CN101096661B - 来自嗜热棒状杆菌的氨基酸生物合成途径的抗热酶的基因 - Google Patents

来自嗜热棒状杆菌的氨基酸生物合成途径的抗热酶的基因 Download PDF

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Abstract

基于在多种微生物中所观察到的已知基因序列在氨基酸水平的保守区域，设计了一些复合引物组合，该已知基因对应于一种来自于Corynebacterium thermoaminogenes的编码L-氨基酸生物合成途径的酶的基因，在优选的情况下该酶在比谷氨酸棒状杆菌更高的温度下发挥功能。通过使用这些引物并且使用Corynebacteriumthermoaminogenes的染色体DNA作为模板进行了PCR。可用于获得扩增片段的引物被用作为引物，以进行从Corynebacteriumthermoaminogenes的染色体DNA质粒文库中选择含有一种靶DNA片段的克隆的筛选。

Description

来自嗜热棒状杆菌的氨基酸生物合成途径的抗热酶的基因
本申请是申请日为2000年10月4日，申请号为00816081.3，发明名称为“来自嗜热棒状杆菌的氨基酸生物合成途径的抗热酶的基因”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及到抗热酶的基因，特别是涉及到Corynebacteriumthermoaminogenes的L-氨基酸，例如L-谷氨酸的生物合成和吸收系统的基因，该菌类为一种嗜热棒状杆菌。
背景工艺
诸如L-谷氨酸这样的L-氨基酸的生产的当今主流为利用棒状杆菌的发酵生产。关于L-氨基酸的发酵生产，已经通过培育具有优良产量的菌株以及开发发酵工艺来尽力降低成本。尽管对于实现成本降低的传统努力主要针对于获得高产率，除了作为发酵成本所涉及因素的原材料之外，对在培养期间所产生的发酵热量进行冷却的能量也不可忽视。这就是说，考虑到用于发酵的为普通的微生物，由于微生物自身在发酵期间所产生的发酵热量会引起温度的升高并且发酵所需的酶由此可能会失活或者生产性细菌可能会因此而被杀死。因此，在发酵期间对培养基的冷却是必需的。由此，为降低冷却成本，多年以来一直在进行对高温发酵的研究。进一步，如果高温发酵成为可能，反应的速度也可能会提高。但是，对于L-氨基酸发酵，有效的高温培养迄今为止尚未实现。
Corynebac terium thermoaminogenes为一种归类于棒状细菌的细菌，它类似于谷氨酸棒状杆菌(乳发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum))，该菌株通常被用于L-氨基酸的发酵。然而，据显示其最佳生长温度为37-43℃，该温度高于谷氨酸棒状杆菌的最佳生长温度，即30-35℃，并且对于L-谷氨酸生产该最佳温度为42-45℃，该温度明显地偏向高温区域(Japanese Patent Laid-open(Kokai)No.63-240779/1988)。
与此同时，用于通过向其中引入一种L-氨基酸合成系统酶来增强棒状杆菌属和短杆菌属的L-氨基酸生产能力的工艺已被开发，该酶来自大肠杆菌或者谷氨酸棒状杆菌。这样的酶的例子包括，例如，柠檬酸合成酶(日本专利出版物(Kokoku)No.7-121228/1995)，该酶为L-谷氨酸生物合成途径的一种酶，这样的例子还包括谷氨酸脱氢酶(Japanese Patent Laid-open No.61-268185/1986)、异柠檬酸脱氢酶、乌头酸水合酶(Japanese Patent Laid-open No.63-214189)等等。
但是，任何来自嗜热棒状杆菌的L-氨基酸合成酶以及编码它们的基因均未被报道。
发明披露
本发明的一个目的为提供编码来自Corynebacteriumthermoaminogenes的酶的基因，在优选的情况下提供在高于谷氨酸棒状杆菌的对应温度下发挥功能的酶。
本发明的发明者进行了广泛的研究以期达到上述的目的。其结果，他们成功地分离了编码Corynebacterium thermoaminogenes的氨基酸生物合成途径的酶的基因或者编码参与细胞摄入氨基酸的蛋白的基因，并且由此实现了本发明。
简而言之，本发明提供了以下的方面。
(1)一种蛋白质，该蛋白质具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列或者为具有一个或多个氨基酸残基的替换、缺失、插入、添加或者反转的SEQ ID NO：2的氨基酸序列，该蛋白质具有异柠檬酸裂合酶活性并且在50℃下进行5分钟的热处理后表现出30％或者更高的残余活性。
(2)一种蛋白质，该蛋白质具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列或者为具有一个或多个氨基酸残基的替换、缺失、插入、添加或者反转的SEQ ID NO：4的氨基酸序列，该蛋白质涉及到来自Corynebacteriumthermoaminogenes的脂酰辅酶A羧化酶活性。
(3)一种蛋白质，该蛋白质具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列或者为具有一个或多个氨基酸残基的替换、缺失、插入、添加或者反转的SEQ ID NO：6的氨基酸序列，该蛋白质具有来自Corynebacteriumthermoaminogenes的DtsR活性。
(4)一种蛋白质，该蛋白质具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列或者为具有一个或多个氨基酸残基的替换、缺失、插入、添加或者反转的SEQ ID NO：8的氨基酸序列，该蛋白质具有来自Corynebacteriumthermoaminogenes的Dt sR活性。
(5)一种蛋白质，该蛋白质具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列或者为具有一个或多个氨基酸残基的替换、缺失、插入、添加或者反转的SEQ ID NO：10的氨基酸序列，该蛋白质在60℃所表现出的磷酸果糖激酶活性同在30℃相比与之等效或者比后者水平更高。
(6)一种蛋白质，该蛋白质具有SEQ ID NO：94的氨基酸序列或者为具有一个或多个氨基酸残基的替换、缺失、插入、添加或者反转的SEQ ID NO：94的氨基酸序列，该蛋白质具有赋予Corynebacteriumthermoaminogenes蔗糖同化能力的活性。
(7)一种蛋白质，该蛋白质具有SEQ ID NOS：17-20的氨基酸序列或者为具有一个或多个氨基酸残基的替换、缺失、插入、添加或者反转的SEQ ID NOS：17-20的氨基酸序列，该蛋白质具有的功能涉及到谷氨酸的摄取并且它来自于Corynebacteriumthermoaminogenes。
(8)一种蛋白质，该蛋白质具有SEQ ID NO：22的氨基酸序列或者为具有一个或多个氨基酸残基的替换、缺失、插入、添加或者反转的SEQ ID NO：22的氨基酸序列，该蛋白质具有来自Corynebacteriumthermoaminogenes的丙酮酸脱氢酶活性。
(9)一种蛋白质，该蛋白质具有SEQ ID NO：24的氨基酸序列或者为具有一个或多个氨基酸残基的替换、缺失、插入、添加或者反转的SEQ ID NO：24的氨基酸序列，该蛋白质具有来自Corynebacteriumthermoaminogenes的丙酮酸羧化酶活性。
(10)一种蛋白质，该蛋白质具有SEQ ID NO：26的氨基酸序列或者为具有一个或多个氨基酸残基的替换、缺失、插入、添加或者反转的SEQ ID NO：26的氨基酸序列，该蛋白质具有磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性并且在45℃下进行5分钟的热处理后表现出50％或者更高的残余活性。
(11)一种蛋白质，该蛋白质具有SEQ ID NO：28的氨基酸序列或者为具有一个或多个氨基酸残基的替换、缺失、插入、添加或者反转的SEQ ID NO：28的氨基酸序列，该蛋白质具有顺乌头酸酶活性并且在50℃下进行3分钟的热处理后表现出30％或者更高的残余活性。
(12)一种蛋白质，该蛋白质具有SEQ ID NO：30的氨基酸序列或者为具有一个或多个氨基酸残基的替换、缺失、插入、添加或者反转的SEQ ID NO：30的氨基酸序列，该蛋白质具有异柠檬酸脱氢酶活性并且在45℃下进行10分钟的热处理后表现出50％或者更高的残余活性。
(13)一种蛋白质，该蛋白质具有SEQ ID NO：32的氨基酸序列或者为具有一个或多个氨基酸残基的替换、缺失、插入、添加或者反转的SEQ ID NO：32的氨基酸序列，该蛋白质具有来自Corynebacterium thermoaminogenes的二氢硫辛酰胺脱氢酶活性。
(14)一种蛋白质，该蛋白质具有SEQ ID NO：34的氨基酸序列或者为具有一个或多个氨基酸残基的替换、缺失、插入、添加或者反转的SEQ ID NO：34的氨基酸序列，该蛋白质具有2-酮戊二酸脱氢酶活性并且在50℃下进行10分钟的热处理后表现出30％或者更高的残余活性。
(15)一种蛋白质，该蛋白质具有SEQ ID NO：80的氨基酸序列或者为具有一个或多个氨基酸残基的替换、缺失、插入、添加或者反转的SEQ ID NO：80的氨基酸序列，该蛋白质在42℃所表现出的谷氨酸脱氢酶活性同在37℃相比与之等效或者比后者水平更高。
(16)一种蛋白质，该蛋白质具有SEQ ID NO：90的氨基酸序列或者为具有一个或多个氨基酸残基的替换、缺失、插入、添加或者反转的SEQ ID NO：90的氨基酸序列，该蛋白质在37℃所表现出的柠檬酸合成酶活性同在23℃相比与之等效或者比后者水平更高。
(17)一种DNA，该DNA编码的蛋白质具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列或者为具有一个或多个氨基酸残基的替换、缺失、插入、添加或者反转的SEQ ID NO：2的氨基酸序列，并且该蛋白质具有异柠檬酸裂合酶活性。
(18)(17)中的DNA，该DNA为下列的(a1)或者(b1)中所定义的DNA：
(a1)一种含有序列表中的SEQ ID NO：1的核苷酸序列的DNA，
(b1)一种DNA，该DNA同序列表中的SEQ ID NO：1的核苷酸序列或者同基于该核苷酸序列的引物可在严格的条件下杂交，并且该DNA编码一种具有异柠檬酸裂合酶活性的蛋白质。
(19)一种DNA，该DNA编码的蛋白质具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列或者为具有一个或多个氨基酸残基的替换、缺失、插入、添加或者反转的SEQ ID NO：4的氨基酸序列，并且该蛋白质涉及到脂酰辅酶A羧化酶活性。
(20)(19)中的DNA，该DNA为下列的(a2)或者(b2)中所定义的DNA：
(a2)一种含有序列表中的SEQ ID NO：3的核苷酸序列的DNA，
(b2)一种DNA，该DNA同序列表中的SEQ ID NO：3的核苷酸序列或者同基于该核苷酸序列的引物可在严格的条件下杂交，并且该DNA编码一种涉及到脂酰辅酶A羧化酶活性的蛋白质。
(21)一种DNA，该DNA编码的蛋白质具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列或者为具有一个或多个氨基酸残基的替换、缺失、插入、添加或者反转的SEQ ID NO：6的氨基酸序列，并且该蛋白质具有DtsR活性。
(22)(21)中的DNA，该DNA为下列的(a3)或者(b3)中所定义的DNA：
(a3)一种含有序列表中的SEQ ID NO：5的核苷酸序列的DNA，
(b3)一种DNA，该DNA同序列表中的SEQ ID NO：5的核苷酸序列或者同基于该核苷酸序列的引物可在严格的条件下杂交，并且该DNA编码一种具有DtsR活性的蛋白质。
(23)一种DNA，该DNA编码的蛋白质具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列或者为具有一个或多个氨基酸残基的替换、缺失、插入、添加或者反转的SEQ ID NO：8的氨基酸序列，并且该蛋白质具有DtsR活性。
(24)(23)中的DNA，该DNA为下列的(a4)或者(b4)中所定义的DNA：
(a4)一种含有序列表中的SEQ ID NO：7的核苷酸序列的DNA，
(b4)一种DNA，该DNA同序列表中的SEQ ID NO：7的核苷酸序列或者同基于该核苷酸序列的引物可在严格的条件下杂交，并且该DNA编码一种具有DtsR活性的蛋白质。
(25)一种DNA，该DNA编码的蛋白质具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列或者为具有一个或多个氨基酸残基的替换、缺失、插入、添加或者反转的SEQ ID NO：10的氨基酸序列，并且该蛋白质具有磷酸果糖激酶活性。
(26)(25)中的DNA，该DNA为下列的(a5)或者(b5)中所定义的DNA：
(a5)一种含有序列表中的SEQ ID NO：9的核苷酸序列的DNA，
(b5)一种DNA，该DNA同序列表中的SEQ ID NO：9的核苷酸序列或者同基于该核苷酸序列的引物可在严格的条件下杂交，并且该DNA编码一种具有磷酸果糖激酶活性的蛋白质。
(27)一种DNA，该DNA编码的蛋白质具有SEQ ID NO：93的氨基酸序列或者为具有一个或多个氨基酸残基的替换、缺失、插入、添加或者反转的SEQ ID NO：93的氨基酸序列，并且该蛋白质具有蔗糖酶(invertase)活性。
(28)(27)中的DNA，该DNA为下列的(a6)或者(b6)中所定义的DNA：
(a6)一种含有序列表中的SEQ ID NO：93的核苷酸序列的DNA，
(b6)一种DNA，该DNA同序列表中的SEQ ID NO：93的核苷酸序列或者同基于该核苷酸序列的引物可在严格的条件下杂交，并且该DNA编码一种具有蔗糖酶活性的蛋白质。
(29)一种DNA，该DNA编码的蛋白质具有SEQ ID NOS：17-20的氨基酸序列或者为具有一个或多个氨基酸残基的替换、缺失、插入、添加或者反转的SEQ ID NOS：17-20的氨基酸序列，并且该蛋白质具有参与谷氨酸摄入的功能。
(30)(29)中的DNA，该DNA为下列的(a7)或者(b7)中所定义的DNA：
(a7)一种含有序列表中的SEQ ID NO：16的核苷酸序列的DNA，
(b7)一种DNA，该DNA同序列表中的SEQ ID NO：16的核苷酸序列或者同基于该核苷酸序列的引物可在严格的条件下杂交，并且该DNA编码一种具有参与谷氨酸摄入的功能的蛋白质。
(31)一种DNA，该DNA编码的蛋白质具有SEQ ID NO：22的氨基酸序列或者为具有一个或多个氨基酸残基的替换、缺失、插入、添加或者反转的SEQ ID NO：22的氨基酸序列，并且该蛋白质具有丙酮酸脱氢酶活性。
(32)(31)中的DNA，该DNA为下列的(a8)或者(b8)中所定义的DNA：
(a8)一种含有序列表中的SEQ ID NO：21的核苷酸序列的DNA，
(b8)一种DNA，该DNA同序列表中的SEQ ID NO：21的核苷酸序列或者同基于该核苷酸序列的引物可在严格的条件下杂交，并且该DNA编码一种具有丙酮酸脱氢酶活性的蛋白质。
(33)一种DNA，该DNA编码的蛋白质具有SEQ ID NO：24的氨基酸序列或者为具有一个或多个氨基酸残基的替换、缺失、插入、添加或者反转的SEQ ID NO：24的氨基酸序列，并且该蛋白质具有丙酮酸羧化酶活性。
(34)(33)中的DNA，该DNA为下列的(a9)或者(b9)中所定义的DNA：
(a9)一种含有序列表中的SEQ ID NO：23的核苷酸序列的DNA，
(b9)一种DNA，该DNA同序列表中的SEQ ID NO：23的核苷酸序列或者同基于该核苷酸序列的引物可在严格的条件下杂交，并且该DNA编码一种具有丙酮酸羧化酶活性的蛋白质。
(35)一种DNA，该DNA编码的蛋白质具有SEQ ID NO：26的氨基酸序列或者为具有一个或多个氨基酸残基的替换、缺失、插入、添加或者反转的SEQ ID NO：26的氨基酸序列，并且该蛋白质具有磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性。
(36)(35)中的DNA，该DNA为下列的(a10)或者(b10)中所定义的DNA：
(a10)一种含有序列表中的SEQ ID NO：25的核苷酸序列的DNA，
(b10)一种DNA，该DNA同序列表中的SEQ ID NO：25的核苷酸序列或者同基于该核苷酸序列的引物可在严格的条件下杂交，并且该DNA编码一种具有磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性的蛋白质。
(37)一种DNA，该DNA编码的蛋白质具有SEQ ID NO：28的氨基酸序列或者为具有一个或多个氨基酸残基的替换、缺失、插入、添加或者反转的SEQ ID NO：28的氨基酸序列，并且该蛋白质具有顺乌头酸酶活性。
(38)(37)中的DNA，该DNA为下列的(a11)或者(b11)中所定义的DNA：
(a11)一种含有序列表中的SEQ ID NO：27的核苷酸序列的DNA，
(b11)一种DNA，该DNA同序列表中的SEQ ID NO：27的核苷酸序列或者同基于该核苷酸序列的引物可在严格的条件下杂交，并且该DNA编码一种具有顺乌头酸酶活性的蛋白质。
(39)一种DNA，该DNA编码的蛋白质具有SEQ ID NO：30的氨基酸序列或者为具有一个或多个氨基酸残基的替换、缺失、插入、添加或者反转的SEQ ID NO：30的氨基酸序列，并且该蛋白质具有异柠檬酸脱氢酶活性。
(40)(39)中的DNA，该DNA为下列的(a12)或者(b12)中所定义的DNA：
(a12)一种含有序列表中的SEQ ID NO：27的核苷酸序列的DNA，
(b12)一种DNA，该DNA同序列表中的SEQ ID NO：27的核苷酸序列或者同基于该核苷酸序列的引物可在严格的条件下杂交，并且该DNA编码一种具有异柠檬酸脱氢酶活性的蛋白质。
(41)一种DNA，该DNA编码的蛋白质具有SEQ ID NO：32的氨基酸序列或者为具有一个或多个氨基酸残基的替换、缺失、插入、添加或者反转的SEQ ID NO：32的氨基酸序列，并且该蛋白质具有二氢硫辛酰胺脱氢酶活性。
(42)(41)中的DNA，该DNA为下列的(a13)或者(b13)中所定义的DNA：
(a13)一种含有序列表中的SEQ ID NO：31的核苷酸序列的DNA，
(b13)一种DNA，该DNA同序列表中的SEQ ID NO：31的核苷酸序列或者同基于该核苷酸序列的引物可在严格的条件下杂交，并且该DNA编码一种具有二氢硫辛酰胺脱氢酶活性的蛋白质。
(43)一种DNA，该DNA编码的蛋白质具有SEQ ID NO：34的氨基酸序列或者为具有一个或多个氨基酸残基的替换、缺失、插入、添加或者反转的SEQ ID NO：34的氨基酸序列，并且该蛋白质具有2-酮戊二酸脱氢酶活性。
(44)(43)中的DNA，该DNA为下列的(a14)或者(b14)中所定义的DNA：
(a14)一种含有序列表中的SEQ ID NO：33的核苷酸序列的DNA，
(b14)一种DNA，该DNA同序列表中的SEQ ID NO：33的核苷酸序列或者同基于该核苷酸序列的引物可在严格的条件下杂交，并且该DNA编码一种具有2-酮戊二酸脱氢酶活性的蛋白质。
(45)一种DNA，该DNA编码的蛋白质具有SEQ ID NO：80的氨基酸序列或者为具有一个或多个氨基酸残基的替换、缺失、插入、添加或者反转的SEQ ID NO：80的氨基酸序列，并且该蛋白质在42℃所表现出的谷氨酸脱氢酶活性同在37℃相比与之等效或者比后者水平更高。
(46)(45)中的DNA，该DNA为下列的(a15)或者(b15)中所定义的DNA：
(a15)一种含有序列表中的SEQ ID NO：79的核苷酸序列的DNA，
(b15)一种DNA，该DNA同序列表中的SEQ ID NO：79的核苷酸序列或者同基于该核苷酸序列的引物可在严格的条件下杂交，并且该DNA编码的蛋白质在42℃所表现出的谷氨酸脱氢酶活性同在37℃相比与之等效或者比后者水平更高。
(47)一种DNA，该DNA编码的蛋白质具有SEQ ID NO：90的氨基酸序列或者为具有一个或多个氨基酸残基的替换、缺失、插入、添加或者反转的SEQ ID NO：90的氨基酸序列，并且该蛋白质在37℃所表现出的柠檬酸合成酶活性同在23℃相比与之等效或者比后者水平更高。
(48)(47)中的DNA，该DNA为下列的(a16)或者(b16)中所定义的DNA：
(a15)一种含有序列表中的SEQ ID NO：89的核苷酸序列的DNA，
(b15)一种DNA，该DNA同序列表中的SEQ ID NO：89的核苷酸序列或者同基于该核苷酸序列的引物可在严格的条件下杂交，并且该DNA编码的蛋白质在37℃所表现出的柠檬酸合成酶活性同在23℃相比与之等效或者比后者水平更高。
(49)一种用于产生L-氨基酸的方法，该方法包括培养一种微生物体以在培养基中产生和积累L-氨基酸，并且从该培养基中收集L-氨基酸，该微生物体中引入了(17)到(48)中任意一种的DNA。
术语“本发明的DNA”在此后被用于指上述的DNA之一或者全部。
在后文中将对本发明进行详细解释。
表1所示为本发明的DNA的核苷酸序列，基因的名称以及本发明的DNA所编码的蛋白质。
核苷酸序列 基因名称 编码蛋白(缩写)
SEQ ID NO：1SEQ ID NO：3SEQ ID NO：5SEQ ID NO：7SEQ ID NO：9SEQ ID NO：11、13、15、93SEQ ID NO：16SEQ I DNO：21SEQ ID NO：23SEQ ID NO：25SEQ ID NO：27SEQ ID NO：29SEQ ID NO：31SEQ ID NO：33SEQ ID NO：79SEQ ID NO：89 aceAaccBCdtsR1dtsR2pfkscrBgluABCDpdhApcppcacnicdlpdodhAgdhgltA 异柠檬酸裂合酶(ICL)脂酰辅酶A羧化酶BC亚基DTSR1蛋白DTSR2蛋白磷酸果糖激酶蔗糖酶谷氨酸摄入系统丙酮酸脱氢酶丙酮酸羧化酶磷酸烯醇丙酮酸羧化酶顺乌头酸酶异柠檬酸脱氢酶二氢硫辛酰胺脱氢酶2-酮戊二酸脱氢酶谷氨酸脱氢酶柠檬酸合成酶
SEQ ID NOS：3、23、25、31和33的开放读码框架(ORF)以及SEQ ID NO：16的第四个ORF均由GTG开始。尽管由这些GTG所编码的氨基酸在序列表中被示为缬氨酸，但它们有可能为甲硫氨酸。
SEQ ID NO：16的序列含有4个ORF，它们从5’末端按顺序对应于gluA、gluB、gluC和gluD。
上述的DNA序列分离自Corynebacterium thermoaminogenesAJ12310菌株(FERM BP-1542)的染色体DNA。然而，在SEQ ID NOS：11和13中所示的DNA序列分别分离自Corynebacteriumthermoaminogenes AJ12340菌株(FERM BP-1539)和AJ12309菌株(FERM BP-1541)，它们分别具有蔗糖酶活性以及蔗糖同化特性，这是因为AJ12310菌株不具有蔗糖酶活性以及蔗糖同化特性，并且分离自该菌株的scrB基因不具有任何开放读码框架。
Corynebacterium thermoaminogenes AJ12310菌株(亦称为YS-314菌株)以及AJ12309菌株(亦称为YS-155菌株)于1987年3月13日保存于National Institute of Bioscience and Human-Technology，Agency of Industrial Scienceand Technology，Ministry of International Trade and Industry(1-3，Higashi1-chome，Tsukuba shi，Ibaraki-ken，Japan，邮编：305-8566)并且分别被分配以保存号FERM P-9246和FERM P-9245。随后，它们于1987年10月27日根据布达佩斯协定移送至国际保存(international despositon)并且分别被分配以保存号FERM BP-1542和FERM BP-1541。
AJ12340菌株(亦称为YS-40菌株)于1987年3月10日保存于National Institute of Bioscience and Human-Technology，Agencyof Industrial Scienceand Technology，Ministry ofInternational Trade and Industry(1-3，Higashi1-chome，Tsukubashi，Ibaraki-ken，Japan，邮编：305-8566)并且被分配以保存号FERM P-9277。随后，它于1987年10月27日根据布达佩斯协定移送至国际保存并且分别被分配以保存号FERM BP-1539。
SEQ ID NOS：11、13和15中所示的核苷酸序列为scrB的部分序列，并且SEQ ID NOS：11和13编码在SEQ ID NOS：12和14中所示的蔗糖酶的部分氨基酸序列。
含有一种靶基因的一个部分片段的DNA序列，可通过对已经报道的多种微生物中的该靶基因的核苷酸序列进行比较，以对高度保守的核苷酸序列进行选择，并且使用基于该区域的核苷酸序列而设计的引物以及使用Corynebacterium thermoaminogenes的染色体DNA作为模板进行PCR反应而获得，这样的微生物的例子如乳发酵短杆菌。进一步，通过使用所获得的DNA片段或者基于该片段序列而制备的探针进行杂交而对Corynebacterium thermoaminogenes的染色体DNA文库进行筛选，可以获得含有全长的该基因的DNA片段。一种含有该全长基因的DNA片段也可以通过使用所获得的该基因的部分片段进行基因组步移而获得。该基因组步移可通过使用一种商业化的试剂盒而进行，例如Takara LA PCR体外克隆试剂盒(Takara Shuro制造)。
例如，编码谷氨酸脱氢酶的DNA(后文中该DNA亦称为“gdh”，该酶亦称为“GDH”)的部分序列可通过PCR(聚合酶链反应)而从Corynebacterium thermoaminogenes，例如，从Corynebacteriumthermoaminogenes AJ12310菌株中获得，该PCR使用染色体DNA作为模板并且使用具有序列表中的SEQ ID NOS：77和78中的核苷酸序列的引物而进行。进一步，完整的gdh基因可通过使用所获得的部分片段进行的基因组步移来获得。
进一步，编码柠檬酸合成酶的DNA(后文中该DNA亦称为“gltA”，该酶亦称为“CS”)的部分序列可通过PCR(聚合酶链反应)而从Corynebacterium thermoaminogenes，例如，从Corynebacteriumthermoaminogenes AJ12310菌株中获得，该PCR使用染色体DNA作为模板并且使用具有序列表中的SEQ ID NOS：83和84中的核苷酸序列的引物而进行。进一步，完整的gltA基因可通过使用所获得的部分片段进行的基因组步移来获得。
上述的引物的核苷酸序列基于一种区域中的核苷酸序列进行设计，所述的区域含有多种微生物已经报道的gdh基因或者gltA基因中的高度保守的核苷酸序列，该区域通过对这些基因进行比较而发现。
对于编码其它酶的DNA序列，编码这些酶的部分片段可使用在表1中提及的引物以类似的方式获得，并且全长的该基因可通过使用所获得的该部分片段而获得。
尽管本发明的DNA可根据上述方法而获得，但该DNA还可以从Corynebacterium thermoaminogenes的一个染色体DNA文库中通过使用一种寡核苷酸作为探针而获得，该寡核苷酸的制备基于本发明的DNA的核苷酸序列。
用于染色体DNA的制备的方法、染色体DNA文库的结构、杂交、PCR、质粒DNA的制备、DNA的消化和连接、转化等等的描述见Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，Maniatis，T.，Molecular Cloning，ColdSpring Harbor Laboratory Press，1.21(1989)。进一步，基因组步移可通过使用商业化的试剂盒而进行，例如Takara LA PCR体外克隆试剂盒(Takara Shuro制造)。
用于获得本发明的DNA的具体方法将在下文中进行解释。
首先，以一种适当的内切酶，例如Sau3AI，对Corynebacteriumthermoaminogenes的染色体DNA进行消化，并且通过琼脂糖凝胶电泳进行分离以获得一种约4到6kb的DNA片段。将所获得的DNA片段插入克隆载体，例如pHSG399，并且以所获得的重组质粒对大肠杆菌进行转化以产生染色体DNA的质粒文库。
另外，生产一些引物以用于通过PCR从质粒文库中选择含有靶基因的克隆。这些引物的设计基于来自多种微生物体的对应于目的基因的保守氨基酸区域。在这些引物的设计中，一些引物组出于棒状杆菌的密码子使用性的考虑而进行设计。
随后，为检测所产生引物的合理性，使用这些引物并且使用Corynebacterium thermoaminogenes的染色体DNA作为模板而进行了PCR。进一步，使用可获得扩增片段的引物作为筛选引物并且使用由该质粒文库中制备的重组质粒作为模板来进行PCR，以对含有靶DNA片段的克隆进行选择。这一操作过程的快速进行可通过对每个含有数十个转化子菌株的批次进行初级筛选，并且对获得了扩增片段的批次进行茵落PCR来进行次级筛选而完成。所扩增基因的片段长度示于表2到7。
通过从根据上法所选出的转化子中制备重组DNA、使用双脱氧终止法测定该插入片段的核苷酸序列并且以该核苷酸序列同已知基因序列进行比较，来证实是否根据上述方法所选出的转化子含有该靶基因。
当所获得的DNA片段含有该靶基因的一部分时，通过基因组步移来获得被缺失的部分。
本发明的DNA可能编码一个含有一个或者多个氨基酸残基的替换、缺失、插入、添加或者反转的蛋白质，只要所编码的蛋白质具有其原功能便可。“多个”所指的数量可根据蛋白质三维结构中的位置或者氨基酸残基的种类而变化。但是，在通常的情况下这样的一种蛋白质优选地表现出同蛋白质全部氨基酸序列具有30到40％或更多的同源性，在更优选的情况下为55到65％或更多。更具体的情况下，术语“多个”所示的数目为2到数百，在优选的情况下为2到数十，更优选的情况下为2到10。
核苷酸和氨基酸序列的分析通过，例如，由Lipman和Peason所开发出的方法来进行(Science，227，1435-1441，1985)，该方法使用商业化的软件进行，例如Genetyx-Mac计算机程序(SoftwareDevelopment Co.，Tokyo，Japan)。
GDH可能同组成GDH的全部氨基酸序列表现出40％到80％或更多的同源性，在优选的情况下为80到90％或更多，并且在42℃下表现出同在37℃下等同或者更高的活性。在这一情况下，该术语“多个”指的数量为2到30，在优选的情况下为2到50，更优选的情况下为2到10。
CS可能同组成CS的全部氨基酸序列表现出40％到80％或更多的同源性，在优选的情况下为80到90％或更多，并且在37℃下表现出同在23℃下等同或者更高的活性。在这一情况下，该术语“多个”指的数量为2到300，在优选的情况下为2到50，更优选的情况下为2到10。
一种编码与上述源蛋白质基本相同的蛋白的DNA，可通过例如，通过诸如定点突变这样的方法对核苷酸进行修饰以使一个特定位置的一个或多个氨基酸残基参与替换、缺失、插入、添加或者反转来获得。上述的经修饰的DNA还可能通过传统的已知突变处理来获得。该突变处理包括一种用于在体外处理编码靶基因的DNA的方法，例如，以羟胺进行，还包括一种以紫外照射或者通常用于突变处理的突变试剂处理携带有编码靶基因的DNA的微生物的方法，例如，处理属于大肠杆菌属的细菌，该突变试剂的例子如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)和亚硝酸。
上述的核苷酸的替换、缺失、插入、添加或反转还包括由于Corynebacterium thermoaminogenes的菌株差异所造成的突变体或变体等。
一种编码与上述源蛋白质基本相同的蛋白的DNA，可通过在适当的细胞中表达有突变的DNA并检测该被表达产物蛋白的活性或功能而获得。该编码与源蛋白质基本相同的蛋白的DNA还可通过，例如，从编码具有突变的蛋白质的DNA中或从携带该DNA的细胞中分离一种可同具有某种核苷酸序列的DNA或者探针在严格条件下杂交的DNA来进行，该核苷酸序列为在表1中所提及的序列号的序列或其编码区域，该探针基于该核苷酸序列而设计，所分离的DNA编码的蛋白质具有该蛋白质原初具有的功能。该活性在优选的情况下对于GDH指42℃下的酶活性或者对于CS指37℃下的酶活性。
通过使用适当的引物而进行的PCR，上述的探针可从任意一个具有表1所示的序列号的核苷酸序列的DNA中或者具有任一该核苷酸序列的DNA制备。
“严格条件”在此处指的是一种条件，在该条件下形成所谓的特异性杂交体并且不能形成非特异性杂交体。使用任何数值来清楚地表述该条件都是很困难的。但是，例如，该严格条件包括一种条件，在该条件下具有高同源性的DNA，例如具有不低于50％的同源性的DNA之间可以互相杂交，并且在该条件下所具有的同源性低于上值的DNA之间不能杂交。或者，严格条件的例子为一种条件，在该条件下DNA的相互杂交所处的盐浓度对应于Southern杂交的普通洗涤条件，即，60℃、1×SSC、0.1％的SDS，在优选的情况下为0.1×SSC、0.1％的SDS。
可在上述条件下进行杂交的基因，包括在其中产生了终止密码子的基因以及由于活性位点的突变而无活性的基因。但是，这样的基因可以通过将其同商业化的活性表达载体相连接并且测量其活性或功能而被简单的除去。
对应于本发明的各DNA的蛋白质可通过在适当的宿主-载体系统中表达该DNA而产生。
作为用于基因表达的宿主，多种原核细胞可被提及，包括乳发酵短杆茵(谷氨酸棒状杆菌)、诸如Corynebacterium thermoaminogenes这样的棒状杆菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆茵等等，以及多种真核细胞，包括酿酒酵母、动物细胞和植物细胞。这些细胞中，原核细胞，特别是棒状杆菌和大肠杆菌是优选的。
如果本发明的DNA同一种可在大肠杆菌和/或棒状杆菌细胞中自行复制的载体DNA连接而形成了重组DNA，并且该重组子DNA被引入了一种大肠杆菌细胞，随后的步骤便会变得简单。在大肠杆菌细胞中自行复制的载体在优选的情况下为一种可在宿主细胞中自行复制的质粒载体，该质粒载体的例子包括pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG399、pHSG398、RSF1010等。
作为可在棒状杆菌细胞中自行复制的载体，可提及的有pAM330(参考Japanese Patent Laid-open No.58-67699/1983)、pHM1519(参考Japanese Patent Laid-open No.58-77895/1983)等。而且，如果将具有制造可在棒状杆菌细胞中自行复制的质粒的能力的DNA片段从这些质粒中取出并插入上述用于大肠杆菌的载体中，所产生的载体可被用作为所谓的穿梭载体，该载体在大肠杆菌和棒状杆菌中均可自行复制。
这样的穿梭载体的例子包括下文提及的载体。所示的还有携带这些载体的微生物以及括号中的这些微生物在国际保存库(international depositories)中的获取号。
pAJ655   大肠杆菌AJ11882(FERM BP-136)
谷氨酸棒状杆菌SR8201(ATCC39135)
pAJ1844  大肠杆菌AJ11883(FERM BP-137)
谷氨酸棒状杆菌SR8202(ATCC39136)
pAJ611   大肠杆菌AJ11884(FERM BP-138)
pAJ3148  谷氨酸棒状杆菌SR8203(ATCC39137)
pAJ440   枯草芽孢杆菌AJ11901(FREM BP-140)
pHC4     大肠杆菌AJ12617(FERM BP-3532)
为了通过将本发明的DNA同在棒状杆菌中具有功能的载体进行连接而制备重组DNA，以一种限制性酶消化该载体，该限制性酶提供一种对应于本发明的DNA的末端的末端。该连接一般通过使用诸如T4DNA连接酶这样的连接酶而完成。
为将上述的重组DNA引入一种诸如棒状杆菌这样的宿主，任何迄今为止已被报道的已知转化方法均可被应用。例如，可以使用一种方法对受体细胞进行氯化钙处理从而提高其对DNA的通透性，该方法已经针对大肠杆菌K-12进行了报道(Mandel，M.and Higa，A.，J.Mol.Biol.，52，159(1970))，还可使用一种方法来从处于生长期的细胞中制备感受态细胞，随后将该DNA引入其中，该方法已经针对枯草芽孢杆菌进行了报道(Duncan，C.H.，Wilson，G.A.and Young，F.E.，Gene，1，153(1977))。除这些方法之外，还可使用一种方法来将DNA受体细胞制成原生质体或者原生质球，它们易于摄取重组DNA，随后将该重组DNA引入这些细胞，该方法已知可应用于枯草芽孢杆菌、放线茵和酵母(Chang，S.and Choen，S.N.，Molec.Gen.Genet.，168，111(1979)；Bibb，M.J.，Ward，J.M.and Hopwood，O.A.，Nature，274，398(1978)；Hinnen，A.，Hicks，J.B.andFink，G.R.，Proc.Natl.Sci.USA，75，1929(1978))。棒状杆菌的转化可通过电脉冲方法有效地进行(参考Japanese PatentLaid-open No.2-207791)。
关于诸如Corynebacterium thermoamonogenes这样的嗜热棒状杆菌的转化，通过用一种可以改变宿主细胞的细胞壁的结构的试剂对细胞进行处理，并且对一种含有DNA和这些细胞壁已经改变的细胞的溶液应用电脉冲来有效地完成。上述的试剂可以改变细胞壁的结构，使得在对一种含有经该试剂处理的细胞以及DNA的溶液进行电脉冲时，这些细胞能够摄入DNA(在下文中亦称为“细胞壁处理试剂”)。这样的试剂的例子包括抑制细菌细胞壁的正常合成的试剂，还包括对细菌细胞壁进行裂解的试剂。它们的具体例子包括溶茵酶、青霉素G、甘氨酸等。
这些细胞壁处理试剂均可单独使用，或者其中两种或者更多种可联合使用。上述试剂中溶菌酶和青霉素G较为优选，并且溶茵酶特别地优选。
进一步，Corynebacterium thermoamonogenes的转化还可通过对含有DNA和经物理方法进行了细胞壁弱化的细胞进行电脉冲来完成，这样的物理方法的例子如超声(FEMS Microbiology Letters，151，135-138(1987))。
为有效地表达本发明的DNA中所含有的基因，可在该宿主细胞中发挥功能的启动子如lac、trp和PL可以连接于该基因编码区域的上游。如果使用含有一种启动子的载体作为该载体，各基因、载体和启动子的连接可一步完成。
可以如上所述而生产的本发明的蛋白质，可根据需要从细胞抽提物或者培养基中纯化，该纯化通过常规的方法进行，例如，离子交换层析、凝胶过滤层析、吸附层析、盐析和溶解沉淀。
预期本发明的蛋白在热稳定性上十分优秀或者同谷氨酸棒状杆菌等的相应蛋白相比较在高温下表现出更高的活性。例如，乳发酵短杆菌的GDH在37℃附近表现出最高的活性，并且该活性在42℃附近明显地降低。但是，本发明的GDH在42℃下所表现出的GDH活性等于或者高于37℃下的活性。在一个优选的实施方案中，本发明的GDH在42℃附近表现出最大活性并且甚至在45℃下还表现出活性。
GDH活性的测量可通过，例如，将该酶加入至100mM Tris-HCl(pH8.0)、20mM NH4Cl、10mMα-酮戊二酸、0.25mM NADPH并且测定在340nm下的吸收的变化来进行(Molecular Microbiology6，317-326(1992))。
进一步，乳发酵短杆菌的CS在23℃附近表现出最高的CS活性，并且该活性在33℃附近明显降低。与之相反，本发明的CS在37℃下所表现出的CS活性等于或者高于23℃下的活性。在一个优选的实施方案中，本发明的CS表现出随反应温度提高的活性直至约37℃，并且甚至在40℃下仍表现出同37℃下的活性相比约40％的活性。
CS活性的测量可通过，例如，在Enzymol.，13，3-11(1969)中所描述的方法来进行。
进一步，本发明的其它蛋白典型的具有以下的特征。异柠檬酸裂合酶在50℃下处理5分钟后具有30％或者更多的残余活性。磷酸果糖激酶在60℃下的活性等于或者高于在30℃下的活性。磷酸肌醇丙酮酸羧化酶在45℃下处理5分钟后具有50％或者更高的残余活性。顺乌头酸酶在50℃下处理3分钟后具有30％或者更高的残余活性。异柠檬酸脱氢酶在45℃下处理10分钟后具有50％或者更高的残余活性。2-酮戊二酸脱氢酶在50℃下处理10分钟后具有30％或者更高的残余活性。
本发明的蛋白质还可从诸如Corynebacteriumthermoaminogenes AJ12310菌株这样的Corynebacteriumthermoaminogenes的细胞抽提物中，以各自活性作为指数使用纯化酶的常规方法来获得，例如，离子交换层析、凝胶过滤层析、吸附层析、盐析和溶解沉淀。
在本发明的DNA中，pfk、pdhA、pc、ppc、acn、icd、gdh和gltA(这些DNA所编码的酶的名称见表1)可被引入L-氨基酸生产茵中，例如棒状杆菌，以增强它们的L-氨基酸生产能力。引入了本发明的DNA的棒状杆菌还被预期能够在高于通常温度下生产L-氨基酸。这些L-氨基酸包括L-谷氨酸、L-天冬氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸、L-谷氨酰胺等等。
例如，预期引入了gdh基因或者gltA基因的L-谷氨酸生产菌，例如棒状杆菌能够在高于通常温度下生产L-谷氨酸。进一步，尽管乳发酵短杆菌的CS可能在通常的培养温度下，例如在31.5℃下不能发挥全部功能，但是通过引入本发明的gltA基因该活性可被增强。
进一步，dtsR1和dtsR2是编码赋予棒状杆菌表面活性剂抗性的蛋白质(DTSR蛋白)的基因，这些基因受到破坏的产L-谷氨酸棒状杆菌会产生大量的L-谷氨酸，甚至在存在的生物素的量足以使野生型菌株基本不能产生L-谷氨酸的情况下仍是如此。进一步，如果具有L-赖氨酸生产能力的产L-谷氨酸棒状杆菌的dtsR1和dtsR2基因被扩增，则该细菌被赋予一种生产显著数量的L-赖氨酸的能力(WO95/23224，Japanese Patent Laid-open(Kokai)No.10-234371/1998)。
srcB基因可被用于改善棒状杆菌以用于生产L-氨基酸，该生产通过在含有蔗糖的培养基中使用棒状杆菌来进行。
通过缺失产L-谷氨酸棒状杆菌等的aceA、accBC、lpd或odhA，它们的L-谷氨酸产量可获得提高。进一步，gluABCD为L-谷氨酸摄取系统的一种基因簇，并且通过缺失产L-谷氨酸棒状杆菌的gluA、gluB、gluC和gluD的其中一种到四种，积累于培养基中的L-谷氨酸的量可获得提高。本发明的aceA、accBC、lpd、odhA和gluABCD可被用于在染色体上破坏这些基因。
用于通过利用引入了本发明DNA的微生物来生产L-氨基酸的培养基可为通常的培养基，该培养基含有碳源、氮源、无机离子和其它所需的有机微量营养物。作为碳源，可以使糖类，例如葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖、蔗糖、blackstrap糖蜜以及淀粉水解物；醇类，例如乙醇和肌醇；或者有机酸，例如乙酸、延胡索酸、柠檬酸和琥珀酸。
作为氮源，可以使用无机铵盐，例如硫酸铵、柠檬酸铵、氯化铵、磷酸铵和乙酸铵、氨，有机氮源，例如蛋白胨、肉类抽提物、酵母抽提物、玉米浆和大豆水解物、氨气、氨水等等。
作为无机离子(或无机离子源)，所添加的为少量的磷酸钾、硫酸镁、铁离子、锰离子等等。对于有机微量营养物，添加所需的物质较为理想，例如所需的适量维生素B1、酵母抽提物等等。
在优选的情况下，培养在通气的条件下进行，该通气通过16到72小时的振荡、搅拌等而进行通气。培养的温度被控制在30℃到47℃之间，并且培养期间pH被控制在5到9。对于培养温度，培养可在适于未引入本发明的DNA的微生物的培养温度或比之更高的温度下进行。为进行pH的调节可以使用无机或者有机酸或碱物质、氨水等等。
L-氨基酸从发酵肉汤中的收集可通过已知方法的综合使用而完成，例如利用离子交换树脂、沉淀、结晶等等基于L-氨基酸的类型的工艺。
图表的简要解释
图1所示为来自Corynebacterium thermoaminogenes AJ12310菌株和乳发酵短杆菌2256菌株的谷氨酸脱氢酶的活性随温度的变化。
图2所示为来自该AJ12310菌株和2256菌株的谷氨酸脱氢酶的热稳定性。
图3所示为来自该AJ12310菌株和2256菌株的柠檬酸合成酶的活性随温度的变化。
图4所示为来自该AJ12310菌株和2256菌株的柠檬酸合成酶的热稳定性。
图5所示为来自该AJ12310菌株和2256菌株的异柠檬酸裂合酶的活性随温度的变化。
图6所示为来自该AJ12310菌株和2256菌株的异柠檬酸裂合酶的热稳定性。
图7所示为来自该AJ12310菌株和2256茵株的磷酸果糖激酶的活性随温度的变化。
图8所示为来自该AJ12310菌株和2256茵株的磷酸果糖激酶的热稳定性。
图9所示为来自该AJ12310菌株和2256菌株的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的活性随温度的变化。
图10所示为来自该AJ12310菌株和2256菌株的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的热稳定性。
图11所示为来自该AJ12310菌株和2256菌株的顺乌头酸酶的活性随温度的变化。
图12所示为来自该AJ12310菌株和2256菌株的顺乌头酸酶的热稳定性。
图13所示为来自该AJ12310菌株和2256菌株的异柠檬酸脱氢酶的活性随温度的变化。
图14所示为来自该AJ12310菌株和2256菌株的异柠檬酸脱氢酶的热稳定性。
图15所示为来自该AJ12310菌株和2256菌株的2-酮戊二酸脱氢酶的热稳定性。
图16所示为携带scrB基因的质粒pSCR155的结构。
图17所示为携带pdhA基因的质粒pPDHA-2的结构。
图18所示为一种pdhA基因扩增茵株的L-谷氨酸的产量：(a)37℃(b)44℃。
图19所示为携带icd基因的质粒pICD-4的结构。
图20所示为一种icd基因扩增茵株的L-谷氨酸的产量：(a)37℃(b)44℃。
图21所示为质粒pHSG299YGDH和pYGDH的结构。
图22所示为质粒pHSG299YCS和pYCS的结构。
实施本发明的最佳模式
在下文中，本发明将参考随后的实施例进行进一步具体地说明。
实施例1
<1>Corynebacterium thermoaminogenes的质粒库的产生
在CM2B液体培养基(1g/d1的酵母抽提物(产自Difco)、1g/d1的多蛋白胨(产自Nippon Seiyaku)、0.5g/d1的NaCl、10μg/d1的生物素，pH7.0(以KOH进行调节))中37℃下对Corynebacteriumthermoaminogenes AJ12310菌株进行15个小时的培养，并且使用一种染色体DNA抽提试剂盒(细菌基因组DNA纯化试剂盒)(AdvancedGenetic Technologies生产)从10ml的培养基中制备其染色体DNA。所获得DNA以限制性酶Sau3AI进行部分消化，并且用于0.8％琼脂糖凝胶电泳以进行DNA的分离。随后，从胶中切出对应于约4到6kb的DNA片段的一条带，并且通过使用一种DNA凝胶抽提试剂盒(GIBCOBRL，ConcertTM快速凝胶抽提系统)获得该目的大小的DNA片段。
以BamHI对质粒pHSG399进行完全消化，并且通过使用碱性磷酸酶(CIAP；Takara Shuzo制造)对其末端进行去磷酸化。通过使用由Takara Shuzo生产的DNA连接试剂盒对这一载体和上述的染色体DNA进行连接，并以所获得的重组载体对大肠杆菌JM109进行转化。转化子的选择在含有30μg/ml氯霉素、0.04mg/ml的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)以及0.04mg/ml的X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)的LB琼脂培养基(含有1.5g/d1琼脂)上进行，获得了约4000个白色茵落。
<2>用于各基因的扩增的引物的设计
对用于通过PCR从以上获得的质粒文库中选择含有各靶基因的克隆的引物进行了设计。这些靶基因在上文提及。
这些引物基于棒状杆菌的已知基因序列进行设计，即，基于同其它微生物的对应基因进行比较时所观察到的在氨基酸水平上的保守区域的序列进行设计。考虑到棒状杆菌的密码子使用性，对每个基因设计了复合的引物组。
为检测所制备的引物的特征，使用这些引物以及使用Corynebacterium thermoaminogenes AJ12310菌株的染色体DNA作为模板进行PCR以扩增各基因片段。其结果，当使用表2到7中上排所示的引物，并在这些表中标识为“用于获得部分片段的PCR条件”的条件下进行PCR时，对于所有的基因均观察到了扩增片段。引物序列后的括号内的数字为该引物在序列表中的序列号。这些引物被用作为上述的筛选的引物。
表2
基因 aceA accBC dtsR1
5’3’引物3’5’引物 CCTCTGCCCAGCGAACTCCG(35)CTGCCTTGAACTCACGGTTC(36) CATCCACCCCGGCTACGGCT(37)CGGTGACTGGGTGTTCCACC(38) ACGGCCCAGCCCTGACCGAC(39)AGCAGCGCCCATGACGGCGA(40)
用于获得部分片段的PCR条件和用于筛选的PCR条件 94℃，5分钟98℃，5秒66℃，2秒，30个循环Z-Taq 94℃，5分钟98℃，5秒66℃，2秒，30个循环Z-Taq 94℃，5分钟98℃，5秒66℃，2秒，30个循环Z-Taq
菌落PCR条件 94℃，7分钟91℃，30秒55℃，1秒72℃，2.5分钟，30个循环Ex-Taq 94℃，7分钟91℃，30秒55℃，1秒72℃，2.5分钟，30个循环Ex-Taq 94℃，7分钟91℃，30秒55℃，1秒72℃，2.5分钟，30个循环Ex-Taq
被扩增片段 824bp 673bp 805bp
表3
基因 dtsR2 pfk scrB
5’3’引物3’5’引物 ACGGCCCAGCCCTGACCGAC(41)AGCAGCGCCCATGACGGCGA(42) CGTCATCCGAGGAATCGTCC(43)CGTGGCGGCCCATGACCTCC(44) GGNCGHYTBAAYGAYCC(45)GGRCAYTCCCACATRTANCC(46)
用于获得部分片段的PCR条件和用于筛选的PCR条件 94℃，5分钟98℃，5秒66℃，2秒，30个循环Z-Taq 94℃，5分钟98℃，5秒66℃，2秒，30个循环Z-Taq 94℃，5分钟98℃，5秒50℃，10秒72℃，20秒，40个循环Z-Taq
菌落PCR条件 94℃，7分钟91℃，30秒55℃，1秒72℃，2.5分钟，30个循环Ex-Taq 94℃，7分钟91℃，30秒55℃，1秒72℃，2.5分钟，30个循环Ex-Taq 94℃，7分钟91℃，30秒55℃，1秒72℃，2.5分钟，30个循环Ex-Taq
被扩增片段 805bp 472bp 500bp
表4
基因 gluABCD pdhA
5’3’引物3’5’引物 CCATCCGGATCCGGCAAGTC(47)AATCCCATCTCGTGGGTAAC(48) ACTGTGTCCATGGGTCTTGGCCC(49)CGCTGGAATCCGAACATCGA(50)
用于获得部分片段的PCR条件 94℃，5分钟98℃，5秒50℃，10秒72℃，20秒，30个循环Z-Taq 94℃，5分钟98℃，5秒50℃，10秒72℃，20秒，30个循环Z-Taq
被扩增片段 500bp 1200bp
用于筛选的PCR条件以及茵落PCR条件 94℃，5分钟91℃，30秒55℃，1秒72℃，2分钟，30个循环Ex-Taq 94℃，5分钟91℃，30秒55℃，1秒72℃，2分钟，30个循环Ex-Taq
表5
基因 pc ppc
5’3’引物3’5’引物 GGCGCAACCTACGACGTTGCAATGCG(51)TGGCCGCCTGGGATCTCGTG(52) GGTTCCTGGATTGGTGGAGA(53)CCGCCATCCTTGTTGGAATC(54)
用于获得部分片段的PCR条件 94℃，5分钟98℃，5秒55℃，80秒，30个循环Z-Taq 94℃，5分钟98℃，5秒50℃，5秒72℃，10秒，30个循环Z-Taq
被扩增片段 781bp 71000bp
用于筛选的PCR条件 94℃，5分钟98℃，5秒55℃，80秒，30个循环Z-Taq 94℃，5分钟98℃，5秒50℃，5秒72℃，10秒，30个循环Z-Taq
菌落PCR条件 94℃，5分钟98℃，5秒50℃，5秒72℃，10秒，50个循环Z-Taq 94℃，5分钟98℃，5秒50℃，10秒72℃，20秒，50个循环Z-Taq
表6
Figure S071A9631720070628D000261
Figure S071A9631720070628D000271
表7
基因 odhA
5’3’引物3’5’引物 ACACCGTGGTCGCCTCAACG(61)TGCTAACCCGTCCCACCTGG(62)
用于获得部分片段的PCR条件 94℃，5分钟98℃，2秒68℃，2秒，30个循环Z-Taq
被扩增片段 1306bp
LA克隆(N’)5’3’引物 S1：GTACATATTGTCGTTAGAACGCGTAATACGACTCA(75)S2：CGTTAGAACGCGTAATACGACTCACTATAGGGAGA(76)
限制性酶 XbaI
LA克隆的条件 第一次94℃，1分钟55℃，2分钟72℃，1分钟，30个循环LA-Taq
第二次94℃，1分钟第三次98℃，20秒68℃，15分钟，30个循环72℃，10分钟LA-Taq
<3>通过PCR对质粒文库进行筛选
通过PCR从质粒文库中选出含有一种靶基因的克隆。从各质粒文库中挑出60个茵落，并且在两个LB琼脂培养基平板上进行复制。以各平板的60个菌落进行组合，接种入含有4ml LB液体培养基的测试试管中并且培养15个小时。随后，分别通过使用Promega生产的质粒DNA抽提试剂盒获得质粒混合物。通过使用这一质粒混合物作为模板并且使用针对个靶基因而制备的筛选引物，在各表中的“用于筛选的PCR条件”下进行PCR以选出一种克隆，从该克隆中可获得一种DNA片段，该片段的大小与使用染色体DNA作为模板所扩增的DNA相同。
通过使用一种Per kin-Elmer生产的Big Dye dye终止体循环测序试剂盒(terminator cycle sequencing kit)来测定所扩增的DNA片段的核苷酸序列，并且对其同已知基因信息的同源性进行研究以确定是否获得了该靶基因。
对于lpd，由于以<2>中生产的引物扩增不出任何DNA片段，所以基于所测定的核苷酸序列而制备了其它的筛选引物。
<4>通过茵落PCR进行的对携带靶基因的克隆的选择
通过使用一种平板而进行了菌落PCR以选择含有该基因片段的克隆，该平板为质粒混合物的来源，对此已经证实了靶基因的扩增。该菌落PCR以表2-7所示的条件进行。
质粒DNA选自一种被选定的转化子，并且对被插入DNA片段的核苷酸序列进行了测定。当该靶基因的全长并未被插入该被插入DNA片段中，并且上游区域、下游区域或两者均被缺失时，基于被测定的核苷酸序列而制备了引物，利用这些引物通过使用Takara LA PCR体外克隆试剂盒(Takara Shuzo)获得了含有全长的靶基因核苷酸序列的基因片段。随后测定了其核苷酸序列。
LA PCR克隆的纲要如下。产生两种引物，这两种引物各具有该被插入DNA片段的两个区域之一。以多种限制性酶对Corynebacteriumthermoaminogenes AJ12310菌株的染色体DNA进行消化，并且与一种对应于各限制性酶的盒式引物进行连接。通过使用这样的DNA作为模板，用一种对应于远离该缺失区域位置的引物(S1)和一种对应于所制备的引物中的盒式引物之外位置的引物(C1)进行PCR。随后，用一种对应于接近该缺失区域的位置的引物(S2)和一种对应于所制备的引物中的盒式引物之内的位置的引物(C2)进行PCR。通过这一途径而获得了一种含有该缺失区域的DNA片段。通过将所获得的该DNA片段同已经获得的DNA片段进行连接而获得了一种含有该靶基因的全长DNA片段。由于该盒的5’末端没有磷酸基团，在该DNA片段的3’末端和该盒的5’末端的连接位置可能形成一种缺刻。因此，在第一次PCR中从C1引物开始的的DNA的合成终止于这一连接位置，并且由此而不能进行非特异性的扩增。因此可以达到特异性的扩增。
表2-7所示为用于LA PCR克隆的引物和反应条件。在这些表中，以“(N’)”提到的引物为用于基因上游缺失部分的克隆的引物，以“(C’)”提到的引物为用于基因下游缺失部分的克隆的引物。根据LA PCR克隆试剂盒附带的指导进行两次PCR。在这些表中所提及的引物中，用于第一次反应的引物(S1)在上排中显示，用于第二次反应的引物(S2)在下排中显示。
如上所述所获得的含有各基因的DNA片段的核苷酸序列用与上文相同的手段进行测定。这些核苷酸序列和可由这些核苷酸序列编码的氨基酸序列见SEQ ID NOS：1-34。以这些序列号所示的序列在此后提及的序列表解释中加以概述。
对于scrB，没有发现任何开放读码框架。由于Corynebacteriumthermoaminogenes AJ12310菌株不具有蔗糖酶活性并且不具有任何蔗糖同化特征，从具有蔗糖同化特征的Corynebacteriumthermoaminogenes AJ12340和AJ12309中以类似方式获得了scrB基因。其结果，从这两个菌株中均获得了具有开放读码框架的DNA片段。
实施例2：gdh和gltA基因的获得
<1>Corynebacterium thermoaminogenes的GDH活性的研究
Corynebacterium thermoaminogenes的野生型菌株AJ12310细胞在CM-2B琼脂培养基上生长(1g/d1的酵母抽提物(产自Difco)、1g/d1的多蛋白胨(产自Nippon Seiyaku)、0.5g/d1的NaCl、10μg/d1的生物素，KOH调节至pH7.0)。将这些细胞接种于一个含有20ml烧瓶培养基的500-ml体积的烧瓶中并且在37℃下培养17个小时(直到剩余的糖达到约1g/d1)，该烧瓶培养基中含有以下组合物。
类似地，乳发酵短杆菌2256菌株(ATCC13869)的细胞在CM-2B琼脂培养基上31.5℃下培养17个小时。
[烧瓶培养基]
葡萄糖                 3g/d1
KH2PO4         0.1g/d1
MgSO4·H2O            0.04g/d1
FeSO4·7H2O            1mg/d1
MnSO4·4H2O            1mg/d1
维生素B1-HCl           200μg/L
生物素                 50μg/L
(NH4)2SO4      1.5g/d1
大豆蛋白水解溶液       48mg/d1
(Memeno(T-N))
CaCO3(Official regent)   5g/d1(分开灭菌)
pH8.0(以KOH调节)
以1000rpm对约1ml的上述培养基进行1分钟的离心以除去CaCO3，并且以200mM的K-磷酸缓冲液(pH6.9)对细胞进行洗涤并且悬浮于300μl的相同缓冲液中。对所获得的细胞悬浮物进行5分钟的超声以破碎细胞，在1000rpm下离心30分钟以获得粗级酶溶液的上清。
使用上述的粗级酶溶液检测GDH活性的最佳反应温度和热稳定性。GDH活性的测量通过将该粗级酶溶液加至一种反应混合物(100mMTris-HCl(pH8.0)，20mM的NH4Cl，10mM的α-酮戊二酸钠，0.25mMNADPH)中并测量340nm下的吸收变化而进行。该粗级酶溶液的蛋白质含量通过Bradford方法(Bio-Rad蛋白质分析试剂盒)使用牛血清白蛋白作为标准通过对595nm吸收的测量而进行定量。该吸收通过使用HITACHIU-2000(Hitachi生产)而进行。
图1所示为在不同的反应温度下测得的GDH活性。尽管ATCC13869菌株在37℃附近表现出最高的GDH特异活性并且该活性在42℃附近明显降低，但是AJ12310菌株在42℃附近表现出最高的特异活性并且它甚至在45℃还表现出活性。
随即对GDH的热稳定性进行了测试。在反应之前，在65℃下放置粗级酶溶液0到30分钟，并且随后在30℃下测量该酶活性。结果见图2。从这些结果清晰可见，尽管ATCC13865菌株的GDH被5分钟的热处理所失活，AJ12310菌株的GDH甚至在30分钟的热处理后依然维持。另外，AJ12310菌株的粗级酶溶液甚至在65℃下处理90分钟后在GDH活性方面基本不表现出变化(数据未出示)。
<2>Corynebacterium thermoaminogenes的GCS活性的检测
使用粗级酶溶液检测CS的最佳反应温度和热稳定性，该粗级酶溶液以同实施例1相同的方式从Corynebacterium thermoaminogenesAJ12310菌株和乳发酵短杆菌ATCC13869菌株的细胞中制备。CS活性的测量通过将各粗级酶溶液加至一种反应混合物(100mM Tris-HCl(pH8.0)，0.1mM的DTNB(5，5’-dithiobis-(2-nitrobenzoicacid))，200mM的L-谷氨酸钠，0.3mM脂酰辅酶A)中并测量412nm处的吸收变化而进行。
图3所示为在不同的反应温度下测得的CS活性。ATCC13869菌株在23℃附近表现出最高的CS比活性并且该活性在33℃附近明显降低。但是，AJ12310菌株直至37℃附近仍然表现出依赖于反应温度的高度活性，并且它甚至在40℃还表现出相对于37℃下约40％的活性。
随后对CS的热稳定性进行了检测。在反应之前，将该粗级酶溶液在35-55℃下放置5分钟并且随后在30℃下测量该酶的活性。结果见图4。ATCC13869菌株的CS可被35-40℃的热处理灭活，而AJ12310菌株的CS甚至在50℃下处理后仍然维持约40％的活性。
<3>Corynebacterium thermoaminogenes的ghd基因的获得
对已经报道的多种微生物的gdh基因的核苷酸序列进行了比较。选中了一个含有高度保守的核苷酸序列的区域，并且基于该区域的核苷酸序列制备了具有SEQ ID NOS：77和78所示的核苷酸序列的引物。
通过使用从Corynebacterium thermoaminogenes AJ12310菌株中制备的染色体DNA作为模板以及上述的引物进行PCR，该染色体DNA使用细菌基因组DNA纯化试剂盒(Advanced Genetic Technologies制造)进行制备。基于所获得的DNA片段，通过使用Takara LA PCR体外克隆试剂盒进行了基因组步移以获得完整的gdh基因。结果见SEQ ID NO：79。进一步，从这一核苷酸序列推导出的氨基酸序列见SEQ ID NO：80。
以类似的方式获得乳发酵短杆菌ATCC13869菌株的gdh基因，并且测定其核苷酸序列。结果见SEQ ID NO：81。由这一核苷酸序列所编码的氨基酸序列见SEQ ID NO：82。
对如上所述测定的Corynebacterium thermoaminogenesAJ12310菌株和乳发酵短杆菌ATCC13869菌株gdh基因的核苷酸序列和GDH的氨基酸序列，以及已知的谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)ATCC13032的gdh基因和GDH氨基酸序列(Molecular Microbiology6，317-326(1992))的同源性进行了研究。结果见表8(核苷酸序列)和表9(氨基酸序列)。
表8：不同的gdh基因的核苷酸序列的同源性
ATCC13869 ATCC13032 AJ12310
ATCC13869 - 94.5％ 82.4％
ATCC13032 - - 78.1％
AJ12310 - - -
表9：不同的GDH的氨基酸序列的同源性
ATCC13869 ATCC13032 AJ12310
ATCC13869 - 90.8％ 91.7％
ATCC13032 - - 83.4％
AJ12310 - - -
<4>Corynebacterium thermoaminogenes的g ltA基因的获得
对已经报道的多种微生物的gltA基因的核苷酸序列进行了比较。选中了一个含有高度保守的核苷酸序列的区域并且基于该区域的核苷酸序列制备了具有SEQ ID NOS：83和84所示的核苷酸序列的引物。
通过使用从Corynebacterium thermoaminogenesAJ12310菌株(FERM BP-1542)中制备的染色体DNA作为模板以及上述的引物7和8进行PCR，该染色体DNA使用细菌基因组DNA纯化试剂盒(AdvancedGenetic Technologies制造)进行制备，并且对约0.9kb的被扩增的核苷酸序列进行了测定。
根据所获得的谷氨酸棒状杆菌的gltA基因的核苷酸序列(Microbiol.，140，1817-1828(1994))而制备了SEQ ID NOS：85、86、87和88的引物。以类似于上文的方式使用AJ12310的染色体DNA作为模板并且使用SEQ ID NOS：85、86、87和88的引物进行PCR，对被扩增的DNA片段的核苷酸序列进行鉴定以测定该gltA基因的完整核苷酸序列。结果见SEQ ID NO：89。进一步，由这一核苷酸序列而预期的氨基酸序列见SEQ ID NO：90。
以类似的方式获得乳发酵短杆菌2256菌株的gltA基因并且测定其核苷酸序列。结果见SEQ ID NO：91。这一核苷酸序列所编码的氨基酸序列见SEQ ID NO：92。
对如上所述测定的Corynebacterium thermoaminogenesAJ12310菌株和乳发酵短杆菌ATCC13869菌株gltA基因的核苷酸序列和CS的氨基酸序列，以及已知的谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)ATCC13032的gltA基因和CS氨基酸序列(Microbiol.，140，1817-1828(1994))的同源性进行了研究。结果见表10(核苷酸序列)和表11(氨基酸序列)。
表10：不同的gltA基因的核苷酸序列的同源性
ATCC13869 ATCC13032 AJ12310
ATCC13869 - 99.5％ 85.7％
ATCC13032 - - 85.6％
AJ12310 - - -
表11：不同的CS的氨基酸序列的同源性
ATCC13869 ATCC13032 AJ12310
ATCC13869 - 99.3％ 92.1％
ATCC13032 - - 92.1％
AJ12310 - - -
实施例3：Corynebacterium thermoaminogenes的scrB基因的获得
由于scrB基因片段如实施例1所示从Corynebacteriumthermoaminogenes AJ12309菌株的中获得，对基因的全序列的获得进行了尝试。首先，使用在SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46中所示的引物，以与实施例1相同的方式获得了一个部分片段。这些引物基于乳发酵短杆菌2256菌株的scrB序列(Japanese Patent Laid-openNo.08-196280/1996)进行合成。
另外，通过使用细菌基因组DNA纯化试剂盒(Advanced GeneticTechnologies Corp.)从AJ12309菌株中制备了染色体DNA。向0.5μg的该染色体DNA、50pmol的各种上述引物、4μl的dNTP混合物(每种2.5mM)、5μl的10×Z-Taq缓冲液(Taraka Shuzo)以及2U的Z-Taq(Taraka Shuzo)中加入无菌水以制备总体积为50μl的PCR反应缓冲液。使用上述的反应混合物以及热循环仪GeneAmp PCR系统9600(PE)进行PCR以扩增出约600bp的scrB部分片段，该PCR所用的循环为98℃下进行5秒钟的变性，在50℃下进行10秒钟的结合并且在72℃下进行20秒钟的延伸反应，该过程重复循环30次。
随后，通过使用LA PCR体外克隆试剂盒(Takara Shuzo)来测定scrB的全序列。所有这些过程均根据该LA PCR体外克隆试剂盒所附带的方案而进行。根据所获得的部分序列而合成了在SEQ ID NOS：97、98、99和100中出示的序列。为进行用于对上游区域进行测序的第一个PCR反应，而使用了SEQ ID NOS：95和97所示的引物以及作为模板的AJ12309菌株染色体DNA，该染色体DNA经EcoT14I消化。为进行第二个PCR反应而使用了SEQ ID NOS：96和98所示的的引物。为进行用于对下游区域进行测序的第一个PCR反应而使用了SEQ IDNOS：95和99所示的引物以及作为模板的AJ12309菌株染色体DNA，该染色体DNA经SalI(Takara Shuzo)消化。为进行第二个PCR反应而使用了SEQ ID NOS：96和100所示的的引物。通过上述的步骤，对含有scrB的ORF的1656bp全长序列进行了测定。这一核苷酸序列示于SEQ ID NO：93，所推定的氨基酸序列见SEQ ID NO：94。
实施例4：异柠檬酸裂合酶、磷酸果糖激酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、 顺乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶以及2-酮戊二酸脱氢酶的热稳定性的检 测
对下列来自Corynebacterium thermoaminogenes的酶的热稳定性进行了检测。在本实施例中，蛋白质浓度使用牛血清白蛋白作为标准蛋白通过Bradford方法(所使用的为Bio-Rad蛋白质分析试剂盒)进行测量。进一步，除非另外说明，吸光度的测量通过使用HI TACHIU-2000(Hitachi)来进行。
<1>异柠檬酸裂合酶
对来自Corynebacterium thermoaminogenes AJ12310菌株的异柠檬酸裂合酶(此后亦称为“ICL”)以及乳发酵短杆菌2256(ATCC13869)菌株的ICL的活性的热稳定性进行了测定。为进行活性测量，所使用的细胞在含有表2中提及的组合物的培养基中的培养，在所有碳源完全耗尽之前终止。该活性测量的方法在Dieter J.Reinscheid et al.，J.Bacteriol.，176(12)，3474(1994)中有所描述。具体地，以50mM的Tris缓冲液(pH7.3)洗涤这些细胞，在相同的缓冲液中进行悬浮，并且通过超声进行破碎(所使用的为KUBOTA制造的INSONATOR201M，200W，5分钟)。超声之后，对悬浮物进行离心(13000×g，30分钟)来除去未破碎的细胞以制备粗级酶溶液。
将该粗级酶溶液加至一个反应系统，并且通过Hitachi分光光度计U-3210来测定不同温度下(30、40、50、60或70℃)的340nm处的吸收，该反应系统含有50mM MOPS-NaOH(pH7.3)、5mM二硫苏糖醇、15mM MgC l2、1mM EDTA、5mM D-苏型-异柠檬酸、0.2mM NADH以及18U的LDH(乳酸脱氢酶)。不同反应温度测量结果见图5。进一步，在50℃下对粗级酶溶液进行预处理(预处理时间：5分钟或者15分钟)并且在37℃下对其活性进行测量。结果见图6。
其结果，AJ12310菌株的ICL在60℃下表现出最大活性，而2256菌株的ICL在约50℃下表现出最大活性。进一步，经5分钟的预处理后2256菌株的ICL完全失活，而AJ12310菌株的ICL经预处理5分钟之后保留了一半的活力。由此而证实了AJ12310菌株的ICL在高温下的稳定性。
表12用于ICL活性测量的培养基的组成
组分 浓度
(NH4)2SO4 5g/l
脲 5g/l
KH2PO4 0.5g/l
K2HPO4 0.5g/l
MOPS 20.9g/l
MgSO4·7H2O 0.25g/l
CaCl2·7H2O 10mM
CuSO4·7H2O 0.2mg/l
生物素 0.2mg/l
MnSO4·7H2O 10mg/l
FeSO4·7H2O 10mg/l
ZnSO4·7H2O 1mg/l
乙酸 4％
<2>磷酸果糖激酶
对来自Corynebacterium thermoaminogenes AJ12310菌株的磷酸果糖激酶(此后亦称为“PKF”)以及乳发酵短杆菌2256茵株的PKF的活性的热稳定性进行了测定。为进行活性测量，所使用的细胞在含有表13中提及的组合物的培养基中的培养，在所有的糖完全耗尽之前终止。该活性测量的方法在Michiko Mori et al.，Agric.Biol.Chem.，51(10)，2671(1994)中有所描述。具体地，以0.1M的Tris缓冲液(pH7.5)洗涤这些细胞，在相同的缓冲液中进行悬浮，并且通过超声进行破碎(所使用的为KUBOTA制造的INSONATOR201M，200W，5分钟)。超声之后，对悬浮物进行离心(13000×g，30分钟)来除去未破碎的细胞以制备粗级酶溶液。
将该粗级酶溶液加至一个反应系统，并且通过Hitachi分光光度计U-3210来测定不同温度下(30、40、50、60或70℃)的340nm处的吸收，该反应系统含有100mM Tris缓冲液(pH7.5)、0.2mM NADH、10mM MgCl2、2mM NH4Cl、10mM KCl、0.2mM磷酸烯醇式丙酮酸、6.4mM果糖-6-磷酸、1mM ATP以及4μg的LDH/PK(丙酮酸激酶)。不同反应温度下的测量结果见图7。进一步，在50℃下对该粗级酶溶液进行预处理(预处理时间：1、3、5分钟或者10分钟)并且在37℃下对其活性进行测量。结果见图8。
其结果，AJ12310菌株的PKF在约50℃下表现出最大活性，而2256菌株的PKF在约30℃下表现出最大活性。由此而证实了AJ12310菌株的PKF活性的最佳温度处于高温区域。
表13用于PKF活性测量的培养基的组成
组分 浓度
多蛋白胨 20g/l
酵母抽提物 20g/l
氯化钠 5g/l
葡萄糖 20g/l
<3>磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶
对来自Corynebacterium thermoaminogenes AJ12310菌株的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(此后亦称为“PEPC”)以及乳发酵短杆菌2256菌株的PEPC的活性的热稳定性进行了测定。
将在CM2-B琼脂培养基上生长的AJ12310菌株细胞接种于一个含有20ml烧瓶培养基(8g/d1的葡萄糖、0.1g/d1的KH2PO4、0.04g/d1的MgSO4·H2O、1mg/d1的FeSO4·7H2O、5mg/d1的MnSO4·4H2O、3g/d1的(NH4)2SO4、48mg/d1的TN(大豆蛋白水解溶液)、200μg/L的维生素B1、300μg/L的生物素、50μl/l的GD-113(消泡剂)、5g/d1的CaCO3(official regent，分开灭菌)，pH8.0(以KOH调节))的500-ml体积的烧瓶中并且在37℃下培养。2256菌株细胞在CM-2B琼脂培养基上在31.5℃下进行类似地培养。
上述令细胞生长至对数培养期的培养肉汤在1000rpm下离心1分钟以除去CaCO3，并且以洗涤缓冲液(100mM Tris/HCl pH8.0，10mMDTT，20％甘油)洗涤这些细胞3次，超声破碎细胞并且以15krpm离心10分钟以除去细胞碎片。上清以60krpm进行1小时的进一步离心以获得上清的粗级酶溶液。
通过使用上述的粗级酶溶液对PEPC活性的最佳反应温度和热稳定性进行检测。PEPC活性的测量通过将粗级酶溶液加至一种反应混合物(100mM Tris/H2SO4(pH8.5)、5mM磷酸烯醇式丙酮酸、10mM KHCO3、0.1mM乙酰辅酶A、0.15mM的NADH、10mM MgSO4、10U的苹果酸脱氢酶、0.1mM DTT)并且在800μl反应体积中测量340nm处的吸收变化来进行。
图9所示为在不同反应温度下测定的PEPC活性。2256菌株的活性在40℃下明显地减少，而AJ12310菌株甚至在40℃下基本不表现出活性的降低。
随后对PEPC的热稳定性进行了检测。在反应之前将该粗级酶溶液在45℃下放置0-20分钟，并且随后在20℃下测量该酶活性。结果见图10。从结果清晰可见，2256菌株的PEPC活性在经过10分钟的热处理后基本丧失，AJ12310菌株的PEPC甚至在热处理20分钟后仍然保持。
这些结果显示了AJ12310菌株的PEPC在高温下的稳定性。
<4>顺乌头酸酶
测定了来自Corynebacterium thermoaminogenes AJ12310菌株的顺乌头酸酶(此后亦称为“ACN”)以及乳发酵短杆菌2256菌株的ACN，以及其热稳定性。
将在CM2-B琼脂培养基上生长的AJ12310菌株细胞接种于一个含有20ml烧瓶培养基的500-ml体积的烧瓶中并且在37℃下培养，该烧瓶培养基含有的组分与<3>中提及的组分相同。2256菌株细胞在CM-2B琼脂培养基上在31.5℃下进行类似地培养。
上述令细胞生长至对数培养期的培养肉汤在1000rpm下离心1分钟以除去CaCO3，并且以50mM Tris/HCl pH8.0洗涤这些细胞3次，超声破碎细胞并且以15krpm离心10分钟以获得上清的粗级酶溶液。
通过使用上述的粗级酶溶液对ACN活性的最佳反应温度和热稳定性进行检测。ACN活性的测量通过将粗级酶溶液加至一种反应混合物(20mM Tris/HCl(pH7.5)、50mM NaCl、20mM异柠檬酸三钠)并且在800μl反应体积中测量240nm处的吸收变化来进行。
图11所示为在不同反应温度下测定的ACN活性。同2256茵株相比较，AJ12310菌株在高温之下表现出更高的活性。
随后对ACN的热稳定性进行了检测。在反应之前将该粗级酶溶液在50℃下放置0-15分钟，并且随后在30℃下测量该酶活性。结果见图12。从结果清晰可见，同2256菌株相比较，AJ12310的ACN表现出较少的由于热处理所造成活性降低。
这些结果显示了AJ12310菌株的ACN在高温下的稳定性。
<5>异柠檬酸脱氢酶
对来自Corynebacterium thermoaminogenes AJ12310菌株的异柠檬酸脱氢酶(此后亦称为“ICDH”)以及乳发酵短杆菌2256菌株的ICDH的活性的热稳定性进行了测定。
将在CM2-B琼脂培养基上生长的AJ12310菌株细胞接种于一个含有20ml烧瓶培养基的500-ml体积的烧瓶中并且在37℃下培养，该烧瓶培养基含有的组分与<3>中提及的组分相同。2256菌株细胞在CM-2B琼脂培养基上31.5℃下进行类似地培养。
上述令细胞生长至对数培养期的培养肉汤在1000rpm下离心1分钟以除去CaCO3，并且以50mM Tris/HClpH7.5洗涤这些细胞3次，超声破碎细胞并且以15krpm离心10分钟以获得上清的粗级酶溶液。
通过使用上述的粗级酶溶液对ICDH活性的最佳反应温度和热稳定性进行检测。ICDH活性的测量通过将粗级酶溶液加至一种反应混合物(35mM Tris/HCl、0.35mM EDTA(pH7.5)、1.5mM MnSO4、0.1mMNADP、1.3mM异柠檬酸三钠)并且在800μl反应体积中测量340nm处的吸收变化来进行。
图13所示为在不同反应温度下测定的ICDH活性。2256菌株的活性在70℃下明显地减少，而AJ12310菌株甚至在70℃下基本观察不到活性的降低。
随后对ICDH的热稳定性进行了检测。在反应之前将该粗级酶溶液在45℃下放置0-15分钟，并且随后在30℃下测量该酶活性。结果见图14。从结果清晰可见，对于2256菌株，经过15分钟的热处理后仅仅观察到15％的残余活性，而对于AJ12310菌株可观察到60％的残余活性。
这些结果显示了AJ12310菌株的ICDH在高温下的稳定性。
<6>2-酮戊二酸脱氢酶
对来自Corynebacterium thermoaminogenes AJ12310菌株的2-酮戊二酸脱氢酶(此后亦称为“ODHC”)以及乳发酵短杆菌2256菌株的ODHC进行了测试并对其热稳定性进行了测定。
为进行活性测量，所使用的细胞在含有表14中提及的组合物的培养基中的培养，在所有糖完全耗尽之前终止。该活性测量的方法在Isamu Shiio et al.，Agric.Biol.Chem.，44(8)，1897(1987)中有所描述。具体地，以0.2％的氯化钾洗涤这些细胞，在100mMTES-NaOH(pH7.5)，30％的甘油溶液中进行悬浮，并且通过超声进行破碎(所使用的为KUBOTA制造的INSONATOR201M，200W，5分钟)。超声之后，对悬浮物进行离心(13000×g，30分钟)来除去未破碎的细胞，并且使用同样缓冲液和Sephadex-G25进行凝胶过滤以制备粗级酶溶液。
将该粗级酶溶液加至一个反应系统，并且通过Hitachi分光光度计U-3210来测定不同温度下(30、40、50、60或70℃)的365nm下的吸收，该反应系统含有100mM TES-NaOH(pH7.7)、5mM MgCl2、0.2mM辅酶A、0.3mM脱羧辅酶、1mMα-酮戊二酸、3mM L-半胱氨酸以及1mM的乙酰吡啶-腺嘌呤二核苷酸。不同反应温度测量结果见图5。进一步，在50℃下对粗级酶溶液进行预处理(预处理时间：5分钟或者15分钟)并且在37℃下对其活性进行测量。结果见图15。
其结果，经10分钟的预处理后2256菌株的ODHC完全失活，而AJ12310菌株的ODHC活性基本保持恒定并不因预热时间不同而变化，并且由此而证实了该菌株的ODHC在高温下的稳定性。
表14用于ODHC活性测量的培养基的组成
组分 浓度
葡萄糖 80g/l
KH2PO4 1g/l
MgSO4·7H2O 0.4g/l
FeSO4·7H2O 0.01g/l
MnSO4·7H2O 0.05g/l
(NH4)2SO4 30g/l
大豆蛋白水解物 480mg/l
盐酸硫胺素 200μg/l
生物素 300μg/l
实施例5：srcB基因进行的基因转移所造成的蔗糖同化能力的获得
由于Corynebacterium thermoaminogenes AJ12310菌株不具有蔗糖酶活性以及蔗糖同化能力，因此对是否能够通过将AJ12309菌株的scrB基因转移至该菌株中而将蔗糖同化能力赋予该茵株进行了探索。
<1>携带来自Corynebacterium thermoaminogenes AJ12309菌株的scrB的质粒的产生
为获得一个scrB基因片段，根据SEQ ID NOS：93的核苷酸序列合成了SEQ ID NOS：101和102中所示的引物，这些引物的两个末端均同SmaI序列进行连接。将无菌水加至0.5μg12309菌株的染色体DNA、上述寡核苷酸各50pmol、4μl的dNTP混合物(各2.5mM)、5μl的10×Pyrobest缓冲液(Takara Shuzo)以及2U的Pyrobest聚合酶(Taraka Shuzo)以制备成总体积50μl的反应混合物。使用上述的反应混合物以及热循环仪GeneAmp PCR系统9600(PE)进行PCR，扩增出约1.7kbp含有scrB ORF的片段，该PCR所用的循环为98℃下进行10秒钟的变性，在55℃下进行30秒钟的结合并且在72℃下进行2分钟的延伸反应，该过程重复循环30次。
随后，SmaI(Takara Shuzo)消化上述的扩增片段，并且与含有一个去磷酸化的复制起点的质粒pSAC4进行连接以制备pSCR155，该复制起点可在棒状杆菌中发挥作用，该质粒已经经过SmaI的消化。图16所示为pSCR155的结构。pSAC4按下列步骤产生。为使大肠杆菌载体pHSG399(Takara Shuzo)能够在棒状杆菌中自行复制，向其中引入了来自能够在棒状杆菌自行复制的质粒pHM1519(Miwa，k.etal.，Agric.Biol.Chem.，48(1984)2901-2903)的复制起点(Japanese Patent Laid-open No.5-7491/1993)。具体地，以限制性酶BamHI和KpnI消化pHM1519，并且通过使用Takara Shuzo所生产的平末端化试剂盒将所获得的含有复制起点的片段平末端化，并且通过使用一种SalI连接物(Takara Shuzo制造)将该片段插入pHSG399的SalI位点以获得pSAC4。
<2>携带scrB基因的质粒向AJ12310菌株的转移
向Corynebacterium thermoaminogenes AJ12309菌株中引入上文中生产的pSCR155和携带有来自乳发酵短杆菌的scrB基因的质粒pSSM30BS(Japanese Patent Laid-open No.08-196280/1996)。该转化根据以下程序进行。将细胞接种于含有20％的蔗糖的CM-2B培养基中，接种量应使该培养基的OD660为0.1，并且在37℃下振荡培养直至OD660成为0.3。向该培养基内加入浓度为100μg/ml的溶茵酶，并且这些细胞被进一步培养2小时。以20％的蔗糖洗涤这些细胞3次，悬浮于20％的蔗糖中，加入从大肠杆菌JM110中收集的质粒，充分混合并且对其使用电脉冲(18KV/cm，300毫秒)以引入这些DNA。在含有20％的蔗糖的CM-2B培养基中使这些细胞进行过夜恢复培养之后，在含有5μg/ml氯霉素的CM-2B培养基上对转化子进行选择。具体地，转化通过电脉冲方法进行(Japanese Patent Laid-openNo.12-204236/2000)，转化子的选择在含有5μg/ml氯霉素的CM2B培养基上37℃下进行。其结果，未获得任何携带含有来自乳发酵短杆菌的scrB基因的质粒pS SM30BS的转化子，而只获得携带含有来自Corynebacterium thermoaminogenes的scrB基因的质粒pSCR155的转化子。这一菌株被命名为AJ12310/pSCR155。
<3>对使用蔗糖作为碳源进行的AJ12310/pSCR155菌株的培养的评估
将上文制备的AJ12310/pSCR155接种于一种含有表15所示的组分的培养基中，并且在37℃下振荡培养22小时。在培养之后测量吸收值(OD)和残余的糖(RS)。结果见表16。其结果，经过证实，AJ12310菌株不能同化蔗糖并且因此不能进行生长，而引入了scrB基因的菌株AJ12310/pSCR155菌株变得能够同化蔗糖。
表15培养基组成
培养基组分 浓度
蔗糖 60g/l
KH2PO4 1g/l
MgSO4·7H2O 0.4g/l
FeSO4·7H2O 0.01g/l
MnSO4·7H2O 0.01g/l
(NH4)2SO4 30g/l
大豆蛋白水解物 480mg/l
盐酸硫胺素 200μg/l
生物素 300μg/l
表16蔗糖培养结果
OD(×51) RS(g/l)
2256 1.292 0.00
AJ12310 0.058 60.00
AJ12310/pSCR155 1.571 0.84
实施例6：通过pdhA基因扩增的菌株进行的L-谷氨酸的生产
<1>携带pdhA的质粒pPDHA-2的结构
通过对质粒文库的筛选而获得了来自Corynebacteriumthermoaminogenes AJ12309菌株的pdhA基因。具体地，使用质粒文库混合物作为模板以实施例1的表4所示的条件进行PCR，并且选出了一个克隆p21A，从该克隆中扩增出了一个DNA片段，该片段的大小与以染色体DNA作为模板进行的PCR所获得DNA片段相同。对这一质粒的DNA序列进行测定以确认全长的pdhA包含于其中。
以XbaI和KpnI对p21A进行消化以切割成一个含有全长pdhA基因和启动子区域的4kb的DNA片段。将这一含有pdhA基因的DNA片段插入pHSG299(Takara Shuzo)的XbaI和KpnI位点。随后，以XbaI消化该质粒，并且将一个通过以XbaI消化pXK4而获得的片段插入其中以制备pPDHA-2。pPDHA-2的制备过程见图17。一种DNA连接试剂盒Ver.2(Takara Shuzo)被用于连接反应，大肠杆菌JM109菌株(Takara Shuzo)被用作为遗传操作的宿主。上述的pXK4按如下过程产生。用限制性酶BamHI和KpnI对一种棒状杆菌和大肠杆菌的穿梭质粒pHK4(Japanese Patent Laid-open No.5-7491/1993)进行消化，以获得一种含有复制起点的DNA片段，并且通过使用一种DNA平末端化试剂盒(平末端化试剂盒由Takara Shuzo制造)对所获得的片段进行平末端化，将其同一种XbaI连接头(由Takara Shuzo制造)进行连接并且插入pHSG299的XbaI位点以获得质粒pKX4。
<2>携带pdhA基因的质粒向AJ12310菌株中的转移
将上文生产的质粒pPDHA-2引入Corynebacteriumthermoaminogenes AJ12309菌株以制备一种可进行pdhA基因扩增的菌株。该转化以同实施例5相同的方式进行，并且在含有25μg/ml的卡那霉素的CM-2B培养基上对转化子进行选择以获得AJ12310/pPDHA-2菌株。
<3>用pdhA扩增的菌株进行的L-谷氨酸的生产
AJ12310菌株和上文获得的pdhA基因扩增的菌株AJ12310/pPDHA-2菌株均在CN-2B培养基上生长，将它们接种于一个500-ml体积的烧瓶中并且在37℃下进行振荡培养直至葡萄糖完全耗尽，该烧瓶含有20ml用于育种培养烧瓶的培养基，该培养基见表17。以2ml该培养物肉汤接种于一个500ml体积烧瓶中并且在37℃和44℃下作为主要培养物进行培养，该烧瓶含有20ml用于主要培养烧瓶的培养基，该培养基见表17。持续进行主要培养直至葡萄糖完全耗尽。培养之后测量该培养基的OD以及L-谷氨酸的积累量以测定该基因扩增在细胞生长和谷氨酸生产中的作用。OD的测量通过使用HITACHIU-2000分光光度计(Hitachi)来进行，L-谷氨酸含量的测量通过使用AS-210谷氨酸分析仪(Asahi Chemical Industry)来进行。结果见图18。
pdhA基因扩增的菌株，即AJ12310/pPDHA-2菌株，同Aj12310菌株相比较表现出L-谷氨酸积累增加并且表现出OD的增加，因此表明该pdhA基因对于L-谷氨酸的产生是有效的。
表17用于pdhA基因扩增的菌株的评测的培养基
Figure S071A9631720070628D000451
实施例7：用icd基因扩增的菌株进行的L-谷氨酸的生产
<1>携带来自Corynebacterium thermoaminogenes AJ12310菌株的i cd的质粒pICD-4的结构
根据SEQ ID NO：29所示的AJ12310茵株的icd基因序列合成了一些引物，这些引物见SEQ ID NO：103和SEQ ID NO：104。将一个Bg1II位点引入这两种引物的5’末端。另外，通过使用基因组DNA纯化试剂盒(Edge Biosystems)来制备Corynebacteriumthermoaminogenes AJ12310菌株的基因组DNA。将无菌水加至作为模板的该染色体DNA、上述引物各100pmol、8μl的dNTP混合物(各2.5mM)、10μl的10×Pyrobest缓冲液II(Takara Shuzo)以及2.5U的Pyrobest聚合酶(Taraka Shuzo)，制备成总体积100μl的反应混合物。使用上述的反应混合物以及热循环仪TP240(Taraka Shuzo)进行PCR扩增出约3.3kb的含有icd基因及其启动子的DNA片段，该PCR所用的循环为98℃下进行10秒钟的变性，在55℃下进行1分钟的结合并且在72℃下进行4分钟的延伸反应，该过程重复循环30次。
随后，以Bg1II消化这一含有icd基因的DNA片段并且在BamHI位点同pHSG299(Taraka Shuzo)进行连接。随后以XbaI对这一质粒进行处理，并且将一种通过以XbaI消化pXK4而获得的片段插入该质粒中以结构pICD-4。pICD-4的结构程序见图19。一种DNA连接试剂盒Ver.2(Takara Shuzo)被用于连接反应，大肠杆菌JM109菌株(Takara Shuzo)被用作为遗传操作的宿主。
<2>携带icd基因的质粒向AJ12310菌株中的转移
将上文所产生的质粒pICD-4引入Corynebacteriumthermoaminogenes AJ12310菌株以制备一种icd基因扩增的茵株。该转化以与实施例5相同的方式进行，并且在含有25μg/ml的卡那霉素的CM-2B培养基上对转化子进行选择以获得AJ12310/pICD-4菌株。
<3>通过icd扩增菌株进行的L-谷氨酸的生产
通过实施例6所描述的培养方法对AJ12310菌株和其icd扩增茵株AJ12310/pICD-4进行培养评估。结果见图20。icd扩增菌株AJ12310/pICD-4菌株同AJ12310菌株相比较，表现出L-谷氨酸积累增加以及OD的提高，由此表明icd基因的扩增对于L-谷氨酸的生产是有效的。
实施例8：用gdh基因扩增菌株进行的L-谷氨酸的生产
<1>携带来自Corynebacterium thermoaminogenes AJ12310菌株的gdh的质粒结构
根据SEQ ID NO：79所示的AJ12310菌株的gdh基因序列合成了一些引物，这些引物见SEQ ID NO：105和SEQ ID NO：106。另外，通过使用细菌基因组DNA纯化试剂盒(Advanced GeneticTechnologies Corp.)制备AJ12310菌株的基因组DNA。将无菌水加至0.5μg作为模板的该染色体DNA、上述引物各10pmo l、8μl的dNTP混合物(各2.5mM)、5μl的10×LATaq缓冲液(Takara Shuzo)以及2U的LA Taq(Taraka Shuzo)，制备成总体积50μl的反应混合物。使用上述的反应混合物以及热循环仪TP240(Taraka Shuzo)进行PCR以扩增出约2kb的含有gdh基因及其启动子的DNA片段，该PCR所用的循环为94℃下进行30秒钟的变性，在55℃下进行1秒种的结合并且在72℃下进行3分钟的延伸反应，该过程重复循环30次。以PstI(Takara Shuzo)消化所获得的扩增片段，将其与经过PstI完全消化的pHSG299(Takara Shuzo)混合并同其进行连接。TakaraShuzo生产的一种DNA连接试剂盒Ver.2被用于连接反应。连接之后，以连接产物对大肠杆菌JM109的感受态细胞(Takara Shuzo出产)进行转化，涂布于含有10μg/ml的IPTG(异丙基-β-D-硫代牛乳糖苷)、40μg/ml的X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)以及40μg/ml的氯霉素的L培养基平板上(10g/1的细菌蛋白胨、5g/l的细菌酵母抽提物、5g/l的NaCl、15g/l的琼脂，pH7.2)，并且进行过夜培养。挑选出现的白色菌落并且进行单茵落分离以获得转化子。
通过碱法从转化子中制备质粒(由日本生物科学和生物工程学会编辑的生物工程实验课本，p.105，Baifukan，1992)并且制作其限制性内切图谱。具有与图21所示的图谱等同的限制性图谱的质粒被命名为pHSG299YGDH。
将一种在棒状杆菌中发挥作用的复制起点引入pHSG299YGDH。具体地，以一种限制性酶XbaI消化pXC4以获得一种含有来自pHM1519的复制起点的片段，并且将该片段同经过XbaI完全消化的pHSG299YGDH进行混合并且同其进行连接。以上述途径制备质粒并且将具有与图21所示的图谱等同的限制性图谱的质粒命名为pYGDH。除了使用pHSG399(Cmr)代替pHSG299之外，pXC4的结构方式与实施例6中提及的pXK4的结构相同。
<2>携带gdh基因的质粒向AJ12310中的转移
将上文所产生的质粒引入Corynebacterium thermoaminogenesAJ12310菌株以制备一种可进行gdh基因扩增的菌株。该转化以与实施例5相同的方式进行，并且在31℃下在含有25μg/ml的卡那霉素的CM-2B培养基上对转化子进行选择以获得AJ12310/pYGDH菌株。
<3>通过gdh扩增菌株进行的的L-谷氨酸的生产
分别将在CM-2B培养基上生长的AJ12310菌株和上文获得的gdh扩增菌株AJ12310/pYGDH接种于500ml体积的烧瓶中并且在37℃下进行振荡培养直至葡萄糖被耗尽，该烧瓶中含有20ml用于育种培养的培养基，该培养基见表18。以2ml该培养物肉汤接种于一个500ml体积烧瓶中并且在37℃和44℃下作为主要培养物而培养，该烧瓶含有20ml用于主要培养烧瓶的培养基，该培养基见表19。持续进行主要培养直至葡萄糖完全耗尽。培养完成之后测量该培养基的OD620以及L-谷氨酸的积累量，以测定该基因扩增在细胞形成和谷氨酸生产中的作用。OD的测量通过使用HITACHIU-2000分光光度计(Hitachi)来进行，L-谷氨酸含量的测量通过使用AS-210谷氨酸分析仪(AsahiChemical Industry)来进行。
表18用于育种培养的培养基的组成
Figure S071A9631720070628D000481
表19用于主要培养的培养基的组成
Figure S071A9631720070628D000482
Figure S071A9631720070628D000491
培养的结果见表20和21。在37℃下，该gdh扩增菌株同亲本菌株AJ12310相比较表现出较高的糖类消耗速率、较为良好的生长以及获得较高的OD。进一步，L-谷氨酸积累和产率被显著地提高，即，在37％下提高5-7％。在44℃下产率也被提高，获得的OD也有所增加。在另一方面，在gdh扩增菌株中已经证实α-酮戊二酸的积累有所减少。这些结果表明gdh基因的扩增对于L-谷氨酸的产率的改善和副产物的减少是有效的。
表20可进行gdh扩增的菌株的培养结果(37℃)
OD620(51×) L-Glu的积累(g/d1) L-Glu产率(％) α-KG(mg/d1)
AJ12310 0.58 1.74 30.7 53.9
AJ12310/PYGDH 0.65 2.23 39.3 4.1
表21gdh扩增菌株的培养结果(44℃)
OD620(51×) L-Glu的积累(g/d1) L-Glu产率(％)
AJ12310 0.63 1.70 26.7
AJ12310/PYGDH 0.71 1.79 27.8
实施例9：通过gltA基因扩增的菌株进行的L-谷氨酸生产
<1>来自Corynebacterium thermoaminogenes的携带gltA基因的质粒的结构
根据SEQ ID NO：89所示的AJ12310菌株的gltA基因序列合成了一些引物，这些引物见SEQ ID NO：107和SEQ ID NO：108。
另外，通过使用细菌基因组DNA纯化试剂盒(Advanced GeneticTechnologies Corp.)来制备AJ12310菌株的基因组DNA。将无菌水加至0.5μg作为模板的该染色体DNA、上述引物各10pmol、8μl的dNTP混合物(各2.5mM)、10μl的10×Pyrobest-Taq缓冲液(Takara Shuzo)以及2U的Pyrobest Taq(Taraka Shuzo)，制备成总体积100μl的反应混合物。使用上述的反应混合物以及热循环仪TP240(TarakaShuzo)进行PCR以扩增出约2kb的含有gltA基因及其启动子的DNA片段，该PCR所用的循环为94℃下进行30秒钟的变性，在45℃下进行30秒种的结合并且在72℃下进行3分钟的延伸反应，该过程重复循环30次。KpnI(Takara Shuzo)消化所获得的扩增片段，将其与经过KpnI完全消化的pHSG299(Takara Shuzo)混合并同其进行连接。Takara Shuzo生产的一种DNA连接试剂盒Ver.2被用于连接反应。连接之后，以连接产物对大肠杆菌JM109的感受态细胞(TakaraShuzo出产)进行转化，涂布于含有l0μg/ml的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)、40μg/ml的X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)以及40μg/ml的氯霉素的L培养基平板上(10g/l的细茵蛋白胨、5g/l的细菌酵母抽提物、5g/l的NaCl、15g/l的琼脂，pH7.2)，并且进行过夜培养。挑选出现的白色茵落并且进行单茵落分离以获得转化子。
通过碱法从转化子中制备质粒(由日本生物科学和生物工程学会编辑的生物工程实验课本，p.105，Baifukan，1992)并且制作其限制性内切图谱。具有与图22所示的图谱等同的限制性图谱的质粒被命名为pHSG299YCS。
将一种在棒状杆菌中可以复制的复制起点引入pHSG299YCS。具体地，以一种限制性酶XbaI消化pXC4以获得一种含有来自pHM1519的复制起点的片段，并且将该片段同经过XbaI完全消化的pHSG299YCS进行混合并且同其进行连接。以上述途径制备质粒并且将具有与图22所示的图谱等同的限制性图谱的质粒命名为pYCS。
<2>携带gltA基因的质粒向AJ12310中的转移
将上文所产生的质粒引入Corynebacterium thermoaminogenesAJ12310菌株以制备一种gltA基因扩增的菌株。该转化以与实施例5相同的方式进行，并且在含有25μg/ml的卡那霉素的CM-2B培养基上对转化子进行选择以获得AJ12310/pYCS菌株。
<3>通过gltA扩增菌株进行的的L-谷氨酸的生产
分别将在CM-2B培养基上生长的AJ12310菌株和上文获得的gltA扩增菌株AJ12310/pYCS以与实施例8相同的方式进行培养。培养的结果见表22和表23。在培养温度37℃和44℃下，CS增强的菌株与其亲代菌株相比较表现出谷氨酸积累增加。进一步，该gltA扩增菌株表现出L-天冬氨酸和L-赖氨酸的积累的降低，它们合成自草酰乙酸。
这些结果表明gltA基因的扩增对于L-谷氨酸的产率的改善和副产物的减少是有效的。
表22可进行gltA扩增的菌株的培养结果(37℃)
L-Glu积累(g/d1) 产率(％) L-Asp积累(g/d1) L-Lys积累(g/d1)
AJ12310 1.79 31.9 11.8 11.0
AJ12310/pYCS 2.04 36.5 8.1 7.3
表23可进行gltA扩增的菌株的培养结果(44℃)
L-Glu积累(g/d1) 产率(％) L-Asp积累(g/d1) L-Lys积累(g/d1)
AJ12310 1.79 31.9 11.8 11.0
AJ12310/pYCS 2.04 36.5 8.1 7.3
[序列表说明]
SEQ ID NO：1：aceA，核苷酸序列
SEQ ID NO：2：aceA，氨基酸序列
SEQ ID NO：3：accBC，核苷酸序列
SEQ ID NO：4：accBC，氨基酸序列
SEQ ID NO：5：dtsR1，核苷酸序列
SEQ ID NO：6：dtsR1，氨基酸序列
SEQ ID NO：7：dtsR2，核苷酸序列
SEQ ID NO：8：dtsR2，氨基酸序列
SEQ ID NO：9：pfk，核苷酸序列
SEQ ID NO：10：pfk，氨基酸序列
SEQ ID NO：11：scrB(AJ12340)，核苷酸序列
SEQ ID NO：12：scrB(AJ12340)，氨基酸序列
SEQ ID NO：13：scrB(AJ12309)，核苷酸序列
SEQ ID NO：14：scrB(AJ12309)，氨基酸序列
SEQ ID NO：15：scrB(AJ12310)，核苷酸序列
SEQ ID NO：16：gluABCD，核苷酸序列
SEQ ID NO：17：gluABCD，氨基酸序列
SEQ ID NO：18：gluABCD，氨基酸序列
SEQ ID NO：19：gluABCD，氨基酸序列
SEQ ID NO：20：gluABCD，氨基酸序列
SEQ ID NO：21：pdhA，核苷酸序列
SEQ ID NO：22：pdhA，氨基酸序列
SEQ ID NO：23：pc，核苷酸序列
SEQ ID NO：24：pc，氨基酸序列
SEQ ID NO：25：ppc，核苷酸序列
SEQ ID NO：26：ppc，氨基酸序列
SEQ ID NO：27：acn，核苷酸序列
SEQ ID NO：28：acn，氨基酸序列
SEQ ID NO：29：icd，核苷酸序列
SEQ ID NO：30：icd，氨基酸序列
SEQ ID NO：31：lpd，核苷酸序列
SEQ ID NO：32：lpd，氨基酸序列
SEQ ID NO：33：odhA，核苷酸序列
SEQ ID NO：79：gdh(AJ12310)，核苷酸序列
SEQ ID NO：80：gdh(AJ12310)，氨基酸序列
SEQ ID NO：81：gdh(2256)，核苷酸序列
SEQ ID NO：82：gdh(2256)，氨基酸序列
SEQ ID NO：89：gltA(AJ12310)，核苷酸序列
SEQ ID NO：90：gltA(AJ12310)，氨基酸序列
SEQ ID NO：91：gltA(2256)，核苷酸序列
SEQ ID NO：92：gltA(2256)，氨基酸序列
SEQ ID NO：93：scrB(AJ12309)，核苷酸序列
SEQ ID NO：94：scrB(AJ12309)，氨基酸序列
工业应用
根据本发明，编码来自Corynebacterium thermoaminogenes的氨基酸生物合成途径酶的基因或者编码氨基酸向细胞内摄入的蛋白质的基因。
本发明的基因可被用于上述酶或者蛋白质的生产或者氨基酸生产细菌的育种。
序列表
<110>Aj inomoto Co.，Inc.
<120>来自棒状嗜热细菌的氨基酸生物合成途径的酶的基团
<130>B691SMOP1072
<140>
<141>2000-10-04
<150>JP11-282716
<151>1999-10-04
<150>JP11-311147
<151>1999-11-01
<150>JP2000-120687
<151>2000-04-21
<160>108
<170>PatentIn Ver.2.0
<210>1
<211>1980
<212>DNA
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Figure S071A9631720070628D000561
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<212>PRT
<213>Corynebacterium thermoaminogenes
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Figure S071A9631720070628D000581
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<211>2381
<212>DNA
<213>Corynebacterium thermoaminogenes
<220>
<221>CDS
<222>(577)..(2349)
<400>3
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Figure S071A9631720070628D000611
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<212>PRT
<213>Corynebacterium thermoaminogenes
<400>4
Figure S071A9631720070628D000621
Figure S071A9631720070628D000631
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<211>2128
<212>DNA
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<213>Corynebacterium thermoaminogenes
<400>6
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Figure S071A9631720070628D000671
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<213>Corynebacterium thermoaminogenes
<220>
<221>CDS
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Figure S071A9631720070628D000691
Figure S071A9631720070628D000701
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<213>Corynebacterium thermoaminogenes
<400>8
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Figure S071A9631720070628D000731
Figure S071A9631720070628D000741
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<212>PRT
<213>Corynebacterium thermoaminogenes
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Figure S071A9631720070628D000742
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<212>DNA
<213>Corynebacterium thermoaminogenes
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<212>PRT
<213>Corynebacterium thermoaminogenes
<400>12
Figure S071A9631720070628D000762
Figure S071A9631720070628D000771
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<212>DNA
<213>Corynebacterium thermoaminogenes
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Figure S071A9631720070628D000782
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<221>CDS
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<221>CDS
<222>(3235)..(4065)
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Figure S071A9631720070628D000811
Figure S071A9631720070628D000821
Figure S071A9631720070628D000831
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<212>PRT
<213>Corynebacterium thermoaminogenes
<400>17
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<212>PRT
<213>Corynebacterium thermoaminogenes
<400>18
Figure S071A9631720070628D000852
Figure S071A9631720070628D000861
<210>19
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<212>PRT
<213>Corynebacterium thermoaminogenes
<400>19
Figure S071A9631720070628D000862
Figure S071A9631720070628D000871
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<212>PRT
<213>Corynebacterium thermoaminogenes
<400>20
Figure S071A9631720070628D000872
Figure S071A9631720070628D000881
<210>21
<211>3598
<212>DNA
<213>Corynebacterium thermoaminogenes
<220>
<221>CDS
<222>(454)..(3222)
<400>21
Figure S071A9631720070628D000882
Figure S071A9631720070628D000891
Figure S071A9631720070628D000901
Figure S071A9631720070628D000911
Figure S071A9631720070628D000921
<210>22
<211>923
<212>PRT
<213>Corynebacterium thermoaminogenes
<400>22
Figure S071A9631720070628D000922
Figure S071A9631720070628D000941
Figure S071A9631720070628D000951
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<211>4013
<212>DNA
<213>Corynebacterium thermoaminogenes
<220>
<221>CDS
<222>(319)..(3735)
<400>23
Figure S071A9631720070628D000952
Figure S071A9631720070628D000961
Figure S071A9631720070628D000981
Figure S071A9631720070628D000991
Figure S071A9631720070628D001001
<210>24
<211>1139
<212>PRT
<213>Corynebacterium thermoaminogenes
<400>24
Figure S071A9631720070628D001011
Figure S071A9631720070628D001021
Figure S071A9631720070628D001031
Figure S071A9631720070628D001041
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<212>DNA
<213>Corynebacterium thermoaminogenes
<220>
<221>CDS
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Figure S071A9631720070628D001051
Figure S071A9631720070628D001071
Figure S071A9631720070628D001081
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<212>PRT
<213>Corynebacterium thermoaminogenes
<400>26
Figure S071A9631720070628D001091
Figure S071A9631720070628D001101
Figure S071A9631720070628D001111
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<212>DNA
<213>Corynebacterium thermoaminogenes
<220>
<221>CDS
<222>(686)..(3388)
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Figure S071A9631720070628D001112
Figure S071A9631720070628D001121
Figure S071A9631720070628D001141
Figure S071A9631720070628D001151
Figure S071A9631720070628D001161
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<212>PRT
<213>Corynebacterium thermoaminogenes
<400>28
Figure S071A9631720070628D001171
Figure S071A9631720070628D001181
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<211>3006
<212>DNA
<213>Corynebacterium thermoaminogenes
<220>
<221>CDS
<222>(328)..(2514)
<400>29
Figure S071A9631720070628D001191
Figure S071A9631720070628D001201
Figure S071A9631720070628D001211
Figure S071A9631720070628D001221
<210>30
<211>729
<212>PRT
<213>Corynebacterium thermoaminogenes
<400>30
Figure S071A9631720070628D001222
Figure S071A9631720070628D001231
Figure S071A9631720070628D001241
<210>31
<211>2322
<212>DNA
<213>Corynebacterium thermoaminogenes
<220>
<221>CDS
<222>(806)..(2212)
<400>31
Figure S071A9631720070628D001251
Figure S071A9631720070628D001271
<210>32
<211>469
<212>PRT
<213>Corynebacterium thermoaminogenes
<400>32
Figure S071A9631720070628D001272
Figure S071A9631720070628D001281
<210>33
<211>4096
<212>DNA
<213>Corynebacterium thermoaminogenes
<220>
<221>CDS
<222>(250)..(3951)
<400>33
Figure S071A9631720070628D001291
Figure S071A9631720070628D001301
Figure S071A9631720070628D001321
Figure S071A9631720070628D001331
Figure S071A9631720070628D001341
<210>34
<211>1234
<212>PRT
<213>Corynebacterium thermoaminogenes
<400>34
Figure S071A9631720070628D001342
Figure S071A9631720070628D001351
Figure S071A9631720070628D001361
Figure S071A9631720070628D001371
Figure S071A9631720070628D001381
<210>35
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：aceA的引物
<400>35
Figure S071A9631720070628D001382
<210>36
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：aceA的引物
<400>36
Figure S071A9631720070628D001383
<210>37
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：accBC的引物
<400>37
Figure S071A9631720070628D001391
<210>38
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：accBC的引物
<400>38
Figure S071A9631720070628D001392
<210>39
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：dtsR1的引物
<400>39
Figure S071A9631720070628D001393
<210>40
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：dtsR1的引物
<400>40
Figure S071A9631720070628D001394
<210>41
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：dtsR2的引物
<400>41
Figure S071A9631720070628D001401
<210>42
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：dtsR2的引物
<400>42
Figure S071A9631720070628D001402
<210>43
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：pfk的引物
<400>43
Figure S071A9631720070628D001403
<210>44
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：pfk的引物
<400>44
Figure S071A9631720070628D001404
<210>45
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：scrB的引物
<220>
<221>不确定
<222>(3)
<223>n＝a or g or c or t
<400>45
Figure S071A9631720070628D001411
<210>46
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：scrB的引物
<220>
<221>不确定
<222>(18)
<223>n＝a or g or cor t
<400>46
Figure S071A9631720070628D001412
<210>47
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：gluABCD的引物
<400>47
Figure S071A9631720070628D001413
<210>48
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：gluABCD的引物
<400>48
<210>49
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：pdhA的引物
<400>49
Figure S071A9631720070628D001422
<210>50
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：pdhA的引物
<400>50
<210>51
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：pc的引物
<400>51
Figure S071A9631720070628D001424
<210>52
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：pc的引物
<400>52
Figure S071A9631720070628D001431
<210>53
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：ppc的引物
<400>53
Figure S071A9631720070628D001432
<210>54
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：ppc的引物
<400>54
Figure S071A9631720070628D001433
<210>55
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：acn的引物
<220>
<221>不确定
<222>(3，6，9)
<223>n＝次黄苷
<400>55
Figure S071A9631720070628D001434
<210>56
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：acn的引物
<220>
<221>不确定
<222>(3，9，18)
<223>n＝次黄苷
<400>56
Figure S071A9631720070628D001441
<210>57
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：icd的引物
<400>57
Figure S071A9631720070628D001442
<210>58
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：icd的引物
<400>58
Figure S071A9631720070628D001443
<210>59
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：lpd的引物
<400>59
Figure S071A9631720070628D001451
<210>60
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：lpd的引物
<400>60
Figure S071A9631720070628D001452
<210>61
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：odhA的引物
<400>61
Figure S071A9631720070628D001453
<210>62
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：odhA的引物
<400>62
Figure S071A9631720070628D001454
<210>63
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：lpd筛选PCR的引物
<400>63
Figure S071A9631720070628D001461
<210>64
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：lpd筛选PCR的引物
<400>64
Figure S071A9631720070628D001462
<210>65
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：acn LA克隆的引物
<400>65
<210>66
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：acn LA克隆的引物
<400>66
Figure S071A9631720070628D001464
<210>67
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：icd LA克隆的引物
<400>67
Figure S071A9631720070628D001471
<210>68
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：icd LA克隆的引物
<400>68
Figure S071A9631720070628D001472
<210>69
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：lpd LA克隆的引物
<400>69
Figure S071A9631720070628D001473
<210>70
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：lpd LA克隆的引物
<400>70
Figure S071A9631720070628D001474
<210>71
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：acn LA克隆的引物
<400>71
Figure S071A9631720070628D001481
<210>72
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：acn LA克隆的引物
<400>72
Figure S071A9631720070628D001482
<210>73
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：icd LA克隆的引物
<400>73
<210>74
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：icd LA克隆的引物
<400>74
Figure S071A9631720070628D001484
<210>75
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：odhA LA克隆的引物
<400>75
Figure S071A9631720070628D001491
<210>76
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：odhA LA克隆的引物
<400>76
Figure S071A9631720070628D001492
<210>77
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：gdh基因扩增引物
<400>77
<210>78
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：gdh基因扩增引物
<400>78
<210>79
<211>1344
<212>DNA
<213>Corynebacterium thermoaminogenes
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1341)
<400>79
Figure S071A9631720070628D001511
Figure S071A9631720070628D001521
<210>80
<211>447
<212>PRT
<213>Corynebacterium thermoaminogenes
<400>80
<210>81
<211>1344
<212>DNA
<213>乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1341)
<400>81
Figure S071A9631720070628D001532
Figure S071A9631720070628D001541
Figure S071A9631720070628D001551
<210>82
<211>447
<212>PRT
<213>乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)
<400>82
Figure S071A9631720070628D001552
Figure S071A9631720070628D001561
Figure S071A9631720070628D001571
<210>83
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：gltA基因扩增引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(9)
<223>n＝次黄苷
<400>83
Figure S071A9631720070628D001572
<210>84
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：gltA基因扩增引物
<400>84
Figure S071A9631720070628D001573
<210>85
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：gltA基因扩增引物
<400>85
Figure S071A9631720070628D001574
<210>86
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：gltA基因扩增引物
<400>86
Figure S071A9631720070628D001581
<210>87
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：gltA基因扩增引物
<400>87
Figure S071A9631720070628D001582
<210>88
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：gltA基因扩增引物
<400>88
Figure S071A9631720070628D001583
<210>89
<211>1293
<212>DNA
<213>Corynebacterium thermoaminogenes
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1290)
<400>89
Figure S071A9631720070628D001591
Figure S071A9631720070628D001601
<210>90
<211>430
<212>PRT
<213>Corynebacterium thermoaminogenes
<400>90
<210>91
<211>1314
<212>DNA
<213>乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1311)
<400>91
Figure S071A9631720070628D001631
Figure S071A9631720070628D001641
<210>92
<211>437
<212>PRT
<213>乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)
<400>92
Figure S071A9631720070628D001642
Figure S071A9631720070628D001651
<210>93
<211>1656
<212>DNA
<213>Corynebacterium thermoaminogenes
<220>
<221>CDS
<222>(309)..(1595)
<400>93
Figure S071A9631720070628D001661
Figure S071A9631720070628D001671
<210>94
<211>429
<212>PRT
<213>Corynebacterium thermoaminogenes
<400>94
Figure S071A9631720070628D001682
Figure S071A9631720070628D001691
<210>95
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：scrB基因扩增引物
<400>95
Figure S071A9631720070628D001692
<210>96
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：scrB基因扩增引物
<400>96
Figure S071A9631720070628D001701
<210>97
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：scrB LA克隆引物
<400>97
Figure S071A9631720070628D001702
<210>98
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：scrB LA克隆引物
<400>98
<210>99
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：scrB LA克隆引物
<400>99
<210>100
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：scrB基因LA克隆引物
<400>100
<210>101
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：scrB基因扩增引物
<400>101
Figure S071A9631720070628D001712
<210>102
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：scrB基因扩增引物
<400>102
<210>103
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：icd基因扩增引物
<400>103
Figure S071A9631720070628D001714
<210>104
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：icd基因扩增引物
<400>104
Figure S071A9631720070628D001721
<210>105
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：gdh基因扩增引物
<400>105
<210>106
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：gdh基因扩增引物
<400>106
Figure S071A9631720070628D001723
<210>107
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：gltA基因扩增引物
<400>107
<210>108
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：gltA基因扩增引物
<400>108
Figure S071A9631720070628D001732

Claims (6)

1.一种蛋白质，该蛋白质由序列表中SEQ ID NO：90的氨基酸序列组成。
2.一种DNA，该DNA编码的蛋白质由序列表中SEQ ID NO：90的氨基酸序列组成。
3.权利要求2的DNA，该DNA由序列表中SEQ ID NO：89的核苷酸序列组成。
4.一种用于生产L-谷氨酸的方法，该方法包括在培养基中培养一种棒状杆菌，在该培养基中产生并且积累L-谷氨酸，以及从该培养基中收集该L-谷氨酸，所述棒状杆菌中引入了权利要求2或3的DNA。
5.权利要求4的方法，其中通过使用载体将DNA引入棒状杆菌中。
6.权利要求4的方法，其中所述棒状杆菌是谷氨酸棒状杆菌或Corynebacterium thermoaminogenes。
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