CN114858953A - 一种动物源食品中红霉素及降解产物的检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种动物源食品中红霉素及降解产物的检测试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种动物源食品中红霉素及降解产物的检测试剂盒及检测方法，属于食品检测方法技术领域。本发明所述的动物源食品中红霉素及降解产物的检测试剂盒包括溶剂1乙腈、溶剂2水、溶剂3正己烷、盐1无水硫酸镁、盐2氯化钠；之后先采用试剂盒(正己烷‑乙腈‑盐‑水萃取分离法)对动物源中红霉素及降解产物进行快速提取，再采用超高液相色谱质谱联用仪(Q Exactive HF‑X)对待测样品中目标物含量进行检测分析，通过同位素内标法和外标法(标准曲线)同时定量目标物。本发明可以实现对动物源食品中红霉素及其降解产物的快速提取和检测，能实现检出限为0.5‑1ng/mL，定量限为1‑3ng/mL。

Description

一种动物源食品中红霉素及降解产物的检测试剂盒及检测 方法
技术领域
本发明涉及一种动物源食品中红霉素及降解产物的检测试剂盒及检测方法，属于食品检测方法技术领域。
背景技术
随着生活水平的提高，人们对鱼、肉、蛋、奶等营养必需品的需求量增加，养殖业日益兴起。由于高密度和粗放的养殖方式，使种内和种间细菌性感染疾病频发，为了解决这一问题，红霉素的使用首当其冲。养殖人员通过在饲料添加红霉素、在水产品生活的海水中添加红霉素或向畜禽类动物直接注射红霉素等方式达到抗菌的效果。但红霉素不易代谢易在活体内残留，若长期食用(摄入量＞每日0-0.7μg/kg体重)含红霉素的食物会产生过敏、腹泻、免疫力降低等症状。
国家农业部规定红霉素在动物性食品中允许检出的最大限量为200μg/kg，但红霉素对热及酸性条件敏感，易降解成其他有害产物，根据目前研究可知红霉素的主要降解产物有红霉素A烯醇醚、脱水红霉素A和N-去甲基红霉素A，这些物质依然有引起人类疾病(腹泻等)和产生耐药性的风险，所以对动物源食品中红霉素及降解产物的含量检测尤为重要，对动物源食品中红霉素及其降解产物的风险评估及食品安全有重要意义，同时为企业原料的选取和食品原料药物残留的监管提供理论支持，促进食品行业的健康发展。
但是，国标也没有明确的检测方法用于红霉素及其降解产物的检测，因此建立动物源食品中红霉素及其降解产物的检测方法是非常必要的。
发明内容
[技术问题]
目前，对于食品中红霉素及其降解产物的前处理方法主要为固相萃取法，该方法操作较复杂，耗时长，不利于大批量样品的处理；检测方法主要为色谱法或液相色谱质谱联用法，但都有灵敏度较低，精准度较差的缺点。因此，建立一种快速、高效的红霉素及其降解产物的检测方法是非常重要的。
[技术方案]
为了解决上述问题，本发明采用正己烷-乙腈-盐-水萃取分离法，对动物源中红霉素及降解产物进行快速提取，实现了高效、便捷的前处理过程，为动物源食品中红霉素及其降解产物的研究提供重要工具。
本发明的第一个目的是提供一种动物源食品中红霉素及降解产物的检测试剂盒，所述的试剂盒中包括溶剂1乙腈、溶剂2水、溶剂3正己烷、盐1无水硫酸镁、盐2氯化钠。
本发明的第二个目的是提供一种基于本发明所述的试剂盒来检测动物源食品中红霉素及降解产物的方法，包括如下步骤：
(1)样品预处理：
配制浓度为1-10μg/mL的内标工作液；
在3-5g待测样品中加入50-100μL内标溶液和10-25mL溶剂1(乙腈)和溶剂2(水)的混合溶液，匀浆，得到均匀分散的食品基质；之后冰水浴超声，加入5-10mL溶剂3(正己烷)和4-8g盐1(无水硫酸镁)及盐2(氯化钠)的混合物，涡旋震荡，离心，将中间层溶液全部取出，干燥；之后复溶，离心取上清液，得到预处理之后的样品；
(2)检测：
采用Acquity UPLC CSH-C18 column(1.7μm，2.1×100mm)对预处理之后的样品中的红霉素及其降解产物进行分离、富集，通过超高液相色谱高分辨率质谱联用仪测定，得到红霉素及其降解产物峰面积和内标峰面积；将红霉素及其降解产物峰面积和内标峰面积的比值代入标准曲线，得到待测样品中红霉素及其降解产物的含量。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)所述的内标工作液采用13C,d3-红霉素作为内标，50％(v/v)乙腈-水溶液作为溶剂。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)所述的匀浆前加入的溶剂1(乙腈)和溶剂2(水)的混合溶液中溶剂1和溶剂2的体积比为1：1。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)所述的匀浆条件是0-4℃下，以6000-10000rpm匀浆30-60s。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)所述盐1(无水硫酸镁)和盐2(氯化钠)的混合物中盐1与盐2的比例为4:1-10:1(w/w)。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)所述的涡旋震荡的条件为：4000-6000rpm时间为2-3min。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)所述震荡后离心是在0-8℃下以2000-4000g离心10-15min。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)所述的干燥是用氮气干燥至有机试剂全部挥干。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)所述的复溶采用的溶剂为溶剂1(乙腈)和溶剂2(水)的混合溶液，其中溶剂1与溶剂2的体积比为1-4:1。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)所述复溶之后的离心为0-8℃下以15000-25000g离心10-15min。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)所述超高液相色谱的检测条件如下：
进样量：1μL；
采集模式：(ESI+)Full MS+PRM；
流动相：A相为0.1％甲酸-水(v/v)溶液；B相为乙腈溶液；
洗脱流速：0.4mL/min；
柱温：35-40℃
洗脱梯度：0-0.1min，80％流动相B；0.1-4min，85-5％流动相B；4-8min，5％流动相B；8-9min，5-80％流动相B；9-12min，80％流动相B。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)所述质谱的检测条件如下：
采用电喷雾电离源(ESI)；正离子模式下的Full MS+PRM模式进行检测；ESI源参数设置为：鞘气流速：40psi；
辅助气体流量：10arb；
辅助燃气加热器温度：320℃
吹扫气流量：2psi；
喷雾电压：+4.0kV；
毛细管温度：320℃。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)所述红霉素及其降解产物包括红霉素(Erythromycin)、红霉素A烯醇醚(Erythromycin A enol ether)、脱水红霉素A(Dehydrated Erythromycin A)和N-去甲基红霉素A(N-Demethylerythromycin A)。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)所述标准曲线的构建方法为：
选用红霉素(Erythromycin)、红霉素A烯醇醚(Erythromycin A enol ether)、脱水红霉素A(Dehydrated Erythromycin A)和N-去甲基红霉素A(N-DemethylerythromycinA)作为标准品，以13C,d3-红霉素(13C,d3-Erythromycin)作为内标，采用50％(v/v)乙腈水溶液作为溶剂，分别配制成0.1，0.5，1，5，10，50，100，200，500ng/mL浓度的标准品工作液，所述每个浓度标准品溶液中内标终浓度为50-100ng/mL；
将得到的不同浓度的混合标准品溶液采用Acquity UPLC CSH-C18 column(1.7μm，2.1×100mm)色谱柱，通过超高液相色谱高分辨率质谱联用仪测定；其中，超高液相色谱的检测条件如下：
进样量：1μL；
采集模式：(ESI+)Full MS+PRM；
流动相：A相为0.1％甲酸-水(v/v)溶液；B相为乙腈溶液；
洗脱流速：0.4mL/min；
柱温：35-40℃
洗脱梯度：0-0.1min，80％流动相B；0.1-4min，85-5％流动相B；4-8min，5％流动相B；8-9min，5-80％流动相B；9-12min，80％流动相B。
质谱的检测条件如下：
采用电喷雾电离源(ESI)；正离子模式下的Full MS+PRM模式进行检测；ESI源参数设置为：
鞘气流速：40psi；
辅助气体流量：10arb；
辅助燃气加热器温度：320℃
吹扫气流量：2psi；
喷雾电压：+4.0kV；
毛细管温度：320℃；
以红霉素及其降解产物标准样品峰面积与内标的峰面积的比值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标得到标准曲线。
在本发明的一种实施方案中，步骤(5)所述标准曲线为Y＝aX+b，Y＝目标物峰面积/内标峰面积，X＝目标物含量；其中红霉素A的标准曲线为：y＝0.0187266+0.00988151x，线性范围为1-500ng/mL，检出限为3ng/mL，定量限为5ng/mL，相关系数为0.9985；去甲基红霉素A的标准曲线为：y＝-0.00113796+0.00192734x，线性范围为1-500ng/mL，检出限为3ng/mL，定量限为5ng/mL，相关系数为0.9929；脱水红霉素A的标准曲线为：y＝-0.0047071+0.0019862x，线性范围为1-500ng/mL，检出限为3ng/mL，定量限为5ng/mL，相关系数为0.9918；红霉素A烯醇醚的标准曲线为：y＝-0.0161312+0.017877x，线性范围为0.1-500ng/mL，检出限为0.5ng/mL，定量限为1ng/mL，相关系数为0.9978。
本发明的第三个目的是本发明所述的方法在食品检测领域的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述的食品包括畜禽、水产、农产品。
[有益效果]
(1)本发明的试剂盒为待测样品的前处理提供便利，该处理方法为三相分离萃取法，根据红霉素、红霉素A烯醇醚、脱水红霉素A和N-去甲基红霉素A的非极性特点选择溶剂1纯乙腈，溶剂2纯水溶液作为萃取溶剂，红霉素及其降解产物通过疏水作用与蛋白质紧密结合，乙腈能使动物源食品中的蛋白质缓慢而彻底的变性，分离与蛋白质结合的目标物。水还能溶解基质中的水溶性蛋白和小分子物质，通过加入盐1NaCl和盐2无水MgSO4调节水相饱和度、脱水，使水相和乙腈相达到分层的效果。溶剂3正己烷的加入可以在保留目标物的同时去除大量脂质，避免基质效应过强影响检测信号，还能保护仪器不被污染。该前处理方法操作简单、成本低、效果好，尤其适用于高脂肪、高蛋白动物源食品的检测大批量样品的处理。
(2)本发明采用Acquity UPLC CSH-C18反相色谱柱，该色谱柱具有出的分离度，可显著缩短分析时间。同时与超高效液相色谱高分辨率质谱联用仪配合使用，可实现高灵敏度和高分辨率的效果。
(3)本发明的质谱检测模式为：(ESI+)Full MS+PRM，Full MS采集模式可以将检测范围内的母离子进行扫描，PRM模式可将杂物列表中的已定义离子通过四极杆-八级杆-C阱冷却捕集输送至高能碰撞池，进行二次碎裂，碎裂后的离子再次通过C阱转移至轨道阱质量分析器中，通过离子震荡频率获得比传统液相色谱质谱联用仪更精确的质荷比。此外，质谱图中的能获得更多的子离子信息，为目标物的定性提供了强有力的证据。
(4)本发明基于超高效液相色谱高分辨率质谱(Q Exactive HF-X)联用仪建立一种动物源食品中红霉素及其降解产物快速检测法，本研究对动食品安全和人体健康有重要意义，为食品监督管理和风险评估提供了一种便捷高效的方法。
(5)本发明检测方法用于动物源食品中红霉素及降解产物的检测，能实现检出限为0.5-1ng/mL，定量限为1-3ng/mL。
附图说明
图1是实施例1得到的红霉素标准品色谱图。
图2是实施例1得到的脱水红霉素A标准品色谱图。
图3是实施例1得到的红霉素A烯醇醚标准品色谱图。
图4是实施例1得到的N-去甲基红霉素A标准品色谱图。
图5是实施例1得到的13C,d3-红霉素标准品色谱图。
图6是实施例1中红霉素标准品质谱图。
图7是实施例1中脱水红霉素A标准品质谱图。
图8是实施例1中红霉素A烯醇醚标准品质谱图。
图9是实施例1中N-去甲基红霉素A标准品质谱图。
图10是实施例1中13C,d3-红霉素标准品质谱图。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解实施例是为了更好地解释本发明，不用于限制本发明。
实施例1标准曲线的构建
(1)同位素内标溶液配制：
采用13C,d3-红霉素作为内标，以50％(v/v)乙腈-水溶液作为溶剂配制成终浓度为1μg/mL内标溶液；
(2)标准样品溶液配制：
分别红霉素(Erythromycin)、红霉素A烯醇醚(Erythromycin A enol ether)、脱水红霉素A(Dehydrated Erythromycin A)和N-去甲基红霉素A(N-DemethylerythromycinA)作为标准品，用50％(v/v)乙腈-水溶液稀释至1mg/mL，作为标准样品工作液备用。
(3)待测标准溶液配制：
将各标准品工作液配制成0.1，0.5，1，5，10，50，100，200和500ng/mL九个水平的混合标准品工作液，内标在各混合标准品中的浓度为50ng/mL；
(4)检测条件：
将得到的不同浓度的标准品工作液采用Acquity UPLC CSH-C18 column(1.7μm，2.1×100mm)色谱柱，通过超高液相色谱高分辨率质谱联用仪测定；其中超高液相色谱的检测条件如下：
进样量：1μL；
采集模式：(ESI+)Full MS+PRM；
流动相：A相为0.1％甲酸-水(v/v)溶液；B相为乙腈溶液；
洗脱流速：0.4mL/min；
柱温：35-40℃
洗脱梯度：0-0.1min，80％流动相B；0.1-4min，85-5％流动相B；4-8min，5％流动相B；8-9min，5-80％流动相B；9-12min，80％流动相B。
质谱的检测条件如下：
采用电喷雾电离源(ESI)；正离子模式下的Full MS+PRM模式进行检测；ESI源参数设置为：
鞘气流速：40psi；
辅助气体流量：10arb；
辅助燃气加热器温度：320℃
吹扫气流量：2psi；
喷雾电压：+4.0kV；
毛细管温度：320℃。
(5)构建标准曲线：
以红霉素及其降解产物标准样品的峰面积与内标的峰面积的比值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标得到标准曲线，具体情况如表1所示：
表1保留时间及标准曲线方程
Figure BDA0003653297080000071
所测得标准品色谱图为图1-图4，质谱图为图6-图9；从图1-4和图6-9可以看出：各物质保留时间稳定，峰形良好；通过线性回归分析可知，4种物质在各浓度范围内线性相关系良好，相关系数≥0.9918；检出限为0.5-1ng/mL，定量限为1-3ng/mL。
实施例2回收率和精密度测定
(1)同位素内标溶液配制：
采用13C,d3-红霉素作为内标，以50％(v/v)乙腈-水溶液作为溶剂配制成终浓度为1μg/mL内标溶液；
(2)标准溶液配制：
采用红霉素(Erythromycin)、红霉素A烯醇醚(Erythromycin A enol ether)、脱水红霉素A(Dehydrated Erythromycin A)和N-去甲基红霉素A(N-DemethylerythromycinA)作为标准品，分别用50％(v/v)乙腈-水溶液稀释至1mg/mL，作为标准样品工作液备用。
(3)样品预处理：
称取3g大菱鲆鱼肉样品，加入50μL内标溶液及超低、低、中、高浓度水平的混合标准品溶液(具体浓度见如表2所示)，再加入20mL溶剂1(乙腈)和溶剂2(水)(1:1,v/v)的混合溶液，8000rpm下匀浆30s，得到均匀分散的食品基质；冰温超声，加入5mL溶剂3(正己烷)、4g盐1(无水MgSO4)和0.5g盐2(NaCl)，6000rpm迅速涡旋震荡2min，在4℃下以3500g离心10min，将中间层溶液全部取出，用氮气干燥至有机试剂全部挥干；加入1mL溶剂1(乙腈)和溶剂2(水)(1:1,v/v)的混合溶液复溶，在4℃下以20000g离心10min，取800μL上清液，即为得到预处理之后的样品，每个样品做三次平行实验。
表2超低、低、中、高浓度水平的混合标准品溶液中的各化合物浓度(ng/mL)
Figure BDA0003653297080000081
(4)按照实施1步骤(4)对动物源食品中红霉素及其降解产物测定方法的回收率和精密度进行测试，回收率计算公式如下式(1)：
Figure BDA0003653297080000082
在超低、低、中、高四个浓度水平下对大菱鲆鱼肉样品中红霉素及其降解产物的回收率及RSD测定结果如表3所示。
表3大菱鲆鱼肉中红霉素及其降解产物回收率及RSD值
Figure BDA0003653297080000083
由表3可以看出：红霉素A在超低水平和低水平下回收率为72.21％和79.37％，去甲基红霉素A在中水平下回收率为78.54％。其余条件下，待测物回收率均在99％-130％之间，RSD≤16.48％，该方法的准确度和精密度均达到残留分析检测的要求。
实施例3
一种基于试剂盒来检测动物源食品水煮热处理后的红霉素及降解产物的方法，包括如下步骤：
(1)内标溶液配制：
采用13C,d3-红霉素作为内标，以50％(v/v)乙腈-水溶液作为溶剂，配制成终浓度为1μg/mL内标溶液；
(2)阳性样品制备：
取新鲜大菱鲆鱼肉与红霉素溶液混合，使每克鱼肉中红霉素含量为1000ng；
(3)样品热处理：
称取5g大菱鲆鱼肉制成鱼丸状，在100℃条件下，分别水煮3min、5min、7min、10min、15min，每组进行四次平行实验；
(4)样品预处理：
向4.0-4.4g(水煮3min、5min、7min、10min、15min鱼肉质量依次为4.4g、4.2g、4.2g、4.1g、4.0g)热处理后的大菱鲆鱼肉样品中，加入50μL内标溶液和20mL溶剂1(乙腈)和溶剂2(水)(1:1,v/v)的混合溶液，8000rpm下匀浆30s，得到均匀分散的食品基质；冰温超声，加入5mL溶剂3(正己烷)、4g盐1(无水MgSO4)和0.5g盐2(NaCl)，6000rpm迅速涡旋震荡2min，在4℃下以3500g离心10min，将中间层溶液全部取出，用氮气干燥至有机试剂全部挥干；之后加入1mL溶剂1(乙腈)和溶剂2(水)(1:1,v/v)的混合溶液复溶，在4℃下以20000g离心10min，取800μL上清液，即为得到预处理之后的样品；
(5)进行检测：
采用Acquity UPLC CSH-C18 column(2.1×100mm,1.7μm)反相色谱柱分离待测物，通过UHPLC-Q-Exactive HF-X检测(4)制备的预处理之后的样品，其中，超高液相色谱检测条件如下：
进样量：1μL；
流动相：A相为0.1％甲酸-水溶液(v/v)；B相为纯乙腈溶液；
洗脱流速：0.4mL/min；
柱温：35℃
洗洗脱梯度：0-0.1min，80％流动相B；0.1-4min，85-5％流动相B；4-8min，5％流动相B；8-9min，5-80％流动相B；9-12min，80％流动相B；
质谱的检测条件为：
采用电喷雾电离源(ESI)；正离子模式下的Full MS+PRM模式进行检测；ESI源参数设置为：
鞘气流速：40psi；
辅助气体流量：10arb；
辅助燃气加热器温度：320℃
吹扫气流量：2psi；
喷雾电压：+4.0kV；
毛细管温度：320℃。
(6)定量：
将待测样品中检测出的红霉素及其降解产物峰面积和内标峰面积的比值带入实施例1的标准曲线进行计算，得到红霉素及其降解产物的含量，如表4所示。
表4水煮热处理时红霉素及其降解产物含量(ng/g)
Figure BDA0003653297080000101
检测的准确性如表5，从表5可以看出：将含1000ng/g红霉素的鱼肉进行水煮热处理后，鱼肉中红霉素及其降解产物检出的总降解产物回收率在60.18％-76.45％，部分物质溶解在水中或进一步生成降解产物的次级衍生物。
表5水煮热处理时红霉素及其降解检测准确性
Figure BDA0003653297080000102
实施例4
一种基于试剂盒来检测动物源食品烘烤热处理后的红霉素及降解产物的方法，包括如下步骤：
(1)内标溶液配制：
采用13C,d3-红霉素作为内标，以50％(v/v)乙腈-水溶液作为溶剂，配制成终浓度为1μg/mL内标溶液；
(2)阳性样品制备：
取新鲜大菱鲆鱼肉与红霉素溶液混合，使每克鱼肉中红霉素含量为1000ng；
(3)样品热处理：
称取5g大菱鲆鱼肉制成鱼丸状，在200℃条件下，分别烘烤5min、10min、15min、20min、25min，每组进行四次平行实验；
(4)样品预处理：
向3.0-4.1g(烘烤5min、10min、15min、20min、25min鱼肉质量依次为4.1g、3.8g、3.5g、3.2g、3.0g)热处理后的大菱鲆鱼肉样品中，加入50μL内标溶液和20mL溶剂1(乙腈)和溶剂2(水)(1:1,v/v)的混合溶液，8000rpm下匀浆30s，得到均匀分散的食品基质；冰温超声，加入6mL溶剂3(正己烷)、4g盐1(无水MgSO4)和0.5g盐2(NaCl)，6000rpm迅速涡旋震荡2min，在4℃下以3500g离心10min，将中间层溶液全部取出，用氮气干燥至有机试剂全部挥干；之后加入1mL溶剂1(乙腈)和溶剂2(水)(1:1,v/v)的混合溶液复溶，在4℃下以20000g离心10min，取800μL上清液，即为得到预处理之后的样品；
(5)进行检测：
采用Acquity UPLC CSH-C18 column(2.1×100mm,1.7μm)反相色谱柱分离待测物，通过UHPLC-Q-Exactive HF-X检测(4)制备的预处理之后的样品，其中，超高液相色谱检测条件如下：
进样量：1μL；
流动相：A相为0.1％甲酸-水溶液(v/v)；B相为纯乙腈溶液；
洗脱流速：0.4mL/min；
柱温：35℃
洗洗脱梯度：0-0.1min，80％流动相B；0.1-4min，85-5％流动相B；4-8min，5％流动相B；8-9min，5-80％流动相B；9-12min，80％流动相B；
质谱的检测条件为：
采用电喷雾电离源(ESI)；正离子模式下的Full MS+PRM模式进行检测；ESI源参数设置为：
鞘气流速：40psi；
辅助气体流量：10arb；
辅助燃气加热器温度：320℃
吹扫气流量：2psi；
喷雾电压：+4.0kV；
毛细管温度：320℃。
(6)定量：
将待测样品中检测出的红霉素及其降解产物峰面积和内标峰面积的比值带入实施例1的标准曲线进行计算，得到红霉素及其降解产物的含量，如表6所示。
表6烘烤热处理时红霉素及其降解产物含量(ng/g)
Figure BDA0003653297080000121
检测准确率如表7，从表7可以看出：总降解产物回收率在72.43％-77.35％。
表7烘烤热处理时红霉素及其降解检测准确性
Figure BDA0003653297080000122
实施例5
一种基于试剂盒来检测动物源食品微波热处理后的红霉素及降解产物的方法，包括如下步骤：
(1)内标溶液配制：
采用13C,d3-红霉素作为内标，以50％(v/v)乙腈-水溶液作为溶剂，配制成终浓度为1μg/mL内标溶液；
(2)阳性样品制备：
取新鲜大菱鲆鱼肉与红霉素溶液混合，使每克鱼肉中红霉素含量为1000ng；
(3)样品热处理：
称取5g大菱鲆鱼肉制成鱼丸状，850W微波加热60s、90s、120s、150s、180s，每组进行四次平行实验；
(4)样品预处理：
向3.0-3.6g(微波加热60s、90s、120s、150s、180s鱼肉质量依次为3.6g、3.3g、3.2g、3.0g、3.0g)热处理后的大菱鲆鱼肉样品中，加入50μL内标溶液和20mL溶剂1(乙腈)和溶剂2(水)(1:1,v/v)的混合溶液，8000rpm下匀浆30s，得到均匀分散的食品基质；冰温超声，加入8mL溶剂3(正己烷)、4g(无水MgSO4)和0.5g盐2(NaCl)，6000rpm迅速涡旋震荡2min，在4℃下以3500g离心10min，将中间层溶液全部取出，用氮气干燥至有机试剂全部挥干；之后加入1mL溶剂1(乙腈)和溶剂2(水)(1:1,v/v)的混合溶液复溶，在4℃下以20000g离心10min，取800μL上清液，即为得到预处理之后的样品；
(5)进行检测：
采用Acquity UPLC CSH-C18 column(2.1×100mm,1.7μm)反相色谱柱分离待测物，通过UHPLC-Q-Exactive HF-X检测(4)制备的预处理之后的样品，其中，超高液相色谱检测条件如下：
进样量：1μL；
流动相：A相为0.1％甲酸-水溶液(v/v)；B相为纯乙腈溶液；
洗脱流速：0.4mL/min；
柱温：35℃
洗洗脱梯度：0-0.1min，80％流动相B；0.1-4min，85-5％流动相B；4-8min，5％流动相B；8-9min，5-80％流动相B；9-12min，80％流动相B；
质谱的检测条件为：
采用电喷雾电离源(ESI)；正离子模式下的Full MS+PRM模式进行检测；ESI源参数设置为：
鞘气流速：40psi；
辅助气体流量：10arb；
辅助燃气加热器温度：320℃
吹扫气流量：2psi；
喷雾电压：+4.0kV；
毛细管温度：320℃。
(6)定量：
将待测样品中检测出的红霉素及其降解产物峰面积和内标峰面积的比值带入实施例1的标准曲线进行计算，得到红霉素及其降解产物的含量，如表8所示。
表8微波热处理时红霉素及其降解产物含量(ng/g)
Figure BDA0003653297080000141
检测准确率如表9，从表9可以看出：总降解产物回收率在68.26％-76.31％。
表9微波热处理时红霉素及其降解检测准确性
Figure BDA0003653297080000142
实施例6
一种基于试剂盒来检测动物源食品油炸热处理后的红霉素及降解产物的方法，包括如下步骤：
(1)内标溶液配制：
采用13C,d3-红霉素作为内标，以50％(v/v)乙腈-水溶液作为溶剂，配制成终浓度为1μg/mL内标溶液；
(2)阳性样品制备：
取新鲜大菱鲆鱼肉与红霉素溶液混合，使每克鱼肉中红霉素含量为1000ng；
(3)样品热处理：
称取5g大菱鲆鱼肉制成鱼丸状，在175℃条件下油炸加热30s、60s、90s、120s、150s，每组进行四次平行实验；
(4)样品预处理：
向3.0-4.1g(油炸加热30s、60s、90s、120s、150s鱼肉质量依次为4.1g、3.7g、3.4g、3.1g、3.0g)热处理后的大菱鲆鱼肉样品中，加入50μL内标溶液和20mL溶剂1(乙腈)和溶剂2(水)(1:1,v/v)的混合溶液，8000rpm下匀浆30s，得到均匀分散的食品基质；冰温超声，加入10mL溶剂3(正己烷)、盐1(无水MgSO4)和0.5g盐2(NaCl)，6000rpm迅速涡旋震荡2min，在4℃下以3500g离心10min，将中间层溶液全部取出，用氮气干燥至有机试剂全部挥干；之后加入1mL溶剂1(乙腈)和溶剂2(水)(1:1,v/v)的混合溶液复溶，在4℃下以20000g离心10min，取800μL上清液，即为得到预处理之后的样品；
(5)进行检测：
采用Acquity UPLC CSH-C18 column(2.1×100mm,1.7μm)反相色谱柱分离待测物，通过UHPLC-Q-Exactive HF-X检测(4)制备的预处理之后的样品，其中，超高液相色谱检测条件如下：
进样量：1μL；
流动相：A相为0.1％甲酸-水溶液(v/v)；B相为纯乙腈溶液；
洗脱流速：0.4mL/min；
柱温：35℃
洗洗脱梯度：0-0.1min，80％流动相B；0.1-4min，85-5％流动相B；4-8min，5％流动相B；8-9min，5-80％流动相B；9-12min，80％流动相B；
质谱的检测条件为：
采用电喷雾电离源(ESI)；正离子模式下的Full MS+PRM模式进行检测；ESI源参数设置为：
鞘气流速：40psi；
辅助气体流量：10arb；
辅助燃气加热器温度：320℃
吹扫气流量：2psi；
喷雾电压：+4.0kV；
毛细管温度：320℃。
(6)定量：
将待测样品中检测出的红霉素及其降解产物峰面积和内标峰面积的比值带入实施例1的标准曲线进行计算，得到红霉素及其降解产物的含量，如表10所示。
表10油炸热处理时红霉素及其降解产物含量(ng/g)
Figure BDA0003653297080000161
检测准确率如表11，从表11可以看出：总降解产物回收率在59.62％-70.82％，部分物质可能溶解在油中。
表11油炸热处理时红霉素及其降解检测准确性
Figure BDA0003653297080000162
对比例1
(1)内标溶液配制：
采用13C,d3-红霉素作为内标，以50％(v/v)乙腈-水溶液作为溶剂配制成终浓度为1μg/mL内标溶液；
(2)标准溶液配制：
采用红霉素(Erythromycin)、红霉素A烯醇醚(Erythromycin A enol ether)、脱水红霉素A(Dehydrated Erythromycin A)和N-去甲基红霉素A(N-DemethylerythromycinA)作为标准品，分别用50％(v/v)乙腈-水溶液稀释至1mg/mL，作为标准样品工作液备用；
(3)样品预处理：
称取3g大菱鲆鱼肉样品，加入50μL内标溶液及超低、低、中、高浓度水平的混合标准品溶液(具体浓度见如表2所示)；再加入20mL乙腈和5mL正己烷，8000rpm下匀浆30s，得到均匀分散的食品基质；冰温超声，在4℃下以3500g离心10min，将乙腈层溶液全部取出，用氮气干燥至有机试剂全部挥干，加入1mL乙腈和水(1:1,v/v)的混合溶液复溶，在4℃下以20000g离心10min，取800μL上清液，即为得到预处理之后的样品；每个样品做三次平行实验；进行回收率和精密度测试。
在超低、低、中、高四个浓度水平下对大菱鲆鱼肉样品中红霉素及其降解产物的回收率及RSD测定结果如表12所示。
表12大菱鲆鱼肉中红霉素及其降解产物回收率及RSD值
Figure BDA0003653297080000171
由表12可以看出：样品预处理过程，是否使用的试剂盒，对红霉素及其降解产物测定影响较大。
对比例2
调整实施例2中乙腈为甲醇，其他条件和实施例2保持一致，进行测试。
回收率结果如下表13：
表13大菱鲆鱼肉中红霉素及其降解产物回收率及RSD值
Figure BDA0003653297080000172
如表13所示：使用甲醇萃取大菱鲆鱼肉中的红霉素及其降解产物时，甲醇相与水相分层界限不明显，红霉素A、去甲基红霉素A、脱水红霉素A、红霉素A烯醇醚的回收率明显降低。
对比例3
调整实施例2中无水MgSO4和NaCl的比例为2:1(w/w)，即加入2g无水MgSO4和1gNaCl，其他和实施例2，保持一致，进行测试。
回收率结果如下表14：
表14大菱鲆鱼肉中红霉素及其降解产物回收率及RSD值
Figure BDA0003653297080000181
如表14所示：当调整无水MgSO4和NaCl的比例为2:1时，红霉素A、去甲基红霉素A、脱水红霉素A、红霉素A烯醇醚的回收率显著降低。
对比例4
调整实施例2中NaCl为CH3COONa，其他和实施例2，保持一致，进行测试。
回收率结果如下表15：
表15大菱鲆鱼肉中红霉素及其降解产物回收率及RSD值
Figure BDA0003653297080000182
如表15所示：当调整NaCl为CH3COONa时，红霉素A、去甲基红霉素A、脱水红霉素A、红霉素A烯醇醚的回收率较低。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种动物源食品中红霉素及降解产物的检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包括溶剂1乙腈、溶剂2水、溶剂3正己烷、盐1无水硫酸镁、盐2氯化钠。
2.一种基于权利要求1所述的试剂盒来检测动物源食品中红霉素及降解产物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)样品预处理：
配制浓度为1-10μg/mL的内标工作液；
在3-5g待测样品中加入50-100μL内标溶液和10-25mL溶剂1(乙腈)和溶剂2(水)的混合溶液，匀浆，得到均匀分散的食品基质；之后冰水浴超声，加入5-10mL溶剂3(正己烷)和4-8g盐1(无水硫酸镁)及盐2(氯化钠)的混合物，涡旋震荡，离心，将中间层溶液全部取出，干燥；之后复溶，离心取上清液，得到预处理之后的样品；
(2)检测：
采用Acquity UPLC CSH-C18 column(1.7μm，2.1×100mm)对预处理之后的样品中的红霉素及其降解产物进行分离、富集，通过超高液相色谱高分辨率质谱联用仪测定，得到红霉素及其降解产物峰面积和内标峰面积；将红霉素及其降解产物峰面积和内标峰面积的比值代入标准曲线，得到待测样品中红霉素及其降解产物的含量。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的匀浆前加入的溶剂1(乙腈)和溶剂2(水)的混合溶液中溶剂1和溶剂2的体积比为1:1。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述盐1(无水硫酸镁)和盐2(氯化钠)的混合物中盐1与盐2的比例为4:1-10:1(w/w)。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述红霉素及其降解产物包括红霉素(Erythromycin)、红霉素A烯醇醚(Erythromycin A enol ether)、脱水红霉素A(Dehydrated Erythromycin A)和N-去甲基红霉素A(N-Demethylerythromycin A)。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的匀浆条件是0-4℃下，以6000-10000rpm匀浆30-60s。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的复溶采用的溶剂为溶剂1(乙腈)和溶剂2(水)的混合溶液，其中溶剂1与溶剂2)的体积比为1-4:1。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述超高液相色谱的检测条件如下：
进样量：1μL；
采集模式：(ESI+)Full MS+PRM；
流动相：A相为0.1％甲酸-水(v/v)溶液；B相为乙腈溶液；
洗脱流速：0.4mL/min；
柱温：35-40℃
洗脱梯度：0-0.1min，80％流动相B；0.1-4min，85-5％流动相B；4-8min，5％流动相B；8-9min，5-80％流动相B；9-12min，80％流动相B。
9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述质谱的检测条件如下：
采用电喷雾电离源(ESI)；正离子模式下的Full MS+PRM模式进行检测；ESI源参数设置为：鞘气流速：40psi；
辅助气体流量：10arb；
辅助燃气加热器温度：320℃
吹扫气流量：2psi；
喷雾电压：+4.0kV；
毛细管温度：320℃。
10.权利要求2-9任一项所述的方法在食品检测领域的应用。
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