BR112016006512B1

BR112016006512B1 - Kits, métodos para preparar solução de conservação de órgãos e tecidos e métodos para conservação de órgãos e tecidos

Info

Publication number: BR112016006512B1
Application number: BR112016006512-3A
Authority: BR
Inventors: Mahendra Suryan
Original assignee: Somahlution, Llc
Priority date: 2013-11-22
Filing date: 2014-11-18
Publication date: 2021-11-23
Also published as: ZA202210899B; JP2016537333A; CN105916374A; CL2016001003A1; MX2016006651A; AU2014353199B2; BR112016006512A2; EP3027016A1; PE20160861A1; CN105916374B; IL244834B; ES2744637T3; PH12016500909A1; MY181282A; US11291201B2; IL244834A0; WO2015077199A1; HK1220081A1; US20160249603A1; DK3027016T3

Abstract

kits de conservação de órgãos, órgão, solução e métodos para preparar solução para conservação de órgãos ou tecidos e tecidos vivos a presente invenção se refere a soluções para conservação de órgãos e tecidos com estabilidade melhorada. as soluções são constituídas por duas soluções separadas. a primeira solução, solução a, é constituído por uma solução salina equilibrada, que é estável em solução a um ph de 7,0 ou acima. uma segunda solução, solução b, é constituída por uma solução aquosa contendo l-glutationa e / ou cisteinilglicina, um açúcar tal como d-glicose, l-arginina, um agente redutor tal como ácido ascórbico e água a um ph inferior a 7,0; de preferência de cerca de 3,0 a 5,0. as duas soluções são então misturadas em conjunto no ponto de utilização e o ph ajustado a cerca de 7,3, resultando na solução para conservação de órgãos e tecidos que tem uma estabilidade melhorada. de preferência, a solução a tem um ph de cerca de 7,6 e a solução b tem um ph de cerca de 5,0. a presente invenção também é constituída por 20 kits que contêm as duas soluções em dois recipientes separados 22, 24. em uma forma de realização alternativa, o açúcar pode estar na solução a.

Description

RELATÓRIO DESCRITIVO Pedidos Relacionados

[001] Este Pedido reivindica o benefício e prioridade ao Pedido de Patente Provisório US pendente n° de Série 61/963.093 anteriormente depositado em 22 de novembro de 2013, cuja divulgação é aqui incorporada por referência em sua totalidade.

Campo da Invenção

[002] A presente invenção é dirigida a formulações para conservação da função de tecidos e órgãos e, mais particularmente, a formulações de longa duração para conservar a função de tecidos e órgãos, em especial a função de condutos vasculares, antes da implantação.

Antecedentes da Invenção

[003] Os ensinamentos de todas as referências aqui citadas são incorporados em sua totalidade por referência.

[004] A Patente US n° 7.981, 596 divulga soluções para conservação de tecidos e órgãos, geralmente chamada GALA. Ela é denominada após três componentes: glutationa, ácido ascórbico e L- arginina. Soluções GALA também incluem uma solução salina equilibrada. Estas soluções são especialmente úteis para a conservação de condutos vasculares, tais como artérias e veias. Condutos vasculares são usados como enxertos para uma variedade de procedimentos cirúrgicos de bypass, incluindo, mas, sem limitação, a cirurgia de bypass vascular periférica e cirurgia de revascularização do miocárdio (CABG). A revascularização é um método no qual um conduto vascular é enxertado de tal forma a ignorar uma artéria obstruída para restaurar o fluxo sanguíneo para um tecido alvo. Durante as cirurgias vasculares, os condutos vasculares são colhidos, lavados e armazenados temporariamente em uma solução de conservação antes do seu enxerto.

[005] A disfunção endotelial é o principal determinante na patogênese interligada que leva à insuficiência do conduto vascular. A falha do enxerto é precedida por trombose do enxerto, hiperplasia intimal e aterosclerose acelerada do enxerto, todas as quais se baseiam em insuficiência funcional e / estrutural anterior do endotélio do conduto vascular. Foi reconhecido que a escolha da solução de armazenamento para os segmentos de veia safena colhidos intraoperativamente tem um impacto significativo sobre a estrutura e a função endotelial e, portanto, a permeabilidade do enxerto. A incapacidade destas soluções de conservar adequadamente o conduto vascular foi demonstrada por uma série de investigadores (Thatte SH, Biswas KS, Najjar SF, et al. Multiphoton microscopic evaluation of saphenous vein endothelium and its preservation with a new solution, GALA. Ann Thorac Surg 2003; 75: 1145- 52and Hussaini 2011). Em um estudo ex vivo de 201 1 por Wilbring et al, demonstrou-se que a função vascular foi completamente abolida depois que condutos colhidos de pacientes foram armazenados em uma solução salina tamponada, comumente utilizada para o armazenamento de conduto vascular. Os dados revelaram que a função das células endoteliais também foi significativamente reduzida, contudo esses condutos disfuncionais foram utilizados com sucesso como enxertos para a cirurgia de bypass neste estudo.

[006] O efeito da solução de conservação GALA™ sobre segmentos de veia safena humana foi avaliada em estudos ex vivo. Enquanto as soluções em uso clínico atualmente levaram a uma queda profunda na viabilidade das células endoteliais de condutos vasculares (veia safena), GALA™ manteve a função endotelial e viabilidade estrutural durante pelo menos 24 horas (Thatte 2003, Circulation 2013:127 e6-e245 Hussaini BE, Lu XG, Wolfe JA e Thatte S. Evaluation of endoscopic vein extraction on structural and functional viability of saphenous vein endothelium. J Cariothorac Surg 2011; 6:82-90). Os dados ex vivo demonstraram, assim, que uma melhor conservação dos condutos vasculares poderia ser conferida através do uso de GALA™ como uma solução de conservação de conduto vascular. No entanto, a solução descrita tem uma vida útil limitada devido à instabilidade da solução.

[007] Assim, há uma necessidade de produzir soluções melhoradas das soluções para conservação de órgãos e tecidos GALA para melhorar a estabilidade e a vida útil da solução.

Sumário da Invenção

[008] A presente invenção tem como premissa a percepção de que a estabilidade da formulação GALA pode ser melhorada através da separação da formulação em uma primeira Solução A tendo um pH de pelo menos 7, geralmente 7,4-8 e uma Solução B com um pH de menos de 7, geralmente mais baixo. A solução A inclui uma solução salina equilibrada. A Solução B inclui água, um antioxidante tal como ácido ascórbico, um agente de redução, em particular L-glutationa, um substrato de óxido nítrico tal como L-arginina e um açúcar, tal como D- glicose. Esta solução é mantida a um pH inferior a 7, de preferência 5, 4 ou 3, e de preferência com um teor de oxigênio a zero partes por milhão. Em uma forma de realização alternativa da presente invenção, as Soluções A e B são formuladas como indicado acima, com a exceção de que o açúcar é adicionado à Solução A e não à Solução B. Além disso, em uma formulação alternativa, eritropoietina (EPO) pode ser adicionada, de preferência à Solução B. reve Descrição dos Desenhos

[009] A FIG. 1 é uma vista em perspectiva de um saco de câmaras múltiplas para uso na presente invenção;

[010] A FIG. 2 é uma vista em perspectiva de um kit com um primeiro e um segundo recipientes para uso com a presente invenção;

[011] As Figs. 3A e 3B são gráficos que representam a concentração ao longo do tempo em condições de armazenagem aceleradas de glutationa, ácido ascórbico e arginina;

[012] A FIG. 4 são dois gráficos que representam a velocidade de degradação de L-glutationa na Solução B; e

[013] As FIGS. 5A-5D são representações em diagrama do método de praticar a presente invenção.

Descrição Detalhada

[014] A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que o normalmente entendido por um perito comum na arte à qual pertence esta invenção. Embora quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos possam ser utilizados na prática ou no teste da presente invenção, os métodos e materiais preferidos são descritos. Para os fins da presente invenção, os seguintes termos são definidos abaixo.

[015] Conforme aqui utilizado, o termo “paciente” inclui os membros do reino animal, incluindo, mas, sem limitação, a seres humanos.

[016] Conforme aqui usado, “órgão” inclui, mas não se limita a, coração, veias, artérias, pulmões, fígado, pâncreas e rins. Partes de órgãos são também contempladas.

[017] Conforme aqui utilizado, “água estéril” inclui, mas não se limita a, (a) água estéril para injeção, USP, (b) água deionizada destilada estéril e (c) água estéril para irrigação.

[018] Conforme aqui utilizado, “cardioplegia” inclui, mas, sem limitação, paralisia do coração.

[019] Conforme aqui utilizado, “hipotermia moderada” é a cerca de 10° - 21°C.

[020] Conforme aqui utilizado, o termo “antioxidante” é uma substância que, quando presente em uma mistura ou estrutura que contém uma molécula biológica de substrato oxidável, atrasa ou impede a oxidação da molécula biológica do substrato. Por exemplo, ácido ascórbico é um antioxidante.

[021] “Solução salina equilibrada” é definida como uma solução aquosa que é osmoticamente equilibrada para prevenir a insuficiência aguda da célula ou tecido.

[022] “Solução salina tamponada” é definida como uma solução salina equilibrada à qual foram adicionadas substâncias químicas para manter um intervalo predeterminado de pH fisiológico.

[023] “GALA” se refere a um tipo de solução de conservação de tecidos, incluindo glutationa, ácido ascórbico, L-arginina e uma solução salina equilibrada.

[024] “Enxerto” é definido como o tecido que é transplantado ou implantado em uma parte do corpo para reparar um defeito.

[025] “Conduto de derivação colhido” é definido como uma rota alternativa instalada cirurgicamente para o sangue contornar uma obstrução.

[026] “Solução de cardioplegia” é definida como uma solução que auxilia na conservação do coração durante transporte ou cirurgia.

[027] “Agente redutor celular” é definido como uma substância que perde elétrons facilmente fazendo assim com outras substâncias sejam reduzidas quimicamente.

[028] Um “agente de tamponamento” é um ácido ou base usada para manter a acidez (pH) de uma solução próxima de um valor escolhido. Os agentes de tamponamento preferidos usados para produzir as soluções da presente invenção são HCl a 4N e 84% de NaHCO3.

[029] Uma solução isotônica se refere a duas soluções com a mesma pressão osmótica através de uma membrana semipermeável. Uma solução isotônica é uma solução que tem a mesma concentração de sal que as células.

[030] Solução fisiológica é definida como uma solução salina aquosa que é compatível com o tecido normal, em virtude de ser isotônica com o fluido intersticial normal.

[031] A presente invenção proporciona uma formulação para conservação de tecido tipo GALA composta de duas soluções, Solução A e Solução B, tendo estabilidade inesperadamente mais elevada do que as soluções de conservação de tecidos de solução única anteriores do tipo GALA.

[032] De acordo com a presente invenção, a primeira solução ou Solução A é constituída por uma solução salina equilibrada. A solução salina equilibrada é composta de água e sais fisiologicamente aceitáveis. Uma solução salina equilibrada típica será constituída por água, íons de cálcio, íons de cloreto, íons de potássio, íons de fosfato, íons de magnésio e íons de sódio.

[033] A solução salina equilibrada inclui sais selecionados a partir do seguinte: cloreto de cálcio di-hidratado, cloreto de potássio, fosfato de potássio monobásico, cloreto de magnésio hexa-hidratado, sulfato de magnésio hepta-hidratado, cloreto de sódio, bicarbonato de sódio, fosfato de sódio dibásico hepta-hidratado e suas combinações. A solução salina equilibrada é proporcionada a uma concentração que vai resultar em uma solução isotônica quando a primeira e a segunda soluções são misturadas em conjunto. Em uma forma de realização exemplificativa, a solução salina equilibrada inclui cerca de 0,14 grama / litro de di-hidrato de cloreto de cálcio; cerca de 0,4 grama / litro de cloreto de potássio; 0,06 grama / litro fosfato de potássio monobásico; cerca de 0,1 grama / litro de cloreto de magnésio hexa-hidratado; cerca de 0,1 grama / litro de sulfato de magnésio hepta-hidratado; cerca de 8 gramas / litro de cloreto de sódio; cerca de 0,36 grama / litro de bicarbonato de sódio e cerca de 0,03 grama / litro de fosfato de sódio dibásico hepta-hidratado.

[034] Os componentes da solução A são dissolvidos em conjunto em água e o pH da solução resultante é ajustado a cerca de 7,48,0 através da adição de uma base, tal como bicarbonato de sódio.

[035] Opcionalmente, a Solução A pode conter agentes anti- inflamatórios não-esteroidais tais como aspirina, naproxeno e ibuprofeno. Opcionalmente, medicamentos anestesia de local podem ser adicionados, de preferência em solução A ou, em alternativa, a medicação de anestesia pode ser adicionada no ponto de utilização. Exemplos de tais medicamentos de anestesia local incluem, mas, sem limitação, lidocaína, articaíne / epinefrina, mepivacaína, bupivacaína, ropicavaína e cloroprocaína.

[036] De acordo com a presente invenção, os seguintes componentes de GALA estarão em uma segunda solução, ou Solução B: Glutationa reduzida, um agente redutor tal como ácido ascórbico; um açúcar tal como D-glicose, L-arginina, um agente de tamponamento e água que tenha sido purgada com um gás inerte, tal como argônio, para remover substancialmente todo o oxigênio dissolvido (de preferência a menos do que 0,1 ppm). O pH da solução B resultante é inferior a 7 e geralmente de 3 a 5. Como alternativa, cisteinilglicina pode ser substituída por Glutationa reduzida ou uma mistura de cisteinilglicina e Glutationa reduzida pode estar presente na Solução B. Em uma formulação preferida, o pH da solução A é 8,0 e o pH da solução B é cerca de 3,0.

[037] Mais especificamente, a Solução B é uma solução de componentes orgânicos em um recipiente separado da solução A e composta de L-glutationa, L-arginina, ácido L-ascórbico, D-glicose e H2O para injeção com um pH de 3,0 - 5.0. Outros açúcares que podem ser usados em lugar da glicose são qualquer açúcar, mas de um modo preferido qualquer monossacarídeo incluindo, mas, sem limitação, a frutose, manose e ribose. Quando as soluções A e B são misturadas no ponto de utilização, o pH da solução mista é de 7,3 ± 0,4. O pH das Soluções A e B pode ser ajustado utilizando diversos agentes de tamponamento conhecidos. Agentes de tamponamento preferidos são HCl a 4N e 84% NaHCO3. Em uma formulação preferida, o pH da solução A é cerca de 7,8 e o pH da solução B é cerca de 4,0. Em uma formulação mais preferida, o pH da Solução A é 8,0 e o pH da Solução B é 3,0.

[038] Os sais na solução estão destinados ao tamponamento (manter o pH) e a manter a isotonicidade com respeito aos condutos vasculares. Os componentes orgânicos são destinados a manter a capacidade de tamponamento adicional, a osmolalidade e a fornecer um ambiente não oxidante para condutos vasculares. Os quatro componentes orgânicos; L-glutationa, ácido L-ascórbico, L-arginina e D- glucose, são constituintes normais do sangue e são incluídos para os seus papéis na conservação e manutenção do ambiente extracelular de condutos vasculares.

[039] A L-Glutationa e o ácido L-ascórbico são antioxidantes que previnem o dano oxidativo às células por absorção de radicais livres. A função destes antioxidantes na solução para conservação de tecidos é, 1) estabilizar outros componentes da solução impedindo a oxidação, melhorando assim a estabilidade e a vida útil do produto e 2) prevenir o dano oxidativo a membranas celulares e a estruturas da matriz extracelular. Mostrou-se que o dano oxidativo quebra a integridade estrutural da arquitetura extracelular, assim causando revestimento celular endotelial interrompido. O revestimento endotelial interrompido é um indicador de enxerto vascular danificado. O açúcar destina-se a proporcionar uma fonte de energia para o tecido ou órgão.

[040] Quando a Solução é combinada com a Solução B, a concentração de L-arginina deve ser de cerca de 250 μM a cerca de 2000 μM. A concentração de glicose deve ser de cerca de 50 mM a cerca de 120 mM, L-glutationa a 50 μM até cerca de 2000 μM, e ácido L-ascórbico a 25 μM até cerca de 1000 μM,

[041] A primeira ou a segunda formulação podem incluir opcionalmente um anticoagulante em uma quantidade suficiente para ajudar a prevenir a coagulação do sangue no interior da vasculatura de um tecido ou órgão. Anticoagulantes ilustrativos incluem heparina e hirudina, mas podem ser utilizados outros anticoagulantes, tal como a aspirina. Uma forma de realização exemplificativa inclui heparina em gamas de concentração de cerca de 50 unidades / mL a cerca de 250 unidades / mL. A heparina também pode ser adicionada em separado depois que as Soluções A e B foram combinadas e antes da utilização.

[042] Em uma forma de realização exemplificativa, a razão volumétrica entre a Solução A e a Solução B é de cerca de 19:1. Por exemplo, em uma forma de realização, 950 ml da solução A são misturados com 50 ml da Solução B para resultar na formulação final para conservar a função de um tecido ou órgão.

[043] Se a EPO é adicionada a qualquer das soluções A ou B, a concentração de EPO deve ser de cerca de 5 unidades / mL quando a Solução A e a Solução B são combinadas.

[044] De acordo com a presente invenção, uma segunda solução alternativa para preservação do tecido inclui uma solução A, que inclui um açúcar tal como glicose, manose, frutose ou semelhantes, em combinação com uma solução salina equilibrada a um pH de 7,4 a 8 e uma segunda solução, Solução B, compreende glutationa reduzida, ácido ascórbico, L-arginina, um agente de tamponamento em água a um pH abaixo de 7, em geral 5, 4 ou 3, que pode ser armazenado em um ambiente livre de oxigênio.

[045] De um modo geral, nem a Solução A nem a B em qualquer forma de realização irá incluir outros componentes orgânicos que não os especificamente listados, uma vez que estes seriam desnecessários e aumentariam os custos de produção. Em particular, compostos orgânicos diferentes dos anteriormente listados que são encontrados em outros tipos de soluções para conservação de tecidos não seriam incluídos na Solução A ou B, para minimizar o custo e reduzir as potenciais reações colaterais, que poderiam ser prejudiciais ao produto final.

[046] O processo de fabricação é robusto e é realizado sob condições cGMP. O produto é esterilizado por meio de procedimentos de enchimento asséptico e testes de estabilidade proporcionam uma vida útil proposta de pelo menos 2 anos.

[047] As FIG. 1 e FIG. 2 mostram formas de realização exemplificativas de kits ou contentores usados para transportar, armazenar e finalmente usar as soluções de preservação de tecidos da presente invenção. Estes são exemplificativas e outros recipientes podem ser utilizados para fornecer Soluções A e B distintas, que são combinadas no ponto de uso para a conservação de tecidos.

[048] A Figura 1 mostra um saco 10 que tem duas câmaras 12 e 14 que são divididas ou fixadas uma separada da outra pelo grampo 16. A câmara 12 contém a Solução A e a câmara 14 contém a Solução B. Quando o grampo 16 é removido, as câmaras 12 e 14 se tornam uma câmara de saco 10 e a Solução A se mistura com a solução B, resultando na completa solução para conservação de órgãos e tecidos no saco 10. Veja a patente US n° 5.257.985.

[049] A Figura 2 mostra um kit de conservação de órgãos e tecidos 20 que tem dois recipientes 22 e 24. A Solução A está contida no recipiente 22 e a Solução B está contida no recipiente 24. No ponto de uso, o conteúdo do recipiente 24 pode ser esvaziado para dentro do recipiente 22 ou o conteúdo tanto do recipiente 22 como do recipiente 24 podem ser tanto esvaziados para dentro de uma bacia ou intestino dentro do qual uma artéria ou veia pode ser colocada para produzir uma solução completa para conservação de órgãos e tecidos.

[050] Em uma forma de realização preferida como mostrado na Figura 2, a solução A é colocada assepticamente em um frasco de Nalgene pré-esterilizado, que é depois protegido com uma tampa de rosca de HDPE pré-esterilizada.

[051] A Solução B é colocada assepticamente em um frasco de vidro, Tipo I, de borosilicato pré-esterilizado, que é fixado com um septo Stelmi pré-esterilizado, que é mantido no lugar com um selo de corte. O selo de corte é cravado à garrafa através de um processo de cravamento validado no ajuste de cravamento recomendado pelo fabricante. O frasco B pode ser desgaseificado com gás argônio, durante o processo de mistura e enchimento para reduzir a presença de oxigênio, mas isso pode não ser necessário.

[052] O frasco contendo a Solução A e o frasco contendo a Solução B são então colocados em uma caixa pré-impressa de cartolina. O folheto também é colocado na caixa neste momento. A caixa é então selada e rotulada de distribuição.

[053] No ponto de uso, as Soluções de A & B são misturadas em conjunto para concluir a Solução final C de GALA e o pH será ajustado a cerca de 7,3 ± 0,4. Se o pH da solução A é 8,0; o pH da Solução B será de cerca de 3,0. Se o pH da Solução A é 7,8; o pH da solução B será de cerca de 4,0. E, se o pH da Solução A é 7,6; o pH da Solução B será de cerca de 5,0.

[054] O que segue é um procedimento recomendado para a prática da presente invenção.

[055] Permitir que as soluções 22 e 24 se aqueçam à temperatura ambiente. Antes do uso, verificar cada recipiente 22 e 24 quanto a fugas por inspeção dos fechos. Se um vazamento for encontrado, descartar o recipiente da solução. Realizar uma inspeção visual da solução quanto a partículas. Não usar a solução se partículas óbvias, precipitados ou contaminação estiver evidente na solução. Imediatamente antes do uso, executar as seguintes etapas: 1. Verter todo o conteúdo da Solução A do frasco 22 para dentro de um recipiente estéril 26 (por exemplo, bandeja, copo ou bacia pequena) em que o conduto vascular 32 será armazenado antes da enxertia, como mostrado na FIG. 5A. 2. Com uma seringa esterilizada 28, remover assepticamente 12,5 ml da Solução B do frasco 24 e adicioná-los ao recipiente 26 com a Solução A (Fig. 5B) para formar a solução GALA 34. 3. Adicionar 12.500 unidades de heparina ao recipiente 26 contendo as Soluções A e B como mostrado na FIG. 5C. 4. Misturar por agitação suavemente no recipiente 26.

[056] A solução é utilizada para lavar o conduto vascular isolado 32 imediatamente após a remoção do paciente. As soluções A e B combinadas podem também ser usadas em combinação com uma seringa para aplicar uma pressão hidrostática ao conduto para avaliar quanto a vazamento do conduto antes do armazenamento na solução. O conduto vascular 32 é então armazenado na solução combinada 34 no recipiente 26 até que o conduto vascular possa ser enxertado no paciente.

[057] As soluções, dispositivos e métodos de perfusão da presente invenção não estão limitados à utilização com um determinado tipo de tecido, órgão ou célula. Por exemplo, a invenção pode ser usada com as veias safenas colhidas, artérias epigástricas, artérias gastroepiploicas e artérias radiais utilizadas na vascularização do miocárdio (CABG). A presente invenção também pode ser utilizada para manter órgãos e tecidos durante as operações de transplante. A presente invenção não é limitada a qualquer tecido ou órgão particular. Por exemplo, é tido em consideração que tais órgãos ou tecidos podem ser o coração, pulmões, rins, cérebro, sangue, plaquetas, enxertos de músculo, pele, intestino, osso, apêndices, olhos, etc. ou suas partes. Além disso, a presente invenção pode ser utilizada como um conservante de tecido ou órgão in situ. Contempla-se que a solução da presente invenção seja utilizada para lavar e banhar tecidos e órgãos que não tenham sido removidos do paciente. Por exemplo, é tido em consideração que a presente invenção seja usada durante a cardioplegia. É também tido em consideração que a presente invenção seja usada em, por exemplo, procedimentos de emergência em que um tecido ou órgão pode precisar ser banhado para conservá-lo até que a cirurgia ou outra atenção médica possa ser obtida. A este respeito, a solução pode ser disponibilizada para o pessoal médico de emergência tanto em ambientes hospitalares quanto “no campo” (isto é, em ambulâncias ou em instalações médicas temporárias de emergência).

[058] A solução GALA (Soluções A e B combinadas) também pode ser usada como uma solução-lavagem em cirurgias, em particular, cirurgia plástica ou reconstrutiva. Isto inclui, mas não se limita a lipoaspiração, reconstrução da mama, mastectomia ou outras operações em que seria desejada uma solução isotônica, de pH equilibrado, tal como GALA. A solução GALA também pode ser utilizada para lavar ou escorvar uma máquina de diálise usando o procedimento do fabricante para escorva ou lavagem. A solução GALA também pode ser usada em conjunto com um suporte externo venoso. Um exemplo desse suporte é o suporte externo vascular Vest™ sendo desenvolvido pela Vascular Graft Solutions de Tel-Aviv, Israel.

[059] Os componentes das soluções para conservação de órgãos e tecidos podem também ser incorporados em géis, cremes ou hidrogéis. Exemplos de hidrogéis são descritos na Patente US n° 6.339.074.

[060] A Tabela 1 abaixo mostra uma forma de realização da presente invenção em que o pH da Solução A é cerca de 8,0 e o pH da Solução B é cerca de 3,0. Tabela 1 Composição Qualitativa Quantitativa das Soluções A e de uma Forma de Realização

[061] Os componentes combinados da Solução A e Solução B são mostrados na Tabela 2: Tabela 2 Composição Qualitativa e Quantitativa das Soluções A Combinadas

[062] Os exemplos seguintes se destinam a ilustrar a invenção, mas não a limitam de qualquer maneira. Exemplo 1

[063] Vários lotes da Solução A e Solução B da Tabela 1 foram produzidos. Vinte e um conjuntos de recipientes da Solução A e B de três lotes separados foram colocados em uma câmara de estabilidade qualificada mantida a 40 °C com 75% de umidade relativa. Recipientes de solução de cada um dos lotes foram periodicamente recolhidos e examinados sob essas condições aceleradas. Os resultados destes dados foram extrapolados para determinar a vida útil do produto, que tinha sido armazenado a 2-8 °C. A determinação da vida útil foi baseada na avaliação do período mínimo de tempo que as soluções de produtos mantiveram-se dentro das especificações definidas. O pH, a osmolalidade e a condutividade das soluções A e B foram estudados. Os oito sais inorgânicos que constituem a Solução A são inertes e permanecem estáveis em meios aquosos durante períodos de tempo prolongados.

[064] Também se verificou que dois dos componentes da solução B, L-arginina e D-glicose, são estáveis durante longos períodos de tempo a um pH de 3. Portanto, com todas as especificações restantes satisfazendo os critérios de aceitação, os dois componentes que influenciaram o resultado final da vida útil do produto foram o ácido L- ascórbico e a L-glutationa devido a suas propriedades antioxidantes.

[065] A base lógica para a propriedade limitante da estabilidade geral foi que a solução mantivesse as condições necessárias para um ambiente de redução no geral. Quando as soluções deixaram de oferecer esse benefício, elas estavam fora da especificação. Um ambiente de redução foi obtido enquanto parte da L-glutationa e ácido L-ascórbico reduzidos, ainda que pequena, permaneceu em seus estados reduzidos em redox, equilíbrio e solução. Em outras palavras, enquanto L- glutationa e ácido L-ascórbico, cada um, permaneceram acima dos limites detectáveis do método analítico.

[066] Os dados obtidos durante o armazenamento da solução a 40 °C foi extrapolado para a temperatura média de armazenamento de 5° dessas soluções usando um fator Q10 de 2. Com base nesta extrapolação, prevê-se que a estabilidade de armazenamento da Solução B é de cerca de 900 dias, proporcionando uma vida útil de pelo menos dois anos, ultrapassando em muito os requisitos da indústria e ultrapassando em muito a estabilidade das formulações atuais. Os dados em bruto obtidos que mostram a concentração de glutationa são mostrados na FIG. 3A e a concentração ao longo do tempo para o ácido ascórbico e a arginina é mostrada na FIG. 3B. EXEMPLO 2

[067] De acordo com a Regra Q10, as relações entre a velocidade constante, temperatura e vida útil podem ser expressas como:

[068] Onde k1 e k2 são as constantes de velocidade a temperaturas T1 e T2 com vidas úteis SLL e SL2. O valor do coeficiente de temperatura Q10 é dependente da energia de ativação Ea para a reação. Portanto, Q10 pode ser calculado utilizando a equação acima se as constantes de velocidade são conhecidas para pelo menos duas temperaturas diferentes. Os valores de P10 são tipicamente de 2, 3 ou 4 dependendo se as estimativas desejadas de vida útil são a) conservadoras, b) prováveis e razoáveis, ou c) menos conservadora possível, respectivamente. Como regra importante, um Q10 de 2 corresponde a Ea de 12,2 kcal / mol; 3 para 19,4 kcal / mol e 4 para 24,5 kcal / mol.

[069] Durante as fases iniciais de apresentação regulamentar do produto, quando um dado cinético detalhado dependente da temperatura pode ainda não estar disponível, uma estimativa conservadora de vida útil deve ser feita. Uma baixa energia de ativação para a reação de degradação é, portanto, assumida com um valor Q10 de 2 para determinar uma estimativa conservadora da vida útil do produto. De acordo com esta regra, a velocidade de reação seria aproximadamente o dobro para cada aumento de 10 graus nas temperaturas de armazenamento, assumindo uma “energia de ativação mais provável” para a reação.

[070] A constante de velocidade de primeira ordem para a decomposição de L-glutationa na Solução B a 40 °C foi determinada como sendo 0,0643 dia-1 a partir de estudos acelerados de dois Lotes da Solução B - um com argônio no headspace e outro sem. Estes perfis são mostrados juntos na Figura 4. O decaimento exponencial de primeira ordem é mostrado no gráfico inferior, e o gráfico logarítmico linear correspondente é mostrado no gráfico superior. Além disso, nesta temperatura (40 °C), as especificações do produto para L-glutationa aproximaram-se do seu limite de validade em cerca de 73 dias. Usando os argumentos na equação acima, uma estimativa conservadora da vida útil a 5 °C pode ser estimada por extrapolação usando um valor Q10 de 2 como a seguir:

* Vida Útil - dias - meses

[071] A partir deste cálculo, por conseguinte, pode-se inferir que, no mínimo, a vida útil da solução B seria prevista como sendo de 27 meses quando o produto é armazenado a 5 °C.

[072] Estudos em tempo real detalhados sobre a estabilidade de três lotes de GMP da Solução B a 2-8 °C após quinze meses de dados recolhidos, no entanto, sugerem que a estimativa de vida útil de 27 meses a partir de estudos acelerados pode ser extremamente conservadora e o fator Q10 real é 2,94.

[073] Os estudos de estabilidade em tempo real a 5 °C progrediram cerca de um ano até agora. Os dados cinéticos de 12-15 meses disponíveis da degradação de L-glutationa desses lotes podem ser ajustados a uma cinética de reação de primeira ordem com uma constante de velocidade de cerca de 1,40 x 10-3 dias-1. Com estas velocidades, a especificação do produto para L-glutationa se aproximou de seu limite de validade em cerca de 100 meses. Surpreendentemente, a vida útil determinada com base em estudos acelerados a 40 °C usando a técnica de extrapolação Q10 foi significativamente mais curta (27 meses) do que o que é sugerido pelos dados efetivos em tempo real. Essa discrepância pode ser racionalizada com base em suposições feitas durante a extrapolação de Q10, conforme descrito abaixo.

[074] A velocidade observada para a degradação de L- glutationa na Solução B da Solução B sob condições aceleradas de 40 °C / 75% de HR ao longo de um período de 65 dias é mostrada na Figura 4. Tendências semelhantes foram observadas para vários outros Lotes da Solução B. Em todos os casos, a velocidade desta reação é puramente exponencial em caracteres (primeira ordem), implicando que o mesmo tempo decorrido dá diminuição fracionada igual na concentração do analito, neste caso a concentração de L-glutationa, ao longo do intervalo de tempo estudado. As constantes de velocidade em ambas a 40 °C e 5 °C de todos os onze Lotes estudados estão resumidas na Tabela 3. Os valores dos expoentes na equação derivada do ajuste exponencial são a constante da velocidade de primeira ordem k1 (em unidades de dias-1). Estes valores são também apresentados na Tabela 3 em cada uma das temperaturas estudadas.

[075] Este valor empiricamente derivado de 2,94 para o coeficiente de temperatura Q10 é mais elevado do que o valor de 2 utilizado nos cálculos anteriores de vida útil. Um valor Q10 = 2 representa uma estimativa muito conservadora da vida útil resultante de uma energia de ativação relativamente baixa de 12 kcal / mmol. A energia de ativação mais elevada de 19 kcal / mmol com um valor Q10 = 2,94, por outro lado, significa que a velocidade da reação seria cerca do triplo para cada aumento de 10 graus na temperatura de armazenamento com uma relação inversa correspondente à vida útil.

[076] Com o valor Q10 revisto de 2,94 que é mais representativo da verdadeira energia de ativação de 19,0 kcal / mol para a decomposição da L-glutationa, a vida útil da Solução B pode ser recalculada ou extrapolando os dados de vida útil a 40 °C de e / ou diretamente a partir do ajuste exponencial dos dados em tempo real de um ano a 5 °C. Os valores revistos são apresentados na Tabela 3.

[077] A disparidade nos resultados obtidos pelas duas abordagens é ilustrada na comparação das vidas úteis a várias temperaturas entre 5 °C e 60 °C, por extrapolação dos dados empíricos a 40 °C utilizando valores Q10 de 2 (conservador) e 2,94 (empírico). Os resultados são mostrados na Tabela 4. Tabela 3. Constantes de Velocidade Vida Útil a partir de Estudos de Estabilidade

[078] Deste modo, a vida útil é significativamente melhorada separando os componentes da solução GALA em uma solução salina equilibrada de pH mais elevado, que opcionalmente pode incluir glicose, e armazenando os componentes orgânicos, em particular o ácido ascórbico L-arginina e glutationa mais opcionalmente um açúcar a pH muito mais baixo. Foi inesperadamente descoberto que o aumento da estabilidade da glutationa reduzida também aumenta a estabilidade do ácido ascórbico e L-Arginina. A estabilidade de armazenamento das duas soluções excede em muito as expectativas ou necessidades comerciais, tornando esta formulação muito mais prática e adequada para uma ampla variedade de ambientes diferentes. Isto proporciona um resultado final de melhoria do desempenho do enxerto, melhora da viabilidade celular do material de enxerto.

[079] Esta foi uma descrição da presente invenção, juntamente com o método preferido de praticar a presente invenção. No entanto, a própria invenção só deve ser definida pelas Reivindicações anexas.

Claims

1. Kit de conservação de órgãos e tecidos, caracterizado por que compreende uma primeira solução aquosa contida em um primeiro recipiente e uma segunda solução contida em um segundo recipiente, em que a primeira solução aquosa é compreendida de uma solução salina equilibrada e a referida primeira solução tem um pH de 7,4 a 8,0; e em que a segunda solução é compreendida de água, glutationa reduzida, ácido ascórbico, um açúcar, L-arginina e a referida segunda solução tem um pH de 5,0 ou menos.

2. Kit de conservação de órgãos e tecidos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por que o primeiro e o segundo recipientes são primeira e segunda câmaras dentro de um único recipiente e as primeira e segunda câmaras são separadas uma da outra por uma divisória, em que após a remoção da divisória, a primeira solução se mistura com a segunda solução para formar a solução de conservação completa de órgão e tecidos.

3. Kit de conservação de órgãos e tecidos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por que o pH da primeira solução é 7,8 e o pH da segunda solução é 4,0.

4. Kit de conservação de órgãos e tecidos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por que o pH da primeira solução é 7,6 e o pH da segunda solução é 5,0.

5. Método para preparar solução para conservação de órgãos ou tecidos usando o kit conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 caracterizado por que compreende: preparar uma primeira solução compreendendo a formação de uma solução salina equilibrada tendo um pH de 7,6 a 8,0; preparar uma segunda solução compreendida de água, D- glicose, L-Arginina; glutationa e ácido ascórbico e tendo um pH de 3 a 5; e no ponto de uso, misturar a primeira solução juntamente com a segunda solução para formar uma solução combinada com um pH de 7,3 ± 0,4.

6. Método para conservação de órgãos ou tecidos ex vivo caracterizado por que compreende formar uma solução preparada pelo método como definido na reivindicação 5 e colocar o tecido ou órgão em contato com a referida solução.

7. Método para conservação de órgãos ou tecidos ex vivo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por que o tecido ou órgão é selecionado a partir do grupo que consiste em veias safenas, artérias epigástricas, artérias gastroepiploicas, artérias radiais, coração, pulmões, rins, cérebro, enxertos de músculo, pele, intestino, osso, apêndices, olhos e partes dos referidos tecidos ou órgãos.

8. Kit de conservação de órgãos e tecidos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por que a primeira solução tem um pH de 7,6 a 8,0 e a segunda solução tem um pH de 3 a 5.

9. Método para preparar solução para conservação de órgãos ou tecidos usando o kit conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 caracterizado por que compreende: preparar uma primeira solução compreendida de uma solução aquosa salina equilibrada com um pH de 7,6 a 8,0; preparar uma segunda solução compreendida de água, um açúcar, L- Arginina, glutationa e ácido ascórbico tendo um pH de 3 a 5, e no ponto de uso misturar a primeira solução juntamente com a segunda solução.

10. Método para preparar solução para conservação de órgãos ou tecidos, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por que o pH da primeira solução é 7,6 e o pH da segunda solução é 5,0.

11. Kit de conservação de órgãos e tecidos, caracterizado por que compreende uma primeira solução aquosa contida em um primeiro recipiente e uma segunda solução contida em um segundo recipiente, em que a primeira solução aquosa é compreendida de uma solução salina equilibrada e a referida primeira solução tem um pH de 7,4 a 8,0; em que a segunda solução é compreendida de água, cisteinilglicina, glutationa reduzida, ácido ascórbico, um açúcar, L-arginina, um agente de tamponamento, e água que tenha sido purgada com um gás inerte para remover substancialmente todo o oxigênio dissolvido, e opcionalmente cisteinilglicina, e em que a referida segunda solução tem um pH de menos de 7.

12. Kit de conservação de órgão e tecido, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por que a cisteinilglicina é substituída por glutationa reduzida.

13. Método para preparar solução para conservação de órgãos ou tecidos usando o kit conforme definido em qualquer uma das reivindicações 11 a 12 caracterizado por que compreende: preparar uma primeira solução compreendendo a formação de uma solução salina equilibrada com um pH de 7,6 a 8,0; preparar uma segunda solução compreendida de água, D- glicose, L-arginina; cisteinilglicina e ácido ascórbico a um pH de 3 a 5; e no ponto de uso, misturar a primeira solução juntamente com a segunda solução.

14. Método para preparar solução para conservação de órgãos ou tecidos, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por que a segunda solução é ainda compreendida de glutationa reduzida.

15. Método para conservar tecidos ou órgãos vivos usando o kit conforme definido em qualquer uma das reivindicações 11 a 12 caracterizado por que compreende: combinar uma primeira solução aquosa com uma segunda solução aquosa; em que a referida primeira solução aquosa é compreendida de uma solução salina equilibrada e está a um pH de 7,4 a 8,0; em que a referida segunda solução é compreendida de água, um açúcar, glutationa reduzida, ácido ascórbico, L- arginina a um pH de 5,0 ou menos, para formar uma solução; e pôr em contato o referido tecido ou órgão com a referida solução combinada.

16. Método para conservar tecidos ou órgãos vivos, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por que o referido pH da referida primeira solução é 8 e o pH da referida segunda solução é 3.

17. Método para conservar tecidos ou órgãos vivos, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por que a cisteinilglicina é substituída por glutationa na referida segunda solução ou a referida segunda solução inclui ainda cisteinilglicina.

18. Kit de conservação de órgãos e tecidos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por que o pH da primeira solução é 8,0 e o pH da segunda solução é 3,0.

19. Método para conservar tecidos ou órgãos vivos usando o kit conforme definido em qualquer uma das reivindicações 11 a 12 caracterizado por que compreende: combinar uma primeira solução aquosa com uma segunda solução aquosa; em que a referida primeira solução aquosa compreende uma solução salina equilibrada com um pH de 7,6 a 8,0; e em que a referida segunda solução compreende água, L- arginina, um açúcar, glutationa reduzida, ácido ascórbico e, opcionalmente, cisteinilglicina a um pH de 3 a 5, assim formando uma solução combinada; e pôr em contato o referido tecido ou órgão com a referida solução combinada.