管性痴呆、アルツハイマー病、固形癌（例えば、卵巣癌、大腸癌）、血管腫、血管内皮腫、肉腫、カポジ肉腫及び造血器腫瘍等の悪性新生物が例示される。
　本発明の治療用医薬組成物としては、本発明の血管新生抑制剤を公知の医薬用担体と組み合わせて製剤化したものが挙げられる。また、本発明の治療用医薬組成物としては、本発明の抗体又はその断片以外に、本発明の抗体又はその断片と同じ用途に使用可能な他の成分、例えば公知の血管新生抑制作用を有する成分と配合することもできる。
　本発明の治療用医薬組成物の製造は、本発明の抗体又はその断片が循環血中を介して血管新生の抑制を要する部位に到達できるような剤型に製造できるのであれば、通常、本発明の血管新生抑制剤を薬学的に許容できる液状又は固体状の担体と配合することにより行われ、所望により溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等を加えて、錠剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、カプセル剤等の固形剤や、通常液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤とすることができる。また、使用前に適当な担体の添加によって液状となし得る乾燥品や、その他、外用剤とすることもできる。なお、医薬用担体は、治療剤の投与形態及び製剤形態に応じて選択することができ、特に限定はない。本明細書において、血管新生の抑制を要する部位とは、上記血管新生の抑制を要する疾患の発症部位を意味する。
　上記のような各種製剤形態での治療用医薬組成物は、それぞれ公知の医薬用担体などを利用して、適宜、常法により製造することができる。また、かかる治療用医薬組成物における本発明の抗体又はその断片の含有量は、その投与形態、投与方法などを考慮し、本発明の所望の効果の発現が得られ得るような量であればよく、特に限定されるものではない。本発明の治療用医薬組成物中の本発明の抗体又はその断片の含有量としては通常１～１００重量％程度である。なお、ここでいう本発明の抗体又はその断片の含有量とは、本発明の抗体及びその断片を複数種類含有する場合には合計含有量のことを意味する。
　本発明の治療用医薬組成物は、製剤形態に応じた適当な投与方法で投与される。投与方法も本発明の抗体又はその断片を循環血中を介して送達できるのであれば特に限定はなく、例えば内用、外用及び注射により投与することができる。本発明の治療用医薬組成物を注射により投与する場合は、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、皮内などに投与し得、外用により投与する場合は、例えば、座剤等の外用剤として、その適する投与方法により投与すればよい。
　本発明の治療用医薬組成物の投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的及び当該医薬組成物の投与対象である患者又は患獣の年齢、体重、症状によって適宜設定され一定ではない。また、投与は、所望の投与量範囲内において、１日内において単回で、又は数回に分けて行ってもよい。投与期間も任意である。
　本発明はまた、被験個体に、有効量の本発明の抗体又はその断片を投与することを含む、血管新生の抑制を要する疾患の治療方法を提供する。
　本明細書中において被験個体とは、好ましくは血管新生の抑制を必要とするヒトであるが、バソヒビン２タンパク質により血管新生が促進される哺乳動物であればよく、ウシ、ウマ、ヤギ等の家畜動物、イヌ、ネコ、ウサギ等のペット動物、又は、マウス、ラット、モルモット、サル等の実験動物であってもよい。
　また、本明細書中において有効量とは、本発明の抗体又はその断片を上記被験個体に投与した場合に、投与していない被験個体と比較して、血管新生が抑制される抗体又はその断片の量である。具体的な有効量としては、投与形態、投与方法、使用目的及び被験個体の年齢、体重、症状等によって適宜設定され一定ではない。
　本発明の血管新生の抑制を要する疾患の治療方法においては、有効量の本発明の抗体又はその断片をそのまま上記被験個体に投与してもよく、また、上記のような治療用医薬組成物等の医薬として投与してもよい。また、投与方法にも限定はなく、例えば、上記の治療用医薬組成物と同様に、経口投与や注射等により投与すればよい。
　本発明の治療方法によれば、前記の本発明の治療用医薬組成物の対象となる疾患を治療することができ、例えば、血管新生によって進展する疾患の治療を行う効果が発揮され得る。
　本発明は、本発明の抗体又はその断片を含有する、診断薬を提供する。本診断薬を用い、前記本発明の治療用医薬組成物の対象となる疾患を診断することができる。
　本発明者らは、バソヒビン２タンパク質ががん細胞で発現することを報告している（Xue et al. Oncogene. 2012 [Epub ahead of print], Takahashi et al. Mol. Cancer Res. 10 (2012), 1135-1146.参照）。従って、本発明の診断薬を用いることで、被験個体から採取した生体試料、例えば、血液、血漿、組織等においてバソヒビン２タンパク質の検出を行うことができ、検出されたバソヒビン２タンパク質の有無又はバソヒビン２タンパク質の量に基づいて、被験個体ががんをはじめとするバソヒビン２タンパク質２による血管新生によって進展する疾患に罹患しているか否かを診断することができる。例えば、被験個体から採取した生体試料において、本発明に係る診断薬を用いて検出したバソヒビン２タンパク質量と、健常対照個体から採取した生体試料において本発明に係る診断薬を用いて検出したバソヒビン２タンパク質量とを比較し、健常対照個体よりも、被験個体において有意にバソヒビン２タンパク質量が多い時に、被験個体が血管新生によって進展する疾患に罹患していると診断することができる。なお、本診断薬を使用した診断方法において、バソヒビン２タンパク質の検出方法、定量方法は当業者に周知の方法を用いることができる。
　また、本発明の一態様として、抗血管新生薬の薬効評価方法が提供される。
　本発明者らは、バソヒビン２タンパク質ががん細胞から分泌され、バソヒビン２をノックダウンすることで腫瘍血管新生と腫瘍増殖が抑制されることを報告している（Xue et al. Oncogene. 2012 [Epub ahead of print], Takahashi et al.  Mol. Cancer Res. 10 (2012), 1135-1146.参照）。従って、抗血管新生薬が投与された個体では、腫瘍組織における血管新生が抑制されて、腫瘍組織の増殖が抑制されるためにバソヒビン２の分泌量が減少し、血中バソヒビン２量が変化する可能性があると考えられる。各個体におけるがん細胞に対する抗血管新生薬の反応性は個体によって異なることが予想されるが、その反応性はまさにそれらの薬剤の持つ抗血管新生効果に反映される。従って、本発明の薬効評価方法において、これらの薬剤の投与の前後での血中バソヒビン２タンパク質の変動量を測定することにより、各個体における薬剤への反応性を予測したり、実際に投与した後の薬効を評価したりすることが可能になると考えられる。
　上記薬効評価方法は、具体的には、
工程(Ａ)：抗血管新生薬の候補化合物の投与後における被験個体由来の生体試料と、本発明の抗体又はその断片とを接触させて複合体を形成させて、該複合体の存在量を測定する工程
工程(Ｂ)：前記工程(Ａ)で測定された存在量を、投与前における存在量と比較する工程、ならびに
工程(Ｃ)：前記工程(Ｂ)で行った比較において、該候補化合物の投与前に比べて投与後の方が該複合体の存在量が少ないと認められる場合に該候補化合物が抗血管新生薬として薬効を示している可能性が高いと判定する工程
を含む。
　上記薬効評価方法の工程(Ａ)における複合体の存在量の測定は、本発明の抗体又はその断片を用いる方法であれば、当業者においては周知の方法を用いることができるが、サンドイッチELISA法が好ましい。なお、ここでいう複合体とは、本発明の抗体又はその断片とバソヒビン２タンパク質との複合体を意味する。また、被検個体としては、前記と同様のものが例示されるが、特に、新規抗血管新生薬候補物質の薬効を評価し、有効な物質を選別する場合は、ヒト以外の実験動物を被験個体とすることが好ましい。一方、本薬効評価方法によって、抗血管新生薬がその個体において有効か否かを判断する場合には、ヒトを被験個体とすることが好ましい。
　工程(Ｂ)において、上記により得られた存在量について、候補化合物の投与前における該存在量に基づいて統計学的な解析を行って比較を行う。解析方法としては、特に限定はなく、公知の方法を用いることができる。また、その後の工程(Ｃ)における判定は、例えば、該候補化合物の投与後の試料における複合体存在量が投与前の試料における複合体存在量と比べて少ない場合に、該候補化合物が抗血管新生薬として血管新生を抑える効果を示している可能性が高いと判断される。
　本発明の別の態様では、抗血管新生薬の薬効評価を行うためのキットが提供される。
　本発明のキットには、本発明の抗体又はその断片を含有するものが挙げられ、サンプル中のバソヒビン２タンパク質を検出する際に本発明の抗体又はその断片を用いる検出方法であれば、前記キットを用いることができる。本発明の抗体又はその断片は生体内バソヒビン２タンパク質を良好な特異性で認識することが可能であることから、該キットの使用は抗血管新生薬の薬効評価に大きな貢献をもたらすことができる。
　以下、実施例及び比較例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実施例に制限されるものではない。
参考例１〔バソヒビン２の内皮細胞の遊走能に対する効果〕
　ＭＬＴＣ－１細胞に、Ｍｏｃｋ遺伝子、野生型バソヒビン２（野生型ＶＡＳＨ２）としてＡＹ８３４２０２ポリペプチドをコードする遺伝子、変異型バソヒビン２（変異型ＶＡＳＨ２）としてＡＹ８３４２０２ポリペプチドのアミノ酸番号２８１～２８５のアミノ酸５個をアラニン４個に置換したポリペプチドをコードする遺伝子をそれぞれ導入し、得られた細胞（ＭＬＴＣ－１／Ｍｏｃｋ、ＭＬＴＣ－１／野生型ＶＡＳＨ２、ＭＬＴＣ－１／変異型ＶＡＳＨ２）を２４穴プレートに１×１０５個／ウェルずつ播種し、０．５％血清を含む培地で２４時間培養した。その後、低血清培地で１７時間培養した臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）５×１０４個をポアサイズ８μｍのインサートに添加し、３７℃で４時間インキュベートした後、メンブレンの下面に移動したＨＵＶＥＣをギムザ染色で染色した。下面に移動したＨＵＶＥＣを光学顕微鏡下に２００倍でランダムに５視野カウントしその平均値および標準偏差を算出した。結果を図１に示す。なお、内皮細胞の遊走能検査は、in vitroでの代表的な血管新生のアッセイ法の１つである。
　ＭＬＴＣ－１／野生型ＶＡＳＨ２の培養上清は、Ｍｏｃｋと比較して有意にＨＵＶＥＣの遊走を促進した（ｐ＜０．０１）が、ＭＬＴＣ－１／変異型ＶＡＳＨ２の培養上清ではＭｏｃｋと比較して遊走促進効果が観察されなかった。
参考例２〔バソヒビン２の内皮細胞のネットワーク形成に対する効果〕
　２４穴プレートの各ウェルに、５００μＬの成長因子非添加Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加してゲル化させ、その上に低血清培地で１７時間培養したＨＵＶＥＣ　７．５×１０４個（５００μＬに懸濁）を播種し、参考例１で得られたＭＬＴＣ－１／Ｍｏｃｋ、ＭＬＴＣ－１／野生型ＶＡＳＨ２、ＭＬＴＣ－１／変異型ＶＡＳＨ２の培養上清５００μＬをそれぞれ添加して３７℃で５時間インキュベートした。形成されたネットワークの分岐点を位相差顕微鏡下に４０倍でランダムに５視野カウントしその平均値および標準偏差を算出した。ＰＢＳ添加群を陰性コントロール、ＶＥＧＦ　２０ｎｇ／ｍＬ添加群を陽性コントロールとした。結果を図２に示す。なお、内皮細胞のネットワーク形成能検査は、in vitroでの代表的な血管新生のアッセイ法の１つである。
　ＭＬＴＣ－１／野生型ＶＡＳＨ２の培養上清を添加するとＨＵＶＥＣによるネットワーク形成はＭｏｃｋと比較して有意に促進されたが（ｐ＜０．０１）、ＭＬＴＣ－１／変異型ＶＡＳＨ２の培養上清を添加するとネットワーク形成促進効果が観察されなかった。
　これらより、ＡＹ８３４２０２ポリペプチドのアミノ酸番号２８１～２８５のアミノ酸は、ＨＵＶＥＣの遊走を促進する活性に関連することが明らかとなった。
調製例１〔モノクローナル抗体の調製〕
(抗原の調製)
　バソヒビン２タンパク質として、ＡＹ８３４２０２ポリペプチドのアミノ酸番号２８１～２８５のアミノ末端あるいはカルボキシル末端にシステイン残基を付加したペプチドをシグマアルドリッチ社にて合成し、それぞれをクローン７１、１６９４、１７６０、２３５６とした。得られた各ペプチドについて、マレイミド化したKLH〔Keyhole Limpet Hemocyanin、Imject(登録商標)Maleimide Activated mcKLH、ピアス社製〕を用いて、ペプチドのSH基を介してハプテン抗原を調製した。なお、ＡＹ８３４２０２ポリペプチドは、特許文献３に記載の方法に従って作製した。
(モノクローナル抗体の調製)
　バソヒビン２のハプテン抗原を、初回免疫には完全アジュバントと、２回目以降は不完全アジュバントと等量混和することにより、免疫原としての乳剤を調製した。
　モノクローナル抗体は以下のようにして作成した。５週齢の雌Ｂａｌｂ／c系マウスに、投与１回につき、一匹当り５０μｇのハプテン抗原をＦＣＡ等のアジュバントと混合し、腹腔内に投与した。２週間以上の間隔をおいて免疫を繰り返し、抗原ペプチドに対して抗体価の上昇したマウスに対して最終のブースターとして５０μｇのハプテン抗原を尾静脈より投与した。最終ブースト３日後にマウスより脾臓を摘出し、脾細胞を調製した。脾細胞とミエローマ細胞（ｐ３．ｘ６３．Ａｇ８．６５３)とをＰＥＧ法を用いて細胞融合を行い、ハイブリドーマを作製した。
　各モノクローナル抗体は、抗体産生ハイブリドーマの無血清培地あるいはハイブリドーマをマウスに投与して得られた腹水より、プロテインＡカラム（ＭＡＰＳ　ＩＩキット、Ｂｉｏ－Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ．）を用いて精製した。
実施例１〔モノクローナル抗体の内皮細胞の遊走能に対する効果〕
　ＭＬＴＣ－１／野生型ＶＡＳＨ２を２４穴プレートに１×１０５個／ウェルずつ播種し、０．５％血清を含む培地で２４時間培養した後、低血清培地で１７時間培養したＨＵＶＥＣ　５×１０４個をポアサイズ８μｍのインサートに添加した。この時マウスＩｇＧ、マウス抗血清（ポリクローナル抗体）、抗ヒトＶＡＳＨ２モノクローナル抗体のクローン７１、１６９４、１７６０、２３５６をそれぞれ５μｇ／ｍＬの濃度でｌｏｗｅｒ　ｃｈａｍｂｅｒに添加した。３７℃で４時間インキュベートした後、メンブレンの下面に移動したＨＵＶＥＣをギムザ染色で染色した。下面に移動したＨＵＶＥＣを光学顕微鏡下に２００倍でランダムに５視野カウントしその平均値および標準偏差を算出した。ＭＬＴＣ－１／Ｍｏｃｋを播種した群を陰性コントロールとした。結果を図３に示す。
　図３より、ポリクローナル抗体と各モノクローナル抗体を添加した群は、いずれもマウスＩｇＧ添加群と比較して有意に内皮細胞の遊走を抑制したが、クローン１７６０が最も抑制効果が強かった（ｐ＜０．０１）。
実施例２〔モノクローナル抗体の内皮細胞のネットワーク形成に対する効果〕
　２４穴プレートの各ウェルに、５００μＬの成長因子非添加Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加してゲル化させ、その上に低血清培地で１７時間培養したＨＵＶＥＣ　７．５×１０４個（５００μＬに懸濁）を播種し、ＭＬＴＣ－１／野生型ＶＡＳＨ２の培養上清５００μＬを添加した。この時マウスＩｇＧ、マウス抗血清（ポリクローナル抗体）、抗ヒトＶＡＳＨ２モノクローナル抗体のクローン７１、１７６０、あるいは以前にＡＹ８３４２０２ポリペプチドのアミノ酸番号２０７（セリン）～２１９（リジン）までの部分ペプチドを抗原として作成したモノクローナル抗体５Ｅ３をそれぞれ５μｇ／ｍＬの濃度でｌｏｗｅｒ　ｃｈａｍｂｅｒに添加した。３７℃で５時間インキュベートした後、形成されたネットワークの分岐点を位相差顕微鏡下に４０倍でランダムに５視野カウントしその平均値および標準偏差を算出した。ＭＬＴＣ－１／Ｍｏｃｋを播種した群を陰性コントロールとした。結果を図４に示す。
　図４より、クローン７１、１７６０、５Ｅ３を添加した群は、いずれもマウスＩｇＧ添加群と比較して有意にネットワーク形成を抑制したが、遊走実験と同様、クローン１７６０が最も抑制効果が高かった（ｐ＜０．０１）。なお、以前に作成していた別のアミノ酸配列を認識する抗ＶＡＳＨ２モノクローナル（５Ｅ３）には中和活性は認められなかった。
　以上の結果から、作製したモノクローナル抗体はバソヒビン２タンパク質に対する中和活性を有しており、このうちクローン１７６０が最も中和活性が高いことが明らかとなった。
実施例３〔マウス腫瘍モデル－１〕
　６～８週齢、雌のＢＡＬＢ－ｃヌードマウスの背部皮下に、ヒト卵巣漿液性腺癌細胞株（ＳＫＯＶ－３）１×１０６個を１００μＬのＰＢＳに懸濁して移植した（ｎ＝４）。腫瘍が計測可能になった時点（直径５ｍｍ程度）よりマウスＩｇＧ（５ｍｇ／ｋｇ）あるいは抗ヒトＶＡＳＨ２モノクローナル抗体のクローン１７６０（５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与した。また、抗体投与時に腫瘍径を計測し、長径×短径×短径×１／２より腫瘍体積を算出し、平均値を算出した。抗体投与は計６回(０日目、４日目、７日目、１２日目、１５日目、１９日目)行い、治療開始２２日目に腫瘍を摘出した。腫瘍摘出直前の代表的な写真を図５に、腫瘍体積の変化を図６に示す。
　図５及び６より、クローン１７６０投与群では、マウスＩｇＧ投与群と比較して有意に腫瘍増殖が抑制され（ｐ＜０．０５）、３３％の腫瘍体積減少を認めた。
　また、摘出した腫瘍の血管を免疫染色で可視化し、腫瘍面積における血管断面積比率を算出した。腫瘍血管の代表的な写真を図７に、その断面積の比較を図８に示す。
　図７及び８より、クローン１７６０投与群では、マウスＩｇＧ投与群と比較して有意な腫瘍の血管断面積の減少が認められ（ｐ＜０．０１）、個体レベルでの腫瘍血管新生抑制効果が確認された。
実施例４〔マウス腫瘍モデル－２〕
　６～８週齢、雌のＢＡＬＢ－ｃヌードマウスの背部皮下に、実施例３と同様にして、ヒト卵巣漿液性腺癌細胞株（ＳＫＯＶ－３）１×１０６個を移植した（ｎ＝８）。腫瘍が計測可能になった時点（直径５ｍｍ程度、約１週間後）よりマウスＩｇＧ（５ｍｇ／ｋｇ）あるいは抗ヒトＶＡＳＨ２モノクローナル抗体のクローン１７６０（１０、１５、２５、５０ｍｇ／ｋｇ）、血管新生阻害薬であるベバシズマブ（中外製薬社製、５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与した。また、抗体投与時に腫瘍径を計測し、長径×短径×短径×１／２より腫瘍体積を算出し、平均値を算出した。抗体投与は計５回(０日目、４日目、７日目、１１日目、１４日目)行い、治療開始１８日目に腫瘍を摘出した。１８日目の腫瘍体積を図９に示す。
　図９より、ベバシズマブ（５ｍｇ／ｋｇ）投与群とクローン１７６０（２５ｍｇ／ｋｇ）投与群はほぼ同程度の腫瘍増殖抑制効果を示すことが分かる。
　また、マウスＩｇＧ（５ｍｇ／ｋｇ）投与群、クローン１７６０（２５ｍｇ／ｋｇ）投与群、ベバシズマブ（５ｍｇ／ｋｇ）投与群の腫瘍体積の変化を図１０に示す。
　図１０より、ベバシズマブ投与群はマウスＩｇＧ投与群に対して腫瘍増殖がｐ＜０．０１６で抑制されたのに対し、クローン１７６０投与群では腫瘍増殖がｐ＜０．０１０で抑制されており、その抑制効果の推移もほぼ同じであることが分かる。
　さらに、摘出した腫瘍の血管を免疫染色で可視化し、腫瘍面積における血管断面積比率を算出した。マウスＩｇＧ（５ｍｇ／ｋｇ）投与群、クローン１７６０（２５ｍｇ／ｋｇ）投与群、ベバシズマブ（５ｍｇ／ｋｇ）投与群の代表的な写真を図１１に、その断面積の比較を図１２に示す。
　図１１及び１２より、クローン１７６０投与群では、ベバシズマブ（５ｍｇ／ｋｇ）投与群と同様に、マウスＩｇＧ投与群と比較して有意な腫瘍の血管断面積の減少が認められ（ｐ＜０．０１）、個体レベルでの腫瘍血管新生抑制効果が確認された。
　本発明者らは、バソヒビン２がヒトの肝癌や卵巣癌に発現し、そのバソヒビン２の発現をノックダウンすることで腫瘍血管新生や腫瘍の発育が抑制できることを明らかにしている。また、本発明者らは以前にＡＹ８３４２０２ポリペプチドのアミノ酸番号２０７～２１９までを認識するモノクローナル抗体５Ｅ３を樹立していたが、中和活性を報告されている抗バソヒビン２抗体はないことから、本発明において、本発明の抗バソヒビン２抗体が腫瘍の発育を抑制できる事を初めて明らかにした。以上より、本発明の抗体は、病的な血管新生の制御を目的としたがん治療や眼科疾患への応用が期待される。
　本発明の抗バソヒビン２抗体は、バソヒビン２タンパク質を良好な特異性で認識し、バソヒビン２タンパク質の有する血管新生促進作用を抑制することができることから、抗バソヒビン２抗体を含有する医薬組成物は、例えば、がんなどの血管新生の抑制を要する疾患の治療などに好適に用いられる。
配列表の配列番号１は、ＡＹ８３４２０２ポリヌクレオチドである。
配列表の配列番号２は、ＡＹ８３４２０２ポリペプチドである。

Claims (14)

  1. 　配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２６９～２８８を認識する、抗バソヒビン２抗体又はその断片。
  2. 　モノクローナル抗体である、請求項１記載の抗体又はその断片。
  3. 　受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－１４７４で示されるハイブリドーマにより産生される、請求項２記載の抗体又はその断片。
  4. 　配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２６９～２８８を認識する、遺伝子組換え抗バソヒビン２抗体又はその断片。
  5. 　配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２６９～２８８を認識する抗バソヒビン２モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
  6. 　受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－１４７４で示される、請求項５記載のハイブリドーマ。
  7. 　請求項１～４いずれかに記載の抗体又はその断片を含有してなる、血管新生抑制剤。
  8. 　請求項１～４いずれかに記載の抗体又はその断片を含有してなる、医薬組成物。
  9. 　請求項７記載の血管新生抑制剤を含有してなる、血管新生の抑制を要する疾患の治療用医薬組成物。
  10. 　血管新生の抑制を要する疾患が、がんであることを特徴とする請求項９に記載の治療用医薬組成物。
  11. 　工程(Ａ)：抗血管新生薬の候補化合物の投与後における被検個体由来の生体試料と、請求項１～４いずれかに記載の抗体又はその断片とを接触させて複合体を形成させて、該複合体の存在量を測定する工程
    工程(Ｂ)：前記工程(Ａ)で測定された存在量を、投与前における存在量と比較する工程、ならびに
    工程(Ｃ)：前記工程(Ｂ)で行った比較において、該候補化合物の投与前に比べて投与後の方が該複合体の存在量が少ないと認められる場合に該候補化合物が抗血管新生薬として薬効を示している可能性が高いと判定する工程
    を含む、抗血管新生薬の薬効評価方法。
  12. 　請求項１～４いずれかに記載の抗体又はその断片を含有してなる、抗血管新生薬の薬効評価用キット。
  13. 　請求項１～４いずれかに記載の抗体又はその断片の治療有効量を血管新生の抑制を要する疾患の治療を必要とする個体に投与する工程を含む、血管新生の抑制を要する疾患の治療方法。
  14. 　血管新生の抑制を要する疾患の治療または予防するための、請求項１～４いずれかに記載の抗体又はその断片。
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