CN1009766B - 测定凝集参数用的试验载体和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供测定凝集参数用的试验载体，其中包括一层含有涂以聚乙烯醇或聚乙烯醇/乙烯基乙酸酯的玻璃纤维的试验层。本发明还提供一种制造玻璃纤维层的方法。其中包括玻璃纤维在过量的水中与加入的聚乙烯醇形成浆液，按常规的造纸方法形成一层纤维层，并在升高的温度下干燥。而且，本发明提供测定血液的凝集参数的方法。其中包括将血液通过含有涂以聚乙烯醇或聚乙烯醇/乙烯基乙酸酯的玻璃纤维的玻璃纤维层的测定步骤。

Description

本发明涉及测定所谓凝集参数用的试验载体，即分析血液中影响凝集过程的组分用的试验载体。

对于体液成份的定性定量分析测定，其中尤其对血液的分析，所谓载体结合试验的应用，最近愈来愈普遍。在这些试验中，将试剂引入固体试验载体的适当层次中，与样品进行接触。样品和试剂的反应产生可检测的信号，尤其是颜色的变化，这可通过视觉辨别或通过仪器，经常采用光学反射方法测量。

试验载体常做成试验条，这种试验条主要由合成树脂材料的纵向载体层和其中所涂的试验区组成。但试验载体也常常做成方形或矩形小板。

欧州专利说明书0045476号叙述了从全血分离血浆或血清用的试剂和方法，尤其是用于体液成分（所谓参数）诊断测定用的试验载体，使用该种载体就使以简单的方式测定全血的组分成为可能。按照本发明的说明书，血浆可与红血球分离，其方法是让全血流经纤维直径小于2.5μm的玻璃纤维层，这些纤维可阻止红血球通过。因而最好将血液加到矩形玻璃纤维毛的一端，血浆由此经毛细作用力被输送到该装置的其它部位。血浆分离以后，充满血浆的纤维毛被受压通过含必需试剂的基质（纸、吸收薄膜等），在该基质中，进行用缓解测量法测定待检测参数的检测反应。

这一简单的血浆获取和输送方法可用于测定所有重要的临床化学参数，只有在测定研究止血学问题范围内的参数时是例外。众所周知， 凝集分析在原则上是要在合成树脂容器或涂硅酮树脂以失活的玻璃容器内进行，因为未经处理的玻璃会影响血液和血浆的共凝集能力。因此，即使凝集因子处于正常范围内，由于玻璃的活化作用，可缩短血浆的奎克一期的凝集时间，至于在凝集因子含量较低的血浆情况下，奎克一期凝集时间会由于凝集因子的失活而延长。尤其是玻璃会使第Ⅴ和第Ⅱa因子失活。由于这种失活作用并由此产生凝集时间假性延长，使诊断的有效性因各个凝集因子的比例的改变而失效。以百分率表示的奎克值，除包括纤维蛋白原浓度外，也包括第Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ和第Ⅹ因子的活性。将从健康供体取得的混合血浆定为100%的血浆，用生理盐水稀释，制备出合适的较低百分率的血浆。通过这种稀释系列，可作出一条参考曲线，据此可测出病人血浆的奎克值。

然而，部分促凝血激酶时间（PTT）也受第Ⅻ和第Ⅺ因子失活的相反影响。抗凝血酶Ⅲ和肝素的检测会由于玻璃引起的凝血酶的失活而受很大干扰。

因此，本发明的目的之一是提供玻璃纤维层，这些玻璃纤维层特别适用于试验载体中的分离和输送体系，由于这些玻璃纤维层不影响凝集，因而适用于止血学研究。所以最好要保留它们的分离输送性能。

因此，按照本发明，可提供测定凝集参数用的试验载体，其中包括一层涂以聚乙烯醇或聚乙烯醇/乙烯基乙酸酯的玻璃纤维的试验层。

本发明也提供一种制造玻璃纤维层的方法，特别是制造按照本发明所述的试验载体用的玻璃纤维层的方法，其中包括使玻璃纤维在过量的水中与加入的聚乙烯醇形成浆液，按常规的造纸方法形成一层纤维层，并在升高的温度下干燥。

而且，本发明还提供一种测定血液的凝集参数的方法，其中包括 将血液通过含有涂以聚乙烯醇或聚乙烯醇/乙烯基乙酸酯的玻璃纤维的玻璃纤维层的处理步骤。

我们已经发现，玻璃表面可通过加入聚乙烯醇而使之变性，使其保留亲水性，这一性能对例如玻璃纤维毛等物质的吸收能力是必需的，但丧失了它们对凝集因子的影响，即使之不影响凝集。这一点尤其有价值，因为人们知道，玻璃表面可通过用硅酮树脂乳液硅化处理使表面涂覆，因而排除了玻璃对凝集因子的影响，但这种渗硅处理在玻璃纤维的特殊情况下，会使表面产生高度憎水而使湿润不再发生，因而纤维完全损失了对血浆的输送能力和对红血球的分离能力。

聚乙烯醇是由聚乙烯乙酸酯皂化生成的，皂化中，根据产品的所需性能，可进行完全皂化或部分皂化。根据本发明的用法，既可采用完全皂化产物，也可采用部分皂化产物。从商业上可大量买到的聚乙烯醇，特别是在平均分子量方面和剩余酰基含量方面彼此不同，其分子量通常从约10000至100000左右，在某些特殊场合还会有更高的值。含有约5-15%，特别是含10%左右乙酰基的低分子量化合物，最易溶于水，而分子量较高的产物和/或乙酰基含量较高的产物则难溶于水。聚乙烯醇链之间的相互作用也对溶解度有影响。由于聚合物的链在某些范围内的结晶区出现部分平行定向，而定向化的倾向越大，构成的链越规则，而抵消定向最强烈的乙酰基的比例也越低。因而在97-100%皂化度的情况下，即在3-0%乙酰化度的情况下，“结晶度”会极大增加，而另一方面，其冷水溶解度大为减小。

而且，其水溶解度可用酰类后处理（乙酰化作用）或通过醇基团的其它化学变化而减小。聚乙烯醇在冷水中溶解度低，但在热水中溶 解度高，这在本发明中特别有用。在20℃，产物在水中溶解缓慢或根本不溶，但在50-100℃，特别是在60℃以上，在水中溶解非常容易。

按照本发明的玻璃纤维毛可用下法制备：用聚乙烯醇水溶液或其适当有机溶液处理合适的玻璃纤维毛，接着最好在60℃以上，特别是90-140℃的温度下干燥;或者在玻璃纤维毛制备过程中加入聚乙烯醇。如所周知，玻璃纤维毛是将干燥而成毡状的玻璃纤维悬浮在大大过量的水中制成的，其中玻璃纤维的平均直径为0.1-20μm，长度为0.1-5mm，纤维因而受分割，借助于常规的造纸机，使用相似于造纸中常用的方法，将这种形成的“浆”制成薄层并使之干燥。在玻璃纤维浆的制浆期间，加入浆中的聚乙烯醇粉或纤维便均匀分布于浆中。在其后玻璃毛的制备中，纤维毛溶解或熔化，接着干燥，便在玻璃纤维上形成一层均匀涂层。这种涂层使玻璃纤维不影响凝集。但另一方面，却能保持亲水性能，使这些玻璃纤维毛对水或水溶液的吸收能力和输送能力不受影响。

将硅烷化玻璃纤维加入这种浆液中特别可取。这类合适的纤维见联邦德国专利说明书3523969号所述，该专利的全文在此引入作为参考。然后按本发明方法，将这些纤维表面涂以聚乙烯醇或聚乙烯醇/乙烯基乙酸酯。这样就获得了特种玻璃纤维层，它既不影响凝集，又具有极为优良的强度。

当按本发明方法进行涂覆时，聚乙烯醇会使玻璃纤维上产生的涂层相当均匀，因此，即使相当少量聚乙烯醇，特别是约0.5-20%，最好是1-5%便足以使纤维不影响凝集。超过20%的比例对所需的效果也无害处，但从经济性上考虑，没有必要。

按照欧州专利说明书0045476号所述，这种玻璃纤维毛不仅用于输送血清和血浆，而且用于分离血浆和红血球，因此，这种玻璃纤维的平均直径必须为0.2-5μm，最好为0.5-2.5μm，玻璃纤维毛的密度为0.1-0.5g/cm³。然而，因为这只是个不影响凝集和输送性能的问题，较粗的玻璃纤维和不同密度的玻璃纤维毛也可使用。在这种玻璃毛的情况下，玻璃毛上聚乙烯醇的含量也可大于20%。

本发明的玻璃纤维可用常规方法转化成玻璃纤维毛，如上所述，特别是从下述实例可见，这种玻璃毛可用于测定凝集参数所用的介质中。然而，它们也可以短柱的形式使用，用以获得欧州专利说明书0045476号所述的血浆，该血浆然后即可在常规凝集试验中使用。

按照本发明，还包括用于测定凝集参数的可能的试验载体，这种载体可按相似于这里引入的资料欧州专利说明书0045476号所述的介质制备法制备之。很显然，在这些介质中，不仅是本发明的玻璃纤维，而且所有与血浆接触的其它部份必须是由不影响凝集的材料所构成，在此场合，尤其适合采用熟知的合成树脂。

本发明可参考附图和几个实例详细说明如下。在附图中：

图1是按本发明的试验载体的侧视图;

图2是使用按图1所述的试验载体所产生的缓解曲线。

图1举出的试验载体1具有常规条形载体的主要形式。在聚苯乙烯之类合成树脂膜的载体层2上，固定着软胶带3、玻璃纤维层4和部分覆盖于玻璃纤维层4上的盖网3a。

在另一面上，玻璃纤维层4被氧化剂层5和反应层6所覆盖，后二者由另一软胶带7以片状固定到载体层2上。

进行分析时，将一滴血滴到盖网3上，血便通过玻璃纤维层4进 入氧化剂层5和反应层6的范围。这样便发生按欧州专利说明书0045476号所述的方式进行的血浆分离。为了引发与含在层5、6中试剂间的反应，它们被迫向下流动，这样试样液便穿透进入这两层并发生相应的反应。

关于在目前所述这类凝集试验中发生的化学反应的详情可参见欧州专利说明书0182373号和下述实例。

实例1    按本发明的玻璃纤维毛的制备

将1kg玻璃纤维与4201水搅拌成浆，为了便于搅拌器中纤维的分离，把水调节至弱酸，使PH为3.0。在造纸机的贮存器中（翻斗筛机，Void，Heidenheim，Germany），将纤维稀释成0.3%，向此稀释液中加入50g聚乙烯醇纤维（Kuraray公司的Kuralon VPB 105-2），然后混匀。在造纸机的混料盒内，用循环水将悬浮液稀释到0.05%，将稀释后的悬浮液投到造纸机的筛子上，便形成纤维片。将纤维片在110-120℃下在干燥圆筒上干燥。根据机器的调节状况，便可得单位表面积重量为20-100g/m²，厚度为0.2-1mm的玻璃毛。

实例2    玻璃纤维毛无凝集影响试验

从按实例1制出的玻璃纤维毛中，取出40mg样品与从健康供体取得的混合血浆300μl混合，又取40mg玻璃毛样品与已作抗凝治疗的患者取得的血浆300μl混合，然后在37℃下培养1分钟。然后，用离心法将血浆分离。在血浆用玻璃纤维毛处理前后，分别研究其奎克一期凝集时间。这里可以采用凝血试验：开始用氯化钙和促凝血酶原激酶进行凝集级联，然后钩住样品，测量直至形成纤维蛋白线的时间。这里也可采用光度测定试验测定奎克时间（参见U.Becker 等人，Neue    Aspekte    der    Gerinnungsdiagnostik，pub.F.K.Schattauer    Verlag，Stuttgart    and    New    York，1984，PP.17-30）。

实例3    奎克一期凝集时间的测定

a）试验载体的制备

制备按附图1所示的试验载体。玻璃纤维层4是一层玻璃毛，其单位表面积的重量为50-60g/m²，厚度0.5mm。在试验载体长度方向上，其长度为15mm。盖网3a的网线厚140μm，网格尺寸为250μm。

反应层6由200μm厚的聚碳酸酯膜构成，其上是一层包在厚度为110μm的湿膜内的试验膜，并在45℃时干燥。膜形成物质由下法制备：

在1l水中溶解10g线性交联的聚丙烯胺（Roehm公司的Rohagit    700，Darmstadt，Germany）;100mmol    4-（2-羟乙基）-1-哌嗪-乙基磺酸;1mmol    Tos-Gly-Pro-Arg-对苯二胺;15mmol    N-（4-氟苯基）-N-甲胺基甲烷-膦酸和4.9g兔脑促凝血酶原激酶，用氢氧化钠水溶液将此溶液的PH调至7.5。

氧化剂层5由合适浸渍的尼龙网制成（纤维厚度约40μm，网眼大小约60μm，是瑞士Züricher    Beuteltuchfabrik公司的NY20HC型网布）。该网子用50mmol六氰铁（Ⅲ）酸钾/l和50mmol氯化钙/l的水溶液浸渍过。

b）按本发明方法制造的试验载体和常用的普通玻璃毛制成的试验载体间的比较

向固定了玻璃纤维毛4的尼龙网3a上，分别吸移35μl用生理盐水系列稀释的100%、50%、33%、25%和12.5%的柠檬酸盐血浆。将试验载体温热至37℃，使用弛张光度计监测产生颜色的时间。

因而可以观察到用按照本发明制备的玻璃纤维毛得到的信号明显比用未处理的玻璃纤维毛得到的信号高（见附图2）。所谓奎克时间，是取达到缓解减小10%所需的时间。它们之间的差别列于下表：

表

血浆    缓解减小10%的时间（秒）

用按本发明的    用未涂覆的

玻璃纤维毛    玻璃纤维毛

100%    44.7    46.2

50%    51.5    78.8

33%    58.8    121.7

25%    66.0    160.2

12.5%    99.0    不再可测

Claims (9)

1、测定凝集参数用的试验载体，其中包括一层含有涂以聚乙烯醇或聚乙烯醇/乙烯基乙酸酯的玻璃纤维的试验层(4)。

2、按照权利要求1的试验载体，其中的试验层（4）含有0.5-20%的聚乙烯醇。

3、按照权利要求2的试验载体，其中的试验层（4）含有1～5%的聚乙烯醇。

4、按照权利要求1的试验载体，其中的玻璃纤维是硅烷化的。

5、按照权利要求1的试验载体，其中的试验层（4）形成为毛状物。

6、按照上述任一权利要求的试验载体，其中的玻璃纤维的平均直径为0.2-5μm，试验层（4）的密度为0.1-0.5g/cm。

7、按照权利要求6的试验载体，其中的玻璃纤维的平均直径为0.5-2.5μm。

8、测定血液凝集参数的方法，其中包括将血液通过含有涂以聚乙烯醇或聚乙烯醇/乙烯基乙酸酯的玻璃纤维的玻璃纤维层。

9、按照权利要求8的方法，其中的血液沿玻璃纤维层通过。

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