KR102428676B1 - 장기 및 조직 보존 용액의 안정성 및 유효 기간을 증가시키기 위한 용액 - Google Patents

Abstract

개선된 안정성을 갖는 장기 및 조직 보존 용액이 개시된다. 용액은 2개의 분리 용액으로 구성된다. 제1용액, 용액 A은, 7.0 이상의 pH에서 용액 내에서 안정적인 평형의 염 용액으로 구성된다. 제2용액, 용액 B은, 7.0 아래, 바람직하게는 대략 3.0 내지 5.0의 pH에서, L-글루타티온 및/또는 시스테이닐글리신, D-글루코오스와 같은 설탕, L-아르기닌, 아스코르브산과 같은 환원제 및 물을 함유하는 수용액으로 구성된다. 그 다음, 2개의 용액은 사용 현장에서 및 대략 7.3으로 조절된 pH에서 함께 혼합되어, 개선된 안정성을 갖는 장기 및 조직 보존 용액으로 귀결된다. 바람직하게는, 용액 A는 대략 7.6의 pH를 갖고, 용액 B는 대략 5.0의 pH를 갖는다. 또한, 본 발명은, 2개의 분리 용기(22, 24) 내의 2개의 용액을 함유하는 키트(20)로 구성된다. 대안적인 실시형태에 있어서, 설탕은 용액 A에서 될 수 있다.

Description

장기 및 조직 보존 용액의 안정성 및 유효 기간을 증가시키기 위한 용액 {SOLUTIONS FOR INCREASING THE STABILITY AND SHELF LIFE OF AN ORGAN AND TISSUE PRESERVATION SOLUTION}

본 출원은, 그 개시 내용 전체가 참조로 본 명세서에 통합된 2013년 11월 22일 출원된, 계류중인 미국 예비특허 출원 번호 제61/963,093호의 이득 및 우선권을 청구한다.

본 발명은 조직 및 장기 기능을 보존하기 위한 제제에 관한 것이고, 특히 이식에 앞서서 혈관 도관의 기능인 조직 및 장기 기능을 보존하기 위한 상온에서 안정적인 제제(shelf shelf formulation)에 관한 것이다.

본 명세서에 언급된 모든 참조 문헌의 기술은 그 전체가 참조로 통합된다.

U.S. 특허 번호 제7,981,596호는 GALA로 일반적으로 불리는 조직 및 장기 보존 용액을 개시한다. 이는 3개의 성분의 이름을 따서 명명된다: 글루타티온, 아스코르브산 및 L-아르기닌. 또한, GALA 용액은 평형의 염 용액을 포함한다. 특히, 이들 용액은 동맥 및 정맥과 같은 혈관 도관을 보존하기 위해 유용하다. 혈관 도관은 주변 혈관 우회 수술 및 관상 동맥 우회로 조성술 수술(coronary artery bypass grafting (CABG) surgery)과 같은 다양한 우회 수술 과정을 위한 그라프트(graft)로서 사용된다. 우회 이식(Bypass grafting)은, 표적 조직으로 흐르는 혈액을 복구시키기 위해서 가로막힌 동맥을 우회하는 방식으로 혈관 도관이 이식되는 방법이다. 혈관 수술 동안, 혈관 도관은 채취되고, 플러시(flush)되며, 그들의 이식에 앞서서 보존 용액 내에 임시로 저장된다.

내피적인 기능 장애(Endothelial dysfunction)는 혈관 도관 부전을 발생시키는 밀접한 관계의 병인에서 1차적인 결정 요인이다. 이식 실패는 이식 혈전증, 내피 과식증 및 가속된 이식 아테몰성 동맥 경화증(atherosclerosis)에 의해 진행되는데, 이들 모두는 혈관 도관 내피의 이전의 기능적인 및/구조적인 손상에 근거를 둔다. 수술중 채취된 복재 정맥(saphenous vein) 세그먼트를 위한 저장 용액의 선택은, 내피적인 구조 및 기능 및 그 이식 개방성(graft patency)에 상당한 영향을 준다. 혈관 도관을 충분히 보존하기 위한 이들 용액의 무능은, 다수의 연구자에 의해 증명된다(Thatte HS, Biswas KS, Najjar SF, et al. Multi-photon microscopic evaluation of saphenous vein endothelium and its preservation with a new solution, GALA. Ann ThoracSurg 2003; 75: 1145-52and Hussaini 2011). Wilbring 등에 의한 2011 탈체(ex vivo) 연구에서는, 환자로부터 채취된 도관이 혈관 도관 저장을 위해 일반적으로 사용되는 완충된 생리식염수 내에 저장된 후, 혈관 기능이 완전히 파괴되었던 것을 증명했다. 데이터는, 내피 세포 기능이 또한 상당히 감소되어, 이들 기능 장애의 도관이 이 연구에서 우회 수술을 위한 그라프트로서 아직 성공적으로 사용되지 않았던 것을 밝혔다.

휴먼 복제 정맥 세그먼트에 대한 GALA™ 보존 용액의 영향은, 탈체(ex vivo) 연구에서 평가되었다. 오늘날의 임상 사용에서의 용액은 혈관 도관(복제 정맥)의 내피 세포 생존 능력에서 심한 감퇴를 이끌어 내는 한편, GALA™는 적어도 24 시간까지 내피적인 기능 및 구조적인 생존 능력을 지속했다(Thatte 2003, Circulation 2013:127 e6-e245 Hussaini BE, Lu XG, Wolfe JA and Thatte S. Evaluation of endoscopic vein extraction on structural and functional viability of saphenous vein endothelium. J CariothoracSurg 2011; 6:82-90). 따라서, 탈체(ex vivo) 데이터는, 혈관 도관의 양호한 보존이 혈관 도관 보존 용액으로서 GALA™의 사용을 통해서 될 수 있는 것을 증명했다. 그러데, 개시된 용액은 용액의 불안정성에 기인해서 제한된 유효 기간을 갖는다.

따라서, 용액의 안정성 및 유효 기간을 개선하기 위해 GALA 장기 및 조직 보존 용액의 개선된 용액을 생산할 필요가 있다.

본 발명은, GALA 제제의 안정성이, 제제를, 적어도 7, 일반적으로 7.4-8의 pH를 갖는 제1용액 및 7 미만, 일반적으로 아래의 pH를 갖는 제1용액으로 분리함으로써 개선될 수 있다는 사실에, 전제한다. 용액 A는 평형의 염 용액을 포함한다. 용액 B는, 물, 아스코르브산과 같은 산화 방지제, 환원제, 특히 L-글루타티온, L-아르기닌과 같은 일산화 질소 기질 이러한 및 D-글루코오스와 같은 설탕을 포함한다. 이 용액은, 7 아래, 바람직하게는 5, 4 또는 3의 pH에서 유지되고, 바람직하게는 제로 ppm(parts per million)에서 산소 함량을 갖는다. 본 발명의 대안적인 실시형태에 있어서, 용액 A 및 B는, 설탕이 용액 A에 첨가되고 용액 B에 첨가되지 않는 것을 제외하고, 상기된 바와 같이 형성된다.

또한, 대안적인 제제에 있어서는, 에리스포이에틴(EPO: erythropoietin)이, 바람직하게는 용액 B에 첨가될 수 있다.

도 1은 본 발명에서 사용하기 위한 멀티-챔버 백(multi-chamber bag)의 사시도;
도 2는 본 발명과 함께 사용하기 위한 제1 및 제2용기를 갖는 키트의 사시도;
도 3A 및 3B는 글루타티온, 아스코르브산 및 아르기닌의 가속된 저장 조건에서 시간에 걸친 농도를 나타내는 그래프;
도 4는 용액 B 내의 L-글루타티온의 저하 속도를 묘사하는 2개의 그래프;
도 5A-5D는 본 발명을 실시하는 방법의 도식적인 묘사이다.

다르게 정의되지 않는 한, 여기서 사용된 모든 기술적인 및 과학적인 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 동일한 의미를 갖는다. 여기에 기술된 것과 동일한 또는 동등한 소정의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 테스트에서 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료가 기술된다. 본 발명의 목적을 위해서, 다음 용어들이 아래와 같이 정의된다.

여기서 사용됨에 따라, 용어 "환자"는, 이에 제한되지 않지만, 인간을 포함하는 동물계의 멤버를 포함한다.

여기에 채용됨에 따라, "장기"는, 이에 제한되지 않지만, 심장, 정맥, 동맥, 폐, 간장, 췌장 및 신장을 포함한다. 장기의 부분이 또한 고려된다.

여기서 사용됨에 따라, "살균수(sterile water)"는, 이에 제한되지 않지만, (a) 주사용 살균수, USP, (b) 살균 증류된 탈염수, 및 (c) 세정용 살균수를 포함한다.

여기서 사용됨에 따라, "심장마비(cardioplegia)"는, 이에 제한되지 않지만, 심장의 마비를 포함한다.

여기서 사용됨에 따라, "보통의 저체온증(moderate hypothermia)"은 대략 10°- 21℃이다.

여기서 사용됨에 따라, "산화 방지제"는 산화성 기질 생물학적인 분자를 함유하는 혼합물 또는 구조 내에 존재할 때, 기질 생물학적인 분자의 산화를 지연 또는 방지하는 물질이다. 예를 들어, 아스코르브산은 산화 방지제이다.

"평형의 염 용액"은 격렬한 세포 또는 조직 손상을 방지하기 위해 삼투적으로 평형인 수용액으로서 규정된다.

"완충된 염 용액"은 사전 결정된 생리학적 pH 범위를 유지하기 위해서 화학 물질이 첨가된 평형의 염 용액으로서 규정된다.

"GALA"는, 글루타티온, 아스코르브산, L-아르기닌 및 평형의 염 용액을 포함하는 한 타입의 조직 보존 용액을 언급한다.

"그라프트(Graft)"는 결손을 회복하기 위해서 신체의 부분 내에 트랜스플랜트(transplant)된 또는 임플랜트(implant)된 조직으로서 규정된다.

"채취된 우회 도관"은 장애물을 우회하는 혈액에 대해서 외과적으로 설치된 대안적인 경로로서 규정된다.

"심장마비의 용액"은, 운송 또는 수술 동안 심장의 보존을 돕는 용액으로서 규정된다.

"세포의 환원제"는 전자를 쉽게 잃고 이에 의해 다른 물질이 화학적으로 환원되게 하는 물질로서 규정된다.

"완충제"는 선택된 값에 근접한 용액의 산성도(pH)를 유지하기 위해서 사용된 산(acid) 또는 염기(base)이다. 본 발명의 용액을 생산하기 위해 사용된 바람직한 완충제는 4N HCl 및 84% NaHCO₃이다.

등장(isotonic) 용액은 반투성 멤브레인을 가로지르는 동일한 삼투성 압력을 갖는 2개의 용액으로 언급한다. 등장 용액은 세포와 동일한 염 농도를 갖는 용액이다.

생리학적인 용액은, 정상 간질액(interstitial fluid)으로 등장됨으로써 정상 조직과 양립하는 수성 염 용액으로서 규정된다.

본 발명은 2개의 용액으로 구성된 GALA-타입 조직 보존 제제를 제공하는데, 용액 A 및 용액 B는 GALA 타입의 종래의 단일-용액 조직 보존 용액보다 예상외의 더 높은 안정성을 갖는다.

본 발명에 따르면, 제1용액 또는 용액 A는 평형의 염 용액으로 구성된다. 평형의 염 용액은 물 및 생리학적으로 용인되는 염으로 이루어진다. 전형적인 평형의 염 용액은 물, 칼슘 이온, 염화 이온, 칼륨 이온, 인산염 이온, 마그네슘 이온 및 소듐 이온으로 구성될 것이다.

평형의 염 용액은 다음으로부터 선택된 염을 포함한다: 염화칼슘 수화물(calcium chloride dihydrate), 염화칼슘, 인산캄륨 1염기(potassium phosphate monobasic), 염화마그네슘 6수화물(magnesium chloride hexahydrate), 황산마그네슘 7수화물(magnesium sulfate heptahydrate), 염화나트륨, 중탄산나트륨(sodium bicarbonate), 인산나트륨 2염기 7수화물(sodium phosphate dibasic heptahydrate) 및 그 조합. 평형의 염 용액은 제1 및 제2용액이 함께 혼합될 때 등장 용액으로 귀결되는 농도로 제공된다. 예시적인 실시형태에 있어서, 평형의 염 용액은, 대략 0.14 grams/liter 염화칼슘 수화물, 대략 0.4 grams/liter 염화칼슘, 0.06 grams/liter 인산캄륨 1염기, 대략 0.1 grams/liter 염화마그네슘 6수화물 대략 0.1 grams/liter 황산마그네슘 7수화물, 대략 8 grams/liter 염화나트륨, 대략 0.36 grams/liter 중탄산나트륨, 및 대략 0.03 grams/liter 인산나트륨 2염기 7수화물을 포함한다.

용액 A의 성분은 물에서 함께 용해되고, 결과 용액의 pH는 중탄산나트륨과 같은, 염기의 첨가에 의해 대략 7.4 - 8.0로 조절된다.

옵션으로, 용액 A는 아스피린, 니프록센(naproxen) 및 이부프로펜(ibuprofen)과 같은 비스테로이드 항염증제(non-steroidal anti-inflammatory agent)를 함유할 수 있다. 옵션으로, 국소 마취 약품은, 바람직하게는 용액 A 내에 첨가될 수 있고, 또는 대안적으로, 마취 약품은 사용 현장에서 첨가될 수 있다. 이러한 국소 마취 약품의 예들은, 이에 제한되지 않지만, 리도카인(lidocaine), 아르티카인(articaine)/에피네프린(epinephrine), 메피바카인(mepivacaine), 부피바카인(bupivacaine), 로피카바인(ropicavaine) 및 클로로프로카인(chloroprocaine)을 포함한다.

본 발명에 따르면, GALA의 다음의 성분이 제2용액, 또는 용액 B 내에 있게 될 것이다: 실질적으로 모든 용해된 산소를 제거하기 위해서(바람직하게는, 0.1ppm 미만), 환원된 글루타티온, 아스코르브산과 같은 환원제; D-글루코오스와 같은 설탕, L-아르기닌, 완충제, 및 아르곤과 같은 불활성 가스로 퍼지된(purged) 물. 결과의 용액 B의 pH는 7 미만이고, 일반적으로 3 내지 5이다. 대안으로서, 시스테이닐글리신(cysteinylglycine)은 환원된 글루타티온을 대체할 수 있거나 또는 시스테이닐글리신과 환원된 글루타티온의 혼합물이 용액 B 내에 존재할 수 있다. 바람직한 제제에 있어서, 용액 A의 pH는 8.0이고 용액 B의 pH는 대략 3.0이다.

특히, 용액 B는 용액 A로부터 분리된 용기 내의 유기 성분의 용액이고, 3.0-5.0의 pH에서 주사를 위해 L-글루타티온, L-아르기닌, L-아스코르브산, D-글루코오스 및 H₂O로 이루어진다. 글루코오스 대신 사용될 수 있는 다른 설탕은 소정의 설탕인데, 이에 제한되지 않지만, 과당, 마노스(mannose) 및 리보오스(ribose)를 포함하는 바람직하게는 소정의 단당류이다. 용액 A 및 B가 사용 현장에서 혼합될 때, 혼합된 용액의 pH는 7.3 ± 0.4이다. 용액 A 및 B의 pH는 많은 공지된 완충제를 사용해서 조절될 수 있다. 바람직한 완충제는 4N HCl 및 84% NaHCO₃이다. 바람직한 제제에 있어서, 용액 A의 pH는 대략 7.8이고 용액 B의 pH는 대략 4.0이다. 바람직한 제제에 있어서, 용액 A의 pH는 8.0이고 용액 B의 pH는 3.0이다.

용액 내의 염은 완충(유지 pH)을 의도하고, 혈관 도관에 대해서 등장성을 유지시키기 위한 것이다. 유기 성분은 추가적인 완충 능력, 삼투압 몰농도(osmolality)를 유지하는 것을 의도하고, 혈관 도관에 비-산화하는 환경을 제공하는 것을 의도한다. 4개의 유기 성분; L-글루타티온, L-아스코르브산, L-아르기닌 및 D-글루코오스은 혈액의 정상 구성 요소이고, 혈관 도관의 세포 밖의 환경을 보존 및 유지하는 그들의 역할을 위해 포함된다.

L-글루타티온 및 L-아스코르브산은, 자유 라디칼을 소킹 업(soaking up)함으로써 세포에 대한 산화의 손상을 방지하는 산화 방지제이다. 조직 보존 용액 내의 이들 산화 방지제의 기능은, 1) 산화를 방지함으로써 용액의 다른 성분을 안정화시키고, 이에 의해 생산물의 안정성 및 유효 기간을 개선하고, 2) 세포 멤브레인 및 세포 밖의 매트릭스 구조에 대한 산화의 손상을 방지시키는 것이다. 산화의 손상은 세포 밖의 아키텍처의 구조적인 무결성을 부수는 것으로 보였고, 따라서 중단된 내피 세포 라이닝(endothelial cell lining)을 일으킨다. 중단된 내피 세포 라이닝은 손상된 혈관 그라프트의 인디케이터이다. 설탕은 조직 또는 장기에 대한 에너지 소스를 제공하는 것을 의도한다.

용액 A가 용액 B와 결합할 때, L-아르기닌의 농도는 대략 250 μM 내지 대략 2000 μM로 되어야 한다. 글루코오스의 농도는 대략 50 mM 내지 대략 120 mM이고, L-글루타티온 50 μM 내지 대략 2000 μM, 및 L-아스코르브산 25 μM 내지 대략 1000 μM이 되어야 한다.

옵션으로, 제1 또는 제2제제는 조직 또는 장기의 맥관 구조 내의 혈액의 응고를 방지하는 것을 돕는데 충분한 양의 혈액 응고 방지제를 포함할 수 있다. 예시적인 혈액 응고 방지제는 해파린(heparin) 및 히루딘(hirudin)을 포함하지만, 아스피린과 같은 다른 혈액 응고 방지제가 사용될 수 있다. 예시적인 실시형태는, 대략 50 units/mL로부터 대략 250 units/mL의 농도 범위 내의 해파린을 포함한다. 또한, 해파린은, 사용에 앞서, 용액 A 및 B가 결합된 후, 분리해서 첨가될 수 있다.

예시적인 실시형태에 있어서, 용액 A 및 용액 B 사이의 부피 비율은 대략 19:1이다. 예를 들어, 한 실시형태에 있어서는, 950 ml의 용액 A가 50 ml의 용액 B와 혼합되어, 조직 또는 장기의 기능을 보존하기 위한 최종 제제로 귀결된다.

EPO가 용액 A 또는 B에 첨가되면, EPO의 농도는 용액 A 및 용액 B가 결합될 때 대략 5 units/mL이 되어야 한다.

본 발명에 따르면, 제2의 대안적인 조직 보존 용액은, 7.4 내지 8의 pH에서 평형의 염 용액과 결합하는, 글루코오스, 마노스, 과당 등과 같은 설탕을 포함하는 용액 A 및, pH 7 아래, 일반적으로 5, 4 또는 3에서 물 내에 환원된 글루타티온, 아스코르브산, L-아르기닌, 완충제를 포함하는 제2용액, 용액 B를 포함하는데, 무산호 환경 내에 저장될 수 있다.

일반적으로, 이들이 불필요하게 되고 생산 비용이 증가됨에 따라, 어느 실시형태에 있어서의 용액 A 또는 B는 명확히 리스트된 것 이외의 다른 유기 성분을 포함하지 않게 될 것이다. 특히, 다른 타입의 조직 보존 용액 내에서 발견된 이전에 리스트된 것과 다른 유기 화합물은, 비용을 최소화하고 최종 생산물에 대해서 해롭게 될 수 있는 잠재적인 부반응을 감소시키기 위해서, 용액 A 또는 B 내에 포함되지 않게 된다.

제조 프로세스는 강건하고, cGMP 조건 하에서 수행된다. 생산물은 무균 충전(aseptic filling) 과정에 의해 살균되고, 안정성 테스트는 적어도 2 년의 제안된 유효 기간을 제공한다.

도 1 및 도 2는 본 발명의 조직 보존 용액을 수송, 저장 및 최종적으로 사용하기 위해 사용된 예시적인 실시형태의 키트 또는 용기를 나타낸다. 이들은 예시적이고, 다른 용기가 조직 보존을 위한 사용 현장에서 결합된 분리 용액 A 및 B를 제공하기 위해 사용될 수 있다.

도 1은 2개의 클램프(16)에 의해 구획된 또는 클램프 오프(clamp off)된 챔버(12 및 14)를 갖는 백(10)을 나타낸다. 챔버(12)는 용액 A를 함유하고 챔버(14)는 용액 B를 함유한다. 클램프(16)가 제거될 때, 챔버(12 및 14)는 백(10)의 한 챔버가 되고, 용액 A는 용액 B와 혼합하여, 백(10) 내의 완성된 장기 및 조직 보존 용액으로 귀결된다. U.S. 특허 번호 제5,257,985호 참조.

도 2는 2개의 용기(22 및 24)를 갖는 장기 및 조직 보존 키트(20)를 나타낸다. 용액 A는 용기(22) 내에 함유되고, 용액 B는 용기(24) 내에 함유된다. 사용 현장에서, 용기(24)의 내용물은 용기(22) 내로 흐르게 될 수 있게 되거나 또는 양쪽 용기(22) 및 용기(24) 내의 내용물은 모두 그릇(basin) 또는 창자(bowel) 내로 흐르게 될 수 있는데, 이들 내로 동맥 또는 정맥이 완성된 장기 및 조직 보존 용액을 생산하기 위해서 위치될 수 있다.

도 2에 나타낸 바와 같은 바람직한 실시형태에 있어서, 용액 A는 사전-살균된 날진(Nalgene) 병 내에 무균으로 충전되는데, 이 병은 그 다음 사전-살균된 HDPE 나사 뚜껑으로 고정된다.

용액 B는 사전-살균된 붕규산염, 타입 I, 유리병 내에 무균으로 충전되는데, 이 유리병은 사전-살균된 스텔미 격막(Stelmi septum)으로 고정되고, 이는 티어-오프 실(tear-off seal)로 고정된다. 티어-오프 실은, 제조업자의 추천된 크림핑 세팅에서 인증된 크림핑 프로세스를 사용해서 병에 크림핑된다. 병 B는 산소의 존재를 감소시키기 위해서 혼합 및 충전 프로세스 동안 아르곤 가스로 탈기될 수 있지만, 이는 반드시 필요하진 않다.

그 다음, 용액 A를 함유하는 병 및 용액 B를 함유하는 병은 카드-스톡(card-stock) 사전 인쇄된 박스 내에 위치된다. 또한, 이때, 패키지 인서트(package insert)가 박스 내에 위치된다. 그 다음, 박스는 배포를 위해 실되고 라벨이 붙는다.

사용 현장에서, 용액 A 및 B는 함께 혼합되어 GALA의 최종 용액 C를 완성하고, pH는 대략 7.3 ± 0.4로 조절될 것이다. 용액 A의 pH가 8.0이면, 용액 B의 pH는 대략 3.0이 될 것이다. 용액 A의 pH가 7.8이면, 용액 B의 pH는 대략 4.0이 될 것이다. 그리고, 용액 A의 pH가 7.6이면, 용액 B의 pH는 대략 5.0이 될 것이다.

다음은 본 발명을 실시하기 위한 추천된 과정이다.

용액 22 및 24을 주위 또는 실내 온도로 따뜻하게 하자. 사용에 앞서, 폐쇄를 조사함으로써 누출에 대해서 각각의 용기(22 및 24)를 체크하자. 누출이 발견되면, 용액 용기를 폐기하자. 미세 물질에 대한 용액의 시각적인 조사를 수행한다. 명백한 미세 물질, 침전물, 또는 오염이 용액 내에서 분명하면, 용액을 사용하지 않는다. 사용 직전에, 다음의 단계들을 수행하자:

1. 용액 A의 전체 내용물을 유리병(22)으로부터, 혈관 도관(32)이 도 5A에 나타낸 바와 같이, 이식하기에 앞서 저장되는, 살균한 용기(26)(예를 들어, 트레이, 컵 또는 작은 그릇) 내에 붙자.

2. 살균한 주사기(28)로, 12.5 ml의 용액 B를 유리병(24)으로부터 무균으로 제거하고, 이를 용액 A를 갖는 용기(26(도 5B))에 첨가하여, GALA 용액(34)을 형성하자.

3. 도 5C에 나타낸 바와 같이, 12,500 unit의 해파린을 용액 A 및 B를 함유하는 용기(26)에 첨가하자.

4. 용기(26)를 완만하게 스월링함(swirling)으로 혼합한다.

용액은 환자로부터 제거된 직후 분리된 혈관 도관(32)을 플러시하기 위해 사용된다. 또한, 결합된 용액 A 및 B는 용액 내의 저장에 앞서 도관 누출을 평가하기 위한 유체 정압(hydrostatic pressure)을 도관에 인가하기 위해서 주사기와 조합해서 사용될 수 있다. 그 다음, 혈관 도관(32)은, 혈관 도관이 환자 내에 이식될 수 있을 때까지, 용기(26) 내의 결합된 용액(34) 내에 저장된다.

본 발명의 용액, 장치, 및 관류(perfusion) 방법은, 특정 조직, 장기 또는 세포 타입의 사용에 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 발명은 관상의 우회 이식(CABG)에서 사용된 채취된 복재 정맥, 상복부의 동맥, 위대망의 동맥 및 요골 동맥과 함께 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 트랜스플랜트 수술 동안 장기 및 조직을 유지하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명은 소정의 특정 조직 또는 장기에 제한되지 않는다. 이러한 장기 또는 조직이 심장, 폐, 신장, 뇌, 혈액, 혈소판, 근육 그라프트, 피부, 장, 뼈, 부속지 눈, 등 또는 이의 부분이 될 수 있는 것으로 고려된다. 더욱이, 본 발명은 제자리(in situ) 조직 또는 장기 보존제로서 사용될 수 있다. 본 발명의 용액은 환자로부터 제거되지 않은 조직 및 장기를 워시 앤드 배스(wash and bath)하는데 사용되는 것으로 고려된다. 예를 들어, 본 발명은 심장마비 동안 사용되는 것으로 고려된다. 또한, 본 발명은, 예를 들어, 수술 또는 다른 치료가 달성될 때까지, 조직 또는 장기가 배스될 필요가 있는 응급 과정에서 사용되는 것으로 고려된다. 이에 관해서, 용액은 병원의 세팅 및 "필드에서"(즉, 앰블런스 내에서 또는 임시 응급 의료 시설) 모두에서 응급 의료인이 이용할 수 있게 만들어질 수 있다.

또한, GALA 용액(결합된 용액 A 및 B)은 수술, 특히 성형 또는 복원 수술에서 세척-용액으로서 사용될 수 있다. 이는, 이에 제한되지 않지만, GALA와 같은 등장, pH-평형의 용액이 바람직하게 되는 지방 흡입술, 가슴 복원, 유방 제거 또는 다른 수술을 포함한다. 또한, GALA 용액은, 프라이밍(priming) 또는 플러싱(flushing)을 위한 제조업자의 과정을 사용해서 투석 장치를 플러시 또는 프라임하기 위해 사용된다. 또한, GALA 용액은 정맥의 외부 지지부와 함께 사용될 수 있다. 이러한 지지부의 예는, Vascular Graft Solutions of Tel-Aviv, Israel에 의해 개발되는 Vest^TM 혈관 외부 지지부이다.

또한, 장기 및 조직 보존 용액의 성분은 겔, 연고, 크림, 로션 또는 하이드로겔이 될 수 있다. 예의 하이드로겔은 U.S. 특허 번호 제6,339,074호에 개시된다.

아래 표 1은 용액 A의 pH가 대략 8.0이고 용액 B의 pH는 대략 3.0인 본 발명의 실시형태를 나타낸다.

표 1

한 실시형태의 용액 A 및 B의 질적인 및 양적인 구성

성분	*농도(± 5%)
용액 A	g/L	g/237.5mL	mM
염화칼슘 수화물	0.147	0.035	1.326
염화칼슘	0.421	0.100	5.653
인산캄륨 1염기	0.063	0.015	0.463
황산마그네슘 7수화물	0.105	0.025	0.432
염화마그네슘 6수화물	0.105	0.025	0.516
염화나트륨	8.421	2.000	144.100
중탄산나트륨	0.379	0.090	4.390
인산나트륨 2염기 an하이드로us	0.028	0.007	0.200
주사를 위한 물	q.s. 내지 1L	q.s. 내지 237.5mL	-
중탄산나트륨 1.0M/HCl 1.0M	조절 pH to 8.0
성분	*농도(± 5%)
용액 B	g/L		g/12.5mL	mM
L-글루타티온	6.200		0.078	20.200
D-글루코오스	20.000		0.25	111.000
L-아르기닌	3.000		0.038	17.200
L-아스코르브산	1.800		0.023	10.200
주사를 위한 물	q.s. 내지 1L		q.s.내지 12.5mL	-
중탄산나트륨 1.0M/HCl 1.0M	조절 pH to 3.0

결합된 용액 A 및 용액 B의 성분을 표 2에 나타낸다:

표 2

결합된 용액 A 및 B의 질적인 및 양적인 구성

성분	*농도(± 5%)
용액 A + B	g/L	g/250mL	mM
염화칼슘 수화물	0.14	0.0348	1.26
염화칼슘	0.40	0.0998	5.37
인산캄륨 1염기	0.06	0.0148	0.44
황산마그네슘 7수화물	0.10	0.0248	0.41
염화마그네슘 6수화물	0.10	0.0248	0.49
염화나트륨	8.00	1.9998	136.89
중탄산나트륨	0.36	0.0900	4.17
인산나트륨 2염기 an하이드로us	0.026	0.0065	0.187
L-글루타티온	0.31	0.0775	1.01
D-글루코오스	1.00	0.2500	5.55
L-아르기닌	0.15	0.0375	0.86
L-아스코르브산	0.09	0.0225	0.51
A 및 B 혼합 후 pH 범위	7.3 ± 0.4

다음의 예들은, 이에 제한되지 않지만, 본 발명을 도시하는 것을 의미한다.

예 1

표 1로부터 다수 로트(lot)의 용액 A 및 용액 B이 생산되었다. 3개의 분리 로트로부터의 21 세트의 용액 A 및 B 용기는, 40℃, 75% 상대 습도에서 유지된 적격의 안정성 챔버 내에 위치되었다. 각각의 로트로부터의 용액 용기는 주기적으로 취해지고 이들 가속된 조건 하에서 테스트된다. 이 데이터의 결과는, 2-8℃에서 저장되면, 생산물의 유효 기간을 결정하기 위해서 외삽되었다. 유효 기간 결정은 생산된 용액이 세트 사양 내에서 남았던 시간의 최소 기간의 평가에 기반했다. 용액 A 및 B의 pH, 삼투압 몰농도 및 전도성이 연구되었다. 용액 A를 구성하는 8개의 무기 염은 시간의 연장된 주기 동안 수성 매체 내에서 불활성이고 안정적으로 남는다.

또한, 용액 B의 2개의 성분, L-아르기닌 및 D-글루코오스는, 3의 pH에서 시간의 연장된 주기 동안 안정적인 것이 발견되었다. 그러므로, 수용 기준을 만족하는 모든 나머지 사양과 함께, 생산물의 유효 기간의 최종 결과에 영향을 주는 2개의 성분은 그들의 산화 방지제 성질에 기인해서 L-아스코르브산 및 L-글루타티온이었다.

전체 안정성 제한 성질에 대한 근거는, 용액에 대해서 전체 환원하는 환경에 대해서 필요한 조건을 유지시키는 것이었다. 용액이 이 이득의 제공을 중단할 때, 사양 밖이 된다. 환원하는 환경은, 그런데 몇몇 환원된 L-글루타티온 및 L-아스코르브산이 산화 환원 반응의, 평형 및 용액 내의 그들의 환원된 상태에서 적게 남는 한, 달성되었다. 즉, L-글루타티온 및 L-아스코르브산 각각이 분석적인 방법의 상기 검출가능한 제한에 남는 한, 달성되었다.

40℃에서 용액을 저장하는 동안 획득된 데이터가 2의 Q10 팩터를 사용하는 이러한 용액의 평균 5° 저장 온도에 외삽되었다. 이 외삽에 기반해서, 용액 B의 저장 안정성은 대략 900 일(day)이고, 적어도 2개의 년의 유효 기간을 제공하는 것이 예측되었데, 이는 산업에서의 요구 조건을 훨씬 초과하고 현재 제제의 안정성을 훨씬 초과하는 것이다. 글루타티온의 농도를 나타내는 획득된 로 데이터(raw data)가 도 3A에 보이고, 아스코르브산 및 아르기닌에 대한 시간에 걸친 농도가 도 3B에 보인다.

예 2:

Q10 룰(Rule)에 따르면, 반응 속도 상수, 온도, 및 유효 기간 간의 관계는 다음과 같이 표현될 수 있다:

여기서, k1 및 k2는 유효 기간 SL1 및 SL2와 함께 온도 T1 및 T2에서의 반응 속도 상수이다. 온도 계수 Q10의 값은, 반응에 대한 활성화의 에너지 Ea에 의존한다. 그러므로, Q10는, 반응 속도 상수가 적어도 2개의 다른 온도에 대해서 공지되면, 상기 등식을 사용해서 계산될 수 있다. 전형적으로, Q10의 값은, 유효 기간의 요구된 평가가 a) 보존적인, b) 개연성 있는 및 합리적인, 또는 c) 덜 보존적이지만 가능한지에 각각 의존해서, 각각 2, 3, 또는 4이다. 경험 법칙으로서, 2의 Q10는 12.2 kcal/mol의 Ea에 대응하고, 19.4 kcal/mol에 대해서 3, 및 24.5 kcal/mol에 대해서 4이다.

생산물의 규칙적인 제출의 초기 스테이지 동안, 상세한 온도-의존 키네틱 데이터가 아직 이용될 수 없을 때, 유효 기간의 보존적인 평가가 만들어져야 한다. 그러므로, 열화 반응에 대한 낮은 활성화 에너지는 생산물 유효 기간의 보존적인 평가를 결정하기 위해서 2의 Q10 값을 갖는 것으로 상정된다. 이 룰에 따르면, 반응 속도는, 반응에 대한 "가장 개연성 있는 활성화 에너지"를 상정하는 저장 온도에서 매 10 디그리(degree) 상승마다 거의 2배가 된다.

40℃에서, 용액 B 내의 L-글루타티온의 분해를 위한 1차 반응 속도 상수는, 용액 B의 2개의 로트의 가속된 연구로부터 0.0643 days^-1로 결정되는데 - 하나는 헤드스페이스 내에 아르곤을 갖고, 다른 것은 없다. 이들 프로파일은 도 4에 함께 보인다. 1차 지수적인 부식이 하부 플롯에서 보이고, 대응하는 선형 대수적인 플롯이 상부 플롯에서 보인다. 더욱이, 이 온도(40℃)에서, L-글루타티온에 대한 생산 사양은 대략적으로 73 일인 만료의 한계에 접근했다. 상기 등식에서의 인수(argument)를 사용하면, 5℃ 저장에서의 유효 기간의 보존적인 평가는 2의 Q10값을 사용하는 외삽에 의해 다음과 같이 될 수 있다:

그러므로, 이 계산으로부터, 생산물이 5℃에서 저장될 때, 최소으로 용액 B의 유효 기간이 27 달(month)로 되는 것이 예측되는 것이 추론될 수 있다.

그러데, 15 달의 데이터가 수집된 후, 2-8℃에서 용액 B의 3개의 GMP 로트의 안정성에 대한 상세한 실시간 연구는, 가속된 연구로부터의 27-달 유효 기간 평가가 극히 보존적이 될 수 있었고, 실제 Q10 팩터가 2.94인 것을 제안한다.

5℃에서 실시간 안정성 연구가 이제까지 대략 1 년 동안 진행되었다. 이들 로트로부터의 L-글루타티온 열화의 이용 가능한 12-15 달 키네틱 데이터는 대략 1.40x10^{-3 days-1}의 반응 속도 상수를 갖는 1차 반응 키네틱에 고정될 수 있다. 이들 속도에서, L-글루타티온에 대한 생산 사양은 대략 100 달의 만료의 그 한계에 접근했다. 놀랍게도, Q10 외삽 기술을 사용하는 40℃ 가속된 연구를 기반으로 결정된 유효 기간은, 실제 실시간 데이터에 의해 제안된 것보다 상당히 짧았다(27 달). 이 불일치는 이하 기술되는 바와 같이 Q10 외삽 동안 만들어진 추청에 기반해서 합리화될 수 있다.

65-일 주기에 걸친 40℃/75%RH의 가속된 조건 하에서 용액 B의 용액 B 내의 L-글루타티온의 열화에 대한 관찰된 속도가 도 4에 보인다. 유사한 경향이 용액 B의 다수의 다른 로트에 대해서 관찰되었다. 모든 사례에 있어서, 이 반응의 속도는, 동등한 경과 시간이 분해 물질 농도에서의 동등한 부분적 감소를 제공하는 것을 의미하는 특성(1차)에서 순수하게 지수적인데, 이 경우 시간 범위에 걸친 L-글루타티온의 농도가 연구된다. 연구된 모두 11개의 로트의 40℃ 및 5℃ 양쪽에서의 반응 속도 상수가 표 3에 요약된다. 지수 피팅(exponential fit)으로부터 도출된 등식에서의 지수의 값은 1차 반응 속도 상수 k1(days^-1의 단위로)이다. 또한, 이들 값은 연구된 각각의 온도에서 표 3에 나타낸다.

온도 계수 Q10에 대한 2.94의 이 경험적으로 도출된 값은, 유효 기간의 이전의 계산에서 사용된 2의 값보다 더 높다. Q10 = 2의 값은 12 kcal/mmol의 활성화의 비교적 낮은 에너지로부터 귀결되는 유효 기간의 매우 보존적인 평가를 나타낸다. 한편, Q10 = 2.94의 값을 갖는 19 kcal/mmol의 더 높은 활성화 에너지는, 반응 속도가 유효 기간에 대한 대응하는 역 관계를 갖는 저장 온도에서의 매 10 디그리 상승에 대해서 거의 3배가 된다.

L-글루타티온 분해 동안 19.0 kcal/mol의 활성화의 순수한 에너지를 나타내는, 2.94의 교정된 Q10 값과 함께, 용액 B의 유효 기간은, 40℃ 유효 기간 데이터를 외삽함으로써 및/또는 5℃에서 1-년 실시간 데이터의 지수 피팅으로부터 직접 다시 계산될 수 있다. 교정된 값은 표 3으로 작성된다.

2개의 접근에 의해 도출된 결과에서의 불일치는, Q10 값 2(보존적인) 및 2.94(경험적인)를 사용하는 40℃ 경험적인 데이터를 외삽함으로써 5℃와 60℃ 사이의 다양한 온도에서 유효 기간의 비교를 도시한다. 결과는 표 4에 보인다.

#	표 3. 안정성 연구로부터의 반응 속도 상수 및 유효 기간
	용액 B 헤드스페이스	[GSH] g/L	k1, days-1	온도 ℃	유효 기간, days
					5℃* 에서	20℃* 에서	실제**
1	w/ 아르곤	6.2	0.00143	5	3220	639	3220
2	w/ 아르곤	6.4	0.00143	5	3220	639	3220
3	w/ 아르곤	6.4	0.00140	5	3290	653	3290
4	wo/ 아르곤	6.2	0.05937	40	3390	631	73
5	wo/ 아르곤	6.2	0.06465	40	3100	622	72
6	wo/ 아르곤	6.2	0.06465	40	3100	622	72
7	w/ 아르곤	6.2	0.06378	40	3130	622	72
8	w/ 아르곤	6.2	0.06465	40	3100	622	72
9	w/ 아르곤	6.2	0.06465	40	3100	631	73
10	w/ 아르곤	6.2	0.05780	40	3400	691	80
11	w/ 아르곤	6.2	0.05608	40	3400	709	82
* 2.94의 Q10 값을 갖는 Q10 룰을 사용해서 외삽된 40℃ 내지 5℃ 및 20C
** 1% [GSH]에 접근하는 실제 가속된 및 실시간 데이터 곡선

표 4. 오래된(보존적인) 및 새로운(경험적인) Q10 값에 기반한 용액 B의 외삽된 유효 기간
저장 온도, ℃	외삽된 유효 기간, days
	Q10 = 2	Q10 = 2.94
5	830	3300
20	290	640
25	200	367
40	73	73
50	35	23
60	18	7

따라서, 유효 기간은 GALA 용액의 성분을 더 높은 pH 평형의 염 용액으로 분리함으로써 상당히 개선되는데, 이는, 옵션으로 글루코오스를 포함할 수 있고, 유기 성분, 특히 L-아르기닌 아스코르브산 및 글루타티온 플러스 옵션으로 매우 낮은 하부 pH에서의 설탕을 저장한다. 환원된 글루타티온의 안정성을 증가시키는 것이 또한 아스코르브산 및 L-아르기닌의 안정성을 증가시키는 것이 예기치 않게 발견되었다. 2개의 용액의 저장 안정성이 상업적인 기대 또는 요구를 훨씬 초과하고, 이 제제를 넓은 다양한 환경에 대해서 매우 실용적이고 적합하게 한다. 이는, 개선된 이식 성능의 최종 결과를 제공하고, 이식 재료의 세포 생존 능력을 개선한다.

본 발명을 실시하는 바람직한 방법과 함께 본 발명의 상세한 설명이 개시되었다. 그런데, 본 발명 자체는 첨부된 청구항들에 의해서만 규정되어야 한다.

Claims (31)

1. 제1용기 내에 함유된 제1수용액 및 제2용기 내에 함유된 제2수용액으로 구성된 장기 및 조직 보존 키트로서, 제1수용액은 평형의 염 용액으로 구성되고, 상기 제1수용액은 7.6 내지 8.0의 pH를 가지며; 제2수용액은 물, 환원된 글루타티온, 아스코르브산, 설탕, L-아르기닌으로 구성되고, 상기 제2수용액은 3.0 내지 5.0의 pH를 갖는 것을 특징으로 하는 키트.
2. 제1항에 있어서,
   제1 및 제2용기는 단일 용기 내의 제1 및 제2챔버이고, 제1 및 제2챔버는 클램프에 의해 서로로부터 구획되고, 클램프의 제거에 따라, 제1수용액이 제2수용액과 혼합되어 완성된 장기 및 조직 보존 용액을 형성하는 것을 특징으로 하는 키트.
3. 제1항에 있어서,
   제1수용액의 pH는 7.8 - 8.0이고, 제2수용액의 pH는 3.6 내지 4.4인 것을 특징으로 하는 키트.
4. 제1항에 있어서,
   제1수용액의 pH는 7.6 내지 7.9이고, 제2수용액의 pH는 4.6 내지 5.0인 것을 특징으로 하는 키트.
5. 제1항에 있어서,
   제1수용액 및 제2수용액은 겔, 연고, 크림, 로션 또는 하이드로겔로 형성되는 것을 특징으로 하는 키트.
6. 장기 또는 조직 보존 용액을 준비하기 위한 방법으로서;
   7.6 내지 8.0의 pH를 갖는 평형의 염 용액을 형성하는 것을 포함하여 제1수용액을 준비하는 단계와;
   3.0 - 5.0의 pH에서 물, 설탕, L-아르기닌; 환원된 글루타티온 및 아스코르브산으로 구성된 제2수용액을 준비하는 단계와;
   사용 현장에서, 결합된 용액을 형성하기 위해서 제1수용액을 제2수용액과 함께 혼합하는 단계를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제
12. 삭제
13. 제6항에 있어서,
    제1수용액의 pH는 7.6 내지 7.9이고, 제2수용액의 pH는 4.6 내지 5.0인 것을 특징으로 하는 방법.
14. 삭제
15. 제6항에 있어서,
    설탕은 글루코오스인 것을 특징으로 하는 방법.
16. 삭제
17. 삭제
18. 삭제
19. 삭제
20. 삭제
21. 삭제
22. 삭제
23. 삭제
24. 삭제
25. 삭제
26. 제6항에 있어서,
    상기 제1수용액의 상기 pH는 7.6 내지 8.0이고, 상기 제2수용액의 pH는 3.0 내지 3.4인 것을 특징으로 하는 방법.
27. 삭제
28. 삭제
29. 제1항에 있어서,
    상기 설탕은 글루코오스인 것을 특징으로 하는 키트.
30. 제1항에 있어서,
    제1수용액의 pH는 7.6 내지 8.0이고, 제2수용액의 pH는 3.0 내지 3.4인 것을 특징으로 하는 키트.
31. 삭제

Images