CN101076727A - 检测、鉴定和定量大环内酯及其杂质的方法与系统 - Google Patents

检测、鉴定和定量大环内酯及其杂质的方法与系统 Download PDF

Info

Publication number
CN101076727A
CN101076727A CNA2005800143945A CN200580014394A CN101076727A CN 101076727 A CN101076727 A CN 101076727A CN A2005800143945 A CNA2005800143945 A CN A2005800143945A CN 200580014394 A CN200580014394 A CN 200580014394A CN 101076727 A CN101076727 A CN 101076727A
Authority
CN
China
Prior art keywords
macrolide
impurity
specimen
erythromycylamine
eluent
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CNA2005800143945A
Other languages
English (en)
Inventor
J·李
J·瑟瑞恩
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
NOVARTIS VACCINES and DIAGNOSTIC Inc
Original Assignee
Chiron Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chiron Corp filed Critical Chiron Corp
Publication of CN101076727A publication Critical patent/CN101076727A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/02—Food
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H17/00—Compounds containing heterocyclic radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H17/04—Heterocyclic radicals containing only oxygen as ring hetero atoms
    • C07H17/08—Hetero rings containing eight or more ring members, e.g. erythromycins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N2030/022—Column chromatography characterised by the kind of separation mechanism
    • G01N2030/027—Liquid chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
    • G01N30/28—Control of physical parameters of the fluid carrier
    • G01N30/34—Control of physical parameters of the fluid carrier of fluid composition, e.g. gradient
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/64—Electrical detectors
    • G01N30/70—Electron capture detectors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/72—Mass spectrometers
    • G01N30/7233—Mass spectrometers interfaced to liquid or supercritical fluid chromatograph
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
    • Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
  • Investigating Or Analyzing Non-Biological Materials By The Use Of Chemical Means (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)

Abstract

本发明涉及检测大环内酯以及检测、鉴定和定量含有大环内酯的样品中杂质的反向高效液相色谱(RP－HPLC)方法和系统。

Description

检测、鉴定和定量大环内酯及其杂质的方法与系统
相关申请的交叉引用
本申请要求2004年5月6日提交的美国系列号60/568,637的优先权，其内容全文纳入本文作为参考。
发明领域
本发明涉及检测、鉴定和定量大环内酯，例如红霉胺和相关化合物的分析方法与系统，包括反相高效液相色谱(RP-HPLC)和电化学检测或质谱检测。
发明背景
大环内酯是用于治疗各种细菌感染的抗生素家族。大环内酯的化学特征在于14到16个原子和一般至少一个侧挂糖(pendant sugar)、氨基糖或相关部分组成的大环内酯环结构。据信，大环内酯与细菌50S核糖体上的两个位点结合导致转移RNA解离和肽连接终止，从而抑制了细菌蛋白质合成。红霉素是于1952年发现的第一个大环内酯类抗生素并且很快进入临床使用。红霉素和早期的衍生物(例如，不同的盐和酯)的一般特征在于对大多数革兰阳性细菌，特别是链球菌具有抑菌或杀菌活性，以及对呼吸道病原体具有良好活性。已证实大环内酯对许多呼吸道感染安全有效，并可用于青霉素过敏的患者。
大环内酯一般在非常低的波长范围(例如，＜220nm)具有紫外(UV)吸收，这接近光度检测方法的极限。红霉素(结构见下文)的美国药典国家处方集(USP-NF)的法定试验方法包括利用215nm紫外检测以L21固定相(反相，刚性，球状苯乙烯-二乙烯基苯共聚物，5到10μm粒径)进行的RP-HPLC(参见，例如2000年1月1日出版的USP-NF的第663-665页)。事实上，许多还原的红霉素衍生物和相关分子，例如9-(S)-红霉胺(erythromycylamine)(eryamine或PA2794，结构见下文)在远低于215nm具有最大紫外吸收带(UVmax)。例如，9-(S)-红霉胺的UVmax发生在约191nm，这接近标准光度检测方法的短波长极限。因此，例如电化学检测质谱检测方法的替代检测方法是有吸引力的(参见，例如Whitaker等，J.Liq.Chromatogr.，(1988)，11(14)，3011-20；Pappa-Louisi等，J.Chromatogr：，B：Biomed.Sci.Appl.，(2001)，755(1-2)，57-64；Kees等，J.Chromatogr.，A(1998)，812(1+2)，287-293；Hedenmo等，J.Chromatogr.，A(1995)，692(1+2)，161-6；Daszkowski等，J.Liq.Chromatogr.Relat.Technol.，(1999)，22(5)，641-657和Dubois等，J.Chromatogr.，B：Biomed.Sci.Appl.，(2001)，753(2)，189-202)。然而，这些替代方法主要设计用于检测生物基质，例如血浆或其它生物物质中的大环内酯，其并未优化用于将基本纯的大环内酯(用作，例如活性药物成分(API))与较低含量的杂质分开，而许多这些杂质是具有类似物理性质的相关大环内酯。
Figure A20058001439400101
              红霉素              9-(S)-红霉胺
因为检测、鉴定和定量大环内酯样品中的杂质是质控所必需的，特别是当该大环内酯是API时所必需的，目前需要适当地设计利用HPLC试验方法来检测、鉴定和定量大环内酯，例如9-(S)-红霉胺及其杂质的试验(方法)。本文所述的方法和系统有助于满足这些与其它需求。
发明概述
本发明提供检测测试样品中的大环内酯的方法，其中该测试样品的主要组分以重量计是大环内酯，该方法包括：
a)将该测试样品施加至反相高效液相色谱(RP-HPLC)柱；
b)用含有挥发性缓冲液、水、乙腈和醇类的梯度流动相洗脱该测试样品；和
c)用电化学检测器或质谱检测器监测柱的流出液以分别检测对应于该大环内酯的电流峰或质量峰。
本发明还提供测定测试样品的纯度的方法，其中该测试样品的主要组分以重量计是大环内酯，该方法包括：
a)将该测试样品施加至反相高效液相(RP-HPLC)色谱柱；
b)用含有挥发性缓冲液、水、乙腈和醇类的梯度流动相洗脱该样品；
c)用电化学检测器监测柱的流出液，以检测：
i)对应于该大环内酯的电流峰；和
ii)任选的一个或多个对应于该测试样品中的一种或多种杂质的其它电流峰；和
d)测定该检测器所检测的电流峰的一种或多种特性来计算该测试样品中的杂质含量。
本发明还提供鉴定测试样品中杂质的方法，其中该测试样品的主要组分以重量计是大环内酯，该方法包括：
a)将该测试样品施加至反相高效液相色谱(RP-HPLC)柱；
b)用含有挥发性缓冲液、水、乙腈和醇类的梯度流动相洗脱该测试样品；
c)用质谱检测器监测柱的流出液，以检测：
i)对应于该大环内酯的质量峰(mass peak)；和
ii)对应于该测试样品中杂质的其它质量峰；和
d)测定对应于杂质的其它质量峰的质量。
本发明还提供测定测试样品中杂质含量的方法，其中该测试样品的主要组分以重量计是大环内酯，该方法包括：
a)通过HPLC-MS或HPLC-ECD试验鉴定杂质；
b)通过包括以下步骤的方法测定杂质的响应因子：
i)在用含有离子对试剂的流动相洗脱的反向高效液相色谱(RP-HPLC)柱上操作已知量的杂质和已知量的大环内酯。其中该RP-HPLC柱的外部装有检测波长为约180nm到约220nm的紫外(UV)检测器；
ii)用紫外检测器监测柱的流出液，以检测位于检测波长的对应于杂质的第一吸收峰；
iii)用紫外检测器监测柱的流出液，以检测位于检测波长的对应于大环内酯的第二吸收峰；和
iv)利用第一和第二吸收峰的峰面积计算杂质的响应因子；和
c)通过包括以下步骤的方法测定该测试样品中杂质的含量：
i)在与步骤b)相同的试验条件下操作该测试样品，以检测对应于杂质的第三吸收峰；和
ii)利用响应因子计算该测试样品中杂质的含量。
本发明还提供了检测红霉胺测试样品中的杂质的系统，包括：
a)包括以下部分的反向高效液相色谱柱：
i)C18柱；
ii)含有洗脱液A和洗脱液B的混合物的梯度流动相，其洗脱液A和洗脱液B的相对含量在洗脱进程中变化，其中洗脱液A基本上由约60到约75mM水配制的乙酸铵组成，洗脱液B基本上由约60到约75mM的用约50到约70％乙腈(以体积计)和约30到约50％甲醇(以体积计)组成的混合物配制的乙酸铵组成。
b)电化学检测器或质谱检测器，其中该电化学检测器包括保护电极、筛选电极和工作电极。
本文的方法和系统可检测的示例性大环内酯包括，例如9-(S)-红霉胺、9-(R)-红霉胺、红霉素、红霉素腙、红霉素、9-亚氨基红霉素、红霉素肟、红霉素B、红霉素腙B、9-亚氨基红霉素B、红霉胺B、红霉素腙丙酮加合物、9-羟基亚氨基红霉素、氢氧化红霉胺、9-羟基亚氨基红霉素B、氢氧化红霉胺B、红霉胺C、红霉胺D、阿奇霉素、甲基红霉素、迪利霉素、罗红霉素、三乙酰竹桃霉素、它们的衍生物等。
本发明还包括发明详述中所提供的实施方案。
附图简述
图1和2显示本发明方法和系统可检测、鉴定和定量的9-(S)-红霉胺的可能的杂质。
图3描述了9-(S)-红霉胺的示例性合成。
发明详述
本发明特别提供了利用电化学(ECD)和/或质谱(MS)作为检测方法检测、鉴定和定量大环内酯及其杂质的HPLC方法和系统等。HPLC-ECD和HPLC-MS试验包括在用含有挥发性缓冲液、水、乙腈和醇类的梯度流动相洗脱的反向高效液相色谱(RP-HPLC)柱上操作大环内酯样品。用电化学检测器或质谱检测器监测柱的流出液以分别检测对应于样品中的大环内酯和/或可能的任何杂质的电流峰或质量峰。在一些实施方案中，利用质谱有助于鉴定在所得图谱中检测到的化合物。还可联用HPLC试验与光度检测(例如，HPLC-UV)来定量大环内酯样品中已鉴定的杂质。
本发明(所述)的大环内酯包括任何已知的抗生素或其它大环内酯和它们的衍生物。典型的大环内酯的特征在于12-、14-或16-元大环内酯核心结构。大环内酯是本领域广为知晓的，其详细描述于，例如全文纳入本文作为参考的《大环内酯类抗生素》(Macrolide Antibiotics)，Satoshi Omura编，AcademicPress，Inc.，Orlando，Florida，1984。在一些实施方案中，所述大环内酯具有相对不佳的紫外-可见(UV-VIS)吸收分布，例如，在UV-VIS范围(约100nm到约900nm)中显示最大吸收在波长约180nm到约220nm，约180nm到约200nm，或约180nm到约195nm。在其它实施方案中，该大环内酯在UV-VIS范围中的最大吸收在波长约188、约189、约190、约191、约192、约193、约194、约195、约196、约197、约198、约199、约200、约201、约202、约203、约204或约205nm。
本文的方法和系统可检测的示例性大环内酯包括，例如9-(S)-红霉胺、9-(R)-红霉胺、红霉素、红霉素腙、红霉素、9-亚氨基红霉素、红霉素肟、红霉素B、红霉素腙B、9-亚氨基红霉素B、红霉胺B、红霉素腙丙酮加合物、9-羟基亚氨基红霉素、氢氧化红霉胺、9-羟基亚氨基红霉素B、氢氧化红霉胺B、红霉胺C、红霉胺D、阿奇霉素、甲基红霉素、迪利霉素、罗红霉素、三乙酰竹桃霉素、它们的衍生物等。
在一些实施方案中，该大环内酯是9-(S)-红霉胺。
在一些实施方案中，适用于本发明方法和系统分析的测试样品包含至少一种大环内酯。在一些实施方案中，测试样品包含以重量计构成该测试样品的主要组分的大环内酯。测试样品可以任选包含称为杂质的其它含量较低的组分。在一些实施方案中，测试样品是通过化学合成方法制备、经常含有少量杂质的数批基本纯的大环内酯。本文所用的术语“杂质”指除作为研究对象的大环内酯以外的化合物。在一些实施方案中，以重量计，一种或多种杂质在测试样品中低于约30％、低于约20％、低于约10％、低于约5％或低于约1％。
杂质经常可以是另一种大环内酯，例如占测试样品大部分的大环内酯的衍生物。杂质可以是主要的大环内酯组分的降解产物或化学合成的遗留物。在一些实施方案中，这些杂质包括一种或多种图1和2所示的化合物，例如红霉素B、红霉素腙B、9-亚氨基红霉素B、红霉胺B、红霉素腙丙酮加合物、9-羟基亚氨基红霉素、氢氧化红霉胺、9-羟基亚氨基红霉素B、氢氧化红霉胺B、9-(R)-红霉胺；红霉胺C、红霉胺D或式I、II、III、IV或V所示的化合物：
Figure A20058001439400151
在一些实施方案中，杂质是式VI、VII、VIII、IX、X或XI所示的化合物：
Figure A20058001439400152
本文在提及HPLC试验时所用的短语“操作测试样品”指1)将测试样品施加至HPLC柱，然后2)用流动相洗脱该测试样品，其中用能检测该测试样品中的大环内酯和/或杂质的检测器监测得到的洗脱液。
HPLC-ECD和HPLC-MS试验
与MS检测方法相容的试验所用的流动相一般含有挥发性组分。例如，用于本发明HPLC-ECD和HPLC-MS试验的流动相可含有挥发性缓冲液、水、乙腈和醇类。
合适的挥发性缓冲液包括可将流动相维持在所需pH并且不干扰通过质谱检测大环内酯的任何缓冲物质。在一些实施方案中，该挥发性缓冲液含有例如乙酸铵的铵盐。流动相中挥发性缓冲盐的浓度可以是约40到约100、约50到约80或约60到约75mM。在一些实施方案中，流动相中挥发性缓冲盐的浓度是约67mM。在其它实施方案中，流动相的pH为约6到约8。在还有其它实施方案中，流动相的pH约为7。
流动相中合适的有机组分包括有机溶剂，例如乙腈，和控制峰型和保留时间的有机改性剂(organic modifier)，例如醇类。示例性的合适醇类包括C1-C8直链或支链醇类，例如甲醇、乙醇、异丙醇等。在一些实施方案中，该醇类是甲醇。在一些实施方案中，流动相中乙腈与醇类的体积比可以是约1∶1到约2∶1。在一些实施方案中，乙腈与醇类的体积比可以是约3∶2。
流动相可以作为梯度洗脱流过HPLC柱。因此，流动相可以由两种或多种不同的洗脱液溶液的混合物构成，其比例可随洗脱的进程而变化。在一些实施方案中，流动相由洗脱液A和洗脱液B的混合物构成，洗脱液A和洗脱液B的相对含量在洗脱进程中可变化。在一些实施方案中，洗脱液A含有约60到约75mM水配制的乙酸铵，洗脱液B含有约60到约75mM的用约50到约70％乙腈(以体积计)和约30到约50％甲醇(以体积计)组成的混合物配制的乙酸铵。
在其它实施方案中，洗脱液A含有约65到约70mM水配制的乙酸铵，洗脱液B含有约65到约70mM的用约55到约60％乙腈(以体积计)和约40到约45％甲醇(以体积计)组成的混合物配制恶乙酸铵
在还有其它实施方案中，洗脱液A含有约67mM水配制的乙酸铵，洗脱液B含有约67mM的用约58％乙腈(以体积计)和约42％甲醇(以体积计)组成的混合物配制的乙酸铵。
在还有其它实施方案中，流动相在洗脱期间的任一点可含有约40到约75％(以体积计)的洗脱液A和约25到约60％(以体积计)的洗脱液B组成的混合物。在一些实施方案中，洗脱液B的比例随着洗脱时间而逐渐增加。
固定相可以由任何反相固体载体介质构成，该介质与流动相联用可检测大环内酯并将其与杂质分开。在一些实施方案中，该固定相含有C8到C18基质。在其它实施方案中，该固定相是C18基质。
在将测试样品引入(HPLC)柱前，可用样品稀释溶液将其稀释成稀释样品。稀释样品中大环内酯的合适浓度是任何合适的含量，例如约0.1到约5mg/mL。在一些实施方案中，该浓度可以是约0.5到约1mg/mL。样品稀释剂可以与流动相相同或类似。在一些实施方案中，所述样品稀释剂是水、乙腈和醇类，例如甲醇的混合物。在其它实施方案中，样品稀释剂含有约50到约90％水、约10到约50％以下成分组成的混合物：约50到约70％乙腈和约30到约50％甲醇。在还有其它实施方案中，样品稀释剂含有约70％水和约30％以下成分组成的混合物：约60％乙腈和约40％甲醇。
电化学检测器(ECD)可以是能诱导和检测大环内酯氧化或还原的任何合适的检测器。合适的CED的例子包括利用三个电极的CED：保护电极或小室、筛选电极和工作电极。例如，所述工作电极可以是铂或玻璃碳电极。可通过技术人员已知的任何标准方法来校验电极。在一些实施方案中，CED设置为通过氧化大环内酯和伴有的杂质来检测大环内酯和伴有的杂质。例如，可将工作电极设置于适合氧化大环内酯的电位，该电位可通过各种已知方法，例如循环伏安法来确定。适合于工作电极的电位包括大于约700mV、大于约750mV和大于约800mV。在一些实施方案中，工作电极的电位为约800到约900mV。在其它实施方案中，工作电极的电位为约850mV。本领域技术人员不难确定保护电极和参比电极的电位。例如，保护电极的电位为约100mV，参比电极的电位低于工作电极的，例如约-100mV到约100mV。在一些实施方案中，参比电极的电位为约0mV。
质谱(MS)检测器可包括能检测和测定大环内酯质荷比的任何MS检测器。合适的MS检测器用途广泛，例与许多商业LC-MS仪器联用，它们在检测例如大环内酯的有机化合物中的用途是本领域惯常的。在一些实施方案中，可以正模式(positive mode)利用MS检测器检测大环内酯和任何伴有的杂质。可通过任何合适的方法进行离子化，包括电喷雾或其它方式。合适的MS参数包括毛细管温度为约150到约200℃(例如，约180℃)，汽化室的温度设置为约300到约400℃(例如，约350℃)。
可在各种温度和压力，包括室温和环境压力下根据本发明方法和系统洗脱大环内酯。在一些实施方案中，在约10到约30，约15到约25，或约20℃的恒温进行洗脱。可通过在柱外装上为此应用而设计的冷凝器将温度维持在室温以下。相反，可通过在柱外装上为此应用而设计的加热器将温度维持在室温以上。也可在空气或惰性气氛中进行洗脱。
可通过比较认为用本发明的试验获得的含有对应于大环内酯的峰的色谱图与在同一条件下操作的显示大环内酯已知样品的参比峰的色谱图来证实对大环内酯的检测。例如，在参比峰的约0.2分钟内出现的样品峰可认为得到证实。也可通过比较对应于大环内酯的峰的面积与含量已知的大环内酯参比样品(标准品)所得色谱图中峰的面积来定量样品中大环内酯的含量。
本发明还提供了测定测试样品纯度的方法。该方法包括a)在反向高效液相色谱(RP-HPLC)柱上利用含有挥发性缓冲液、水、乙腈和醇类的梯度流动相洗脱来操作该样品。用电化学检测器监测流出液，以检测：i)对应于大环内酯的电流峰；和ii)任选的对应于样品中一种或多种杂质的一种或多种其它电流峰(例如，其峰面积为大环内酯峰面积的约0.05％或0.05％以上的电流峰)。然后评估电流峰的特性来计算杂质含量，例如可利用峰面积或峰高的百分比比率来评价和计算杂质含量(纯度)。在一些实施方案中，测定每种所检测杂质以及大环内酯的电流峰面积，并计算每种物质的总峰面积百分比。
例如，可通过测定本发明HPLC-MS方法得到的色谱图中对应于杂质的峰的质量来鉴定样品中的杂质。
用HPLC-UV定量大环内酯杂质
可联用HPLC试验与光度检测(HPLC-UV试验)来定量上述HPLC-MS和/或HPLC-ECD试验所鉴定的测试样品中的杂质。
适用于HPLC-UV试验的流动相组成可以是能有效地洗脱所需大环内酯、将该大环内酯与可能的杂质分开进而在检测波长光度检测该大环内酯的任何液体组分的混合物。在一些实施方案中，该流动相在约205nm以上的吸光度(例如，用分光光度计在1cm光程上检测)可忽略不计。“忽略不计”指吸光度为约0.02以下。在其它实施方案中，该流动相在检测波长的吸光度(例如，用分光光度计在1cm光程上检测)低于约0.5、低于约0.3或低于约0.1。
HPLC-UV试验的流动相可含水、有机溶剂或它们的混合物。可以使用与水混溶且不干扰在检测波长检测大环内酯的任何合适的有机溶剂。在一些实施方案中，该有机溶剂是乙腈。流动相可含有0到100％(v/v)水和0到100％(v/v)的有机溶剂。在一些实施方案中，该流动相含有约5到约75、约10到约60、或约20到约50％(v/v)的有机溶剂。
HPLC-UV试验的流动相还含有缓冲液以将溶液稳定于所需pH。可以使用不干扰在检测波长检测大环内酯的任何缓冲液。在一些实施方案中，该缓冲液是磷酸盐或硫酸盐缓冲液。在其它实施方案中，该缓冲液是硫酸盐缓冲液。缓冲液浓度可以是，例如约0.1mM到约1000mM。在一些实施方案中，缓冲液浓度是约1mM到约500mM、约5mM到约100mM或约10mM到约30mM。大环内酯足够稳定从而可用本发明方法和系统检测的任何pH均合适。在一些实施方案中，pH是约1到约4。在其它实施方案中，pH是约3。
在一些实施方案中，该流动相含有离子对试剂，例如有助于将该大环内酯保留在反相柱上的盐。在流动相溶液中相当稳定，能与大环内酯的带电荷形式(例如，质子化或去质子化)形成离子对且不干扰该大环内酯的洗脱或检测的任何离子对试剂均合适。各种合适的离子对试剂可购得，利用这些试剂的HPLC技术为本领域所熟知。离子对试剂的一些例子包括烷基磺酸盐，例如包括1-辛磺酸钠的(C4-C12烷基)磺酸盐。流动相中离子对试剂的浓度可以是约0.1mM到约1000mM。在一些其它实施方案中，离子对浓度是约1mM到约500mM、约5mM到约100mM或约10mM到约30mM。在一些实施方案中，该离子对浓度是约12mM到约15mM。
流动相可以等度洗脱或梯度洗脱流过HPLC柱。在施加梯度流动相的实施方案中，该流动相由两种或多种不同的洗脱液溶液的混合物构成，其比例随洗脱的进程而变化。例如，在洗脱期间，该流动相可含有含量可变的水、有机溶剂、缓冲液和离子对试剂。可以调节组分含量的变化从而使洗脱期间梯度流动相在检测波长的吸光度维持基本恒定。也可调节组分含量的变化来优化峰形、洗脱时间、大环内酯与杂质的分离(程度)和其它参数。
在一些实施方案中，通过用一种洗脱液溶液或两种洗脱液溶液的混合物进行洗脱来改变HPLC-UV试验的流动相组成，所述每种溶液的水、有机溶剂、缓冲液和离子对试剂的含量不同。在一些实施方案中，第一种洗脱液溶液含有约10到约30％(v/v)的有机溶剂，约70到约90％(v/v)的水，约10到约20mM的离子对试剂和约10到约15mM的缓冲液，第二种洗脱液溶液含有约40到约60％(v/v)的有机溶剂，约40到约60％(v/v)的水，约8到约15mM的离子对试剂和约8到约12mM的缓冲液。在其它实施方案中，第一种洗脱液溶液含有约20％(v/v)的有机溶剂，约80％(v/v)的水，约15mM的离子对试剂和约13mM的缓冲液，第二种洗脱液溶液含有约50％(v/v)的有机溶剂，约50％(v/v)的水，约12mM的离子对试剂和约10.5mM的缓冲液。在洗脱期间的任一时间点，流动相可以完全由两种洗脱液溶液的一种或该两种溶液的混合物构成。
HPLC-UV试验的固定相可以由任何反相固体载体介质构成，该介质与流动相联用可检测大环内酯并将其与可能的杂质分开。在一些实施方案中，该固定相含有C8到C18基质。在其它实施方案中，该固定相是C18基质。
为将样品引入(HPLC)柱，可将其稀释成稀释样品。稀释样品的大环内酯浓度是约1到约10mg/mL。样品稀释剂可由Bis-Tris(例如，约20到约100mM、约30到约70mM或约50mM的Bis-Tris)缓冲的水构成，其pH为约6到8，或约7。
监测柱的流出液的紫外检测器可包括能检测紫外波长通过液体样品的吸收或透射的任何分光光度计。可将检测器调谐至洗脱期间恒定的检测波长。在一些实施方案中，在约190nm到约210nm，约197nm到约205nm或约200nm的波长检测流出液。在一些实施方案中，检测波长约200nm。
可通过对杂质含量已知的参比样品以及大环内酯含量已知的高纯度参比样品进行上述HPLC-UV试验来测定上述HPLC-MS和/或HPLC-ECD试验所鉴定的每种杂质的紫外响应因子(杂质与大环内酯在检测波长的标准化峰面积之比)。例如，可按照以下方程式A、B和C计算杂质的响应因子：
响应因子＝(杂质的标准化峰面积)/(大环内酯的标准化峰面积)(A)
其中：
杂质的标准化峰面积＝(杂质的峰面积)×(纯度％)/(杂质的浓度)(B)
大环内酯的标准化峰面积＝(大环内酯的峰面积)×(纯度％)/(大环内酯的浓度)(C)
杂质含量未知的测试样品中杂质的含量可通过以下步骤测定：利用本文所述HPLC-MS或HPLC-ECD试验来鉴定杂质，然后对所鉴定杂质的参比样品和大环内酯的参比样品进行上述HPLC-UV试验来计算所鉴定杂质的响应因子，根据上述HPLC-UV试验对测试样品进行试验，利用所计算的响应因子计算该测试样品中杂质的含量。
系统
本发明也包括包含上述部件的组件的系统。例如，本发明的系统可包括a)包含以下部分的反相高效液相色谱柱(RP-HPLC)：i)含有反相固体载体基质的固定相；和ii)上述流动相；和b)电化学或质谱检测器。
参考文献证实本领域技术人员熟知操作和优化本发明HPLC试验的其它参数，例如其内容全文纳入本文作为参考的Snyder等，《实用HPLC方法开发》(Practical HPLC Method Development)，第二版，Wiley，New York，1997。
通过具体的实施例更详细地描述了本发明。提供以下实施例是出于说明性目的，不是要以任何方式限制本发明。本领域的技术人员不难理解可以改变或改进各种非关键参数而得到基本相同的结果。
实施例
实施例1
9-(S)-红霉胺的电化学和质谱检测的HPLC参数
根据以下参数进行9-(S)-红霉胺的HPLC分析。百分比以体积计。
仪器
Waters2690 HPLC泵
5200A型ESA Coulochem II电化学检测器
5010型ESA分析室
ACE C18 HPLC柱(150×4.6mm，3μm，MAC-MOD，P/N#ACE-111-1546)
Finnigan SSQ7000或JEOL LC-Mate质谱仪系统
流动相
洗脱液A：0.0671M水配制的乙酸铵，经0.22μm过滤器真空过滤，pH 7.04。
洗脱液B：用57.6％乙腈和42.4％甲醇(以体积计)配制的0.0671M乙酸铵(经0.22μm过滤器真空过滤)
样品稀释剂：71％C18圆盘抛光(disc polished)Milli Q水和29％由57.6％乙腈与42.2％乙醇组成的混合物。
标准品和样品制备
利用相同的稀释剂在50.00mL容量瓶中制备0.8到0.9mg/mL的9-(S)-红霉胺标准品溶液和样品溶液。
柱参数
流速：1mL/分钟
柱温：40℃
ECD的注射体积：10μL
MS的注射体积：50μL
操作时间：60分钟
梯度表
    时间   洗脱液A％   洗脱液B％
    0     71     29
    2     71     29
    20     65     35
    48     51     49
    50     71     29
    60     71     29
电化学检测参数
保护小室：1000mV
电极1：0mV
电极2：850mV
噪声过滤器：5秒
范围：50μA
质谱检测参数
APCI正模式
毛细管温度：180℃
汽化室温度：350℃
实施例2
不同批次的9-(S)-红霉胺的HPLC分析
根据实施例1提供的参数，通过单用(或同时使用)质谱或电化学检测的HPLC分析不同供应商的9-(S)-红霉胺样品。根据质量推测结构归属(structureassignment)，相应的结构见图1和2。字母“ND”表示“未检测”。
                                                表2
                      36188CA00和6E1010批次的9-(S)-红霉胺的HPLC-MS和HPLC-ECD
                                                数据
36188CA00#批次
峰编号 ECDRT.     ECDR.RT.   ECD面积％   MSRT.   MSR.RT.    MS峰质量   MS推测结构   MS推测结构的MW/EM
    12345678910111213   3 7056.7417.30910.71314.80015.74816.37626.41030.65333.13936.64637.28939.376   0.2262460.4116390.4463240.6541890.9037620.96165111.6127261.8718252.0236322.2377872.2770522.404494   0.140.320.830.43＜0.010.3096.350.310.500.230.130.460.01   ND7.057.6911.0214.80ND16.8027.0231.10NDND37.8739.46   -0.4196430.4577380.6558930.880952-11.6083331.851190--2.2541672.348810    -735.7721.8721.8721.7-735.6，1470.3749.8719.8--736.7759.8   -1315，16，16R15，16，16R15，16，16R-4108--未知未知   -734.96/734.49720.93/720.48720.93/720.48720.93/720.48-734.96/734.49748.94/748.47718.96/718.50----
 6E0101#批次
峰编号   ECDRT.   ECDR.RT.   ECD面积％   MSRT.   MSR.RT.    MS峰质量   MS推测结构   MS推测结构的MW/EM
    1234567891011   6.6777.0207.24510.62614.80015.42916.35026.27532.73136.519   0.4083790.4293580.4431190.6499080.9051990.94367011.6070342.0018962.233578   0.270.140.610.08＜0.010.0398.440.170.070.22＜0.01   7.177.447.81ND15ND17.10NDND37.0439.57   0.4192980.4350880.456725-0.8771931--2.1660822.314035    735.7577.7721.8-721.7735.6，1470.3--749.6759.8   132015，16，16R-15，16，16R4--10未知   734.96/734.49576.76/576.40720.93/720.48-720.93/720.48734.96/734.49--748.94/748.47-
                                                       表3
                          (S)AE/ii32/56和3535批次的9-(S)-红霉胺的HPLC-MS和电化学检测器
                                                     (ECD)数据
(S)AE/ii32/56#批次
峰编号   ECDRT.   ECDR.RT.   ECD面积％   MSRT.   MSR.RT.     MS峰质量  MS推测结构  MS推测结构的MW/EM
    1234567891011   3.6726.6757.23610.60514.09115.38816.20626.23930.48836.44639.119   0.2265830.4118840.4465010.6543870.8694930.94952511.6190921.8812792.248922.413859   0.040.311.950.110.010.0597.140.130.120.110.04   ND7.157.9ND15.05ND17NDNDND39.55   -0.4205880.464706-0.885294-1---2.326471     -735.7721.7-721.7-735.6，1470.3---759.7  -1315，16，16R-15，16，16R-4---未知  -734.96/734.49720.93/720.48-720.93/720.48-734.96/734.49----
 3535#批次
峰编号   ECDRT.   ECDR.RT.   ECD面积％   MSRT.     MSR.RT.     MS峰质量     MS推测结构   MS推测结构的MW/EM
    1234567891011121314151617181920212223   3.6666.6747.24110.60615.41116.28920.37922.15822.26725.03426.2427.21728.57530.4731.65632.60434.38736.33137.97638.48139.79542.86446.485   0.225060.4097240.4445330.6511140.94609911.251091.3603041.3669961.5368651.6109031.6708821.7542511.8705881.9433972.0015962.1110572.2304012.3313892.3623922.443062.6314692.853766     0.080.240.420.20.0577.810.030.090.080.040.090.440.490.270.052 860.0116.370.080.070.090.060.12     3.837.27.8611.315.11719.84NDNDNDNDND28.3329.6631.2532.6833.435.5536.939.1139.58ND47.38   0.2252940.4235290.4623530.6647060.88823511.167059-----1.6664711.7447061.8382351.9223531.9647062.0911762.1705882.3005882.328235-2.787059     751.8，809.8735.7721.7721.7721.7735.6，1470.2690.6-----775.6763.7719.8735.7749.7756.7749.7704.6759.7-714.7   111315，16，16R15，16，16R15，16，16R418-----未知未知8未知10未知1019未知-未知   750.96/750.49734.96/734.49720.93/720.48720.93/720.48720.93/720.48734.96/734.49689.87/689.44-------718.96/718.50-748.94/748.47-748.94/748.47704.93/704.48---
                                                     表4
                  6E0201和PDC325/Vd070202批次的9-(S)-红霉胺的HPLC-MS和电化学
                                                检测器(ECD)数据
6E0201#批次
峰编号   ECDRT.   ECDR.RT.     ECD面积％   MSRT.     MSR.RT.     MS峰质量   MS推测结构     MS推测结构的MW/EM
    1234567891011121314151617   3.5726.5036.7687.25610.47814.39115.31316.09920.43323.05326.30930.59632.77036.58638.816   0.221880.403940.42040.450710.650850.893910.9511811.269211.431951.634201.900492.035532.272562.41108     0.340.270.150.670.07＜0.030.090.0397.23＜0.030.090.030.180.730.040.070.06     3.927.257.537.9111.3214.1214.98ND16.4920.2621.2924.227.1631.29NDNDND     0.237720.439660.456640.479680.686480.856280.90843ND11.228621.291091.467561.647061.89751NDNDND     751.6735.7577.7721.8721.8707.4721.7735.7690.6735.7735.6，777.4749.8719.8---   11132015，16，16R15，16，16R1715，16，16R418未知未知108---   750.96/750.49734.96/734.49576.76/576.40720.93/720.48720.93/720.48706.90/706.46720.93/720.48734.96/734.49689.87/689.44--748.94/748.47718.96/718.50---
  PDC325/Vd070202#批次
  峰编号   ECDRT.   ECDR.RT.   ECD面积％   MSRT.     MSR.RT.     MS峰质量   MS推测结构     MS推测结构的MW/EM
    12345678910111213   3.5716.4996.7647.26210.487ND14.40115.31916.093-26.33130.67838.839     0.22190.403840.420310.451250.65165ND0.894860.95191-1.636181.906292.41341     0.120.330.180.250.03-0.080.0298.75＜0.030.090.060.08     3.927.237.527.9211.2914.0414.95ND16.3820.2127.1731.2743.52     0.239320.441390.45910.483520.689260.857140.9127ND11.233821.658731.909042.6569     751.7，807.1735.6577.5721.4721.7707.5721.6-735.6690.6749.7719.5716.5     11132015，16，16R15，16，16R1715，16，16R-418108未知   750.96/750.49734.96/734 49576.76/576.40720.93/720.48720.93/720.48706.90/706.46720.93/720.48-734.96/734.49689.87/689.44748.94/748.47718.96/718.50
                                           表5
             PD2012/WRS/328/016和10006647批次的9-(S)-红霉胺的HPLC-MS数据
PD2012/WRS/328/016#批次
峰编号     MSRT.   MSR.RT.     MS峰质量   MS推测结构     MS推测结构的MW/EM
    1234567     7.3538.19515.54616.76622.48955.19355.723  0.43860.48880.92721.00001.34133.29203.3236     735.3721.5721.5735.5751.4690.5230.1/307.2/324.2/339.1   1315，16，16R15，16，16R4未知18未知  734.96/734.49720.93/720.48720.93/720.48734.96/734.49-689.87/689.44-
 10006647#批次
峰编号     MSRT.   MSR.RT.     MS峰质量     MS推测结构     MS推测结构的MW/EM
    123456789     7.3678.1914.4715.44716.83422.28131.75755.17755.73  0.43760.48650.85960.91761.00001.32361.88653.27773.3106     735.3721.5707.5721.5751.4751.5719.5690.5230.2/307.2/324.3/339.2   1315，16，16R1715，16，16R411(750.5)未知18未知  734.96/734.49720.93/720.48706.90/706.46720.93/720.48734.96/734.49-689.87/689.44-
实施例3
9-(S)-红霉胺样品中杂质的鉴定和定量
根据以下方法，怀疑6种大环内酯杂质(见表6和以上式VI-XI)是可能的污染物并证实了它们是否存在于用作API的各批次9-(S)-红霉胺中。也定量了所检测杂质的含量。
                             表6
    化学名称 结构式 可能的来源
    脱克拉定糖基(Decladinosyl)-9-(R)-红霉胺   VI 合成副产物
    脱克拉定糖基-9-(S)-红霉胺   VII 合成副产物
    脱克拉定糖基-红霉胺肟   VIII 合成副产物
    9-(R)-红霉胺   IX 合成副产物
    红霉素肟碱(Z-异构体)   X 原材料
    红霉素肟碱(E-异构体)   XI 合成副产物
上述6种可疑杂质的每一种以及9-(S)-红霉胺的参比样品购自Alembic，Inc.(印度)，通过FT-IR以及根据实施例1所述方法进行的HPLC-MS证实了它们的结构。将约2mg参比样品与约100mg干燥的KBr在玛瑙研钵中混合并研磨成细粉末来制备FT-IR样品。将粉末加样于11mm的压片模具中，真空下压缩。以4cm-1扫描16次得到IR光谱。IR光谱和MS数据与表6所列6种化合物的每种一致。
通过以下方法测定以上6种可疑化合物中每种的响应因子。根据以下给出的HPLC-UV参数，通过联用光度检测的HPLC对6种可疑化合物中每种的参比样品进行试验。
仪器
以下根据生产商的使用说明操作的仪器用于获得HPLC色谱图。性能相当的仪器可替换。
真空脱气器：Waters2690
泵：Waters2690
注射器：Waters2690
·50：50体积比的乙腈和水的混合液作为针头洗涤液
·100μL注射环(injection loop)
预柱：装有ODS盒的Phenomenex Security Guard(P/N AJO-4287)
柱：Phenomenex柱，C18(2)，150mm×4.6mm，5μm(P/N 00F-4252-E0)。
·以柱标记所示洗脱液流动的方向装柱，将其放置于维持在20±1℃的Jones色谱柱冷凝器/加热器中。
·不用时将柱保存在70∶30(v/v)的乙腈∶水中。
检测器：Waters2487双波长检测器。
·波长＝200nm
柱冷凝器：7955型Jones Chromatography
·温度设置在20±1℃。
数据系统：Perkin-Elmer Nelson Turbochrom数据系统，6.2.1版。
工作溶液
样品稀释剂：
50mM Bis-Tris(Sigma)
pH 7.4。
洗脱液A：
20％乙腈(HPLC级，Fisher)
15mM 1-辛磺酸钠(Fluka)
13mMNa2SO4(Sigma)
pH 3.1
洗脱液B：
50％乙腈(HPLC级，Fisher)
12mM 1-辛磺酸钠(Fluka)
10.5mM Na2SO4(Sigma)
pH 3.1
HPLC分析
按照以下参数进行样品分析。
流速：1.0mL/分钟
注射体积：20μL
操作时间：40分钟
波长：200nm
样品浓度：0.5mg/mL
将数据系统设置为每秒采集1点，采集时间为40分钟。
按照下表A施加梯度流动相。
                  梯度表
    时间 洗脱液A％(v/v) 洗脱液B％(v/v)
    0     70     30
    1     70     30
    20     30     70
    26     30     70
    27     0     100
    31     0     100
    33     70     30
    40     70     30
利用方程式(D)计算每种杂质参比样品和9-(S)-红霉胺参比样品的标准化峰面积，利用方程式(E)计算响应因子，其中面积1是第一次注射的峰面积，面积2是第二次注射的峰面积。
标准化峰面积＝(面积1+面积2)/2×(纯度％)/浓度(mg/mL)(D)
Figure A20058001439400301
下表7给出了6种可疑杂质中每种以及9-(S)-红霉胺所计算的响应因子。
                                       表7
化学名称     纯度(面积％)     浓度mg/mL   面积   响应因子
脱克拉定糖基-9-(R)-红霉胺(VI)     96.17     0.51   412.22     0.84
脱克拉定糖基-9-(S)-红霉胺(VII)     97.83     0.49   479.51     1.02
脱克拉定糖基-红霉胺肟(VIII)     95.75     0.47   3070.61     6.87
9-(R)-红霉胺(IX)     97.70     0.47   814.93     0.85
红霉素肟碱(Z-异构体)(X)     92.99     0.24  7402.75     7.74
红霉素肟碱(E-异构体)(XI)     97.03     0.50  7370.83     7.70
9-(S)-红霉胺     99.18     0.55   956.84     1.00
通过在上述HPLC-UV柱上操作9-(S)-红霉胺测试样品并利用表7的响应因子来测定该测试样品的6种杂质中每种的含量。结果见下表8。未观察到可检测含量的9-(R)-红霉胺。
                      表8
    化学名称   面积 面积％ 浓度mg/mL 样品中的百分比
  脱克拉定糖基-9-(R)-红霉胺(VI)   7.9652   0.36   0.0105     0.43
  脱克拉定糖基-9-(S)-红霉胺(VII)   2.6698   0.12   0.0029     0.12
  脱克拉定糖基-红霉胺肟(VIII)   10.9227   0.50   0.0018     0.50
  9-(R)-红霉胺(IX)   NA   NA   NA     NA
  红霉素肟碱(Z-异构体)(X)   2.3329   0.11   0.0003     0.11
  红霉素肟碱(E-异构体)(XI)   21.9310   1.00   0.0032     1.00
  9-(S)-红霉胺   2100.5869   95.51   2.3247     95.51
应该理解，为明晰起见而描述于独立的实施方案中的本发明的某些特征也可以组合到一个实施方案中。相反，为简明起见而描述于一个实施方案中的本发明的各种特征也可以单独提供或可合适地再组合。
除了本文所述的之外，本领域技术人员从上述内容可明白本发明的各种改进形式。这种改进形式也要包含在附加的权利要求的范围内。本申请引用的各参考文献全文纳入本文作为参考。

Claims (18)

1.一种检测测试样品中的大环内酯的方法，其中所述测试样品的主要组分以重量计是所述大环内酯，所述方法包括：
a)将所述测试样品施加到反相高效液相色谱(RP-HPLC)柱；
b)用含有挥发性缓冲液、水、乙腈和醇的梯度流动相洗脱所述测试样品；和
c)用电化学检测器或质谱检测器监测所述柱的流出液，以分别检测对应于所述大环内酯的电流峰或质量峰。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述大环内酯是9-(S)-红霉胺。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述大环内酯在约180nm到约220nm的紫外-可见范围具有最大吸收。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述挥发性缓冲液是乙酸铵。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动相的pH为约6到约8。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述醇包括甲醇。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动相含有洗脱液A和洗脱液B的混合物，洗脱液A和洗脱液B的相对含量在洗脱进程中变化，其中洗脱液A基本上由约60到约75mM的水配制的乙酸铵组成，洗脱液B基本上由用以体积计约50到约70％的乙腈和以体积计约30到约50％的甲醇组成的混合物配制的约60到约75mM的乙酸铵组成。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括通过将所述电流峰的面积或高度与参比标准品的电流峰的面积或高度进行比较来定量所述测试样品中所述大环内酯的含量。
9.一种测定测试样品的纯度的方法，其中所述测试样品的主要组分以重量计是大环内酯，所述方法包括：
a)将所述测试样品施加到反相高效液相色谱(RP-HPLC)柱；
b)用含有挥发性缓冲液、水、乙腈和醇的梯度流动相洗脱所述样品；
c)用电化学检测器监测所述柱的流出液，以检测：
i)对应于所述大环内酯的电流峰；和
ii)任选的对应于所述测试样品中的一种或多种杂质的一个或多个其它电流峰；和
d)测定所述检测器所检测的电流峰的一种或多种特性来计算所述测试样品中的杂质含量。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述测定通过以下步骤进行：i)测定每种检测杂质和所述大环内酯的电流峰面积；和ii)计算所述大环内酯引起的总电流峰面积的百分比。
11.一种鉴定测试样品中杂质的方法，其中所述测试样品的主要组分以重量计是大环内酯，所述方法包括：
a)将所述测试样品施加到反相高效液相色谱(RP-HPLC)柱；
b)用含有挥发性缓冲液、水、乙腈和醇的梯度流动相洗脱所述测试样品；
c)用质谱检测器监测柱的流出液，以检测：
i)对应于所述大环内酯的质量峰；和
ii)对应于所述测试样品中所述杂质的其它质量峰；和
d)测定对应于所述杂质的所述其它质量峰的质量。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述大环内酯是9-(S)-红霉胺。
13.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述杂质是大环内酯。
14.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述杂质是：
红霉素B；
红霉素腙B；
9-亚氨基红霉素B；
红霉胺B；
红霉素腙丙酮加合物；
9-羟基亚氨基红霉素；
氢氧化红霉胺；
9-羟基亚氨基红霉素B；
氢氧化红霉胺B；
9-(R)-红霉胺；
红霉胺C；
红霉胺D；或下式所示的化合物；
Figure A2005800143940004C1
15.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述杂质是式VI、VII、VIII、IX、X或XI所示的化合物：
16.一种测定测试样品中杂质含量的方法，其中所述测试样品的主要组分以重量计是大环内酯，所述方法包括：
a)根据权利要求11所述方法鉴定所述杂质；
b)通过包括以下步骤的方法测定所述杂质的响应因子：
i)将已知量的所述杂质和已知量的所述大环内酯施加到外部装有检测波长为约180nm到约220nm的紫外(UV)检测器的反向高效液相色谱(RP-HPLC)柱上；
ii)用含有离子对试剂的流动相洗脱所述已知量的杂质；
iii)用所述紫外检测器监测柱的流出液，以检测位于所述检测波长的第一吸收峰，所述第一吸收峰对应于所述杂质；
iv)用所述紫外检测器监测柱的流出液，以检测位于所述检测波长的第二吸收峰，所述第二吸收峰对应于所述大环内酯；和
v)利用所述第一和第二吸收峰的峰面积计算所述杂质的响应因子；和
c)通过包括以下步骤的方法测定所述测试样品中所述杂质的含量：
i)在与步骤b)相同的试验条件下操作所述测试样品来检测对应于所述杂质的第三吸收峰；和
ii)利用所述响应因子计算所述测试样品中所述杂质的含量。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述杂质是式VI、VII、VIII、IX、X或XI所示的化合物：
18.一种检测9-(S)-红霉胺测试样品中的杂质的系统，包括：
a)包括以下部分的反向高效液相色谱柱：
i)C18柱；
ii)含有洗脱液A和洗脱液B混合物的梯度流动相，洗脱液A和洗脱液B的相对含量在洗脱进程中变化，其中洗脱液A基本上由约60到约75mM的水配制的乙酸铵组成，洗脱液B基本上由用以体积计约50到约70％的乙腈和以体积计约30到约50％的甲醇组成的混合物配制的约60到约75mM的乙酸铵组成。
b)电化学检测器或质谱检测器，其中所述电化学检测器包括保护电极、筛选电极和工作电极。
CNA2005800143945A 2004-05-06 2005-05-06 检测、鉴定和定量大环内酯及其杂质的方法与系统 Pending CN101076727A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US56863704P 2004-05-06 2004-05-06
US60/568,637 2004-05-06

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN101076727A true CN101076727A (zh) 2007-11-21

Family

ID=35320841

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2005800143945A Pending CN101076727A (zh) 2004-05-06 2005-05-06 检测、鉴定和定量大环内酯及其杂质的方法与系统

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20050272166A1 (zh)
EP (1) EP1749209A2 (zh)
JP (1) JP2007536526A (zh)
KR (1) KR20070011572A (zh)
CN (1) CN101076727A (zh)
AU (1) AU2005241563A1 (zh)
BR (1) BRPI0510596A (zh)
CA (1) CA2565773A1 (zh)
MX (1) MXPA06012618A (zh)
RU (1) RU2007104231A (zh)
WO (1) WO2005108984A2 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107505403A (zh) * 2016-06-14 2017-12-22 株洲千金药业股份有限公司 妇科千金片与抗生素联合应用中生物利用度的评价方法
CN114858953A (zh) * 2022-05-20 2022-08-05 大连工业大学 一种动物源食品中红霉素及降解产物的检测试剂盒及检测方法

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050266578A1 (en) * 2004-05-06 2005-12-01 Gruenke Larry D Methods and systems for detection of macrolides
WO2007069264A2 (en) * 2005-12-15 2007-06-21 Alembic Limited Reference standards for determining the purity of telithromycin and processes therefor
JP5624709B2 (ja) * 2008-03-13 2014-11-12 大日本住友製薬株式会社 内因性代謝物の分析方法
AU2011320345C1 (en) 2010-10-29 2017-04-06 Cohesive Technologies Inc. LC-MS configuration for purification and detection of analytes having a broad range of hydrophobicities
RU2469314C2 (ru) * 2011-02-10 2012-12-10 Федеральное государственное учреждение "33 Центральный научно-исследовательский испытательный институт Министерства обороны Российской Федерации" Способ идентификации органических соединений на основе метода высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии
CN102786570B (zh) * 2011-05-18 2016-02-10 上海医药工业研究院 大环内酯类化合物、其制备方法、应用以及中间体
CN102659879A (zh) * 2012-04-20 2012-09-12 宁夏启元药业有限公司 一种红霉素c的制备方法
CN104254774B (zh) * 2012-04-25 2017-03-29 安捷伦科技有限公司 在配比与混合流体时防止相分离
DE102014108125B4 (de) * 2014-06-10 2016-03-31 Heraeus Medical Gmbh Gradienten-HPLC zur simultanen Bestimmung der Verunreinigungen von einer Wirkstoffmischung aus Aminoglycosid und Glykopeptid
CN104965018B (zh) * 2015-07-03 2017-05-24 湖北博凯医药科技有限公司 采用毛细管电泳分离‑二极管阵列检测技术拆分外消旋2‑氯丙酸的方法
CN108864229A (zh) * 2018-07-13 2018-11-23 广东东阳光药业有限公司 分离红霉素b的方法以及制备红霉素b对照品的方法
CN111562328A (zh) * 2020-05-22 2020-08-21 辽宁通正检测有限公司 高效液相色谱配合液相色谱串联质谱检测兽药非法添加喹诺酮类物质
CN111781291A (zh) * 2020-06-23 2020-10-16 广西壮族自治区水产科学研究院 一种水中13种大环内酯类抗生素的高分辨质谱检测方法
CN113008970B (zh) * 2021-02-25 2022-07-08 中国食品药品检定研究院 科博肽中杂质的鉴定方法及科博肽纯度的检测方法
CN113624857A (zh) * 2021-06-25 2021-11-09 伊犁川宁生物技术股份有限公司 一种红霉素菌渣中红霉素a的液质联用检测方法
CN114324643B (zh) * 2021-12-24 2023-07-04 浙江树人学院（浙江树人大学） 有机肥中大环内酯类抗生素的检测方法及其样品处理方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001524829A (ja) * 1997-04-30 2001-12-04 コーサン バイオサイエンシーズ，インコーポレイテッド 足場としてモジュラー性ｐｋｓ遺伝子クラスターを使用して生成されるコンビナトリアルなポリケチドライブラリー
US6664241B2 (en) * 2000-05-31 2003-12-16 Micrologix Biotech Inc. Water-soluble amide derivatives of polyene macrolides and preparation and uses thereof

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107505403A (zh) * 2016-06-14 2017-12-22 株洲千金药业股份有限公司 妇科千金片与抗生素联合应用中生物利用度的评价方法
CN114858953A (zh) * 2022-05-20 2022-08-05 大连工业大学 一种动物源食品中红霉素及降解产物的检测试剂盒及检测方法
CN114858953B (zh) * 2022-05-20 2023-11-21 大连工业大学 一种动物源食品中红霉素及降解产物的检测试剂盒及检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
MXPA06012618A (es) 2006-12-15
CA2565773A1 (en) 2005-11-17
US20050272166A1 (en) 2005-12-08
RU2007104231A (ru) 2008-08-10
AU2005241563A1 (en) 2005-11-17
JP2007536526A (ja) 2007-12-13
EP1749209A2 (en) 2007-02-07
WO2005108984A2 (en) 2005-11-17
WO2005108984A3 (en) 2007-08-09
BRPI0510596A (pt) 2007-11-20
KR20070011572A (ko) 2007-01-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101076727A (zh) 检测、鉴定和定量大环内酯及其杂质的方法与系统
CN101065664A (zh) 检测大环内酯的方法与系统
Nakamoto et al. Monolithic silica spin column extraction and simultaneous derivatization of amphetamines and 3, 4-methylenedioxyamphetamines in human urine for gas chromatographic-mass spectrometric detection
CN100342927C (zh) 用于选择性去除白血球的过滤器
CN1253660A (zh) 一种用氟基化学反应连续测定同位素比率的装置
CN1320354C (zh) 氨基酸的分析方法
CN1032426C (zh) 糖肽回收工艺
CN1242052C (zh) 诺卡氏菌的生物纯培养物
Pastor-Belda et al. Determination of amphenicol antibiotics and their glucuronide metabolites in urine samples using liquid chromatography with quadrupole time-of-flight mass spectrometry
Kim et al. Development of liquid chromatographic method for the analysis of kanamycin residues in varicella vaccine using phenylisocyanate as a derivatization reagent
CN115015422B (zh) 酱油中的3-氯-1，2-丙二醇的液相色谱串联质谱检测方法
Varfaj et al. Efficient enantioresolution of aromatic α-hydroxy acids with Cinchona alkaloid-based zwitterionic stationary phases and volatile polar-ionic eluents
JP6760753B2 (ja) ピロロキノリンキノンの分析方法
CN110954610A (zh) 一种高效液相色谱-质谱联用法同时检测凤香型白酒中六种甜味剂的方法
Park et al. The nebramycin aminoglycoside profiles of Streptomyces tenebrarius and their characterization using an integrated liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometric analysis
Peters et al. Use of fission yeast heterologously expressing human cytochrome P450 2B6 in biotechnological synthesis of the designer drug metabolite N-(1-phenylcyclohexyl)-2-hydroxyethanamine
CN1261762C (zh) 一种体外培植牛黄的质量鉴别方法
Yu et al. Determination of myriocin in natural and cultured Cordyceps cicadae using 9-fluorenylmethyl chloroformate derivatization and high-performance liquid chromatography with UV-detection
CN112505223B (zh) 一种同时检测食品中毒黄素和米酵菌酸含量的方法
CN1958002A (zh) 一种胆木药材中间体及注射液的质量控制方法
CN111474278B (zh) 检测大环内酯类化合物的代谢物的方法和试剂盒
CN1588007A (zh) 一种多糖定量检测方法及系统
CN1785180A (zh) 复方枸橼酸铋钾甲硝唑制剂的质量控制方法
CN1785232A (zh) 千柏鼻炎固体制剂的质量控制方法
CN1280424C (zh) 制造d－丝氨酸的方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: NOVARTIS VACCINES & DIAGNOSTIC

Free format text: FORMER OWNER: CHIRON CORP.

Effective date: 20080530

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20080530

Address after: Delaware

Applicant after: Novartis Vaccines & Diagnostic Inc.

Address before: American California

Applicant before: Chiron Corporation

C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Open date: 20071121