CH678912A5

CH678912A5 -

Info

Publication number: CH678912A5
Application number: CH4832/88A
Authority: CH
Inventors: Folkert O Belzer; James H Southard
Original assignee: Wisconsin Alumni Res Found
Priority date: 1987-12-29
Filing date: 1988-12-28
Publication date: 1991-11-29
Also published as: SE8804661D0; US4879283A; KR890009409A; GB2213362B; SE8804661L; JPH01246201A; ZA889683B; AU2761688A; GB2213362A; DE3843958C2; GB8830096D0; JPH0768082B2; NZ227516A; NL8803186A; FR2625073B1; FR2625073A1; RU2019965C1; BE1003362A3; NL193971B; HU200885B

Description

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Beschreibung

Bei der Renalpräservierung, der ex vivo Aufbewahrung von Leichennieren, handelt es sich um ein relativ neues Gebiet. Die Konservierung von Leichennieren für die Transplantation ist geläufige Praxis in Krankenhäusern; die Fortschritte waren jedoch auf Versuchs- und Fehlerexperimentafion begrenzt. Wenngleich,, vom klinischen Standpunkt, diese Vorgehensweise teilweise erfolgreich war, so sind die hinter diesen Erfolgen stehenden tatsächlichen Prinzipien nicht gut verständlich.

Da sich die Renaltransplantation aus einer eigentlichen Forschungsangelegenheit zu einer etablierten klinischen Therapie bei renalen Erkrankungen im Endstadium entwickelt hat, ist die Renalpräservierung vom Stadium der Laborforschung zu einer etablierten klinischen Methode fortgeschritten. Die gegenwärtig im allgemeinen meist angewendeten beiden Verfahren zur Renalkonservierung sind die einfache hypothermische Lagerung und kontinuierliche Perfusion. Bei der hypothermischen Lagerung, der am meisten angewandten Methode, werden die Organe aus dem toten Spender entfernt und schnell abgekühlt. Dies wird allgemein durch eine Kombination von externer Kühlung und einer kurzen Perfusionsperiode bewerkstelligt, um die Kerntemperatur so schnell wie möglich abzusenken. Die Nieren werden dann gelagert, eingetaucht in eine in einem einfachen Plastikbehälter befindliche Auswaschlösung, und durch Eintauchen des Behälters in Eis auf eine Temperatur von 0 bis 4°C gehalten. Die Vorteile dieser Methode sind ihre Einfachheit, ihre geringen Kosten und die Leichtigkeit für den Transport der Organe. Die Zusammensetzung der (»flush-out») Auswaschlösung wurde eingehend untersucht, um eine optimale Konservierung zu erreichen.

Bei der zweiten Methode zur Renalkonservierung, die Gegenstand eingehender Laboruntersuchungen wie auch von klinischen Tests ist, handelt es sich um eine pulsierende Dauerperfusion. Die grundsätzlichen Elemente der Dauerperfusion sind im allgemeinen: (1) pulsierendes Strömen, (2) Hypothermie, (3) Membranoxigenierung und (4) ein Perfusionsmittel, das sowohl Albumin als auch Lipide enthält. Die kontinuierliche bzw. Dauerperfüsion hat verschiedene Vorteile. Zunächst verschafft die Perfusion genügend Zeit, um die Transplantation zu einer teilweisen'Auswahlprozedur zu machen. Zweitens gestattet sie die Untersuchung der Lebensfähigkeit vor der Implantation. Mit einer bedeutenden Verbesserung der Ergebnisse der Renaltransplantation von Leichen wäre zu erwarten, wenn die Konservierungszeit auf 5 bis 7 Tage ausgedehnt werden könnte, welche für die gegenwärtigen Verfahren der gemischten Lymphozyten-Kulturtests benötigt wird.

Die Möglichkeit, menschliche Nieren für 2 oder 3 Tage entweder durch einfache Kühllagerung nach anfänglichem Auswaschen bzw. Durchspülen mit einer intrazellularen Elektrolytlösung oder einer pulsierenden bzw. rhythmischen Perfusion mit einer Elektrolyt-Proteinlösung erfolgreich zu konservieren, hat genügend Zeit verschafft für die Untersuchung der Gewebeverträglichkeit von Spender und Rezipi-ent, die Nierenverteilung unter den Transplantationszentren, eine sorgfältige präoperative Vorbereitung des Rezipienten, für die Beschaffung vorbereitender Spender-Kulturergebnisse und vaskulärer Ausbesserungen am Nierentransplantat vor der Implantation. Es hat sich erwiesen, dass Nieren, die über 72 Stunden unter Anwendung einer hypothermischen, pulsierenden (rhythmischen) Perfusion mit Kryopräzipitat-Plasma konserviert worden waren, einen bedeutenden Fortschritt in der Konservierung menschlicher Nieren darstellten, und es sich hierbei um das bevorzugte Konservierungsverfahren handelt. Die Nieren-Organkonservierung mit einer eisgekühlten intrazellularen ElektroIyt-Spül(Auswasch)-lösung mit anschliessender einfacher Kältelagerung ist mit zufriedenstellenden Ergebnissen bei der Menschennierenkonservierung bis zu 61 Stunden angewandt worden.

Serumalbumin in den verschiedenen Formen wird ausschliesslich zur klinischen Organkonservierung verwendet, um den nötigen osmotischen Druck zu erzeugen. Bei diesen Formen handelt es sich um Kryopräzipitat-Plasma, eine Plasma-Proteinfraktion, menschliches Serumalbumin und mit Silicagel behandeltes Plasma. Da diese Perfusionsmittel jedoch von natürlichen Materialien abgleitet sind, sind Schwankungen unvermeidlich. Es wäre ganz besonders vorteilhaft, wenn ein Perfusionsmittel zur Verfügung stünde, das ein synthetisches Kolloid enthielte.

In der Vergangenheit sind eine grosse Zahl von synthetischen Kolloidmaterialien experimentell auf ihre Wirksamkeit bei der Nierenkonservierung untersucht worden. Bei diesen Kolloiden handelt es sich um Dextrane, Polyvinylpyrrolidin, Pluronics, Hydroxyethyl-Stärke (HES), Ficoll, Gummi arabicum und Po-lyethylenglykoi. Keines hiervon war so wirksam wie Serumalbumin. HES war jedoch für eine 24- und in manchen Fällen 72stündige Konservierung wirksam. Diese kolloiden Stoffe wurden alle in Perfusations-mitteln auf Salzbasis untersucht. Kürzlich wurde eine ausgezeichnete 72stündige Konservierung von Hundenieren beobachtet bei Anwendung eines Perfusionsmittels, das Gluconat-Anionen anstelle von Chlorid mit menschlichem Serumalbumin (HSA) zur kolloiden osmotischen Unterstützung enthielt.

In den späten 1960ern zeigten zwei wichtige Studien, dass Nieren sicher über 30 Stunden durch Kältelagerung (1) und bis zu 72 Stunden bei Dauerperfusion (2) sicher konserviert werden konnten. Diese beiden Studien veränderten die klinische Transplantation von Leichennieren von einer Notprozedur zu einem Halb-Auswahlverfahren. Die Collins-Lösung oder die modifizierte Eurocollins-Lösung wird von den meisten Transplantationszentren bevorzugt, welche Nieren durch Kältelagerung konservieren.

Die Einführung von Cyclosporin für die Immunosuppression während der 1980er wiederbelebten das Interesse an der Transplantation anderer Organe, insbesondere der Leber, der Pankreas, des Herzens, der Lunge und Herz-Lungen. Die für Nieren erfolgreichen Konservierungsverfahren haben sich

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jedoch bei anderen Organen als nicht erfolgreich erwiesen. Folglich wird die klinische Konservierung von Herz, Leber und Pankreas auf einem Minimum gehalten, nicht länger als 6 bis 10 Stunden. Die Transplantation dieser Organe ist vom Umfang her sehr viel komplexer als die Übertragung von Nieren, so dass die Operationen ständig während der Nacht durchgeführt werden müssen, wenn die Operations-5 räume in den Spenderkrankenhäusern zur Verfügung stehen. Kurze Konservierungszeiten für Herz und Leber machen auch zwei Operationsteams erforderlich, eines für den Spender und das andere für den Empfänger. Die Erstreckung der Konservierungszeit für diese Organe auf 30 Stunden würde auf ihre Transplantation dieselbe Auswirkung haben wie auf die Nierentransplantation, nämlich als Vergrös-serung der Organ-Verfügbarkeit, Verringerung des Organ-Verlusts, Verbesserung der Organ-Vertei-10 lung und Kostenverringerung.

Eine Konservierungslösung für alle Spenderorgane, sowohl für die in situ Organkühlung beim Spender als auch für die Kältelagerung nach Entnahme des Organs, wäre wünschenswert.

Die Erfindung schlägt eine Zusammensetzung für die Konservierung und Lagerung eines für die Implantation in einen Patienten bestimmten Organs vor, die ein Lactobionat und eine Hydroyethyl-Stärke 15 enthält, die im wesentlichen frei ist von Ethylenglykol, Ethylenchlorhydrin, Natriumchlorid und Aceton und die ein Molekulargewicht von 150 000 bis 350 000 u (Daltons) aufweist. Desweiteren schlägt die Erfindung ein Verfahren zur Konservierung eines zur Implantation in einen Patienten bestimmten Organs vor, wobei das betreffende Organ in die vorerwähnte Zusammensetzung eingebracht wird. Eine solche Zusammensetzung bzw. Perfusionsmittel ermöglicht eine 72stündige Konservierung der Bauchspeichel-20 drüse, 48-stündige Lagerung der Niere und wenigstens 24stündige Konservierung der Leber.

Obgleich die Perfusionsmittel auf der Basis von Serumalbumin (HSH) die Lebensfähigkeit der Niere bis zu 3 Tagen aufrechterhalten, werden die Nieren geschädigt, was sich durch die erhöhten Serumkrea-tinin-Werte nach der Transplantation und die für deren Rückführung auf die Normalwerte benötigte Zeit anzeigt.

25 Vor der Erfindung standen akzeptable Verfahren für die Renalpräservierung nicht zur Verfügung. Solche, die sich als klinisch wirksam erwiesen haben sind auf Kurzzeit-Lagerung (3 Tage) beschränkt und sie verringern die Lebensfähigkeit beträchtlich. Die vorliegende Erfindung beschreibt die biochemische Zusammensetzung eines Perfusats und einer Aufbewahrungslösung, die hervorragend geeignet ist für hypothermisch konservierte Organe und ein neues synthetisches kolloidales Osmoseagens, das 30 eine bedeutend verbesserte Langzeit-Konservierung ermöglicht.

Gefrierung und kontinuierliche aerobe Perfusion stellen theoretisch die einzigen Mittel dar, um eine wirklich langzeitige Konservierung (von einem Monat bis Jahren) zu erreichen. Einfache Kältelagerung hat eine spezifische Zeitgrenze, jenseits derer das Organ nicht länger lebensfähig ist. Die Hypothermie verringert die Geschwindigkeit, mit der intrazellulare Enzyme wesentliche Zellbestandteile abbauen, die 35 für die Organ-Lebensfähigkeit notwendig sind. Es hat sich herausgestellt, dass die einfache Kühlung von ischämischen Nieren mit kaltem Blut die Funktion über 12 Stunden aufrechterhielt. Collins (Lancet 1969; 2:1219-1222) zeigte, dass die Verwendung einer geeigneten Durchspüllösung die Lagerzeit für Nieren um einen Faktor 3 (bis 30 Stunden) verbesserte. Dass diese Lösung bei der Konservierung anderer Organe wie Pankreas, Leber und Herz versagte, kann auf organspezifische metabolische Unterschie-40 de zurückzuführen sein.

Für ihre Eignung und Wirksamkeit sollte die Durchspül(flush-out)lösung eine Zusammensetzung aufweisen, welche die hypothermisch verursachte Zellausdehnung minimiert, die Expansion des extrazeliulä-ren Raumes während der Durchspülperiode vermeidet, eine Schädigung durch sauerstofffreie Radikale, insbesondere während der Reperfusion verhütet und Substrate für die Regenerierung energierei-45 eher Phosphatverbindungen während der Reperfusion zur Verfügung stellt.

Die hypothermisch induzierte Zellausweitung wird durch die Anreicherung von Wasser verursacht. DieserTendenzzur Ausweitung kann durch die Zugabe von 110 bis 140 mmol (110 bis 140 mOsm/kg Osmo-tikkraft) an Substanzen entgegengewirkt werden, die für die Zelle undurchlässig sind (Impermeanten). Diese Konzentration der Impermeanten entspricht in etwa der Gfucosekonzentration in der Collins Kaltla-50 gerungslösung (120 mM) und der Impermeanten in anderen Kaltlagerungslösungen. Folglich handelt es sich bei der geeigneten Konzentration an einem effektiven Impermeanten um eine Schlüsselkomponente einer erfolgreich einsetzbaren Kaitlagerungslösung.

Eine effektive kalte Durchspülungslösung muss die Ausdehnung des extrazellularen Raumes verhindern, die während der in situ Durchspülung des Spenderorgans und des hiernach entnommenen Organs 55 stattfinden kann. Durch eine solche Expansion kann das Kapillarsystem komprimiert werden, so dass die Durchspülungslösung nur kärglich in dem Gewebe verteilt wird. Die meisten Kaltlagerungslösungen enthalten keine Substanzen für eine osmotische Unterstützung (Albumin oder andere Kolloide). Deshalb diffundieren die Komponenten der Durchspülungslösung schnell in extrazellulare Räume und verursachen ein Gewebeödem. Demnach sollte eine in situ Durchspülungs(flush-out)lösung Substanzen enthalten, 60 welche einen kolloidalen osmotischen Druck herbeiführen und den freien Austausch von wesentlichen Bestandteilen der Durchspülungslösung gestatten, ohne dass sich der extrazellulare Raum ausweitet.

Es existieren wichtige Unterschiede im Metabolismus der Niere, Leber und Bauchspeicheldrüse. Diese Unterschiede sind von Einfluss darauf, wie gut diese Organe konserviert werden können. Die Unterdrückung der Zellausweitung macht die Anwendung eines wirksamen Impermeanten erforderlich. Gluco-65 se, der Hauptimpermeant bei der Collins-Lösung, ist für die Leber und Bauchspeicheldrüse nicht effek-

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tiv und dringt leicht in die Zellen ein (Southard, et al., Cryobiology 1986; 23:477-482). Mannitol, ein anderer allgemein eingesetzter lmpermeant, ist etwa so permeabel wie Glucose in der Leber. Ein Grund dafür, warum Kaltlagerungslösungen auf der Basis von Glucose oder Mannitol für die Leber und Bauchspeicheldrüse nicht effektiv sind besteht also darin, dass diese Lösungen keine wirksamen Impermeanten enthalten.

Gemäss der vorliegenden Erfindung enthält die Lösung für die Konservierung der Organe das Lacto-bionatanion und vorzugsweise Raffinose als Impermeanten für die Zelle; vorzugsweise besitzt sie eine Lösungsosmolarität von etwa 320 Mosm/L, K+ von 120 mM und Na+ von 30 mM. Das bevorzugte Kolloid ist eine modifizierte Hydroxyethyl-Stärke mit einem gewichtsdurchschnittlichen Molekulargewicht von 150 000 bis 350 000, insbesondere von 200 000 bis 300 000 u (Daltons) und einem Subsiitutionsgrad von 0.4 bis 0.7. Das bevorzugt verwendete Kolloid ist im wesentlichen frei von einer Hydroxyethyl-Stärke mit einem Molekulargewicht von unter 50 000 Daltons.

Damit die Hydroxyethyl-Stärke entsprechend der Erfindung verwendet werden kann, wird sie gegen destiliiertes-deionisiertes Wasser dialysiert oder in anderer Weise behandelt, um verschiedene Konta-minanten zu entfernen, von denen vorher nicht bekannt war, dass sie für die Wirksamkeit der Hy-droxyethyl-Stärke-Zubereitungen schädlich sind. Bei den Stoffen, welche durch die Dialyse entfernt werden, handelt es sich um die ailerkleinsten Hydroxyethyl-Stärke-Bestandteile einschliesslich Ethy-lenglycol und Ethylen-Chlorhydrin als Nebenprodukte der Hydroxyethylierung als auch um Restaceton und Natriumchlorid. Ethyienglycol und Ethylen-Chlorhydrin sind bekanntlich toxisch. Deshalb ist ihre Entfernung, selbst wenn sie in kleinen Mengen vorliegen, wünschenswert.

Ein weiterer wichtiger Aspekt für eine erfolgreiche Kaltlagerung ist die Vermeidung einer intrazellularen Azidose.

Ischämie, selbst in der Kälte, stimuliert die Glycolyse und Glycogenolyse (Pasteureffekt); sie erhöht auch die Erzeugung von Milchsäure und die Konzentration von Wasserstoffionen. Gewebeazidose ist für Zellen ausserordentlich schädlich und kann eine lysosomale Instabilität verursachen, lysosomale Enzyme aktivieren und die mitochondriellen Eigenschaften verändern. Die Verhütung einer intrazellularen Azidose stellt deshalb ein wichtiges Erfordernis für eine gute Konservierung dar. Einige Untersuchungen zeigten, dass die wirksame Abpufferung der Kaltlagerungslösungen oder die Verwendung von Durchspülungslösungen mit einem alkalischen pH die Lagerung von Lebern (Lie, TS et al., Transplant Prqc. 1984,16:134—137) und Bauchspeicheldrüsen (Abstract, Am. Soc. of Transplant Surgeons 13th Annua! Meeting, 28.-29. Mai 1987) verbessert. Die gemäss der vûrliegenden Erfindung bevorzugte Zusammensetzung besitzt einen pH von etwa 7.4.

Ein anderer wichtiger Aspekt für eine effektive Kaltlagerung ist die von sauerstofffreien Radikalen ausgehende Schädigung während der Reperfusion, wobei allerdings die exakte Rolle dieser Agenzien noch unklar ist. Es wird angenommen, dass sauerstofffreie Radikale für menschliche Lebern und Nieren geringe Bedeutung haben, weil endogene Xanthin-Oxidase eine verhältnismässig geringe Aktivität besitzt im Vergleich mit der hohen endogenen Aktivität von Superoxid-Dismutase, für welche Superoxid-Anionen eine Nahrungsquelle darstellt. Demgegenüber stellt die von sauerstofffreien Radikalen ausgehende Schädigung bei Lungen und Intestina, die gegenüber einer solchen Schädigung empfindlich sind, einen wichtigen Faktor dar, weshalb die Zusammensetzung vorzugsweise Giutathion enthält.

Ein anderer wichtiger Aspekt ist der Energie-Metabolismus. Adenosinfriphosphat (ATP) baut während der hypothermischen Lagerung sehr schnell ab, wobei dieser Abbau zur Bildung von Endprodukten (Adenosin, Inosin, Hypoxanthin) führt, für welche die Piasmamembran sehr permeabel ist. Die Organre-perfusion macht die schneite Regeneration der Na-Pumpaktivität erforderlich, wofür ATP notwendig ist. Das Vorhandensein von ATP-Precursoren ist deshalb für eine erfolgreiche Organkonservierung wichtig. Dementsprechend enthält die Zusammensetzung vorzugsweise Adenosin.

Die Hydroxyethyl-Stärke liegt typischerweise in einer Menge von 3 bis 8 Gew.-% vor.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform enthält die Konservierungslösung und Perfusionszusammensetzung die folgenden Bestandteile, vorzugsweise annähernd in den angegebenen Mengen, ohne jedoch hierauf beschränkt zu sein.

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Tabelle 1

Substanz

• Menge in 1 Uter iC-Lactobionat

100 mmol

KH2PQ4

25 mmol

MgS04

5 mmol

Raffinose

*30 mmol

Adenosin

* 5 mmol

Glutathion

3 mmol

Insulin

100 U

Bactrim

0.5 mL

Dexamethason

8 mg

Allopurinol

1'mM

Hydroxyethyl-Stärke

50 g mit einem Molekulargewicht von 200 000 bis 300 000 u (Daltons)

und einem Substitutionsgrad von 0.4 bis 0.7

Die Lösung wird mit NäOH auf einen pH 7.4 bei Raumtemperatur gebracht. Die Endkonzentrationen sind Na+ = 30 ± 5mM, K+ = 120 + 5 mM, mOsm/Liter = 320 ± 5. Bactrim = Trimethoprim (16 mg/rnL) und Sulfamethoxazol (80 mg/mL).

Eine andere bevorzugte Zusammensetzung ist die folgende:

Substanz

Menge pro Liter

Lactobionsäure

35.83 g

Kaliumphosphat, monobasisch

3.40 g

Raffinose-Pentahydrat *

17.83 g

Magnesiumsulfat, Heptahydrat*

1.23 g

Adenosin

1.34 g

Allopurinol

0.136 g

Glutathion (reduziert)

0.922 g

Pentafraction **

50.00 g

Kaliumhydroxid (10 N)

10.0 mL

Natriumhydroxid oder Salzsäure eingestellter pH auf

7.4

Wasser zur Injection bis zur Einstellung eines Volumens von .

1.0 L

* Es körinen selbstverständlich auch andere Hydrate in äquivalenter Menge verwendet werden.

** Hydroxyethyl-Stärke gemäss Beispiel 1

Die vorliegende Erfindung ermöglicht somit eine verlängerte klinische Organkonservierungszeit, wobei die Verwendung eines synthetischen Kolloids Abweichungen minimiert, welche bei Perfusaten auftreten, die aus natürlich abgeleiteten Materialien hergestellt sind.

Mit den nachfolgenden Beispielen wird die Erfindung weiter veranschaulicht.

BEISPIEL 1

Herstellung von Hydroxyethyl-Stärke

100 g Hydroxyethyl-Stärke werden in destiliiertem-deionisiertem Wasser aufgelöst, um eine 10gew.-%ige Lösung zu erhalten. Die HES Lösung wird in Dialysetaschen eingebracht (34 mm x 45,7 cm) mit einem molekularen Ausschlussbereich von 50 000 u (Daltons) eingesetzt in einen 10 bis 15 Liter Behälter mit destiliiertem-deionisiertem Wasser, und während 72 Stunden gerührt. Das Wasser wurde täglich ausgetauscht und die HES gesammelt und durch Gefrieren bis zur Venwendung bei -20°C gehalten, sie wies ein Molekulargewicht von 200 000 bis 300 000 u (Daltons) und einen Substitutionsgad von etwa 0.4 bis 0.5 auf.

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BEISPIEL 2

72stündige Konservierung von Hundepankreas

Weibliche Hundebastarde mit einem Gewicht von 15-25 kg wurden für das Experiment verwendet.

Operationsprozedur. Die Anästhesie wurde mit Pentatol eingeleitet und mit Halothan aufrechterhalten. Durch einen über die Mittellinie laufenden Einschnitt wurde das linke Segment (Ende) der Pankreas wie früher beschrieben entnommen. Das Organ mit der anhängenden Milz wurde auf die Iliurngefässe transplantiert, entweder unmittelbar nach der Durchspülung (flush-out) (zur Kontrolle) oder nach 48 und 72stündiger Kaltlagerung. Der pankreatische Kanal wurde offengelassen, so dass die pankreatischen Säfte frei in die Abdomenhöhlung abfliessen konnten. Es wurden keine Antikoagulantien verwendet. Das rechte Segment der Pankreas wurde zum Zeitpunkt der Transplantation entfernt.

Experimentelles Protokoll, Sämtliche Hunde erhielten 0.5 g Mandol I.V vor der Organentnahme und während der ersten drei Posttransplantationstage. Die Hunde wurden mit einer Standardhundefutter-Diät gefüttert, die Viokase enthielt. Die Tiere wurden in drei Gruppen eingeteilt. Gruppe 1 (Kontrolle): Nach der Entnahme und dem Auswaschen wurden die Organe sofort transplantiert; Gruppe 2 (48stündige Kaltlagerung CS) Gruppe 3 (72stündige Kaltlagerung CS). Die Blutglucose-Konzentration wurde täglich während der ersten Posttransplantationswoche bestimmt und danach zweiwöchentlich.

Der intravenöse Giucose-Toleranztest (IVGTT) wurde während 24 Stunden, 2 Wochen und 4 Wochen nach der Transplantation durchgeführt. Die Organtransplantate wurden nach 4 Wochen entfernt und 2 bis 3 Tage später wurde der IVGTT vorgenommen. Für den IVGTT wurde Glucose (0,5 g/kg Körpergewicht) injiziert und die Blutglucose nach 1, 5,10, 20, 30, 60, 90 und 120 Minuten bestimmt. Der K-Wert wurde aus der Blutglucosekonzentratlon errechnet, die aus den Messungen (9) zwischen 5 bis 60 Minuten erhalten wurden. Die Glucosewerte grösser als 150 mg% während mehr als 2 Tagen und ein K« Wert unterhalb 1.0 wurden als Hinweis auf Diabetes angesehen.

Konservierung. Die Zusammensetzung der Konservierungslösung ist in Tabelle 1 angegeben. Nach der Entfernung wurde das Pankreas mit annähernd 250-300 mL Durchspüiungslösung aus einer Höhe von 60 cm durchspült. Das Organtransplantat wurde in eine doppelte Plastiktasche gebracht, mit der Konservierungslösung überdeckt und in ein Eiswasserbad gestellt.

Statistik. Die statistische Auswertung erfolgte unter Verwendung des Student's T Tests. Die angegebenen Werte sind Mittel ± SEM.

Ergebnisse

Alle Organtransplantate wurden unmittelbar nach der Transplantation gut perfusioniert. Bei den konservierten Transplantaten entwickelten sich nach 5- bis 10minütiger Reperfusion graduell unterschiedliche intralobulare Ödeme. In allen Fällen wurde die Milz gut perfusioniert. Wie aus Tabelle 2 hervorgeht, starben fünf Hunde; drei aus der Kontrollgruppe und zwei aus der Gruppe 3 (72stündige Konservierung). Die Gründe für den Tot standen in keiner Beziehung zu dem Transplantat; alle Hunde starben mit funktionierendem Organtransplantat.

Zum Zeitpunkt der Pankreastektomie zeigten alle transplantierten Organe (sogar aus der Kontroll-gruppe) unterschiedliche Anzeichen einer Fibrose, so auch die Milz. Arterielle und venöse Thrombosen traten bei keinem der Organe in Erscheinung.

In der Tabelle 2 sind für jedes Tier die Posttransplantations-Blutglucosewerte und die Ergebnisse von IVGTT angegeben. Die Tabelle 2 enthält auch die Mittelwerte (±SEM) für jede der untersuchten Gruppen. Der Durchschnitts-Blutglucosewert während der ersten Posttransplantationswoche lag am höchsten bei der Gruppe 3 (124 ± 6 mg%) wobei dieser Wert deutlich verschieden war (P < 0.05) beim Vergleich mit den Werten für die Gruppe 1 (94 ± 7 mg%) und der Gruppe 2 (107 ± mg%). Der mittlere K-Wert am Tag 1 lag ebenfalls bedeutend niedriger (P < 0.05) bei der Gruppe 3 (185 ± 0.15%) im Vergleich mit der Gruppe 1 (2.44 ± 0.14%) und Gruppe 2 (2.53 ± 0.22%). Bei der Gruppe 3 waren die K-Werte, die an den Tagen 14 (1.7 ± 0.1%) und 28 (1.61 ± 0.19%) ermittelt worden, ähnlich dem K-Wert am Tag 1 (P = NS). Bei den Gruppen 1 und 2 nahmen die K-Werte ab und zwei Wochen nach der Transplantation ergaben sich keine bedeutenden Unterschiede zwischen den drei Gruppen. Nach der vierten Woche war der K-Wert für die Gruppe 3 besser als derjenige für die Gruppe 2, jedoch etwas niedriger im Vergleich mit der Kon-trollgruppe (eine statistische Bedeutung konnte wegen der kleinen Anzahl in der Gruppe 1 nicht ermittelt werden).

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Tabelle 2

Posttransplantationg-Pankreasfunktlon nach Konservierung

Hunds-Nr.

Konservierung

Blutglueose

1, Woche • (mg%)

k-Wert:%

IVGTT (1 Tag)

K-Wert: % IVGTT (2 Wochen)

K-Wert: %

IVGTT (4 Wochen)

Bemerkungen

Gruppe 1

1

Kontrolle

72.7 ±6.0

1.97

2.23

Todestag 27, pleurale Effusion

2

Kontrolle

113.1 ±7.7

2,48

1.73

1.33

3

Kontrolle

104.4±16.5

2.65

-

- •

Todestag 5, intra-abdominales Abszess

4

Kontrolle

93.9 ±9.8

2.76

1.82

2.76

5

Kontrolle

78.5 ±16.1

2.38

1.44

-

Todestag'26, iritussusceptlon

Mittel

93.5 ±7.0

2.44 ±0.14

1.81 ± 0.16b

2.05 ±0.71

Gruppe 2

6

48 h CS

95.3 ±5.6

2.76

1.41

-

Tötungstag 14

7

48 h CS

91.1 ±7.3

2.6.5

1.92

-

Tötungstag 14

8

48 h CS

108.3±9.9

2.56

2.15

1.11

9

48 h CS

130.4± 10:0

1.78

1.82

1.41

Mittel

106.5 ±6.6

2.53 ±0:22

1.83±016b

1.26±0.15

Gruppe3

10

72 h CS

113.5± 11.8

1.47

1.52

2.30

.

11

72 h CS

108.7 ±9.8

1.73

-

Todestag 15, pleurale Effusion

12

72 h CS

132.9 ±10.6

1.15

1.30

1.38

13

72 h CS

105.0 ±9.1

2.55

2.37

1.68

14

72 h CS

118.8 ±5.3

2.02

-

Todestag 5, kein augenscheinlicher Grund

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72 h CS

143.2 ±4.0

2.16

1.97

2.03

16

72 h CS

150.0 ±8.1

1.92

1.86

1.15

17

72 h CS

115.9± 11.0

1.77

1.15

Mittel

123.5 ±5.9®

1.85±0.15a

1.71 ±0.18

1.62 ±0.19

a (P<0,05) vs. Gruppe 1 und 2 b(P<0;05)vs. IVGTT Tagt

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Alle Hunde wurden hyperglycämisch (Blutglueose oberhalb 200 mg%) nach der Entfernung des Pankreas, was anzeigte, dass das transplantierte Organ für die Glucose-Homeostasie aliein verantwortlich war. Vier Tiere aus der Gruppe 3 wurden während des langzeitigen Überlebens beobachtet. Ein Hund starb 7 Wochen nach der Transplantation an Pneumonie, blieb jedoch normal-giycämisch. Zwei Tiere wurden nach 3 und 4 Monaten getötet, ein Hund wurde während 6 Monaten gehalten. Keines zeigte Anzeichen von Diabetes und alle waren normal glycämisch.

BEISPIEL 3

24stündige Leberkonservierung

Die klinische Leberkonservierung ist auf etwa 6 bis 10 Stunden begrenzt. Eine Erstreckung auf 24 Stunden oder darüber könnte eine bedeutende Auswirkung auf die Lebertransplantation haben. Eine isolierte, perfusionierte Kaninchenleber wurde verwendet, um die Qualität der Konservierung nach der Kühllagerung in Collins Lösung, Cambridge Plasma-Protein-Fraktion (PPF), Marshalls Lösung und der erfindungsgemassen Lösung (Tabelle 1) zu beurteilen. Die Bilirubin-Erzeugung (bile) während der normalthermischen Perfusion von kühl gelagerten Lebern stellte den nützlichsten Parameter für die Lebensfähigkeit dar; die Geschwindigkeit der Bilirubin-Erzeugung (bile) (mL/100 gm/h ± SD) bei der Kontrolle vs. 24stündiger Kühllagerung von Kaninchenlebern ist in der Tabelle angegeben.

Kontrolle

Cambridge PPF

Eurocollins

Marshalls

Konservierungslösung

5.4±ï.7

. 1.8 ±0.9 .

1.9 ±1.3

3.1 ±0.5

4.4 ±0.5

Die beschriebene Konservierungslösung gemäss der Erfindung war den anderen Kalt-Lagerungslö-sungen überlegen hinsichtlich der Bilirubinerzeugung nach 24stündiger Kühllagerung (2.4°C) und normalthermischer Reperfusion.

Der beste Test für eine erfolgreiche Leberkonservierung ist das Transplantationsmodell (transplantation model). Die Konservierungslösung wurde deshalb an einem orthotopischen Hundeleber-Transplantatmodel gefestet. Nach einfacher Durchströmungsperfusion mit der Lösung wurden drei Hundelebern nacheinander während 24-26 Stunden gelagert. Die Transplantation wurde unter Anwendung einer kombinierten «Manschetten»- und Nähtechnik durchgeführt.

Sämtliche Lebern namen sofort ein zufriedenstellendes Aussehen an und alle drei Hunde wachten prompt auf und standen innerhalb von 4 Stunden nach Ende der Prozedur auf ihren Beinen.

Die Blutplättchenzahl war 6 Stunden nach der Operation normal. Die Bilirubin- und Enzymwerte nach 6 Stunden und den folgenden 7 Tagen sind in der Tabelle (Mittel ± SD) angegeben und zeigen eine schnelle Wiederaufnahme der normalen Leberfunktion. Ein Hund starb am Tag 5 nach der Operation infolge einer Intussusception.

6Std. . ■

Tag1

Tag 3

Tag 5

Tag 7

Bilirubin mg%

0.6 ±0.3

0.7 ±0.6

0.9 ±0.7

0.5 ±0.4

0.4 ±0.2

SGOT

21484983

1835±1145

61 ±16

55 ±40

«±21

Alk. Phos.

186±14

217 ±47

273 ±126

311 ±64

315±48

BEISPIEL 4 Nierenkonservierung

Die beschriebene Kalttagerungs(CS)lösung wurde für eine Nierenkonservierung und auf ihre Wirkung auf die Renalfunktion nach der Reperfusion untersucht: 1) an dem isolierten perfusionierten Hundenieren-Modell (model) (IPK); und 2) bei dem hundeautotransplantierten Modell (model).

1) Hundenieren wurden entweder während 48 Stunden in Eurocollings (ES) oder der beschriebenen Kalt-Lagerungslösung (CS) aufbewahrt. Die Nierenfunktion wurde während der Reperfusion mit dem IPK-Modell untersucht, unter Verwendung einer oxigeniertes, modifiziertes Albumin enthaltenden Krebs-Henseleit-Lösung bei 37aC während einer Dauer von 90 Minuten. Harnproben wurden alle 10 Minuten gesammelt und analysiert. Die Werte für GFR (Creatinin-Freigabe), Harn/Plasma-Protein (U/P) und die fraktionierte Natriumreabsorption (%Na) wurden errechnet. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 3 als Mittel mit den Standardabweichungen in Klammern angegeben.

Beide kühl gelagerte Nierengruppen hatten zum Zeitpunkt der Reperfusion in der Renalfunktion nachgelassen (verglichen mit den Kontrollnieren). Im Gegensatz zu EC-gelagerte Nieren verbesserte sich

8

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

CH 678 912 A5

bei in einer Kälte-Lagerlösung (CS) aufbewahrten Nieren der GFR-Wert und die Natriumreabsorption signifikant während IPK. Diese Funktionsverbesserung legt die Annahme nahe, dass die in CS konservierten Nieren in der Lage sind, eine ischämische Schädigung sehr viel schneller zu verwinden als in EC aufbewahrte Nieren.

2) Acht während 48 Stunden in CS konservierte Hundenieren wurden nacheinander autotransplan-tiert. Drei Tiere starben infolge von technischen Komplikationen (arterieller Thrombose, Intussuscepti-on). Die Werte für das Posttransplantations-Serumcreatinin (Mittel ± SD) der fünf überlebenden Tiere sind in der Tabelle 4 angegeben.

Die Untersuchung zeigt die gute Präservation der Renalfunktion während 48 Stunden der Kaltlagerung mit der CS-Lösung. Diese Lösung ist folglich in der Lage, Nieren, Pankreas und Leber zu konservieren und kann entweder für eine einfache Kaltlagerung oder Dauerperfusion eingesetzt werden.

Tabelle 3

Minuten IPK

10

30

60

90

C*

12.93

(5.74)

15.15

(3.00)

16.00

(4.44)

12,06

(4.49)

Harnfluss

EC

5.84

{1.81)

17.48

(8.77)

24.41

(11.45)

30.31

(19.86)

uL/min.g

CS

2.52

(1.67)

6.20

(2.45)

6.60

(4.79)

10.53

(4.23)

C*

224.96

(88.90)

240.38

(30.70)

210.66

(57.77)

125.48

(31.62)

GFR'

EC

8.09

(3.07)

29.60

(13.60)

38.32

(18.53)

,i 37.30

(21.68)

uL/min.

CS

6.98

(5.46)

27.23

(13.75)

28.06

(23.71)

51.53

(27.20)

C*

0.09

(0.02)

0,10

(0.02)

0.12

(0.06)

0.09

(0.02)

. U/P Verhältnis

Ec ;

0.53

(0.19)

0.43

(0.09)

0.35

(0.07)

0.31

(0.15)

CS

0.43

(0.02)

0.58

(0.16)

0.64

(0.22)

0.59

(0.23)

c*

98.91

(0.81)

99.15

(0.47)

99.05

(0.44)

98.81

(0.48)

%Na

EC

'44.34

(4.93)

55.35

(8,98)

56.52

(0.11)

40.54

(20.52)

CS

64.09

(21.78)

85.71

(5.76)

86.20

(5.76)

87.87

(12.28)

"Kontrollieren bei IPK

Tabellë4

Tage

o

1

2 3

4

5 6

7

8 9

10

Serumcreatinin (mg %) 1,3 -3,1 2,5 2,4 2,2 2,0 1,6 1,6 1,4 1,4 1,2 ' ±0,2 ±0,7 ±1,1 ±1,0 ±0,9 ±0,8 ±0.5 ±0,4 ±0,3 ±0,3 ±0,3

Claims

Patentansprüche

1. Zusammensetzung für die Konservierung und Lagerung eines für die Implantation in einen Patienten bestimmten Organs, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Lactobionat und einer Hydroxyethyl-Stärke, die im wesentlichen frei ist von Ethylenglycol, Ethylen-Chlorhydrin, Natriumchlorid und Aceton und die ein Molekulargewicht von 150 000 bis 350 000 u (Daltons) aufweist

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Stärke im wesentlichen von einer Hydroxyethyl-Stärke mit einem Molekulargewicht von nicht oberhalb 50 000 u (Daltons) frei ist.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet durch eine Lösung mit einer Osmolari-tät von etwa 320 mOsm/Liter.

4. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Stärke ein Molekulargewicht von 200 000 bis 300 000 u (Daltons) aufweist

5. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Stärke einen Substitutionsgrad von 0.4 bis 0,7 aufweist.

6. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen Elektrolyten für die Aufrechterhaltung der Zellebensfähigkeit und ein Arzneimittel für die Reduzierung einer Infektion enthält.

7. Zusammensetzung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass sie Kaliumdihydrogen-phosphat und/oder Calciumchlorid, und/oder Dexamethason und/oder Penicillin enthält.

8. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sie Raffinose enthält

9

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

CH678 912 A5

9. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sie Glutathion enthält.

10. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sie Gluconat enthält.

11. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sie Adenosin und/oder Glucose und/oder Insulin und/oder Allopurinol und/oder Dexamethason enthält.

12. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Stärke in einer Menge von 3 bis 8 Gew.-% vorliegt.

13. Verfahren zur Konservierung eines für die Implantatron in einen Patienten bestimmten Organs, dadurch gekennzeichnet, dass das Organ in eine Zusammensetzung gemäss einem der vorhergehenden Ansprüche eingelegt wird.

14. Verwendung einer Zusammensetzung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 12 für die Konservierung und Lagerung eines für die Implantation in einen Patienten bestimmten Organs.

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