MXPA06012618A

MXPA06012618A - Metodos y sistemas para deteccion, identificacion y cuantificacion de macrolidos y sus impurezas.

Info

Publication number: MXPA06012618A
Application number: MXPA06012618A
Authority: MX
Inventors: Joseph Therrien; Li Jin
Original assignee: Chiron Corp
Priority date: 2004-05-06
Filing date: 2005-05-06
Publication date: 2006-12-15
Also published as: CA2565773A1; US20050272166A1; RU2007104231A; CN101076727A; AU2005241563A1; JP2007536526A; EP1749209A2; WO2005108984A2; WO2005108984A3; BRPI0510596A; KR20070011572A

Abstract

La presente invencion se relaciona a metodos y sistemas de cromatografia de liquidos de alta resolucion (RP-HPLC) para detectar los macrolidos asi como tambien detectar, identificar y cuantificar impurezas en muestras que contienen un macrolido.

Description

la mayoría de las bacterias gram positivas, en particular estreptococos, y buena actividad para patógenos respiratorios. Los macrolidos han probado ser seguros y efectivos para muchas infecciones respiratorias, y son útiles en pacientes con alergia a penicilina. Los macrolidos tienen típicamente la absorbancia ultravioleta (UV) en el intervalo de longitud de onda muy bajo (por ejemplo, <220 nm) , alcanzando los límites de métodos de detección fotométricos . El método de ensayo de- compendio de the United States Pharmacopeia National Formulary (USP-NF) para la eritromicina (ver la estructura posterior) implica RP-HPLC con fase estacionaria L21 (copolímero de estireno-divinilbenceno esférico, rígido, de fase inversa, 5 a 10 µ?t? diámetro de partícula) usando detección UV en 215 nm (ver, por ejemplo, la página 663-665 de USP-NF publicado el Io de Enero de 2000) . De hecho, muchos derivados de eritromicina reducidos y moléculas relacionadas tales como 9- (S) -eritromicilamina (eriamina o PA2794; ver estructura posterior) tienen una banda de absorción máxima de UV (UVmax) bien abajo de 215 nm. Por ejemplo, la UVmax para 9- (S) -eritromicilamina ocurre en aproximadamente 191 nm, acercándose a los límites de longitud de onda de los métodos de detección fotométricos estándar. Por consiguiente, los métodos de detección alternativos tales como los métodos de detección de espectrometría de masa, detección electroquímica han sido encontrados para ser atractivos (ver, por ejemplo, Whitaker, et al., J. Liq. C romatogr . (1988), 11(14), 3011-20; Pappa-Louisi , et al., J. Chromatogr., B: Biomed. Sci . Appl . (2001), 755 (1-2), 57-64; Kees, et al., J. Chromatogr., A (1998), 812 (1+2), 287-293 ; Hedenmo, et al., J. Chromatogr., A (1995), 692 (1+2), 161-6; Daszkowski, et al., J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol . (1999), 22(5), 641- 657 ; y Dubois, et al . , J. Chromatogr., B : Biomed. Sci. Appl. (2001), 753 (2), 189-202). Estos métodos alternativos, sin embargo, son diseñados principalmente para detección de macrólidos en matrices biológicas tales como plasma sanguínea u otra substancia biológica y no se optimizan por separación de macrólidos substancialmente puros (usados como, por ejemplo, ingredientes farmacéuticos activos (API por sus siglas en inglés)) a partir de cantidades menores de impurezas , muchas de las cuales son macrólidos relacionados con propiedades físicas similares .

Eritromicina 9- (S) -eritromicilamina Ya que la detección, identificación y cuantificación de impurezas en una muestra de macrólidos son necesarias para el control de calidad, particularmente cuando el macrólido es un API, hay una necesidad actual para ensayos que sean adecuadamente diseñados para detectar, identificar y cuantificar los macrólidos, tales como la 9-(S)-eritromicilamina y sus impurezas usando métodos de ensayo a base de HPLC. Los métodos y sistemas descritos en la presente ayudan a cumplir con estas y otras necesidades . Sumario de la Invención La presente invención proporciona un método para detectar un macrólido- en una muestra de prueba, en donde el componente principal de la muestra de prueba en peso es el macrólido, el método que comprende: a) aplicar la muestra de prueba en una columna de cromatografía de líquido de alta resolución (RP-HPLC) ; y b) eluir la muestra de prueba con un gradiente de fase móvil la cual comprende un amortiguador volátil, agua, acetonitrilo, y alcohol; y c) monitorear el efluente a partir de la columna con un detector electroquímico o detector de espectrómetro de masa para detectar un pico actual o pico de masa, respectivamente, que corresponde al macrólido. La presente invención además proporciona un método para determinar la pureza de una muestra de prueba, en donde el componente principal de la muestra de prueba en peso es un macrólido, el método que comprende: a) aplicar la muestra de prueba en una columna de cromatografía (RP-HPLC) de líquidos de alta resolución de fase inversa; b) eluir la muestra con una fase móvil de gradiente la cual comprende un amortiguador volátil, agua, acetonitrilo, y alcohol; c) monitorear el efluente a partir de la columna con un detector electroquímico para detector: i) el pico actual que corresponde al macrólido; y ii) opcionalmente uno o más picos corrientes adicionales que corresponden a una o más impurezas en la muestra de prueba; y d) medir una o más características de los picos corrientes detectados por el detector para calcular el contenido de impurezas en la muestra de prueba. La presente invención además proporciona un método para identificar una impureza en una muestra de prueba, en donde el componente principal de la muestra de prueba en peso es un macrólido, el método que comprende: a) aplicar la muestra de prueba en una columna de cromatografía de líquidos de alta resolución de fase inversa (RP-HPLC) ; b) eluir la muestra de prueba con un gradiente de fase móvil la cual comprende un amortiguador volátil, agua, acetonitrilo, y alcohol; c) monitorear el efluente a partir de la columna con un detector de espectrómetro de masa para detectar: i) un pico de masa que corresponde al macrólido; y ii) un pico de masa adicional que corresponde a la impureza en la muestra de prueba; y d) determinar la masa del pico de masa adicional que corresponde a la impureza. La presente invención además proporciona un método para determinar la cantidad de una impureza en una muestra de prueba, en donde el componente principal de la muestra de prueba en peso es un macrólido, el método que comprende a) identificar la impureza por un ensayo de HPLC-MS o HPLC-ECD; b) determinar el factor de respuesta para la impureza por el método que comprende: i) correr una cantidad conocida de la impureza y una cantidad conocida del macrólido en una columna de cromatografía de líquidos de alta resolución de fase inversa (RP-HPLC) se eluye con una fase móvil la cual comprende un reactivo de pares de iones, en donde la columna de RP-HPLC es autofijada con un detector de ultravioleta (UV) el cual tiene una longitud de onda entre aproximadamente 180 nm y aproximadamente 220 nm; ii) monitorear el efluente de columna con el detector de UV para detectar un primer pico de absorción en la longitud de onda de detección, el primer pico de absorción que corresponde a la impureza; iii) monitorear el efluente de la columna con el detector de UV para detectar un segundo pico de absorción en la longitud de onda de detección, el segundo pico de absorción que corresponde al macrólido; y iv) calcular el factor de respuesta de la impureza usando áreas pico de los primeros y segundos picos de absorción; y c) determinar la cantidad de la impureza en la muestra de prueba por el método que comprende: i) correr la muestra de prueba bajo las mismas condiciones de la etapa b) para detectar un tercer pico de absorción que corresponde a la impureza; y ii) calcular la cantidad de la impureza en la muestra de prueba usando el factor de respuesta. La presente invención además proporciona un sistema para detectar impurezas en una muestra de prueba de eritromicilamina, que comprende: a) columna de cromatografía de líquidos de alta resolución de fase inversa la cual comprende: i) una columna de C18; ii) un gradiente de fase móvil el cual comprende una mezcla de eluyente A y eluyente B, las cantidades relativas de las cuales varían durante el curso de elución, en donde el eluyente A consiste esencialmente de aproximadamente 60 a aproximadamente 75 mM de acetato de amonio en agua y el eluyente B consiste esencialmente de aproximadamente 60 a aproximadamente 75 mM de acetato de amonio en una mezcla de aproximadamente 50 a aproximadamente 70% por volumen de acetonitrilo y aproximadamente 30 a aproximadamente 50% en volumen de metanol . b) Un detector electroquímico o detector de espectro de masa, en donde el detector electroquímico comprende un electrodo de protección, un electrodo de tamizado y un electrodo de trabajo. Ejemplos de macrolidos que pueden ser detectados por los métodos y sistemas en la presente incluyen, 9-(S)-eritomicilamina, 9- (R) -eritromicilamina, eritromicina, hidrazona de eritromicina, eritromicina, 9-imino-eritromicina, eritromicina oxima, eritromicina B, hidrazona de eritromicina B, 9-imino eritromicina B, eritromicilamina B, aducto de hidrazona y acetona de eritromicina, 9-hidroxiimino eritromicina, hidróxido de eritromicilamina, 9-hidroxiimino eritromicina B, hidróxido de eritromicilamina B, eritromicilamina C, eritromicilamina D, azitromicina, claritromicina, diritromicina, roxitromicina, troleandomicina, derivados de los mismos y similares . La presente invención además incluye modalidades como se proporciona en la descripción detallada. Breve Descripción de las Figuras Las Figuras 1 y 2 muestran impurezas potenciales de 9- (S) -eritromicilamina que pueden ser detectadas, identificadas y cuantificadas de acuerdo a los métodos y sistemas de la invención. La Figura 3 representa un ejemplo de síntesis de 9- (S) -eritromicilamina. Descripción detallada de la Invención La presente invención proporciona, inter alia, métodos y sistemas en base a HPLC para detectar, identificar, y cuantificar macrólidos, y sus impurezas usando el método de detección electroquímico (ECD por sus siglas en inglés) y/o espectroscopia de masa (MS por sus siglas en inglés) . Los ensayos HPLC-ECD y HPLC-MS implican correr una muestra de macrólido en una columna de cromatografía de líquidos de alta resolución de fase inversa (RP-HPLC) eluida con gradiente de fase móvil la cual contiene un amortiguador volátil, agua, acetonitrilo y alcohol. El efluente a partir de la columna se monitorea con un detector electroquímico o detector de espectrómetro de masa para detectar un pico de corriente o pico de masa, respectivamente, que corresponde al macrólido y/o potencialmente cualesquiera impurezas presentes en la muestra. En algunas modalidades, el uso de un espectrómetro de masa facilita la identificación de compuestos detectados en el cromatograma resultante. Las impurezas identificadas en una muestra de macrólido pueden además ser cuantificadas usando un ensayo de HPLC con detección fotométrica (por ejemplo, HPLC-ÜV) . Los macrólidos de acuerdo a la presente invención incluyen cualquiera de los antibióticos conocidos u otros macrólidos y sus derivados . Los macrólidos típicos son caracterizados por una estructura de núcleo de lactona macrocíclica de 12, 14 ó 16 miembros. Los macrólidos son ampliamente conocidos en la técnica y son totalmente descritos en, por ejemplo, Macrolide Antibiotics, ed. Satoshi Omura, Academic Press, Inc., Orlando, Florida, 1984, el cual se incorpora en la presente para referencia en su totalidad. En algunas modalidades, el macrólido tiene un perfil de absorción de ultravioleta visible relativamente pobre (UV-VIS) , por ejemplo, que muestra una absorción máxima en el intervalo de UV-VIS (aproximadamente 100 nm a aproximadamente 900 nm) en una longitud de onda de aproximadamente 180 nm a aproximadamente 220 nm, aproximadamente 180 nm a aproximadamente 200 nm, o aproximadamente 180 nm a aproximadamente 195 nm. En modalidades adicionales, el macrólido tiene una absorción máxima en el intervalo de UV-VIS en una longitud de onda de aproximadamente 188, aproximadamente 189, aproximadamente 190, aproximadamente 191, aproximadamente 192, aproximadamente 193, aproximadamente 194, aproximadamente 195, aproximadamente 196, aproximadamente 197, aproximadamente 198, aproximadamente 199, aproximadamente 200, aproximadamente 201, aproximadamente 202, aproximadamente 203, aproximadamente 204 ó aproximadamente 205 nm. Ejemplos de macrólidos que pueden ser detectados por los métodos y sistemas en la presente incluyen, por ejemplo, 9- (S) -eritromicilamina, 9- (R) -eritromicilamina, eritromicina, hidrazona de eritromicina, eritromicina, 9-imino eritromicina, oxima de eritromicina, eritromicina B, hidrazona de eritromicina B, 9-imino eritromicina B, eritromicilamina B, aducto de acetona e hidrazona de eritromicina, eritromicina 9-hidroxiimino , hidróxido de eritromicilamina, eritromicina B 9-hidroximino, hidróxido de eritromicilamina B, eritromicilamina C, eritromicilamina D, azitromicina, claritromicina, diritromicina, roxitromicina, troleandomicina, derivados de los mismos y similares. En algunas modalidades, el macrólido es 9-(S)-eritromicilamina . En algunas modalidades , las muestras de prueba adecuadas para análisis por los métodos y sistemas de la presente invención incluyen por lo menos un macrólido. En algunas modalidades, una muestra de prueba incluye una macrólido el cual forma el componente principal en peso en la muestra de prueba. La muestra de prueba puede opcionalmente incluir otras cantidades menores de componentes que pueden ser referidas como impurezas. En algunas modalidades, las muestras de prueba son lotes de macrólido substancialmente puros preparados por procedimientos sintéticos químicos que con frecuencia contienen cantidades pequeñas de impurezas. Como se usa en la presente, el término "impurezas" se refiere a compuestos diferentes al macrólido que es el objeto de estudio. En algunas modalidades, una o más impurezas pueden formar menos de aproximadamente 30%, menos de aproximadamente 20%, menos de aproximadamente 10%, menos de aproximadamente 5%, o menos de aproximadamente 1% en peso de la muestra de prueba. Una impureza puede con frecuencia ser otro macrólido, tal como un derivado del macrólido que forma la mayoría de la muestra de prueba. Las impurezas pueden ser productos de degradación o portadores de síntesis química del componente de macrólido principal . En algunas modalidades, las impurezas incluyen uno o más de los compuestos mostrados en las Figuras 1 y 2, tales como eritromicina B; idrazona de eritromicina B; 9-imino eritromicina B; eritromicilamina B; aducto de acetona e hidrazona de eritromicina; 9-hidroxiimino eritromicina; hidróxido de eritromicilamina; 9-hidroxiimino eritromicina B; hidróxido de eritromicilamina B; 9- (R) -eritromicilamina; eritromicilamina C; eritromicilamina D; o un compuesto el cual tiene la Fórmula I, II, III, IV, ó V; En algunas modalidades, una impureza está compuesta de la Fórmula VI, VII, VIII, IX, X, ó XI: Como se usa en la presente, la frase "correr una muestra de prueba" o similares en referencia a un ensayo de HPLC se entiende para referirse a la 1) aplicación de una muestra de prueba a una columna de HPLC seguido por 2) eluir la muestra de prueba con una fase móvil, donde el eluyente resultante es monitoreado con un detector capaz de detectar un macrólido y/o impurezas en la muestra de prueba. Ensayos HPLC-ECD y HPLC-MS La fase móvil para los ensayos que son compatibles con los métodos de detección MS incluyen típicamente los componentes volátiles. Por ejemplo, la fase móvil para ensayos de HPLC-ECD y HPLC-MS de acuerdo a la invención pueden contener un amortiguador volátil, agua, acetonitrilo y alcohol . Los amortiguadores volátiles adecuados incluyen cualquier substancia de amortiguamiento que mantiene la fase móvil en el pH deseado y no interfiere con la detección del macrólido por un espectrómetro de masa. En algunas modalidades, el amortiguador volátil comprende una sal de amonio tal como acetato de amonio. La concentración de la sal de amortiguador volátil en la fase móvil puede ser aproximadamente 40 a aproximadamente 100, aproximadamente 50 a aproximadamente 80, o aproximadamente 60 a aproximadamente 75 mM. En' algunas modalidades, la sal de amortiguador volátil está presente en la fase móvil en una concentración de aproximadamente 67 mM. En modalidades adicionales, la fase móvil tiene un pH de aproximadamente 6 a aproximadamente 8. En aún modalidades adicionales, la fase móvil tiene un pH de aproximadamente 7.

Los componentes adecuados orgánicos de la fase móvil incluyen solvente orgánico, tal como acetonitrilo, y un modificador orgánico tal como un alcohol para controlar la conformación del pico y tiempo de retención. Alcoholes adecuados de ejemplo incluyen los alcoholes de cadena lineal y ramificada de C1-C8 tales como metanol, etanol, isopropanol, y similares. En algunas modalidades, el alcohol es metanol. En algunas modalidades, la proporción de volumen del acetonitrilo a alcohol en la fase móvil puede ser aproximadamente 1:1 a aproximadamente 2:1. En algunas modalidades, la proporción de volumen de acetonitrilo a alcohol es aproximadamente 3:2. La fase móvil puede ser corrida a través de la columna HPLC como un gradiente de elución. Por consiguiente, la fase móvil puede estar comprendida de una mezcla de dos o más soluciones eluyentes, las proporciones de las cuales pueden variar sobre el curso del tiempo de la elución. En algunas modalidades la fase móvil comprende una mezcla del eluyente A y del eluyente B, cuyas cantidades relativas pueden variar durante el curso de la elución. En algunas modalidades, el eluyente A contiene aproximadamente 60 a aproximadamente 75 mM ¦ de acetato de amonio en agua y el eluyente B contiene aproximadamente 60 a aproximadamente 75 mM de acetato de amonio en una mezcla de aproximadamente 50 a aproximadamente 70% en peso por volumen de acetonitrilo y aproximadamente 30 a aproximadamente 50% en volumen de metanol.

En modalidades adicionales, el eluyente A contiene aproximadamente 65 a aproximadamente 70 mM de acetato de amonio en agua y eluyente B contiene aproximadamente 65 a aproximadamente 70 mM de acetato de amonio en una mezcla de aproximadamente 55 a aproximadamente 60% en peso de acetonitrilo y aproximadamente 40 a aproximadamente 45% en peso de volumen de metanol . En aún modalidades adicionales, el eluyente A contiene aproximadamente 67 mM de acetato de amonio en agua y el eluyente B contiene aproximadamente 67 mM de acetato de amonio en una mezcla de aproximadamente 58% en volumen de acetonitrilo y aproximadamente 42% en volumen de metanol. En aún modalidades adicionales, la fase móvil puede contener en cualquier punto en el momento de la elución una mezcla de aproximadamente 40 a aproximadamente 75% en volumen de eluyente A y aproximadamente 25 a aproximadamente 60% en volumen del eluyente B. En algunas modalidades, la proporción del eluyente B es incrementada bastante para una porción de tiempo durante la elución. La fase estacionaria puede estar compuesta de cualquier medio de soporte sólido de fase inversa que en combinación con la fase móvil permite la detección del macrólido y la separación de las mismas a partir de las impurezas. En algunas modalidades, la fase estacionaria contiene una matriz de C8 a C18. En modalidades adicionales, la fase estacionaria es una matriz de C18. La muestra de prueba puede ser diluida con una solución de diluyente de muestra para formar una muestra diluida antes a la introducción en la columna. Las concentraciones adecuadas de macrólido en la muestra diluida puede ser cualquier cantidad adecuada tal como aproximadamente 0.1 a aproximadamente 5 mg/ml. En algunas modalidades, la concentración puede ser aproximadamente 0.5 a aproximadamente 1 mg/ml. El diluyente de muestra puede ser el mismo o similar a la fase móvil. En algunas modalidades, el diluyente muestra es una mezcla de agua, acetonitrilo y un alcohol tal como metanol . En algunas modalidades, el diluyente muestra contiene aproximadamente 50 a aproximadamente 90% de agua, aproximadamente 10 a aproximadamente 50% de una mezcla de aproximadamente 50 a aproximadamente 70% de acetonitrilo y aproximadamente 30 a aproximadamente 50% de metanol. En algunas modalidades adicionales, el diluyente de la muestra contiene aproximadamente 70% de agua y aproximadamente 30% de una mezcla de aproximadamente 60% de acetonitrilo y aproximadamente 40% de metanol. El detector electroquímico (ECD por sus siglas en inglés) puede ser cualquier detector adecuado capaz de inducir y detectar la oxidación o reducción del macrólido. Un ejemplo de un ECD adecuado incluye uno que usa tres electrodos : un electrodo de protección o celd, un electrodo de tamizado, y electrodo de trabajo. El electrodo de trabajo puede ser, por ejemplo, un electrodo de platino o de carbono de cristal. La calibración de los electrodos puede ser llevada a cabo por cualquier medio estándar conocido para la persona experta. En algunas modalidades, el ECD es fijado para detección del macrólido y se acompaña de impurezas por la oxidación de los mismos. Por ejemplo, el electrodo de trabajo puede ser fijado a un potencial adecuado para oxidar el macrólido, tal como puede ser determinado por cualquiera de los varios métodos conocidos tales como voltametría cíclica. Los potenciales adecuados para el electrodo de trabajo incluyen más de aproximadamente 700n mV, más de aproximadamente 750 mV, y más de aproximadamente 800 mV. En algunas modalidades, el electrodo de trabajo tiene un potencial de aproximadamente 800 a aproximadamente 900 mV. En modalidades adicionales, el electrodo de trabajo tiene un potencial de aproximadamente 850 mV. Los potenciales para el electrodo de protección y electrodo de referencia pueden ser determinados por el experto. Por ejemplo, el electrodo de protección puede tener un potencial de aproximadamente 1000 mV y el electrodo de referencia puede tener un potencial menor a aquel del electrodo de trabajo, tal como de aproximadamente -100 mV a aproximadamente 100 mV. En algunas modalidades, el electrodo de referencia tiene un potencial de aproximadamente 0 mV. El detector espectrómetro de masa (MS) puede incluir cualquier detector MS capaz de detectar y determinar la proporción de masa/carga del macrólido. Los detectores MS adecuados son ampliamente disponibles, tales como en conexión con muchos instrumentos LC-MS comerciales y su uso en detectar compuestos orgánicos tales como macrólidos es rutina en la técnica. En algunas modalidades, la detección del macrólido y cualesquiera impurezas acompañantes puede ser llevada a cabo con el detector MS en modo positivo. La ionización puede ser realizada por cualquier método, incluyendo electroaspersión u otros medios . Los parámetros MS adecuados incluyen una temperatura capilar de aproximadamente 150 a aproximadamente 200°C (por ejemplo, aproximadamente 180°C) y un vaporizador fijado a aproximadamente 300 a aproximadamente 400°C (por ejemplo, aproximadamente 350°C) . La elución del macrólido de acuerdo a los métodos y sistemas de la invención puede ser realizada bajo una variedad de temperaturas y presiones, incluyendo temperatura y presión ambientes. En algunas modalidades, la elución se realiza en una temperatura constante de aproximadamente 10 a aproximadamente 30, aproximadamente 15 a aproximadamente 25, o aproximadamente 20°C. La temperatura puede ser mantenida debajo de la temperatura ambiente por fijar la columna con un enfriador diseñado para tales aplicaciones. Inversamente, la temperatura puede ser mantenida arriba de la temperatura ambiente por fijar la columna con un calentador diseñado para tales aplicaciones . La elución puede también ser realizada al aire o una atmósfera inerte. La detección del macrólido puede ser confirmada por comparar un cromatograma obtenido de acuerdo al ensayo de la invención que contiene un pico que se cree corresponde al macrólido con un cromatograma que corre bajo las mismas condiciones que muestran un pico de referencia para una muestra conocida del macrólido. Por ejemplo, un pico de muestra que parece estar dentro de 0.2 minutos del pico de referencia puede ser considerado confirmado . La cantidad del macrólido en una muestra puede también ser cuantificado por comparar el área de un pico el cual corresponde al macrólido con el área de un pico en un cromatograma obtenido para una muestra de referencia (estándar) que contiene una cantidad conocida del macrólido. La presente invención además proporciona un método para determinar la pureza de una muestra de prueba. El método implica a) correr la muestra en una columna de cromatografía de líquidos de alta resolución (RP-HPLC) con un gradiente de fase móvil el cual comprende un amortiguador volátil, agua, acetonitrilo, y alcohol. El efluente se monitorea con un detector electroquímico para detectar: i) un pico actual que corresponde al macrólido; y ii) opcionalmente uno o más picos actuales que corresponden a una o más impurezas en la muestra (por ejemplo, picos actuales que tienen un área pico de aproximadamente 0.05% ó más del área pico debido al macrólido) . Las características de los picos actuales son entonces evaluados para calcular el contenido de la impureza, por ejemplo, porcentajes de áreas picos o proporciones de altura de pico pueden ser usados para evaluar y calcular el contenido de impurezas (pureza) . En algunas modalidades, el área de pico actual se determina para cada impureza detectada así como también el macrólido, y por ciento del área del pico total para cada uno se calcula. Una impureza en una muestra puede ser identificada por determinar, por ejemplo, la masa del pico correspondiente a la impureza en un cromatograma obtenido por un HPLC-MS método de la invención. Cuantificación de las impurezas del macrólido con HPLC-UV Las impurezas identificadas en muestras de prueba por los ensayos de HPLC-MS y/o HPLC-ECD descritas anteriormente en la presente pueden ser cuantificadas usando un ensayo de HPLC acoplado con detección fotométrica (HPLC-UV) . La composición de fase móvil adecuada para el ensayo de HPLC-UV puede ser cualquier combinación de componentes líquidos que efectivamente eluyen el macrólido deseado, permite la separación del macrólido a partir de impurezas potenciales, y permite la detección fotométrica del macrólido en la longitud de onda de detección. En algunas modalidades, la fase móvil tiene una absorbancia insignificante (por ejemplo, medida con un espectrofotómetro sobre una longitud de trayectoria de 1 cm) anteriormente arriba de 205 nm. Por "insignificante" se entiende absorbancia de aproximadamente 0.02 ó menos. En modalidades adicionales, la fase móvil tiene una absorbancia (por ejemplo, medida con un espectrofotómetro sobre una longitud de trayectoria de 1 cm) de menos de aproximadamente 0.5, menos de aproximadamente 0.3, ó menos de aproximadamente 0.1 en la longitud de onda de detección. La fase móvil del ensayo de HPLC-UV puede contener agua, solvente orgánico, o una mezcla de los mismos. Cualquier solvente orgánico adecuado que es miscible con agua y no interfiere con la detección del macrólido en la longitud de onda de detección puede ser usada. En algunas modalidades, el solvente orgánico es acetonitrilo . La fase móvil puede contener 0 a 100% (v/v) de agua y 0 a 100% (v/v) de solvente orgánico. En algunas modalidades, la fase móvil contiene aproximadamente 5 a aproximadamente 75, aproximadamente 10 a aproximadamente 60, ó aproximadamente 20 a aproximadamente 50% (v/v) de solvente orgánico . La fase móvil del ensayo de HPLC-UV puede además incluir un amortiguador para estabilizar la solución en un pH deseado. Cualquier amortiguador que no interfiere con la detección del macrólido en la longitud de onda puede ser usado. En algunas modalidades, el amortiguador es un fosfato o un amortiguador de sulfato. En modalidades adicionales, el amortiguador es un amortiguador de sulfato. La concentración del amortiguador puede ser, por ejemplo, aproximadamente 0.1 mM a aproximadamente 1000 mM. En algunas modalidades, la concentración del amortiguador es aproximadamente 1 mM a aproximadamente 500 mM, aproximadamente 5 mM a aproximadamente 100 mM, o aproximadamente 10 mM a aproximadamente 30 mM. Cualquier pH en el cual el macrólido es suficientemente estable de tal forma que puede ser detectado por los métodos y sistemas de la invención es adecuado. En algunas modalidades, el pH es aproximadamente 1 a aproximadamente . En modalidades adicionales, el pH es aproximadamente 3. En algunas modalidades, la fase móvil incluye un reactivo de par de iones, tal como por ejemplo, una sal que facilita la retención del macrólido en una columna de fase inversa. Cualquier reactivo de par de iones que es razonablemente estable en la solución de fase móvil, es capaz de formar un par de iones con una forma cargada (por ejemplo, protonado o desprotonado) del macrólido, y no interfiere con la elución o detección del macrólido que es adecuado . Varios reactivos de pares de iones adecuados son comercialmente disponibles y técnicas de HPLC usar los mismos es bien conocido en la técnica. Algunos reactivos de pares de iones de ejemplo incluyen sales de alquilsulfonato tal como sales de alquil (C4-C12) sulfonato que incluyen 1-octansulfonato de sodio.

La concentración del reactivo de pares de iones en la fase móvil puede ser aproximadamente 0.1 mM a aproximadamente 1000 mM. En algunas modalidades adicionales, la concentración del par de iones es aproximadamente 1 mM a aproximadamente 500 mM, aproximadamente 5 mM a aproximadamente 100 M, o aproximadamente 10 mM a aproximadamente 30 mM. En algunas modalidades, la concentración del par de iones es aproximadamente 12 mM a aproximadamente 15 mM. La fase móvil puede ser corrida a través de la columna HPLC como una elución isocrática o elución de gradiente. En modalidades donde se aplica una fase móvil de gradiente, la fase móvil puede estar comprendida de una mezcla de dos o más soluciones de eluyente diferentes, las proporciones las cuales varían sobre el curso de tiempo de la elución. Por ejemplo, la fase móvil puede contener cantidades variables de agua, solvente orgánico, amortiguador, y reactivo de par de iones durante la elución. La variación en cantidades de componentes puede ser ajustada de tal forma que el gradiente de fase móvil mantiene substancialmente constante la absorbancia en la longitud de onda de detección durante el curso de la elución. La variación en cantidades de componente pueden ser ajustadas también para optimizar la conformación del pico, tiempo de elución, separación de macrólido a partir de impurezas; y otros parámetros. En algunas modalidades, la composición de la fase móvil del ensayo de HPLC-UV es variada por eluir con uno de una mezcla de dos soluciones eluyentes, cada una que contiene cantidades diferentes de agua, solvente orgánico, amortiguador y reactivo de pares de iones. En algunas modalidades, una primera solución de eluyente contiene aproximadamente 10 a aproximadamente 30% (v/v) de solvente orgánico, aproximadamente 70 a aproximadamente 90% (v/v) de agua, aproximadamente 10 a aproximadamente 20 mM de reactivo de pares de iones, y aproximadamente 10 a aproximadamente 15 mM de amortiguador, y una segunda solución de eluyente contiene aproximadamente 40 a aproximadamente 60% (v/v) de solvente orgánico, aproximadamente 40 a aproximadamente 60% (v/v) de agua, aproximadamente 8 a aproximadamente 15 mM de reactivo de pares de iones, y aproximadamente 8 a aproximadamente 12 mM de amortiguador. En modalidades adicionales, una primera solución de eluyente contiene aproximadamente 20% (v/v) de solvente orgánico, aproximadamente 80% (v/v) de agua, aproximadamente 15 mM de reactivo de pares de iones, y aproximadamente 13 mM de amortiguador y una segunda solución de eluyente contiene aproximadamente 50% (v/v) de solvente orgánico, aproximadamente 50% (v/v) de agua, aproximadamente 12 mM de reactivo de pares de iones, y aproximadamente 10.5 mM de amortiguador. En cualquier punto durante la elución, la fase móvil puede estar compuesta de 100% de una de las dos soluciones eluyentes o una mezcla de los dos .

La fase estacionaria del ensayo de HPLC-UV puede estar compuesto de' cualquier medio de soporte sólido de fase inversa que en combinación con la fase móvil permite la detección del macrólido y la separación de las mismas impurezas potenciales. En modalidades adicionales, la fase estacionaria contiene una matriz de C8 a C18. En modalidades adicionales, la fase estacionaria es una matriz de C18. La muestra puede ser diluida para formar, una muestra diluida para introducción en la columna. La muestra diluida puede tener una concentración de macrólido de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 mg/ml . El diluyente de la muestra puede estar comprendido de agua amortiguada por Bis-Tris (por ejemplo, aproximadamente 20 a aproximadamente 100 mM, aproximadamente 30 a aproximadamente 70 mM, o aproximadamente 50 mM de Bis-Tris) y que tiene un pH de aproximadamente 6 a aproximadamente 8 , o aproximadamente 7. El detector de UV que monitorea el efluente a partir de la columna puede incluir cualquier espectrofotómetro capaz de detectar la absorción o transmisión de longitudes de onda de UV a través de la muestra líquida. El detector puede ser cambiado a una longitud de onda de detección la cual puede ser constante para la duración de elución. En algunas modalidades, se monitorea el efluente en una longitud de onda de aproximadamente 190 nm a aproximadamente 210 nm, aproximadamente 197 nm a aproximadamente 205 nm, o aproximadamente 200 nm. En algunas modalidades, la longitud de onda de detección es aproximadamente 200 nm. El factor de respuesta de UV (proporción de área de pico normalizado de impureza a macrólido en una longitud de onda de detección) para cada impureza identificada para los ensayos de HPLC-MS y/o HPLC-ECD descritos anteriormente pueden ser determinados por llevar a cabo el ensayo de HPLC-UV en una muestra de referencia la cual contiene una cantidad conocida de la impureza así como también una muestra de referencia la cual contiene una cantidad conocida del macrólido en alta pureza. Por ejemplo, el factor de respuesta para una impureza puede ser calculado de acuerdo a las siguientes ecuaciones, A, B y C: Factor de respuesta^ (área de pico normalizado de impureza) / (área de pico normalizado de macrólido) (A) donde : área de pico normalizado de impureza= (área del pico de impureza) x(% de impureza) / (concentración de impureza) (B) área de pico normalizado de macrólido= (área de pico de macrólido) (% de pureza) / (concentración del macrólido) (C) La cantidad de la impureza en una muestra de prueba la cual contiene una cantidad desconocida de impureza puede ser determinada por identificar la impureza usando los ensayos de HPLC-MS o HPLC-ECD descritos en la presente, seguido por el cálculo de un factor de respuesta para la impureza identificada por realizar el ensayo de HPLC-UV descrito anteriormente en una muestra de referencia de la impureza identificada y muestra de referencia del macrólido, ensayando una muestra de prueba de acuerdo al ensayo de HPLC-UV descrito anteriormente y usando el factor de respuesta calculado para calcular la cantidad de impureza en la muestra de prueba. Sistemas También están comprendidos por la invención los sistemas los cuales incluyen un ensamble de los componentes descritos anteriormente. Por ejemplo, un sistema de la invención puede contener a) una columna de cromatografía de líquidos de alta resolución de fase inversa (RP-HPLC) la cual contiene i) una fase estacionaria la cual comprende la matriz de soporte sólido de fase inversa; y ii) una fase móvil como se describe anteriormente; y b) un detector electroquímico o de espectro de masa. Los parámetros adicionales para correr y optimizar el ensayo de HPLC de acuerdo a la presente invención están bien dentro del conocimiento de un experto en la técnica como se evidencia en la literatura, por ejemplo, por Snyder et al., Practical HPLC Method Development, 2 - edición, Wiley, New York, 1997, la descripción de la cual se incorpora en la presente para referencia en su totalidad. La invención se describe con mayor detalle por la forma de ejemplos específicos. Los siguientes ejemplos son ofrecidos para propósitos ilustrativos, y no se proponen para limitar la invención en ninguna forma. Aquellos expertos en la técnica reconocerán fácilmente una variedad de parámetros no críticos los cuales pueden ser cambiados o modificados para producir esencialmente los mismos resultados. EJEMPLOS Parámetros de HPLC para detección electroquímica y espectrómetro de masa de 9- (S) -eritromicilamina Los análisis de HPLC de 9- (S) -eritromicilamina son realizados de acuerdos a los parámetros posteriores. Los porcentajes son por volumen. Instrumentación Una bomba de HPLC Waters 2690 HPLC Detector electroquímico ESA Model 5200A Coulochem II Una celda analítica ESA Modelo 5010 Una columna ACE C18 HPLC (150 x 4.6 3¡im, MAC-MOD, P/N#ACE-111-1546) Finigan SSQ7000 o JEOL LC-Mate Mass Spectrometer system Fase móvil El eluyente A: 0.0671 M acetato de amonio en agua filtrado al vacío a través de un filtro de 0.22 ¡Jm) en pH 7.04. El eluyente B: acetato de amonio 0.0671 M en 57.6% de acetonitrilo y 42.4% de metanol por volumen (filtrado al vacío a través de un filtro de 0.22 ¡Jm) . Diluyente de muestra: 71% de agua Milli Q pulida con disco C18 y 2% de mezcla de acetonitrilo al 57.6% y metanol al 42.2%. Preparación estándar y de muestra La solución estándar de 9- (S) -eritromicilamina y una solución de muestra de 0.8 a 0.9 mg/ml se prepara en un matraz volumétrico de 50.00 mi usando un diluyente de muestra. Parámetros de columna Proporción de flujo: 1 ml/min Temperatura de columna: 40°C Volumen de inyección para ECD: 10 µ? Volumen de inyección para MS: 50µ1 Tiempo de corrida: 60 minutos Tabla de gradiente Tiempo % de eluyente A % de eluyente B 0 71 29 2 71 29 20 65 35 48 51 49 50 71 29 60 71 29 Parámetros de detección electroquímica: Celda de protección: 1000 mV Electrodo 1 : 0 mV Electrodo 2: 850 mV Filtro de ruido: 5 segundos Intervalo: 50 µ? Parámetros de detección del espectro de masa: Modo positivo APCI Temperatura del capilar: 180 °C Temperatura del vaporizador: 350°C Ejemplo 2 Análisis de HPLC de diferentes lotes de 9- (S) -eritromicilamina Se analizan las muestras de 9- (S) -eritromicilamina a partir de diferentes proveedores por HPLc usando ya sea tanto detección por espectrómetro de masa o electroquímica de acuerdo a los parámetros proporcionados en el Ejemplo 1. Las asignaciones de estructura tentativa son hechos a base de masa y estructuras correspondientes son proporcionadas en las Figuras 1 y 2. Las letras " D" indicando "no detectado".

Tabla 2 Datos de HPLC- S y HPLC-ECD para 9- (S) -eritromicilamina lotes 36188CA00 y 6E0101 Tabla -3 Datos de detector de HPLC-MS y electroquímico (ECD) para 9- (S) -eritromicilamina lotes (S)AE/Ü32/56 y 3535 17 34.387 2.111057 0.01 33.4 1.964706 749.7 10 748.94/ 748.47 18 36.331 2.230401 16.37 35.55 2.091176 756.7 desc. - 19 37.976 2.331389 0.08 36.9 2.170588 749.7 10 748.94/ 748.47 20 38.481 2.362392 0.07 39.11 2.300588 704.6 19 704.93/ 704.48 21 39.795 2.44306 0.09 39.58 2.328235 759.7 desc. - 22 42.864 2.631469 0.06 ND - - - - 23 46.485 2.853766 0.12 47.38 2.787059 714.7 desc.

Tabla 4 Datos para detector de HPLC-MS y electroquímico (ECD) para 9- -eritromicilamina lotes 6E0201 y PDC325/Vd070202 Lote # PDC325/Vd070202 Pea ECD ECD ECD% MS MS MS pico de MS MS k# RT. R.RT. área RT. R.RT. masa MW/EM 1 3.571 0.2219 0.12 3.92 0.23932 751.7, 11 750.96/ 807.1 750.49 2 6.499 0.40384 0.33 7.23 0.44139 735.6 13 734.96/734.49 576.76/576.40 3 6.764 0.42031 0.18 7.52 0.4591 577.5 20 720.93/720.48 720.93/720.48 4 7.262 0.45125 0.25 7.92 0.48352 721.4 15.16.16R 706.90/706.46 15,16, 720.93/720.48 5 10.487 0.65165 0.03 11.29 0.68926 721.7 16R - 17 734.96/734.49 6 ND ND - 14.04 0.85714 707.5 689.87/689.44 15,16, 748.94/748.47 7 14.401 0.89486 0.08 14.95 0.9127 721.6 16R 718.96/718.50 8 15.319 0.9519 0.02 ND ND - 4 9 16.093 1 98.75 16.38 1 735.6 18 10 - - <0.03 20.21 1.23382 690.6 1 I n u 11 26.331 1.63618 0.09 27.17 1.65873 749.7 o 12 30.678 1.90629 0.06 31.27 1.90904 719.5 desc 13 38.839 2.41341 0.08 43.52 2.6569 716.5 Tabla 5 Datos para HPLC-MS para 9- (S) -eritromicilamina lotes PD2012/RS/328/016 y 10006647 Lote # PD2012/WRS/328/016 Pico MS MS MS MS MS # RT. R.RT. Masa de pico Estructura MW/EM tentativa 1 7.353 0.4386 735.3 13 734.96/734.49 2 8.195 0.4888 721.5 15,16,16R 720.93/720.48 3 15.546 0.9272 721.5 15.16.16R 720.93/720.48 4 16.766 1.0000 735.5 4 734.96/734.49 5 22.489 1.3413 751.4 desconocido - 6 55.193 3.2920 690.5 18 689.87/689.44 7 55.723 3.3236 230.1/307.2/ desconocido - 324.2/339.1 Lote # 10006647 Peak# MS MS MS MS MS RT. R.RT. Masa de pico Estructura MW/EM tentativa 1 7.367 0.4376 735.3 13 734.96/734.49 2 8.19 0.4865 721.5 15.16.16R 720.93/720.48 3 14.47 0.8596 707.5 17 706.90/706.46 4 15.447 0.9176 721.5 15,16,16R 720.93/720.48 5 16.834 1.0000 751.4 4 734.96/734.49 6 22.281 1.3236 751.5 11 (750.2) 7 31.757 1.8865 719.5 Unknown - 8 55.177 3.2777 690.5 18 689.87/689.44 9 55.73 3.3106 230.2/307.2/324.3/339.2 unknown - Ejemplo 3 Identificación y cuantificación de impurezas en una muestra de 9- (S) -eritromicilamina De acuerdo al procedimiento posterior, seis impurezas de macrólido (ver Tabla 6 y Fórmulas VI-XI anteriores) se sospecha como probables contaminantes y se confirma así su presencia o ausencia en lotes de 9-(S)-eritromicilamina para uso como en API . Las cantidades de impurezas detectadas son también cuantificadas . Tabla 6 Nombre químico Fórmula Fuente posible Decladinosil-9-(R)-eritromicilamina VI Subproducto sintético DecladinosiI-9-(R)-eritromicilamina VII Subproducto sintético Oxima de Decladinosil-eritromicilamina VIII Subproducto Sintético 9-(R)-eritromicilamina IX Subproducto sintético Base de oxima de eritromicina (Z-isómero) X Materiales primas Base de oxima de eritromicina (E-isómero) XI Subproducto sintético Las muestras de referencia de cada una de las seis que se sospechan son impurezas así como también la 9-(S)-eritromicilamina se compran de Alembic, Inc. (India) y sus" estructuras se verifican por FT-IR así como también HPLC-MS, la cual se realiza de acuerdo al procedimiento descrito en el Ejemplo 1. Las muestras FT-IR son preparadas por mezclar aproximadamente 2 mg de muestra de referencia con aproximadamente 100 mg de KBr seco en un mortero de ágata y se muele en un polvo fino. El polvo se carga en un molde de gránulo de 11 mm y se comprime bajo vacío. Se obtiene el espectro de IR por barrido 16 veces como 4 cm"1. Los espectros IR y datos MS son consistentes con cada uno de los seis compuestos de la Tabla 6. Los factores de respuesta para cada uno de los seis compuestos sospechosos anteriores son determinados por el siguiente procedimiento. Las muestras de referencia de cada uno de los seis compuestos sospechados son ensayados por HPLC usando detección fotométrica de acuerdo a los parámetros HPLC-UV proporcionados posteriormente. Instarumentación El siguiente equipo operado de acuerdo a las instrucciones del fabricante se usan para obtener cromatogramas de HPLC. El equipo con el comportamiento comparable puede ser substituido. Desgasamiento en vacío: Waters 2690 Bomba: Waters 2690 Inyector: Waters 2690 Mezcla 50:50 por volumen de acetonitrilo y agua como lavado de agu a 100 µ? de circuito de inyección Pre-columna: Phenomenex Security Guard con cartucho ODS (P/N AJO-4287) Columna: Columna Phenomenex, C18(2), 150 mm x 4.6 mm, 5 |_im (P/N 00F-4252-E0) Se instala la columna en la dirección del flujo de eluyente . como se instruye en la etiqueta de columna y se coloca en una columna de Cromatografía Jones enfriador/calentador mantenido en 20 _+ 1°C. Se almacena la columna en 70:30 (v/v) acetonitrilo : agua cuando no está en uso. Detector: Waters 2487 Detector de longitud de onda dual Longitud de onda: 200 nm Enfriador de columna: Modelo de cromatografía Jones 7955 La temperatura se fija a 20 + 1°C. Sistema de Datos: Sistema de datos Perkin-Elmer Nelson Turbochrom, versión 6.2.1 Soluciones de desarrollo Diluyente de la muestra: 50 mM Bis-Tris (Sigma) pH 7.4 Eluyente A : Acetonitrilo al 20% (grado HPLC, Fisher) 1-octansulfonato de sodio 15 mM (Fluka) Na2S04 13 mM (Sigma) pH 3.1 Eluyente B Acetonitrilo al 50% (grado HPLC , Fisher) 1-octansulfonato de sodio 12 mM /Fluka) Na2S04 10.5 mM (Sigma) pH 3.1 Análisis de HPLC Se realiza el análisis de muestra bajo los siguientes parámetros : Velocidad de flujo: 1.0 mi/minutos Volumen de inyección: 20 µ? Tiempo de corrida: 40 minutos Longitud de onda: 200 nm Concentración de muestra: 0.5 mg/ml Se fija el sistema de datos para adquirir 1 punto/segundo con 40 minutos tiempo de adquisición. Se aplica un gradiente de fase móvil de acuerdo a la Tabla A posterior.

Tabla A El área de pico normalizado para cada muestra de referencia de impureza y muestra de referencia de 9-(S)- eritromicilamina se calcula usando la ecuación (D) y el factor de respuesta usando la ecuación (E) donde El área 1 es el área de pico de la primera inyección y el área 2 es el área de pico de una segunda inyección. Área de pico normalizada= (área 1 + área 2)/2x (% de pureza) /concentración (mg/ml) (D) Factor de respuesta= (área de pico normalizada de impureza) / (área de pico normalizada de 9- (S) -eritromicilamina) (E) Los factores de repuesta calculados para cada una de 6 las impurezas de sospecha son proporcionadas en la Tabla 7 posterior así como también para 9- (S) -eritromicilamina.

Tabla 7 Cantidades de cada una de las impurezas en una muestra de prueba de 9- (S) -eritromicilamina se determinan por correr la muestra de prueba en la columna de HPLC-UV descrita anteriormente y usando los factores de respuesta en la Tabla 7. Los resultados son proporcionados en la Tabla 8 posterior. No se observa la cantidad detectable de 9-(R)- eritromicilamina . Tabla 8 Nombre químico Area % Area Conc. % en mg/mL muestra Decladinosil-9-(R)-eritromicilamina (VI) 7.9652 0.36 0.0105 0.43 Decladinosil-9-(S)-eritromicilamina (Vil) 2.6698 0.12 0.0029 0.12 9-(R)-eritromicilamina (IX) 10.9227 0.50 0.0018 0.50 Base de oxima de eritromicina (Z-isómero) IX NA NA NA NA Base de oxima y eritromicina (isómero Z) X 2.3329 0.11 0.0003 0.11 Base de oxima de eritromicina (isómero E) XI 21.9310 1.00 0.0032 1.00 9-(S)-eritromicilamina 2100.5869 95.51 2.3247 95.51 Se aprecia que ciertas características de la invención, las cuales, para claridad, son descritas en el contexto de modalidades separadas, pueden también ser proporcionadas en combinación con una sola modalidad. Inversamente, varías características de la invención las cuales son, para brevedad, descritas en el contexto de una sola modalidad, puede también ser proporcionada separadamente o en cualquier subcombinacion adecuada Varias modificaciones de la invención, además de aquellas descritas en la presente, serán aparentes para aquellos expertos en la técnica a partir de la siguiente descripción. Tales modificaciones son también propuestas para caer dentro del alcance de las reivindicaciones anexas . Cada referencia citada en la presente invención es incorporada en la presente para referencia en su totalidad. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como precede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un método para detectar un macrólido en una muestra de prueba, en donde el componente principal de la muestra de prueba en peso es el macrólido, el método caracterizado porque comprende: a) aplicar la muestra de prueba en una columna de cromatografía de líquidos de alta resolución de fase inversa (RP-HPLC) ; b) eluir la muestra de prueba con un gradiente de fase móvil el cual comprende un amortiguador volátil, agua, acetonitrilo, y alcohol; y c) monitorear el efluyente a partir de la columna con un detector electroquímico o detector de espectrómetro de masa para detectar un pico actual, o pico de masa, respectivamente, el cual corresponde al macrólido. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el macrólido es 9-(S)-eritromicilamina . 3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el macrólido tiene una absorción máxima en el intervalo de ultravioleta visible en aproximadamente 180 n a aproximadamente 220 nm. . El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el amortiguador volátil es acetato de amonio . 5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la fase móvil tiene un pH de aproximadamente 6 a aproximadamente 8. 6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el alcohol comprende metanol . 7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la fase móvil comprende una mezcla de eluyente A y eluyente B, las cantidades relativas de las cuales varían durante el curso de la elución, donde el eluyente A consiste esencialmente de aproximadamente 60 a aproximadamente 75 mM de acetato de amonio en agua y el eluyente B consiste esencialmente de aproximadamente 60 a aproximadamente 75 mM de acetato de amonio en una mezcla de aproximadamente 50 a aproximadamente 70% en volumen de acetonitrilo y aproximadamente 30 a aproximadamente 50% en volumen de metanol . 8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende cuantificar la cantidad del macrólido en la muestra de prueba al comparar el área o altura del pico actual con un estándar de referencia. 9 . Un método para determinar la pureza de una muestra de prueba, en donde el componente principal de la muestra de prueba en peso es un macrólido, caracterizado porque comprende: a) aplicar la muestra de prueba en una columna de cromatografía de líquidos de alta resolución de fase inversa (RP-HPLC) ; b) eluir la muestra con un gradiente de fase móvil el cual comprende un amortiguador volátil, agua, acetonitrilo, y alcohol; c) monitorear el efluente a partir de la columna con un detector electroquímico para detectar: i) un pico corriente el cual corresponde al macrólido; y ii) opcionalmente uno o más picos corrientes adicionales el cual corresponde a una o más impurezas en la muestra de prueba; y d) medir una o más características de los picos actuales detectados por el detector para calcular el contenido de impureza en la muestra de prueba. 10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la medición se realiza por i) determinar el área de pico actual para cada impureza detectada y el macrólido; y ii) calcular el porcentaje del área de pico actual total debido al macrólido. 11. Un método para identificar una impureza en una muestra de prueba, en donde el componente principal de la muestra de prueba en peso es un macrólido, caracterizado porque comprende: a) aplicar la muestra de prueba en una columna de cromatografía de líquidos de alta resolución de fase inversa (RP-HPLC) ; b) eluir la muestra de prueba con un gradiente de fase móvil el cual comprende un amortiguador volátil, agua, acetonitrilo, y alcohol; c) monitorear el efluente a partir de la columna con un detector de espectrómetro de masa para detectar: i) un pico de masa que corresponde al macrólido; y ii) un pico de masa adicional el cual corresponde a la impureza en la muestra de prueba; y d) determinar la masa del pico de masa adicional que corresponde a la impureza. 12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el macrólido es 9-(S)-eritromicilamina . 13. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la impureza es un macrólido. 1 . El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la impureza es: Eritromicina B; Hidrazona de eritromicina B; 9-imino Eritromicina B; eritromicilamina B; aducto de acetona e hidrazona de eritromicina; 9-hidroxiimino eritromicina; hidróxido de eritromicilamina; 9-hidroxiimino eritromicina B; hidróxido de eritromicilamina B; 9- (R) -eritromicilamina; eritromicilamina C; eritromicilamina D ; o un compuesto el cual tiene la Fórmula 15. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la impureza es un compuesto de la Fórmula VI, VII, VIII, IX, X o XI: vni IX 16. Un método para determinar la cantidad de una impureza en una muestra de prueba, en donde el componente principal de la muestra en peso es un macrolido, caracterizado porque comprende : a) identificar la impureza de acuerdo al método de la reivindicación 11; b) determinar el factor de respuesta para la impureza por el método que comprende: i) aplicar una cantidad conocida de la impureza y una cantidad conocida del macrolido en una columna de cromatografía de líquidos de alta resolución de fase inversa (RP-HPLC) fijada con un detector ultravioleta (UV) que tiene una longitud de onda entre aproximadamente 180 nm y aproximadamente 220 nm; ii) eluir la cantidad conocida de la impureza con una fase móvil que comprende un reactivo de pares de iones : iii) monitorear el efluyente de columna con el detector de UV para detectar un primer pico de absorción en la longitud de onda de detección, el primer pico de absorción que corresponde a la impureza; iv) monitorear el efluente con columna con el detector de UV para detectar un segundo pico de absorción en la longitud de onda de detección, el segundo pico de absorción que corresponde al macrólido; y v) calcular el factor de respuesta a la impureza usando áreas de pico de los primeros y segundos picos de absorción; y c) determinar la cantidad de la impureza en la muestra de prueba por el método que comprende: i) correr la muestra de prueba bajo las mismas condiciones de ensayo de la etapa b) para detectar un tercer pico de absorción que corresponde a la impureza; y ii) calcular la cantidad de la impureza en la muestra de prueba usando el factor de respuesta. 17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la impureza es un compuesto de la Fórmula VI, VII, VIII, IX, X o XI : 18. Un sistema para detectar las impurezas en una muestra de prueba de 9- (S) -eritromicilamina, caracterizado porque comprende: a) una columna de cromatografía de líquidos de alta resolución de fase inversa la cual comprende: i) una columna de C18; ii) un gradiente de fase móvil que comprende una mezcla de eluyente A y eluyente B, las cantidades relativas las cuales varían durante el curso de la elución, en donde el eluyente A consiste esencialmente de aproximadamente 60 a aproximadamente 75 M de acetato de amonio en agua y el eluyente B consiste esencialmente de aproximadamente 60 a aproximadamente 75 mM de acetato de amonio en una mezcla de aproximadamente 50 a aproximadamente 70% en volumen de acetonitrilo y aproximadamente 30 a aproximadamente 50% en volumen de metanol . b) un detector electroquímico o un detector de espectrómetro de masa, en donde el detector electroquímico comprende un electrodo de protección, un electrodo de tamizado y un electrodo de trabajo.