CN107505403B - 妇科千金片与抗生素联合应用中生物利用度的评价方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种妇科千金片与抗生素联合应用中生物利用度的评价方法。本发明通过检测血浆样本中待测药物的浓度，采用ADAPT 5.1软件反向高斯模型计算药动学参数，SPSS软件对各组参数进行统计分析，完成评价，其中所述血浆样本为经单独给予抗生素药物或联合给予妇科千金片与抗生素后的血浆样本；所述待测药物的浓度为抗生素药物的浓度；所述检测血浆样本中待测药物的浓度的方法为HPLC‑ECD方法或HPLC‑ESI‑MS方法。本发明建立了妇科千金片对阿奇霉素在慢性盆腔炎大鼠体内多次给药药物动力学评价方法，实现评价二者联合用药的合理性的可靠方法。利用本发明评价方法可成功获得妇科千金片对阿奇霉素在慢性盆腔炎大鼠体内的药动学规律，为二者临床合理应用提供科学依据，并对后续相关研究提供参考。

Description

妇科千金片与抗生素联合应用中生物利用度的评价方法

技术领域

本发明涉及药动学评价技术领域，具体涉及中药组方与抗生素联合应用中的生物利用度的评价方法，更具体地，涉及一种妇科千金片与抗生素联合应用中生物利用度的评价方法。

背景技术

慢性盆腔炎(Chronic pelvic inflammatory disease，CPID)为妇科常见病，临床主要表现为下腹坠痛、腰骶酸痛等，其发病机制较为复杂，现代医学研究认为该病主要是由致病菌引起，以抗生素治疗为主。我国传统医学认为湿热瘀结、气滞血瘀是导致该病的主要原因，妇科千金片主要由千斤拔、穿心莲、金樱根、当归等八味药组成，具有清热除湿，益气化瘀之效，为临床治疗慢性盆腔炎的常用药。由于部分慢性盆腔炎发展过程中并无病原体存在，同时抗生素常具有耐药性，因此西医学单独应用抗生素治疗的效果并非特别理想。近年来，随着中医药现代化进程加速，中西药联合应用日趋广泛。临床对慢性盆腔炎的治疗亦常采用中西医结合疗法或中药与抗生素联合应用。近年来，大量研究报道妇科千金片与抗生素联合应用治疗慢性盆腔炎疗效显著提高，且不良反应发生率明显降低。妇科千金片联合阿奇霉素对慢性妇科炎症的疗效优于单用阿奇霉素，临床上常将两者合用治疗慢性妇科炎症疾病。

目前，妇科千金片与抗生素联合应用的研究多集中在二者联用对药效学的影响，而对药动学影响报道较少。药物的体内过程被证实易受性别、年龄、疾病状态及联合用药的显著影响，从而影响其生物利用度。既往研究联合用药对药动学的影响时常采用健康动物单次给药的方法，这种方法采样点较多对受试动物生理状态影响较大，评价的可靠性和实用性不能保证。

妇科千金片作为复方制剂，药味较多，成分复杂，长时间与抗生素(阿奇霉素)配伍使用后可能会产生相互影响，导致药动学过程的改变，而现有的单次给药的评价方法并不能充分模拟和体现临床疾病状态下长时程多次给药的实际情况，所得结果对临床用药的指导意义不大。

目前缺乏一种简便可行、符合临床给药方案的长周期多次给药评价方法，使能够定量研究妇科千金片与阿奇霉素联合应用后对主要抗菌有效成分阿奇霉素药动学过程及生物利用度的影响情况，二者临床配伍应用的合理性、本领域中西药联用的药动学研究模式等方面均缺乏有力的参考研究成果和文献。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对妇科千金片与阿奇霉素联合应用，缺乏符合临床给药方案的长周期多次给药评价方法的技术不足，提供一种妇科千金片与抗生素联合应用中生物利用度的评价方法。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

提供一种妇科千金片与抗生素联合应用中生物利用度的评价方法，包括以下步骤：

S1.检测血浆样本中待测药物的浓度；

S2.采用ADAPT 5.1软件反向高斯模型计算药动学参数，SPSS软件对各组参数进行统计学分析，完成评价；

其中步骤S1所述血浆样本为经单独给予抗生素药物或联合给予妇科千金片与抗生素药物后的血浆样本；所述待测药物的浓度为抗生素的浓度；

步骤S1所述检测血浆样本中待测药物的浓度的方法为HPLC-ECD方法或HPLC-ESI-MS方法；

所述HPLC-ECD法的检测条件为：

色谱柱为Agilent poroshell 120EC-C18(2.7μm，4.6×100mm)695975-902；在线滤器：SSI35-049；流动相：乙腈-pH7.0磷酸缓冲溶液(45:55，V/V)；流速为0.8mL·min^-1；柱温30℃；玻碳工作电极电位+1.2V，参比电极Ag/AgCl。

所述HPLC-ESI-MS方法的检测条件为：

色谱柱为Agilent poroshell 120 EC-C18(2.7μm，4.6×100mm)；流动相：乙腈/10mmol·L^-1醋酸铵水溶液＝65:35(v/v)；柱温40℃；流速为0.2mL·min^-1；进样量5μL；质谱检测条件：电喷雾电离化(ESI)方式，采用选择性正离子检测(SIM)，阿奇霉素SIM离子为[M+H]⁺，m/z 749.35，内标罗红霉素SIM离子为[M+H]⁺，m/z 837.35，电离源电压4.5kV，喷雾气(N₂)的流速为1.5L·min^-1，脱溶剂温度为250℃，检测器电压1.5kv；

所述反向高斯模型的微分方程为：

其中，V_c：中央室表观分布容积；V_p：周边室表观分布容积；CL_t：血浆药物总清除率；CL_d：分布消除速率；MIT：平均输入时间；F：生物利用度；D:口服剂量；方程所示中央室给药量X₁，周边室给药量X₂。所述V_c、V_p、CL_t、CL_d、MIT各项参数根据实验数据获取。

所述血浆样本在检测之前先进行预处理，所述步骤S2所述的预处理方法是采用乙醚萃取法。

优选地，所述乙醚萃取法是取血浆50μL，加入10mol·L^-1NH₄OH溶液和160ng·mL^-1内标罗红霉素甲醇溶液各10μL，涡旋30s混匀，加入2mL乙醚，涡旋1min，13300r·min^-1离心5min，吸取上层有机相，30℃氮气流下吹干，残留物加入150μL流动相溶解，涡旋1min，14000r·min^-1离心10min，取上清液30μL进行色谱测定。

优选地，所述抗生素为阿奇霉素。

本发明所述血浆样本优选通过以下方法获取：

S11.以雌性SD大鼠为实验对象，采用子宫内接种混合菌液加机械损伤法建立慢性盆腔炎动物模型；

S12.慢性盆腔炎模型经给药妇科千金片和/或抗生素；

S13.于不同时间点采集血浆样本。

其中，步骤S11所述建立慢性盆腔炎模型参照现有常规技术。优选地，采用20％乌拉坦0.5mL·100g^-1腹腔注射麻醉试验大鼠，采用注射器对其机械性损伤子宫内膜组织注射混合菌液，朝两侧卵巢方向分别推注混合菌液0.1mL。所述混合菌液的混合菌液由金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌，经生化鉴定后，用M-H(B)培养基37℃培养，取对数生长期，金色葡萄球菌和大肠埃希菌按1:1混合，将混合后的菌液稀释即得。优选地，适用于本发明方法中建立慢性盆腔炎模型的混合菌液是将混合后的菌液稀释至0.01×10⁰。

步骤S12所述给药包括单独或联合给药，实施时根据需要评价的剂量进行给药。在本发明中，将模型大鼠随机分为对照组和联合用药组，对照组灌胃给予阿奇霉素10mg·(kg·d)^-1，联合用药组给予10mg·(kg·d)^-1的阿奇霉素2小时后灌胃妇科千金片1.66g·(kg·d)^-1，每日1次，连续7天。

合理的采样设计是建立可靠群体动力学模型的重要基础。本发明所述采样是选取给药后达峰时间和最低血药浓度时间，即每日给药后2h和24h为后续实验采血时间点。

所述两组动物给药后于首日给予抗生素(阿奇霉素)后2、24、26、48、50、72、74、96、98、120、122、144、146、168、170h经尾静脉采血0.3mL至含有肝素钠离心管中，37℃温育10～20min，3500r·min^-1离心10min，分离血浆于-80℃保存备用。

本发明具有以下有益效果：

现有技术中，鲜见中药单味药及复方的多次给药药动学相关研究。本发明以临床长周期多次给药用药方案为依据，以相应疾病动物模型为研究对象，建立了一种操作简便、科学可靠的中西药物联合应用生物利用度评价方法。

本发明建立了妇科千金片对阿奇霉素在慢性盆腔炎大鼠体内多次给药药物动力学评价方法，可以可靠地用于评价二者联合用药的合理性。利用本发明评价方法可成功获得妇科千金片对阿奇霉素在慢性盆腔炎大鼠体内的药动学规律，为二者临床合理应用提供科学依据，并对后续相关研究提供参考。

附图说明

图1多次给药后反向高斯模型拟合单独及联合使用妇科千金片大鼠阿奇霉素血药浓度原理动力学框图。

图2对照组和联合用药组实测及组内平均浓度的拟合曲线。

图3全体样本的拟合优度。

图4空白基质SIM总离子流图。

图5标准物质+空白基质SIM总离子流图。

图6典型低浓度样品SIM总离子流图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例进一步说明本发明。下述实施例仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。除非特别说明，下述实施例中使用的试剂为常规市购或商业途径获得的试剂，除非特别说明，下述实施例中使用的方法和设备为本领域常规使用的方法和设备。

实施例1

1.试剂和材料

1.1药物与试剂

妇科千金片(由株洲千金药业股份有限公司提供)；希舒美阿奇霉素片(Zithromax，辉瑞制药有限公司)；乙腈(色谱纯，美国Fisher公司)；水为屈臣氏蒸馏水；阿奇霉素、罗红霉素标准品，均购自中国食品药品检定研究院；金黄色葡萄球菌(ATCC25923)，大肠埃希菌(ATCC25922)购买于中国国家菌种库，M-H(B)培养基(OXOID公司)；生理盐水(四川科伦药液股份有限公司)。

1.2仪器

岛津HPLC-MS 2020(ESI接口)，色谱工作站(Lab solution 5.5)(日本岛津)；QL-901涡旋混合仪(江苏海门市麒麟医用仪器厂)；H2050R台式高速冷冻离心机(湘仪离心机仪器有限公司)；CP-124S电子天平(北京赛多利斯有限公司)；FIS13-990-16超低温冰箱(Thermo Scientific)。

1.3动物

雌性SD大鼠，SPF级，体重(220±20)g，由四川省医学科学院实验动物研究所提供，动物合格证编号：SCXK(川)2008-24。

2方法

2.1慢性盆腔炎模型的建立

参照文献方法袁建菱等《妇科千金片对急性盆腔炎模型大鼠血清IgA、IgG、IgM的影响》，采用20％乌拉坦0.5mL·100g^-1腹腔注射麻醉大鼠，10mL注射器针头(磨去针头尖)于阴道底部的子宫颈分叉处小心进入一侧宫腔内，针头在宫腔内来回抽拉2次以机械性损伤子宫内膜组织，1mL注射器针头抽取混合菌液(混合菌液由金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌，经生化鉴定后，用M-H(B)培养基37℃培养，取对数生长期，金色葡萄球菌和大肠埃希菌按1:1混合，稀释，备用)，朝该侧卵巢方向推注菌液0.1mL，同样操作步骤将0.1mL菌液注入另一侧子宫，注射完毕后，倒置大鼠5min，以防菌液漏出。

2.2分组及给药

雌性SD大鼠20只，随机分为对照组和联合用药组。两组动物灌胃等剂量阿奇霉素10mg·(kg·d)^-1，联合用药组在给予阿奇霉素2h后灌胃妇科千金片生理盐水混悬液1.66g·(kg·d)^-1，每日1次，连续7天。

2.3采血时间点的设计

选取3只SD大鼠，单剂量灌胃阿奇霉素10mg·kg^-1进行预实验，结果表明单次给药后血药浓度达峰时间约为2h，观测周期内最低血药浓度时间约为24h。同时考虑到阿奇霉素临床用药为每日口服给药一次，结合其药动学特征和临床给药方案，选取给药后达峰时间和最低血药浓度时间，即每日给药后2h和24h为后续实验采血时间点。

2.4血浆样品采集

两组动物按2.2项下给药方案，于首日给予阿奇霉素后2、24、26、48、50、72、74、96、98、120、122、144、146、168、170h经尾静脉采血0.3mL至含有肝素钠离心管中，37℃温育10-20min，3500r·min^-1离心10min，分离血浆于-80℃保存待测。

2.5标准品溶液的制备

内标罗红霉素储备液的配制：精密称取罗红霉素标准品，置10mL量瓶中，加稀释液(乙腈/水＝65:35，v/v)制备成质量浓度为1.0mg·mL^-1的内标储备液。同法制备阿奇霉素标准品储备液，以上储备液均于4℃冰箱贮藏备用。对照品工作液临用时稀释至所需浓度即得。

2.6血浆样品预处理

取血浆50μL，加入10mol·L^-1NH₄OH溶液和160ng·mL^-1内标罗红霉素甲醇溶液各10μL，涡旋30s混匀，加入2mL乙醚，涡旋1min，13300r·min^-1离心5min，吸取上层有机相，30℃氮气流下吹干，残留物加入150μL流动相溶解，涡旋1min，14000r·min^-1离心10min，取上清液30μL按2.6项下色谱条件测定。

2.7血浆中阿奇霉素测定条件

具体条件如下，色谱柱为Agilent poroshell 120EC-C18(2.7μm，4.6×100mm)；流动相：乙腈/10mmol·L^-1醋酸铵水溶液＝65:35(v/v)；柱温40℃；流速为0.2mL·min^-1；进样量5μL。质谱检测条件：电喷雾电离化(ESI)方式，采用选择性正离子检测(SIM)，阿奇霉素SIM离子为[M+H]⁺，m/z 749.35，内标罗红霉素SIM离子为[M+H]⁺，m/z 837.35，电离源电压4.5kV，喷雾气(N₂)的流速为1.5L·min^-1，脱溶剂温度为250℃，检测器电压1.5kv。

2.8数据分析

药动学模型采用ADAPT 5.1分别进行一、二、三室房室模型和反向高斯模型拟合。采用SPSS statistic对数据进行统计分析，药动学参数的对比分析采用t检验。

3结果

3.1血浆中阿奇霉素测试方法学的建立

采用HPLC-MS测定阿奇霉素血浆药物浓度，具有较高的精密度及准确度，检测定量限为5ng·mL^-1。血浆阿奇霉素在5～2000ng·mL^-1范围内线性关系良好，采用乙醚萃取法法进行血浆样品预处理方法回收率为97.5％～108.6％，该方法稳定可行，符合生物样本检测的各项要求。

3.2慢性盆腔炎模型的评价

建立慢性盆腔炎动物模型，分别于造模后24h，72h，96h后阴道刮片，进行菌落培养。菌落计数结果显示，两组大鼠所感染菌量符合实验要求。解剖后模型大鼠子宫直观可见明显炎性充血肿胀，多数宫腔迂曲扩张，末端膨大，结果表明本研究所采用模型制备方法可成功复制大鼠慢性盆腔炎模型。

3.3药动学模型拟合

阿奇霉素药动学模型分别采用经典的一、二、三房室模型和反向高斯模型进行拟合，以残差图、最小化信息量AIC、参数估计值变异率为标准比较各模型拟合优度。结果表明多数个体动力学模型以反向高斯模型为优，模型拟合优度见图3，最终全体样本均采用该模型分析。其中，图1为动力学框图，图2为对照组和联合用药组实测及组内平均浓度的拟合曲线，图3为全体样本的拟合优度。

微分方程为：

3.4联合用药对阿奇霉素药动学及生物利用度的影响

与对照组相比，联合用药组妇科千金片对阿奇霉素的药动学参数CL_t、CL_d、MIT和F均无显著影响(P>0.05)，主要药动学参数见表1所示，药时曲线见图2。

表1对照组与联合用药组多次给药后阿奇霉素主要药动学参数(

n＝10)

本发明采用多种模型对阿奇霉素的药动学参数进行模型拟合，研究结果表明结合科学的建模方法和检测技术方案基础上，采用反向高斯模型拟合获得最优的评价效果，能定量描述阿奇霉素药物的溶解吸收过程，比经典房室模型更符合阿奇霉素的实际体内过程。同时模型的拟合优度图也进一步印证该模型能较好的描述阿奇霉素在慢性盆腔炎模型大鼠体内的药代动力学过程。

本发明人从理论上分析，阿奇霉素为氮杂环内脂化合物，该结构可阻碍其内部形成半酮缩醛，从而在酸性环境中具有良好的稳定性，因此其吸收受胃肠道pH影响较小。妇科千金片主要抗炎作用机制是通过提高机体免疫力，减轻由炎症细胞介导的炎症反应。有研究表明穿心莲提取物和穿心莲内酯均会显著影响人类细胞色素P450酶(CYP2C9，CYP2D6，CYP3A4)的活性，可能导致某些药物代谢减慢，作用时间延长，进而提高与之合用药物的生物利用度。而阿奇霉素体内代谢主要通过O-去甲基、N-去甲基、去甲后去红霉糖和羟基化4种方式，既不被CYP3A4代谢，也不是它的抑制剂，因此代谢不受细胞色素P450酶系的影响。故在与妇科千金片合用时，不易受其化学成分的影响，生物利用度不发生明显改变。在理论分析的基础上采用本发明方法研究结果显示，对照组多次给药后阿奇霉素血药浓度逐渐增加，与妇科千金片联合应用，后期生物利用度略有降低，但主要药动学参数无显著差异(p>0.05)，提示长时程给予慢性盆腔炎模型大鼠妇科千金片对阿奇霉素的药动学过程无明显影响。试验评价结果与理论分析十分吻合。

本发明以临床长周期多次给药用药方案为依据，以相应疾病动物模型为研究对象，建立了一种操作简便、科学可靠的中西药物联合应用生物利用度评价方法。并以妇科千金片对阿奇霉素在慢性盆腔炎大鼠体内的药动学为例进行探讨。结果表明妇科千金片长周期多次给药对阿奇霉素在慢性盆腔炎大鼠体内的主要药动学参数及生物利用度无明显影响，结合相关药效学报道^[6]，提示临床妇科千金片可与阿奇霉素联合应用于慢性盆腔炎等疾病的治疗，该结果可为二者临床合理应用提供一定的科学依据，并对后续相关研究具有参考价值。

实施例2建模方法的优化试验

本实施例在大量的试验中选取以下关于建模的典型试验进行说明：

(1)材料

动物：雌性SPF级SD大鼠，220g±20g，由四川省医学科学院实验动物研究所购得，实验动物生产许可证号：SCXK(川)2008-24。24只。

实验菌种：金黄色葡萄球菌(ATCC25923)，大肠埃希菌(ATCC25922)购买于中国国家菌种库。受试菌株冻干粉用无菌M-H(B)培养基混悬后均匀铺于无菌M-H(A)平板表面，35℃孵育过夜复活，18h后平板表面生长出菌苔，选取其中长势良好的单一菌团，重新涂抹于M-H(A)斜面，相同条件下孵育18h，密封，4℃条件下冷藏保存；试验前一天取斜面菌涂抹于M-H(A)平板，35℃孵育过夜，即可使用。所有操作均在超净工作台完成。

药品与试剂：M-H(A)培养基(OXOID公司，生产批号：CM0337A)；M-H(B)培养基(OXOID公司，生产批号：CM0405B)；乌拉坦溶液(20％)；生理盐水(四川科伦药液股份有限公司，生产批号：M12012004)；其他试剂和耗材均由成都雅荣生化设备经营部购买提供。

仪器：电热恒温培养箱(上海一恒科技有限公司，BPH-9162)；优普系列超纯水机(成都超纯科技有限公司，UpK-1-10T)；微量加样器(EppendorfResearch，10、100、100uL)；空气浴振荡器(哈尔滨市东联电子技术开发，HZQ-C)；自动电热压力蒸汽灭菌锅(上海申安医疗器械厂，LDZX-40BI)；全波长多功能读数议(美国Thermo)；菌落计数仪。

(2)方法

方法一：高浓度菌液制备

挑3～4个单菌落于40毫升的M-H(B)培养基中。受试菌隔夜增菌培养16小时(37℃，水浴摇床振摇16小时)，次日取出原菌液用全波长多功能读数议测OD值(细菌生长饱和期)；取20ml，分装于离心管中，每管2ml，离心10000～15000rpm/min，10分钟，弃取上清液之中的M-H(B)，用2ml生理盐水混匀后，再离心15000rpm/min，10分钟，弃取上清液中的生理盐水，收集细菌细胞菌体2ml。将相同方法培养的金色葡萄球菌和大肠埃希菌按1：1混合即获得4ml混合菌液。将该菌液为100菌液浓度，用生理盐水进行10倍稀释，稀释至0.1×10⁰，0.01×10⁰，备用(共3个剂量)。

方法二：低浓度菌液制备

挑单一菌落(包括金色葡萄球菌和大肠埃希菌)于2毫升的生理盐水中，分别配制成为0.5麦氏浓度(约1×10⁸CFU·mL^-1)细菌混悬液，将金色葡萄球菌和大肠埃希菌混悬液混合，即得到混合菌液4ml。将该菌液设置成为10A菌液浓度，用生理盐水进行对倍稀释，稀释至0.5×10^A，0.25×10^A，备用(共3个剂量)。

(3)慢性盆腔炎模型制备

大鼠称重标记，腹部常规消毒，20％乌拉坦0.5mL/100g腹腔注射麻醉，用1mL注射器抽取预先制备的混合菌液，左手持鼠尾提起大鼠，用10mL注射器磨去针头尖，于阴道底部的子宫颈分叉处小心进入一侧宫腔内，针头在宫腔内来回抽拉2次以机械性损伤子宫内膜组织，然后朝卵巢方向推注菌液0.1mL，同样操作步骤将0.1mL菌液注入另一侧子宫，注射完毕后，倒置大鼠5min，以防菌液漏出。

分别于24h，48h观察记录各组大鼠感染情况，以大鼠无死亡，于造模后24h，72h，96h后分别阴道刮片，进行菌落培养，选择菌落计数≥30，≤100的感染菌量作为最佳感染菌量。将该菌量作为、为体内感染的菌量。受试大鼠感染菌量为表2所示：

表2

所有实验动物于造模后24h、72h和96h，麻醉，常规消毒腹部，用无菌棉签伸入宫口，来回抽拉2次后，将棉签放入含2ml生理盐水的试管中，获得含测试品混悬液，取出棉签，再用新的无菌棉签充分蘸取混合液均匀涂抹于无菌M-H(A)平板表面，35℃孵育过夜，18h后进行菌落计数。240h牺牲动物，观察子宫感染情况。

(4)结果

各组典型鼠感染菌落计数，结果如表3所示：

表3受试大鼠感染菌量

菌落计数结果显示，3组鼠所感染菌量符合实验要求。同时，解剖后可见子宫等直观可见炎性充血与炎性水肿(基于伦理学及阅读者感观考虑暂删除相关照片)。

(5)结论：方法(一)为受试菌最佳培养方式；0.01×10°，为最佳感染菌量；实验方法可以复制大鼠盆腔细菌慢性感染模型。

实施例3检测条件的优化试验

(1)HPLC-ECD

仪器：LC-30AUPLC(日本岛津)，AntecDecadeIII电化学检测器(荷兰安泰克)，色谱工作站(labsolution5.5)；QL-901涡旋混合仪(上海沪西分析仪器有限公司)；MTN-2800W型氮吹仪(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)；超低温冰箱(FIS13-990-16THERMOSCIENTIFIC)；H2050R台式冷冻离心机(湘仪离心机仪器有限公司)；电子天平(北京赛多利斯有限公司)等。

动物：SPF级SD大鼠，220g±20g，由四川省医学科学院实验动物研究所购得，实验动物生产许可证号：SCXK(川)2008-24。

药品及试剂：希舒美阿奇霉素片(Zithromax，辉瑞制药有限公司)；乙腈、甲醇(色谱纯FisherScientific)；甲酸(色谱纯成都市科龙化工试剂厂)；水为屈臣氏蒸馏水。阿奇霉素、罗红霉素标准品均购自中国食品药品生物制品检定所。

给药及取样：大鼠灌胃给予AZM CMC-Na混悬溶液(60mg/Kg)，分别于给药15min、30min、1h、1.5h、2h、4h、8h、12h、24h取血0.2ml于肝素化离心管中，37℃水浴10～20分钟后，3500r/min离心10min，分离上清于-80℃保存。

液液萃取：取血浆50μL，加入10M NH4OH溶液10μL，加入内标罗红霉素甲醇溶液(160ng/ml)10μL。加入2ml二乙醚，涡旋1min，静置3min，13300r/min离心5min，吸取上层有机相，30℃空气流下吹干，残留物加入150μL流动相溶解，涡旋1min，14000r/min离心3min，取30μL进行分析。

色谱条件：色谱柱Aglient poroshell120EC-C18(2.7μm×4.6×100mm)695975-902，在线滤器：SSI35-0149；流动相：乙腈-pH7.0磷酸缓冲溶液(45∶55，V/V)；流速0.8mL/min；柱温30℃。玻碳工作电极电位+1.2V，参比电极Ag/AgCl。

(2)HPLC-ESI-MS

仪器：岛津HPLC-MS2020，包括在线真空脱气机、二元泵、自动进样器、柱温箱、紫外检测器、ESI、色谱工作站(labsolution5.5)；其余同HPLC-ECD方法下仪器。

色谱条件：色谱柱Aglientporoshell120EC-C18(2.7um×4.6×100mm)695975-902，在线滤器：SSI35-0149；流动相：乙腈-10mMpH5.2醋酸铵(65:35)，流速为0.2mL/min，进样量5μL。

质谱检测条件：电喷雾电离源(ESI)，选择性正离子检测(SIM)，阿奇霉素m/z749.5[M+H]⁺和内标罗红霉素m/z 837.5[M+H]⁺，电离源电压4.5kV，喷雾气(N₂)的流速为1.5L/min，脱溶剂温度为250℃，检测器电压1.5kv。

典型离子流图：AZM约6min，IS约8.4min。

试验结果见图4至图6所示。由图4至图6可见，两种方法以ESI检测更为灵敏，定量限可达15ng/ml。但在以稳态药浓为主要检测对象情形下，ECD可基本满足定量需求。

Claims (7)

1.一种妇科千金片与抗生素阿奇霉素联合应用中生物利用度的评价方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.检测血浆样本中待测药物的浓度；

S2.采用ADAPT 5.1软件反向高斯模型计算药动学参数，SPSS软件对各组参数进行统计学分析，完成评价；

其中步骤S1所述血浆样本为经长周期多次给药的方法单独给予阿奇霉素或联合给予妇科千金片与阿奇霉素后的血浆样本，所述长周期多次给药的方法为每日1次，连续7天；所述待测药物的浓度为阿奇霉素的浓度；

步骤S1所述检测血浆样本中待测药物的浓度的方法为HPLC-ECD方法或HPLC-ESI-MS方法；

所述HPLC-ECD法的检测条件为：

色谱柱为Agilent poroshell 120 EC-C18，2.7μm，4.6×100mm，695975-902；在线滤器：SSI35-049；流动相：乙腈-pH7.0磷酸缓冲溶液，V:V＝45:55；流速为0.8mL·min^-1；柱温30℃；玻碳工作电极电位+1.2V，参比电极Ag/AgCl；

所述HPLC-ESI-MS方法的检测条件为：

色谱柱为Agilent poroshell 120 EC-C18，2.7μm，4.6×100mm；流动相：乙腈/10mmol·L^-1醋酸铵水溶液＝65:35(v/v)；柱温40℃；流速为0.2mL·min^-1；进样量5μL；质谱检测条件：电喷雾电离化(ESI)方式，采用选择性正离子检测(SIM)，阿奇霉素SIM离子为[M+H]⁺，m/z 749.35，内标罗红霉素SIM离子为[M+H]⁺，m/z 837.35，电离源电压4.5kV，喷雾气N₂的流速为1.5L·min^-1，脱溶剂温度为250℃，检测器电压1.5kv；

所述反向高斯模型的微分方程为：

其中，V_c：终端清除相中的表观分布容积；V_p：周边室表观分布容积；CL_t：血浆药物总清除率；CL_d：分布消除速率；MIT：平均输入时间；F：生物利用度；D:口服剂量；C：血药浓度；V₁：中央室表观分布容积；t：时间；Ka：吸收速率常数；X₁：中央室的药量；X₂：周边室的药量。

2.根据权利要求1所述妇科千金片与抗生素联合应用中生物利用度的评价方法，其特征在于，所述检测血浆样本中待测药物的浓度的方法为HPLC-ESI-MS方法。

3.根据权利要求1所述妇科千金片与抗生素联合应用中生物利用度的评价方法，其特征在于，所述单独给予抗生素药物的剂量是阿奇霉素10mg·(kg·d)^-1，每日1次，连续7天。

4.根据权利要求1所述妇科千金片与抗生素联合应用中生物利用度的评价方法，其特征在于，所述联合给予妇科千金片与抗生素药物的剂量是阿奇霉素10mg·(kg·d)^-1，给予阿奇霉素2小时后给予妇科千金片1.66g·(kg·d)^-1，每日1次，连续7天。

5.根据权利要求1所述妇科千金片与抗生素联合应用中生物利用度的评价方法，其特征在于，所述血浆样本的采集点是每日给药后2h和24h。

6.根据权利要求1所述妇科千金片与抗生素联合应用中生物利用度的评价方法，其特征在于，所述血浆样本在检测之前先进行预处理，所述预处理方法为乙醚萃取法。

7.根据权利要求6所述妇科千金片与抗生素联合应用中生物利用度的评价方法，其特征在于，所述乙醚萃取法是取血浆样本50μL，加入10mol·L^-1 NH₄OH溶液和160ng·mL^-1内标罗红霉素甲醇溶液各10μL，涡旋30s混匀，加入2mL乙醚，涡旋1min，13300r·min^-1离心5min，吸取上层有机相，30℃氮气流下吹干，残留物加入150μL流动相溶解，涡旋1min，14000r·min^-1离心10min，取上清液30μL进行测定。

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