KR20010002227A

KR20010002227A - 이식용 장기 및 혈액세포 보존제의 조성물

Info

Publication number: KR20010002227A
Application number: KR1019990021921A
Authority: KR
Inventors: 박상철; 박용훈; 강흔수
Original assignee: 강흔수; 메타볼랩 주식회사
Priority date: 1999-06-12
Filing date: 1999-06-12
Publication date: 2001-01-15
Also published as: KR100304594B1

Abstract

본 발명은 이식할 장기(organ) 및 혈액을 보존하기 위한 액체의 조성에 관한 것으로, 특히 기초 염류 용액에 아스파라긴, 아스파라긴산, 피루베이트산 및 폴리아민인 푸트레신, 스퍼미딘, 스퍼민등을 함유하는 장기 및 적혈구 보존액의 조성물에 관한 것이다.

장기이식시술중 이식장기는 보관과 이식과정에서 허혈손상을 받을 뿐만 아니라 이식후 재관류시 재관류손상이라는 심각한 후유증이 발생하는 문제가 있다. 본 발명에 의하면 기초 염류 용액에 아스파라긴, 아스파라긴산, 피루베이트산 및 폴리아민인 푸트레신, 스퍼미딘, 스퍼민등을 첨가함으로써 췌장에 대해서는 90시간 보존, 신장에 대해서는 60시간 저장 및 간에 대해서는 최소 30시간이상의 보존기간을 제공할 수 있으며, 공지의 적혈구보존액에도 이를 적용하여 적혈구의 세포손상을 줄임으로써 적혈구기능의 저하를 제어할 수가 있다.

Description

이식용 장기 및 혈액세포 보존제의 조성물{Composition for the Preservation of Organs and Blood Cells}

본 발명은 아스파라긴, 아스파라긴산, 피루베이트산 및 폴리아민인 푸트레신, 스퍼미딘, 스퍼민과 그들의 염 또는 그 혼합물을 유효성분으로 함유한 것으로 이식장기의 조직손상을 예방하여 그의 기능을 보호하는 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는 본 발명은 아스파라긴, 아스파라긴산, 피루베이트산 및 폴리아민인 푸트레신, 스퍼미딘, 스퍼민과 그들의 염을 함유하는 액상 또는 분말제 조성물로서, 이식할 장기의 허혈손상 및 이식 후 재관류손상에 의한 이식할 장기의 손상을 예방하고 회복하는데 사용되는 장기조직 보존용 조성물에 관한 것이다.

장기 보존액은 콜린스(Collins)액을 필두로 유로콜린스(Euro-Collins, 이하 EU)액, Sacks액, 위스콘신대학에서 개발한 UW액등이 널리 사용되며 이러한 장기 보존 및 이식 전 처리 액은 간, 심장, 신장 뿐 아니라, 폐, 뇌, 골, 연골, 피부 등의 이식에도 적용되고 있으며 또한 적혈구 보존제로는 CPDA-1 및 AS-3 보존제가 현재 많이 활용되고 있다. 종래에는 효과적인 보존액개발을 위해 2∼3℃에서의 냉 보존 방법과 히드록시에틸 전분(hydroxyethyl starch)사용에 의한 세포 팽창의 방지기능들이 기존 보존액에 추가되기는 하였지만, 이러한 보존액과 적혈구 보존제의 조성으로는 아직도 하기와 같은 문제점들을 해결하지 못하고 있다.

첫째, 조직내 pH 변화를 해결하지 못하고 있다. 장기의 보존은 냉 보존 방법을 이용하는데 이 경우 혐기성 해당 대사가 주로 작동하여 락테이트가 증가된 저 pH 상황이 된다. 저 pH 상황은 대사적으로 여러 시스템을 제한하여 조직 보존에는 유리하지만 이식시에는 pH를 정상으로 회복시켜야 하기 때문에 많은 조직 손상이 일어난다.

둘째, 허혈-재관류에 의한 조직의 산화성 손상을 해결해야 한다. 장기를 이식하고 재관류할 때 각종 산화적 손상 기전이 작동하여 조직파괴가 초래된다. 현재 사용되는 장기 보존 방법으로는 이러한 조직손상을 효율적으로 제어하지 못하고 있는 실정이다.

본 발명자는 아스파르트산이 말레이트 서틀(malate shuttle)대사를 이용하여 NADH/NAD 비율을 조절함으로써 산소라디칼 의존성 조직손상을 예방하고, 특히 이러한 아스파르테이트와 유사한 생화학적 기전을 가진 피루베이트가 심장조직 손상의 대표적 기전인 허혈심근 재관류 손상과 심근독성약물에 의한 심장조직 손상을 효과적으로 예방하고 심근기능 저하를 방지할 수 있다는 사실(한국특허 출원번호 98-16349, 98-016349)을 밝힌 바 있으나, 폴리아민인 푸트레신, 스퍼미딘, 스퍼민과 그들의 염이 산소라디칼에 의한 지질과산화물을 제거함으로써 조직에 미치는 라디칼 손상을 방지하는지에 관한 여부는 알려져 있지 않다. 반응성이 매우 큰 산소라디칼은 생체막의 불포화지방산과 반응하여 다양한 종류의 지질과산화물을 만들어 낸다. 이때 여러 종류의 알데히드인 4-히드록시노네날, 말론디알데히드, 아크롤레인등이 생성되는데 이들 알데히드는 생체내 단백질, 핵산과 같은 거대분자와 반응하여 생체 조직에 손상을 준다.

본 발명자는 상기 종래기술이 안고 있는 문제점을 해결하기 위한 방안을 연구하여 오던 중, 아스파라긴이 아세트알데히드와 스퍼미딘이 말론디알데히드와 각각 반응하여 복합제를 만들 수 있다는 사실에 착안하여, 심장, 간, 폐등 이식 장기조직의 허혈 및 재관류손상을 방지함으로써 보존장기의 조직손상을 방지할 수 있다는 사실과 아울러 공지의 적혈구보존액에도 본 발명의 성분을 첨가하여 줌으로써 적혈구의 세포손상을 줄여 적혈구기능의 저하를 제어할 수 있음을 알아내고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명은 아스파라긴, 아스파라긴산, 피루베이트산 및 폴리아민인 푸트레신, 스퍼미딘, 스퍼민과 그들의 염을 함유하는 액상 또는 분말제 조성물로써 이식할 장기의 허혈손상 및 이식 후의 재관류손상에 의한 이식할 장기의 손상을 예방하고 회복하는 데에 그 목적이 있다.

또한 본 발명은 상기의 조성물을 공지의 적혈구보존액에 첨가함으로써, 적혈구의 세포손상을 줄여 적혈구 기능의 저하를 제어할 수 있도록 하는 데 사용되는 적혈구 보존용 조성물을 제공하는 데에 또 다른 목적을 두고 있다.

본 발명은 이식할 장기(organ) 및 적혈구를 보존하기 위한 액체의 조성에 관한 것으로, 공지의 보존액에 아스파라긴, 아스파라긴산, 피루베이트산 및 폴리아민인 푸트레신, 스퍼미딘, 스퍼민등을 함유하는 것을 특징으로 하는 장기 및 적혈구 보존액의 조성물에 관한 것이다.

이식을 위한 사체의 장기보존은 병원에서 일반적으로 행하여지고 있는 것으로서, 장기보존을 위한 가장 통상적인 방법인 냉각 저장은 사체 공여자로부터 기관을 옮긴 후 이를 즉시 냉각하는 과정이 포함된다. 냉각은 보통 가능한 한 빨리 온도를 낮추기 위해 외부냉각 및 빠른 기관의 관류를 병행함으로써 행하여진다. 그리고나서 장기를 간단한 플라스틱 용기내의 플러쉬-아웃(flush-out)용액내에 침지한 후, 다시 얼음 내에 이 용기를 침지함으로써 적출장기를 0∼4℃의 상태하에 유지시킨다. 이러한 최적의 보존환경을 제공하기 위한 플러쉬-아웃 용액의 조성물이 현재 광범위하게 연구진행 중에 있다.

장기이식은 (1) 장기 적출 (2) 적출 장기의 냉보관 (3) 이식과정에서의 허혈기간 (4) 재관류 과정으로 나뉘어진다. 상기과정 중 보관과 이식과정에서 이식장기는 허혈손상을 받을 수 있기 때문에 빠른 시간 내에 이식을 완료하여야만 이식장기의 기능이나 높은 생존율을 보장받을 수 있다. 그러나 장기의 보관이나 이식시간이 지체되면 조직허혈이 진행되어 허혈손상을 받을 뿐만 아니라 이식 후 재관류시 재관류손상이라는 심각한 후유증이 발생하게 된다. 재관류손상이란 어느 정도 허혈이 진행되어 허혈손상을 받은 조직을 재관류시킬 경우 조직손상이 가속화되는 현상을 말한다. 따라서 이식장기의 허혈 및 재관류손상을 극복할 수만 있다면 지금보다 적출된 장기를 장기간 보관할 수 있어 여유 있게 이식준비를 하여도 되며 장기이식 성공률도 향상될 수 있다.

조직의 허혈 및 재관류손상의 기전은 완전히 밝혀지지는 않았지만 중요한 발병요인으로 산소라디칼 반응, 칼슘의 유입, 프로스타글란딘(Prostaglandin)의 증가, 백혈구 활성증가에 따른 염증반응, 혈관 내피손상에 따른 혈류저하등이 있다. 이러한 기전들을 주요 요인으로 보고 허혈 및 재관류손상을 방지하려는 노력이 활발히 진행되어 왔으나 아직도 이식장기에서 일어나는 세포대사변화에 대해 특히 이식후 재관류손상의 발생기전에 대하여는 명확하게 규명되고 있지 못한 실정이다. 이중에서 반응성이 매우 큰 산소라디칼은 생체막의 불포화지방산과 반응하여 다양한 종류의 지질과산화물을 만들어 내며, 이때 여러 종류의 알데히드인 4-히드록시노네날, 말론디알데히드, 아크롤레인등이 생성되는데 이들 알데히드는 생체내 단백질, 핵산과 같은 거대분자와 반응하여 생체 조직에 손상을 주게 된다.

본 발명의 이식용 장기 보존제는 세포에 대하여 불침투물로서 하기의 표 1에 나타낸 바와 같이 음이온 락토바이오네이트와 라피노스, 아스파라긴, 아스파라긴산, 피루베이트산 및 폴리아민인 푸트레신, 스퍼미딘, 스퍼민등을 함유하고 있으며 약 320Mosm/L의 용액 삼투물 농도(osmolality)와 140mM의 K⁺및 30mM의 Na⁺로 구성된다. 또한 적혈구 보존제용 조성물에 대하여는 표 2로서 나타내고 있다.

(표 1) 저장 용액 및 관류액의 조성물

물질	1리터당 함량
K⁺-락토바이오네이트	100mmol
KH₂PO₄	20mmol
MgSO₄	5mmol
라피노스	30mmol
아데노신	5mmol
글루타치온(환원)	5mmol
인슐린	100U
알로푸리놀	1mmol
덱사메타손	10mg
히드록시에틸 전분	45g
피루베이트산염	3mmol
아스파라긴	5mmol
아스파라긴산염	5mmol
푸트레신	0.5mmol
스퍼미딘	50㎛ol
스퍼민	50㎛ol
글루타민	3mmol
트립푸토판	1mmol
pH	7.4
삼투압	320mOsm/리터

(표 2) 적혈구 보존제 조성물

물질	1리터당 함량
덱스트로스	120mmol
NaCl	150mmol
마니톨	45mmol
아데닌	2mmol
인산염(Na₂HPO₄)	10mmol
구연산염	10mmol
히드록시에틸 전분	10mmol
피루베이트산 염	3mmol
아스파라긴	5mmol
아스파라긴산염	5mmol
푸트레신	0.2mmol
스퍼미딘	20㎛ol
스퍼민	50㎛ol
글루타민	5mmol
pH	7.4
삼투압	450mOsm/리터

장기(organ) 및 혈액을 보존하기 위한 보존제의 성분으로 폴리아민인 푸트레신 0.01∼2mM, 스퍼미딘 1∼500μM 및 스퍼민 1∼500μM 의 범위이내에서의 사용은 본 발명의 효능을 유지시키기에 충분하며. 바람직하기로는 상기 조성물에 피루베이트산 0.1∼10mM, 아스파라긴 0.1∼ 10mM 및 아스파라긴산 0.1∼10mM의 범위에서 첨가하여 사용하는 것이 좋다.

상기 표 1 및 표 2의 조성중에 아스파라긴, 아스파라긴산, 피루베이트산 및 폴리아민인 푸트레신, 스퍼미딘, 스퍼민은 간 및 췌장을 비롯한 장기에서의 세포의 pH 의 급격한 변화를 방지하며, 또한 아스파라긴과 스퍼미딘이 각각 아세트알데히드와 말론디알데히드와의 반응에 의한 복합제를 형성하여 산소라디칼반응에 의한 조직손상의 원인이되는 알데히드를 제거함으로써 심장, 간, 폐등의 이식장기조직에 허혈 및 재관류손상을 방지할 수 있고, 또한 적혈구의 세포손상을 줄여 적혈구기능의 저하를 제어할 수도 있게 한다.

성공적인 냉각 저장을 위하여 고려되어야 할 중요한 것으로는 첫째, 세포내 산중독의 예방을 들 수 있다. 비록 냉각중이라도 허혈은 해당(glycolysis) 및 글리코겐 분해를 자극하여 락트산 생성 및 수소 이온의 농도를 증가시키기도 한다. 조직 산중독은 세포에 치명적이며 리소솜 불안정성, 리소솜 효소의 활성 및 미토콘드리아 성질의 변경을 유도할 수 있다. 그러므로 세포내 산중독 예방은 장기의 우수한 보존을 위한 중요한 선행 조건으로서, 본 발명에 의하면 세포내 급격한 pH 변화를 방지할 수 있는 완충능을 가지게 되므로 세포내 산중독을 방지할 수 있게 된다.

둘째, 이식장기는 찬 장기보존액을 관류시키고 또한 그 액 속에 담겨지기 때문에(cold ischemia 상태) 에너지 고갈과 혐기성 해당작용등의 허혈대사변화는 서서히 진행하지만 여기에 장기간의 인공관류액의 노출과 정상세포대사 억제에 따른 세포조직손상이 일어나게 된다. 조직손상을 방지하는 항산화물질이나 아데노신이 cold ischemia 에 의한 조직손상을 방지한다는 여러 연구보고들에 의하면, 산소라디칼 반응과 에너지 고갈이 조직손상의 주요 병인으로 작용하고 있다는 사실을 알 수 있다. 따라서 상기 조성물에 항산화물질인 글루타치온, 알로푸리놀 및 아데노신을 첨가하여 사용한다면 장기보존 효율에 있어 보다 상승적인 효과를 기대할 수가 있다.

이하 실시예 및 시험예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 하나 다음의 실시예는 본 발명의 실시가능한 일 태양에 불과하고 이를 한정적인 의미로 해석하여서는 아니된다. 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 상기 실시예에 의하여 조성물의 성분이나 비율을 일부 변형하여 사용하는 것이 가능하므로 본 발명의 권리범위는 이들 균등한 영역에도 미친다.

< 실시예 1 > 장기 보존액의 제조

분자량이 20만∼30만 달톤이고 0.4∼0.5의 치환도를 갖는 히드록시에틸 전분 100g을 증류-탈이온수에 용해시켜 10% W/W 용액을 얻었다. 이 10% W/W 전분 용액을 혼합기로 잘 교반하면서 표 1과 표 2에 기재된 조성물을 서서히 첨가하여 용해하여 각각 장기보존액과 적혈구 보존액을 제조하였다.

< 시험예 1 > 개 췌장의 보존실험

각 실험군 당 5마리씩 15∼25kg중량인 암컷 잡종개를 펜타톨로 마취시키고, 중간선 절개를 통하여 췌장을 얻었다. 플러쉬아웃 후 즉시(대조군) 또는 냉각 저장 48 및 90시간 후 부착된 비장을 갖는 이식 조직을 장골관(iliac vessels)에 이식시켰다. 그런 다음 췌장관을 왼쪽으로 개방하여 췌장액이 복강으로 자유롭게 배수되도록 하였다.

이식 전 및 이식 후 최초 삼일 동안에 모든 실험대상개에게 0.5G 만돌 (Mandol) I.V(정맥내 주사)를 주사하였다. 그런 다음 비오카제를 함유하는 표준 개 먹이 식이를 개에게 공급하였다. 동물을 다음과 같이 세 군으로 나누고 대조 보존제로 유로콜린스(EU)액과 UW액 및 본 발명 보존제(MB)를 사용하였다. 이식 장기의 보존은 이식 장기를 이중 플라스틱 백에 넣고 각 보존 용액으로 덮고 얼음-물 욕에 넣었다.

I군(대조) : 이식장기를 즉시 이식한다, 2군(48-시간 냉각 보존저장), 3군(90-시간 냉각 보존저장).

이식 후 최초 일주일 동안은 매일, 그후에는 2주에 1회 혈당 농도를 측정하였다.

(표 3) 보존한 췌장의 이식후 1주동안 평균 혈당치(mg%±SD)

실험군	유로콜린스(EU)	UW	본발명의보존용액(MB)
1군(대조)	90.9±7.3	90.9±7.3	90.9±7.3
2군(48시간)	132.9±11.0	115.4±9.3	107.2±5.5
3군(90시간)	211.4±16.2	178.9±10.5	137.2±6.9

각 동물에 대한 이식 후 1주째 혈당치의 결과는 표 3에 나타내었다. 이식 후 최초 1주 동안 평균 혈당치는 대조군과 비교하여 본 발명의 보존액이 공지의 보존액에 비해 가장 낮게 나타났다. 모든 개는 췌장 제거 후 과혈당증(200mg/% 이상의 혈당)이 되는데 반하여, 본 발명의 보존용액의 경우 3군의 5마리 동물은 장기간 생존이 관찰되었다. 3마리는 2 내지 3달 후에 희생되었으며 1마리는 4달동안 유지되었다.

< 시험예 2 > 토끼 간의 보존실험

공지의 수술법에 의해 분리된 토끼 간을 유로-콜린스 용액, UW용액 및 본 발명의 용액(MB)에 냉각 저장하여 보존의 질을 평가하였다. 냉각 저장된 간의 정상 열 관류 동안 담즙 생성은 생존력의 가장 유용한 변수이며, 공지의 보존용액 및 본 발명의 보존용액에 대하여 30시간 냉각 저장된 토끼 간의 담즙 생성 속도를 측정하여 표 4에 나타내었다.

(표 4) 각 보존제에 의한 간의 담즙 생성 속도(ml/100gm/hr±SD) 측정

대조	유로콜린스	UW	본발명의 보존용액(MB)
5.9±1.5	1.7±0.9	3.4±0.7	4.1±0.5

또한 보존용액을 개의 오르토토픽(orthotopic)간 이식 모델로 효능 시험을 실시하였다. 상기 시험 보존용액으로 단순한 플러쉬 관류 후, 5개의 일련의 개의 간을 30시간 동안 저장한 다음 결합된 "커프(cuff)" 및 봉합 기술을 사용하여 이식을 수행하였다. 모든 간은 만족스런 형상을 즉시 드러내며 모든 5마리의 개는 즉시 깨어났고, 혈소판 수는 수술 6시간 후에 정상이었다. 시술 후 7일째의 담적소 및 GOT와 알칼린포스포타제 효소 값을 표 5에 나타내었다.

(표 5) 각 보존제에 의한 담적소 및 지오티와 알칼린포스포타제 효소치 비교

	유로콜린스	UW	본발명의 보존용액
담적소 mg%	0.6±0.3	0.5±0.6	0.4±0.7
혈액GOT(SGOT)	62±12	51±23	48±17
알칼린 포스포타제(Alkaline Phosphotase)	245±14	289±40	240±45

30시간 냉각저장(2-4℃) 및 정상열 재관류 후 본 발명의 기술된 보존 용액은 공지의 다른 냉각 저장 용액 보다 담즙 생산, 효소 값을 기준으로 효능을 비교해 본 결과 더 월등함을 확인할 수 있었다.

< 시험예 3 > 개 신장 보존실험

상기 냉각 저장용액으로 신장보존에 대해 조사하고 재관류 후 신장 기능에 미치는 효과를 조사하였다.

1) 개의 신장을 60시간 동안 유로콜린스(EC), UW 및 본 발명 보존 용액(MB)에 저장하였다. 37℃에서 90분에 걸쳐 크랩스-헨셀레이트 용액을 함유한 알부민을 사용하여 IPK 모델로 재관류하는 동안 신장 기능을 측정하였다. 소변 표본을 매 30분 마다 채집하여 GFR(크레아티닌 청소율), 소변/플라스마 단백질(U/P) 및 나트륨

재흡수(%Na)을 측정하여 결과를 표 6에 나타내었다.

재관류시 냉각 저장 신장군은 둘다 신장 기능을 감소시켰다. 유로콜린스액과 UW 보존액으로 저장된 신장에 비하여, 본 발명 보존액으로 저장된 신장은 IPK 동안 상당하게 GFR 및 나트륨 재흡수를 개선시켰다(표 6). 이러한 기능의 개선은 본 발명의 보존액에서 보존되는 신장이 공지의 용액에서 저장된 신장 보다 더 빠르게 냉각 허혈 손상을 치료할 수 있음을 의미한다.

(표 6) 각 보존액으로 저장된 신장의 GFR 및 나트륨 재흡수율 비교

	30분	60분	90분
GFRuL/min.g	대조	230.5±31.7	210.6±47.5	125.4±25.6
	EC	29.6±13.0	36.2±18.3	45.0±11.8
	UW	37.3±17.3	48.0±20.1	67.5±23.5
	MB	59.3±15.3	77.3±23.3	87.3±33.3
U/P	대조	0.17±0.01	0.12±0.02	0.18±0.02
	EC	0.41±0.1	0.35±0.1	0.31±0.1
	UW	0.58±0.1	0.41±0.2	0.33±0.2
	MB	0.38±0.1	0.27±0.1	0.29±0.1
%Na	대조	101.5±0.7	98.0±0.4	99.1±0.5
	EC	65.3±8.9	56.2±0.1	49.4±10.5
	UW	85.7±7.7	86.0±6.9	89.8±10.2
	MB	88.1±5.7	85.1±12.7	92.7±5.6

2) 60시간 동안 본 발명의 보존용액에 보존된 일련의 5마리 개의 신장을 자가이식하였다. 이식 후의 혈청 크레아틴(평균±SD)을 표 7에 나타내었다.

(표 7) 이식 후 혈청 클레아티닌 함량(평균±SD)

일	0	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
혈청크레아틴mg%	1.3±0.2	3.1±0.7	2.5±1.1	2.4±1.0	2.2±0.9	2.0±0.8	1.6±0.5	1.6±0.4	1.4±0.4	1.4±0.3	1.2±0.3

이 실험으로 본 발명의 보존용액은 60시간 동안의 신장저장으로도 신장기능을 우수하게 보존할 수 있음을 확인하였다.

< 시험예 4 > 토끼 심장의 보존실험

암수 구분없이 체중 2.0kg 내외의 토끼를 네군으로 구분하여, 제 1군은 대조군으로 유로콜린스용액을, 제 2군은 UW용액을 각각 심장 보존액으로 제 3군은 본 발명 보존액(MB)을 심장 보존액으로 사용하였다.

실험기기로 정압형 랑겐도르프(Langendorff)관류장치를 설치하여, 크렙스-헨셀라이트(krebs-Henseleit, 이하 K-H) 완충액을 담은 컬럼을 150cmH2O의 정압으로 유지하고, 95% O₂와 5% CO₂의 혼합가스로 기포관을 통하여 완충액을 기포화하고 pH는 7.35∼7.45의 범위로 유지시켰다.

토끼의 수술은 복강을 개복하여 검상돌기를 거상하여 양측 흉골연을 따라 늑연골 부위를 절개한 후 심장을 노출시켰다. 심낭을 떼어내어 즉시 4℃의 K-H액에 넣어 냉각시켰다. 랑겐도르프 장치의 대동맥관에 토끼 심장의 대동맥을 연결하여 37℃의 K-H완충액을 관류시켜서 심박동이 회복되도록 하였다. 우심실 전벽에 심박동기용 전극을 2개 장치하고, 심박동기 끝에 라텍스 벌룬(latex balloon)이 달린 가는 도관을 좌심방을 통하여 좌심실에 삽입하여 이완기 말기압이 10mmHg가 되도록 팽창시키고, 압력 변환기에 연결하여 피시오그라프(physiograph)를 통해 좌심실 압력(left ventricular developing pressure, 이하 LVDP)을 관측 기록하고, 미분 계산기(differentiator)를 사용하여 압력 미분치(dp/dt)도 함께 기록 관찰하였다.

적출된 가토의 심장을 20분간의 평형상태를 유지시킨 후 곧 관류액을 차단하고, 4℃의 심정지액을 50cmH2O의 압력으로 주입하였다. 심박동이 정지되면 즉시 랑겐도르프장치에서 분리하여 계획된 실험용 심장 보존액에 단순 저온 침적법으로 저장하였다. 10시간동안 저장한 후 랑겐도르프장치의 대동맥관에 가토의 대동맥을 다시 부착하고 심박동기용 전극, 좌심실의 라텍스 벌룬등을 설치하고, 37℃의 K-H완충액으로 심근을 점차 가온하면서 20분간 재관류시켰다. 심실 세동이 있으면 제세동시켰고 심박수의 차이에 따른 오차를 배제하기 위하여 평형상태와 동일한 심박수를 유지시켰다.

심기능 검사로 평형상태와 재관류시기의 각각 10분과 20분의 시점에 좌심실압, 관관류량, 압력 미분치를 측정하였다. 압력미분치는 총압 미분(total max dp/dt), 최대 수축기압 미분치(+max dp/dt), 최대 이완기압 미분치(-max dp/dt)로 구분하여 분석하였다.

본 발명 보존액이 공지의 심장보존액에 비해 좌심실압, 관관류량, 이완기압 미분치의 회복율이 우수하게 나타나 심근보호에 유익한 보존액임을 확인하였다.

(표 8) 좌심실압력(LVDP)과 압력미분치인 dp/dt의 심장 보존액에 의한 심장 기능 회복률(%)

보존액	관관류량(ml/min)	LVDP(mmHg)	Total dp/dt	+dp/dt	-dp/dt
EC	65.6±14.1	67±16.5	66±17.5	77±16.1	56±20.6
UW	83.5±11.9	71±18.3	72±12.5	75±29.6	67±11.8
MB	114.1±21.4	92±15.3	92±14.5	96±24.0	89±12.5

상기 결과로 볼때, 본 발명의 보존용액은 신장, 췌장, 간 및 심장보존에 있어 우수하며 단순한 냉각 저장 또는 연속적 관류를 위하여도 사용할 수 있음을 확인하였다.

< 시험예 5 > 개의 적혈구 보존실험

독일산 셰퍼드를 대상(5마리, 평균 무게 30Kg)으로 CPDA-1 ,AS-1 및 본 발명의 보존제가 든 백에 혈액을 100ml정도 채취한 후, 미국 혈액은행 협회의 지침서 (AABB)의 적혈구 제조의 표준 지침서에 따라 적혈구를 제조하여 4℃에 보관하였다. 2달이 지난 후 보관된 혈액을 해동하여 동일한 개에 수혈을 실시하여 수혈 부작용의 존재 및 수혈 효과를 평가하였다.

1) 개에서 혈액을 100ml씩 각 혈액 보존액에 채혈한 후 3일간 냉장고에 방치하여 혈장을 분리한 뒤 농축 적혈구를 제조하였다.

2) 2달이 지난 후 보존된 혈액을 꺼내어 37℃의 수조에 20분간 흔들면서 해동하였다.

혈액백을 깨끗이 닦은 다음 12% NaCl용액 25ml를 30초 내에 천천히 주입하면서 손으로 흔들어 혼합한 후 2분간 실온에 방치하였다. 그런 다음 0.2% 덱스트로스가 첨가된 0.9% 염수 25ml를 1분간 서서히 주입하여 혼합한 후 역시 2분간 방치하였다.

3) 세포세척기(Cell washer)를 이용하여 0.2% 덱스트로스가 첨가된 0.9% 염수 1000ml로 2번 이상 세척하였다. 세척된 적혈구를 PVC백에 모아 혈액 냉장고에 보관하였다.

4) 해동 적혈구의 수혈 과정은 수혈 예정인 2마리의 개에게 4시간에 걸쳐 각각 해동 적혈구 수혈을 실시하였다. 수혈 24시간 후 수혈개에서 부작용이 있었는지 확인하고 혈액을 채취하여 실제 수혈 효과가 있는지 평가하였다.

(표 9) 냉장 전, 후 각 보존제에 따른 RBC상태에 대한 비

	CDPA-1	AS-1	본 발명품
냉장전 RBC/unit(mil)	455.2	456.5	452.2
냉장후RBC/unit(mil)	331.6	361.8	388.1
RBC 회복율(%)	72.8%	79.2%	85.8%
삼투압(mOsmol)	289	312	360
LDH(IU/L)	850	798	708
K⁺농도(mEq/L)	8.8	8.5	10.2
plasma Hb(mg/dL)	680	760	834

(표 10) 각 보전액의 적혈구가 수혈된 개의 효과여부

	CDPA-1	AS-1	본 발명품
수혈량(ml)	400	400	400
Hb(수혈전)	13.0	12.8	13.1
Hb(수혈후)	11.5	11.2	13.5
부작용	식욕이 없어짐	식욕이 없어짐	정상

현재 전세계적 CPDA-1 혈액 보존제를 이용하여 적혈구 제제를 보관하고 있으며 이 경우 혈액의 최대 보존 기간은 35일에 불과하고, AS-1 등의 혈액보존제를 이용하여 최대 42일간 보관하고 있다. 냉장 적혈구의 제조시 사용되는 보호제로서 히드록시에틸 전분, 여러 아미노산과 폴리아민을 사용한 결과 적혈구의 세포내 수분을 세포밖으로 이동시켜 세포내 결정 형성이나 세포막의 파괴를 예방하여 기존의 보존제에 비해 우수한 것으로 나타났다.

적혈구의 제조시 안전성에 대한 평가 기준은 미국 혈액은행협회가 정한 표준이 사용되는데 적혈구 회수율이 적혈구의 80%를 넘어야 하고, 해동 혈액의 상층액에서의 삼투압은 500mOsmol/L 이하를 유지하여야 한다. 본 발명의 적혈구 보존제에 의한 2달간의 냉장 보관실험에서 적혈구 회수율과 삼투압이 기준에 합당하였고 수혈 후 개의 상태도 공지의 보존제에 비해 윌등히 우수한 것으로 판정되었다.

본 발명에 의한 장기(organ) 및 혈액을 보존하기 위한 보존제는 췌장에 대해서는 90시간 보존, 신장에 대해서는 60시간 저장 및 간에 대해서는 최소 30시간이상의 보존기간을 제공하며, 공지의 적혈구보존액에도 적혈구의 세포손상을 줄임으로써 적혈구기능의 저하를 제어할 수가 있다.

Claims

장기(organ) 및 혈액을 보존하기 위한 보존제에 있어서, 폴리아민인 푸트레신 0.01∼2mM, 스퍼미딘 1∼500μM, 스퍼민 1∼500μM 와 약제학적으로 허용된는 담체를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 장기 또는 혈액의 보존·저장용 조성물.
제 1항에 있어서, 피루베이트산 0.1∼10mM, 아스파라긴 0.1∼ 10mM , 아스파라긴산 0.1∼10mM를 함유하는 것을 특징으로 하는 장기 또는 혈액의 보존·저장용 조성물.