CH636010A5

CH636010A5 - Composition for the treatment of tumours

Info

Publication number: CH636010A5
Application number: CH233678A
Authority: CH
Inventors: Yasuo Fujiwara; Motoo Ohta; Ichiro Kojima
Original assignee: Nippon Oil Co Ltd; Nippon Petrochemicals Co Ltd
Priority date: 1977-03-04
Filing date: 1978-03-03
Publication date: 1983-05-13
Also published as: JPS53109929A; DE2809093A1; FR2392668A1; FR2392668B1

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein Mittel zur Behandlung von Tumoren enthaltend als Aktivsubstanz Coproporphyrin vom Typus III oder dessen pharmazeutisch annehmbare wasserlösliche Alkalisalze und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder ein Verdünnungsmittel.

In der Vergangenheit sind zahlreiche Verbindungen, die eine Antitumor-Aktivität haben, vorgeschlagen worden. Präparate, die diese Verbindungen enthalten, haben jedoch den allgemeinen Nachteil, dass ihre Wirkungen auf bestimmte spezifische Typen von Tumoren beschränkt sind und in vielen Fällen sogar die normalen gesunden Zellen beschädigen und ihre Toxizität ist häufig nicht insignifikant. Aufgrund dieser Nachteile ist die Verwendung dieser Mittel sehr beschränkt.

Es wurde kürzlich gefunden, dass Porphyrine, insbesondere das Natriumsalz eines Protoporphyrins das normale Funktionieren der Zellen aufrechterhalten und begünstigen kann und dass sie geeignet sind zur Vermeidung der Genesis, des Wachstums, der Metastatis und des Rückfalls eines grossen Bereichs von malignen Tumoren. Diese Entdeckung führte zu dem Vorschlag für ein maligne Tumoren hemmendes Mittel, das Porphyrin oder deren pharmazeutisch annehmbare Salze enthält (Japanische offengelegte Patentanmeldung Nr. 125757/76, veröffentlicht am 2.November 76). Diese Patentanmeldung beschreibt Etioporphyrin, Mesopor-phyrin, Protoporphyrin, Deuteroporphyrin, Hematopor-phyrin, Coproporphyrin und Uroporphyrin als Porphyrine. Es wird angegeben, dass unter diesen Porphyrinen das Natriumsalz eines Protoporphyrins besonders bevorzugt ist und dass es unter verschiedenen Warenzeichen zur Behandlung von gewissen Erkrankungen der Leber verfügbar ist. In allen Ausführungsbeispielen dieser Patentanmeldung wird tatsächlich nur das Natriumsalz von Protoporphyrin verwendet.

Die Urheber der vorliegenden Erfindung arbeiteten mit Coproporphyrin und stellten fest, dass Coproporphyrin vom Typus III und dessen pharmazeutisch annehmbare wasserlösliche anorganische Alkalisalze, die nicht in der japani-5 sehen Patentanmeldung beschrieben sind, bei weitem bessere Antitumor-Aktivitäten haben als Coproporphyrin vom Typus I und deren Alkalisalze und das Protoporphyrin und dessen Salze, die in der japanischen Patentanmeldung empfohlen werden; und dass Coproporphyrin vom Typus III io und deren Salze eine Antitumor-Aktivität gegenüber dem Tumor AH-41C (Ascites hepaticus, Krebs bei Ratten) aufweisen in einem solchen Umfang, dass ein wahrscheinlicher therapeutischer Effekt angenommen werden kann und dass diese Antitumor-Aktivität bei weitem besser ist als diejenige 15 von Protoporphyrin oder Coproporphyrin vom Typus I. Dies ist überraschend im Hinblick auf die Tatsache, dass es als schwierig erachtet wurde, ein therapeutisch wirksames Antitumor-Mittel gegen diesen speziellen Tumor zu finden.

Es wurde ferner gefunden, dass Coproporphyrin vom 20 Typus III besser wasserlöslich ist als das Protoporphyrin, das in der oben genannten Patentanmeldung empfohlen wird, dass die Beschränkungen auf Protoporphyrin hinsichtlich der Art der Formulierung, der Form der Dosierung und den Dosierungskonzentrationen beseitigt werden können 25 und dass Coproporphyrin vom Typus III eine extrem niedrige Toxizität aufweist. Diese Vorteile erlauben die Verabreichung von Coproporphyrin vom Typus III in hohen Konzentrationen oder in einer grossen Menge, so dass erwartet werden kann, dass die Heilwirkung dieser Verbindung ge-30 steigert werden kann.

Die Urheber der vorliegenden Erfindung stellten ferner fest, dass Coproporphyrin vom Typus III wirksam ist gegen die Genesis, das Wachstum, die Metastasen und die Rückfälligkeit bei einem weiten Bereich von malignen Tumoren 35 und dass es geeignet ist für die Behandlung dieser Tumore ohne Beschädigung und andere Nebenwirkungen auf normalerweise gesunde Zellen.

Das vorgenannte, im erfindungsgemässen Mittel enthaltene Coproporphyrin vom Typus III (im folgenden genannt 40 Coproporphyrin III) ist eine bekannte Verbindung der folgenden Formel

CH2CH2C00H

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H00CH2CH2C

CH2CH2C00H

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Die physiologisch annehmbaren Salze von Coproporphyrin III sind beispielsweise pharmazeutisch annehmbare wasserlösliche anorganische Alkalisalze wie Natrium-, Kalium- und Ammoniumsalze.

Porphyrine sind weit verbreitet in Tieren und Pflanzen und können durch Extraktion aus diesen natürlichen Quellen und anschliessender Reinigung gewonnen werden. Das Coproporphyrin III, das in dem erfindungsgemässen Mittel

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verwendet wird, kann ein extrahiertes und gereinigtes Produkt aus derartigen natürlichen Quellen sein. Coproporphyrin III kann auch hergestellt werden unter Verwendung bekannter Mikroorganismen wie Stämme der Gattung Rho-dopseudomonas, Gattung Mikrococcus, Gattung Staphylo-coccus, Gattung Saccharomyces, Gattung Bacillus, Gattung Streptomyces, Gattung Mycobacterium und Gattung Corynebacterium spezielle Beispiele dieser bekannten Mikroorganismen sind beispielsweise Rhodopseudomonas spheroide ATTC 17023-17030; Micrococcus lysodeikticus ATCC 4698, 12698, 15800,15801; Staphylococcus epider-midis ATCC 14990,155,12228, 17917, 21103; Saccharomyces cerevisiae ATTC 2338,2341, 2359, 2365,2366, 2373, 2375,2601,2704,4110,4111,4124-4126,4132,4134, 7752, 7754, 7921, 9017,9018, 9369-9371, 9763,10274, 10275, 11795,11909,12341, 12699, 13264,13601, 13602,15119, 15120, 15121,15122,15248,15513,18111,20169, 560,561, 834,2355,2364,2701,4097,4098,4105,4108,4113,4114, 4117,4123,4127,4921, 6037, 7753, 8255-8258,9841, 9896, 10607,10824,11777,14824,14825, 16664; Bacillus cereus ATCC 14579,2,246,4342,6464, 7004, 7039, 7064,9139, 9592, 9818, 10702, 10987,11778, 11950,12480,13061, 13472,13824,14603,14747,15816,15817,19637,21182, 21281, 6462,6463, 10206,11778,19647; Streptomyces gri-seus ATCC 23345,10137,3309, 3313, 3331, 3336, 3343, 3344, 3352, 3374, 3478,4847, 6246, 10246,10971,10974, 11429,11523,11746,11984,12433,12475,12648,13968, 15395,15569,23337,13741, 13733,15867; Streptomyces oli-vaceus ATCC 3325, 3335, 3369, 10897,11626,12019; Mycobacterium smegmatis ATCC 14468,19420,20, 1-14,281, 359, 607,10143, 11727,11759, 12051,12549,19979,19980,21293 und Corynebacterium diphtheriae ATCC 19409,11913, 13812,296, 9015,9343,11951, 11952, 8028, 9059,9060, 11049. 8032, 9675,11050,14779, 8024, 8026,9061, 9673, 11051.

Es wurde ferner gefunden, dass Coproporphyrin III produziert wird von Arthrocabter globiformis ATCC 8010, 4336, Arthrobacter pascens ATCC 13346, Arthrobacter au-rescens ATCC 13344, Arthrobacter ureafaciens ATCC 7562 und Arthrobacter tumescens ATCC 6947. Das von diesen Stämmen produzierte Coproporphyrin III und deren pharmazeutisch annehmbare wasserlösliche anorganischen Alkalisalze können jedenfalls gemäss der Erfindung angewandt werden.

Es ist besonders vorteilhaft, ein Coproporphyrin III zu verwenden, das von einem Stamm aus der Gattung Arthrobacter und der Gattung Brevibacterium die in der japanischen Patentanmeldung Nr. 83165/75 (Japanische Offenlegungsschrift Nr. 7492/77, veröffentlicht 20. Januar 1977) beschrieben sind, bei deren Erfinder einer der Miterfinder der vorliegenden Anmeldung beteiligt ist, zu verwenden. Der in dieser japanischen Patentanmeldung beschriebene Stamm kann Coproporphyrin III in einer höheren Ausbeute und bei niedrigeren Kosten und leichterer industrieller Durchführung produzieren als die anderen Coproporphyrin III produzierenden, oben erwähnten Stämme. Es sei in dieser Hinsicht darauf verwiesen, dass die vorgenannte japanische Patentanmeldung nicht die Antitumor-Aktivität des erhaltenen Coproporphyrin III oder deren Salze oder die Verwendung derselben als Tumormittel beschreiben.

Beispiele von geeigneten Coproporphyrin III produzierenden Stämmen in dieser japanischen Patentanmeldung sind Arthrobacter hyalinus (FERM-P Nr. 3125; ATCC 31263), Arthrobacter cremeus (FERM-P Nr. 3126; ATCC 31372), Arthrobacter resinosus (FERM-P Nr. 3131; ATCC 31374), Arthrobacter isopropanolophila (FERM-P Nr. 3129; ATCC 31375) und Brevibacterium eburneus (FERM-P Nr. 3128; ATCC 31373). Die bakteriologischen Eigenschaften dieser geeigneten Stämme und Verfahren zu ihrer Kultivierung sind im einzelnen beschrieben in der japanischen Offenlegungsschrift Nr. 7492/77.

Wie in dieser japanischen Patentanmeldung beschrieben, können Kulturmedien, enthaltend eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Salze, Antischaummittel usw., verwendet werden. Beispiele von Kohlenstoffquellen sind Kohlehydrate, Alkohole, Kohlenwasserstoffe und Kleie. Beispiele für die Stickstoffquellen sind Korneinweich- " flüssigkeit, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Peptone, Fischmehl, Ammoniumsalze, Nitratsalze und Harnstoff. Die anorganischen Salze können sein: Magnesiumsalze, Phosphatsalze, Zinksalze, Kalciumsalze, Mangansalze, Molybdänsalze und Kupfersalze.

Die Zusammensetzung des Kulturmediums kann variiert werden und die Komponenten können zusätzlich während der Kultivierung zugegeben werden. Wenn beispielsweise Alkohol als Kohlenstoffquelle verwendet wird, kann zusätzlich nach einem Verfahren bei dem die Herstellung von Coproporphyrin III erhöht wird Alkohol ein- oder zweimal zugegeben werden, wenn die Konzentration des restlichen Alkohols abnimmt oder bevor, während oder nach der Einleitung der Coproporphyrin-III-Produktion.

Vorteilhafte Ergebnisse können erhalten werden, wenn Eisensalze während der Kultivierung im Kulturmedium nichtenthalten sind.

Die Kultivierung wird unter aeroben Bedingungen, beispielsweise unter Schütteln oder belüfteter Bewegung durchgeführt und vorzugsweise werden für die Belüftung möglichst milde Bedingungen angewandt. Die Kultivierungstemperatur liegt im allgemeinen bei etwa 20 bis 40 °C und der pH-Wert des Kulturmediums beträgt im allgemeinen etwa 4 bis 9,5. Die Kultivierungszeit beträgt im allgemeinen 2 bis 8 Tage und kann gemäss der Auswahl der anderen Kultivierungsbedingungen geändert werden.

Da sich Coproporphyrin III in dem Kultivierungsprodukt (d.h. der Kulturbrühe) in weit grösserer Menge bildet als im Fall der Verwendung der anderen bekannten Coproporphyrin III produzierenden Stämme, die oben erwähnt sind, kann es in guten Ausbeuten nach bekannten Verfahren aus dem Kultivierungsprodukt extrahiert werden unter Verwendung eines geeigneten Extraktionsmittels wie Ethylacetat, angesäuert mit Essigsäure. Im allgemeinen wird das Coproporphyrin III aus der Kulturbrühe, aus der die mikrobiellen Zellen und andere Feststoffe entfernt worden sind, extrahiert. Der Extrakt wird beispielsweise durch Methyl-Veresterung des Coproporphyrin III mit Salzsäure-Me-thanol behandelt und erforderlichenfalls wird der Ester durch Kolonnenchromatographie unter Verwendung von Aluminiumoxid gereinigt, wobei Coproporphyrin III in Form des Methylesters erhalten wird.

Die Aktivsubstanz des erfindungsgemässen Mittels ist freies Coproporphyrin III oder dessen pharmazeutisch annehmbare wasserlöslichen anorganische Alkalisalze. Daher können die in der oben beschriebenen Weise erhaltenen Al-kylester von Coproporphyrin III in einem Lösungsmittel wie Benzol, Toluol, Pyridin, Dichlorethan, Trichlorethan, Tetra-hydrofuran oder Dimethylsulfoxid gelöst werden nach Zugabe einer kleinen Menge Alkali wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid oder Ammoniumhydroxid, es wird dann erhitzt, um den Alkylester des Coproporphyrin III zu hy-drolisieren und dessen Alkalisalz entsprechend dem Lösungsmittel auszufallen. Das ausgefällte Alkalisalz von Coproporphyrin III wird durch Filtration abgetrennt und dann das Alkali und eine Spur von Wasser entfernt, beispielsweise unter Verwendung eines Lösungsmittels, um das gewünschte Alkalisalz von Coproporphyrin III zu erhalten. Oder der Alkylester von Coproporphyrin III kann durch Behandlung

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mit einem Alkali wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid oder Ammoniumhydroxid zur Hydrolyse des Alkylesters behandelt werden, wobei es in das entsprechende Alkalisalz überführt wird, Abdampfen des Wassers und Entfernen des Alkalis und einer Spur Wasser mit einem Lösungsmittel.

Anderseits kann das erhaltene Alkalisalz mit einer Säure wie Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Essigsäure oder Ameisensäure behandelt werden, um es in das freie Co-prophorphyrin III zu überführen, Einstellen des pH auf etwa 3,6 zur Ausfällung des freien Coproporphyrin III und Abtrennung durch Filtration.

Ein anderes Trennverfahren besteht in einer Behandlung des Alkylesters von Coproporphyrin III mit einer Säure wie Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Essigsäure oder Ameisensäure in einem wässrigen Medium um den Alkyl-ester zu hydrolisieren und in das freie Coproporphyrin III zu überführen, Einstellen des pH auf etwa 3,6 zur Ausfällung des freien Coproporphyrin III und Abtrennung durch Filtration. Ein weiteres Trennverfahren besteht in einer Behandlung des erhaltenen freien Coproporphyrin III mit Alkali wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid oder Ammoniumhydroxid zur Umwandlung in das entsprechende Alkalisalz, Abdampfen des Wassers und Entfernen des Alkalis und einer Spur von Wasser durch Verwendung eines Lösungsmittels.

Gewünschtenfalls kann das erhaltene Coproporphyrin III oder dessen pharmazeutisch annehmbares wasserlösliches anorganisches Alkalisalz weiter gereinigt werden nach bekannten Verfahren wie durch Umkristallisation, Kolonnenchromatographie oder Lösungsmittelextraktion.

Die Hydrolyse, die Umwandlung in die freie Form usw., wie sie oben beschrieben ist, kann bei Zimmertemperatur durchgeführt werden, wobei kein spezielles Erwärmen oder Abkühlen erforderlich ist. Erforderlichenfalls kann erwärmt oder abgekühlt werden. Im allgemeinen beträgt die geeignete Temperatur ungefähr 0 bis 200 °C, vorzugsweise 10 bis 100 =C.

Das in dem erfindungsgemässen Tumormittel enthaltene Coproporphyrin III oder seine pharmazeutisch annehmbaren wasserlöslichen Alkalisalze können als solche angewandt werden, es ist jedoch üblich sie in Form einer Zubereitung bestehend aus dieser Aktivsubstanz und einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel anzuwenden. Die Träger oder Verdünnungsmittel oder ähnliche Additive können die üblicherweise verwendeten festen oder flüssigen Träger, Verdünnungsmittel oder ähnliche Additive sein.

Beispiele dieser Stoffe sind feste Trägerstoffe oder Verdünnungsmittel wie Zucker (z.B. Laktose, Sukrose, Glukose, Fruktose, Mannitol und Sorbitol), natürliche polymere Verbindungen (z. B. Kornstärke, Weizenstärke, Kartoffelstärke, Dextrin, Gummiarabicum, Tragacanthgummi, Guaiacgummi, Natriumalginat und Gelatine), Aminosäuren, Proteine, teilweise hydrolisierte Stoffe oder Proteine, Mineralöle, Fette, synthetische polymere Verbindungen (z. B. Methylcellulose, Ethylcellulose, Carboxymethylcellu-lose, Hydroxyethylcellulose, Polyvinylalkohol und Poly-ethylenglycol) und anorganische Verbindungen (z.B. Kalziumsulfat, Kalziumphosphat, gefälltes Kalzium-carbonat, Natriumchlorid und Borsäure) und flüssige Verdünnungsmittel wie wässrige Lösungen von Zucker wie beispielsweise Laktose, Sukrose, Glukose, Sorbitol, Xylitol oder Mannitol, eine wässrige Suspension eines natürlichen polymeren Stoffes wie Kornstärke, Weizenstärke, Kartoffelstärke, Dextrin, Gummiarabicum, Tragacanthgummi, Guaiacgummi, Natriumalginat oder Gelatine, eine wässrige Lösung einer Aminosäure oder eines teilweise hydrolisierten Produktes eines Proteins, eine wässrige Suspension eines Mineralöls oder Fettes, und eine wässrige Suspension eines synthetischen Polymeren wie Methylcellulose, Ethylcellulose, Carboxymethylcellulose, Hydroxyethylcellulose, Polyvinyl-acetat oder Polyethylenglycol.

s Da die gemäss der Erfindung verwendete Aktivsubstanz wirksam ist zur Aufrechterhaltung und Förderung der normalen Funktion der lebenden Zellen, können auch verschiedene Nährstoffe, Trinkwasser, Flüssigkeiten und andere Stoffe, die vom Menschen oder Tier im Körper aufgenom-lo men werden, als Träger, Verdünnungsmittel oder Additive dienen. Daher bedeutet die Bezeichnung «pharmazeutisch annehmbare Träger oder Verdünnungsmittel», wie sie in der vorliegenden Beschreibung verwendet wird, nicht nur diese Trägerstoffe, Verdünnungsmittel oder Additive, die übli-15 cherweise in der Medizin verwendet werden, sondern auch Nahrungsmittel, Futtermittel, Trinkwasser, Getränke, Flüssigkeiten und andere Stoffe, die vom Menschen oder Tier aufgenommen werden.

Da die Aktivsubstanz gemäss der Erfindung eine bessere 20 Löslichkeit hat als Protoporphyrin kann es in einem Mittel in jeder gewünschten Form formuliert werden, z. B. als oral anwendbares Mittel wie eine flüssige Zubereitung, Pulver, Granulat, Pille oder Tablette, eine injizierbare oder eine träufelbare Zubereitung, als Suppositorium, oder als «Trou-25 che». Sie kann auch vorliegen in einer Form zur Einverleibung in Nahrungsmittel, Futtermittel, Trinkwasser, Getränke, Flüssigkeiten und andere Produkte, die vom Menschen oder von Tieren wie Geflügel, Zuchtfischen und Haustieren aufgenommen werden. Aufgrund der guten Stabilität 30 von Coproporphyrin III und seinen physiologisch annehmbaren Salze bei hohen Temperaturen können diese Nah-rungs-, Futtermittel, Trinkwasser, Getränke, Flüssigkeiten und andere Produkte vom Menschen oder den Tieren auch unter Wärmebehandlung aufgenommen werden. 35 Die Zubereitung gemäss der Erfindung kann die Aktivsubstanz in variierten Mengen, entsprechend beispielsweise ihrer Form und Art der Verabreichung, enthalten. Beispielsweise kann die Zubereitung ungefähr 0,001 bis ungefähr 99 Gew.-%, vorzugsweise etwa 0,01 bis ungefähr 95 Gew.~% 40 der Aktivsubstanz enthalten.

Das Präparat kann zur Behandlung einer grossen Anzahl von Tumoren verwendet werden, beispielsweise Karzinome des Magens, der Lunge, der Brust, des Uterus, der Leber, en-teraleesphageale- ovariale- pharyngeale- sarcomale Karzino-45 me sowie Krebs der Blase, der Oberkiefer, der Gallengänge, der Zunge, Gehirntumor, Hautkrebs, magliner Kropf, Prostatakrebs, Kodgkin's Erkrankung, maglines Melanoma, multiples Myeloma, renalen Krebs, Leukemia und maglines Lymphocytoma. Da die gemäss der Erfindung angewandte so Aktivsubstanz wirksam ist zur Aufrechterhaltung und Entwicklung der normalen Funktion der lebenden Zellen, ist sie geeignet zur Behandlung der verschiedenen maglinen Tumore und es kann erwartet werden, dass sie auch wirksam ist gegen Lymphocytoma, Leukemia und Hypertension. 55 Die gemäss der Erfindung verwendete Aktivsubstanz hat eine sehr niedrige Toxizität und ihre LD50 (bei der Maus per os) beträgt 1500 mg/kg und ihre LD50 (bei der Maus intravenös) 400 mg/kg. Anderseits hat das Protoporphyrin-Natriumsalz eine LD50 (bei der Maus, intravenöse Injek-60 tion) von 345,3 mg/kg (Dictionary of Japan, Commercial Drugs, veröffentlicht 30.November 1975 in Japan) und eine LD50 (Maus, subcutane Injektion) von 1,147 mg/kg (Japanese Formulary 1974). Daher ist das erfindungsgemässe Mittel nicht nur ausgezeichnet hinsichtlich seiner pharmazeuti-65 sehen Wirksamkeit, sondern auch hinsichtlich seiner Toxizität, wie die vorgenannten Vergleichsbeispiele zeigen.

Die Dosierung des Behandlungsmittels gemäss der Erfindung ist nicht besonders begrenzt, da eine übermässige Ein

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nähme keine ernsthaften Beschwerden verursacht. Die Dosierung kann in geeigneter Weise ausgewählt werden gemäss der Art des zu behandelnden Falles und seinen Symptomen. Im allgemeinen sind Dosierungen bis zu etwa 5 g pro Tag pro 50 kg Körpergewicht für Erwachsene ausreichend, jedoch können gewünschtenfalls grössere Mengen verabreicht werden. Die übliche Dosierung beträgt etwa 1mg bis 1000 mg/kg Körpergewicht/Tag.

Die folgenden Beispiele illustrieren die Erfindung im einzelnen.

Herstellung Nr. 1 der Aktivsubstanz Zunächst wurde der Coproporphyrin-III-Ester gemäss der japanischen Offenlegungsschrift Nr. 7492/77 hergestellt.

Arthrobacter hyalinus (FERM-P Nr. 3125) wurde eingeimpft in einen 500 ml Erlenmeyer-Kolben enthaltend 200 ml eines sterilisierten Kulturmediums aus 1,0 g Hefeextrakt, 3,0 g Pepton, 3,0 g Ammoniumnitrat, 0,4 g Kaliumphosphat, 1,5 g Dinatriumorthophosphat, 0,5 g Mangansulfat, 10 mg Zinksulfat, 50 |xg Kupfersulfat, 10 ng Molybdän-trioxid und 5,0 g Kalziumcarbonat pro Liter des deionisierten reinen Wassers. Unter Schütteln wurde 3 Tage bei 30 °C kultiviert. Dann wurde 2,0 ml der erhaltenen Kulturbrühe beimpft in einem 500 ml Erlenmeyer-Kolben enthaltend 200 ml desselben Kulturmediums wie vorstehend beschrieben und 3 Tage unter Schütteln bei 30 °C kultiviert. Dann wurde 2,0 ml Isopropylalkohol zugefügt und das Schütteln der Kulturbrühe weitere 3 Tage fortgesetzt. Die in der Kulturbrühe erzeugte Menge Coproporphyrin III betrug 86 mg/Liter.

Ein Liter der Kulturbrühe wurde zur Entfernung der mi-krobiellen Zellen und anderer unlöslicher Bestandteile zen-trifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde mit Ethyl-acetat, angesäuert mit Essigsäure extrahiert und eine Ethyl-acetatschicht, enthaltend Coproporphyrin III abgetrennt. Die Ethylacetatschicht wurde zu einer trockenen Masse getrocknet und die Veresterung wurde durchgeführt durch Zugabe von Salzsäure-Methanol zu einem Tetramethylester von Coproporphyrin III. Der Ester wurde in einer Kolonne von Aluminiumoxid chromatographiert und ergab 65 mg Coproporphyrin III-Tetramethylester in Form von Kristallen.

Die Aktivsubstanz gemäss der Erfindung wurde unter Verwendung dieses Tetramethylesters von Coproporphyrin III wie folgt hergestellt:

65 mg der Kristalle des Tetramethylesters von Coproporphyrin III wurden in 100 ml Toluol gelöst und eine kleine Menge 3n Natriumhydroxid zugefügt. Die Reaktion wurde 1 Stunde bei 90 °C durchgeführt. Eine schwarze Ausfallung, die sich gebildet hatte, wurde durch Filtration abgetrennt und das Alkali und eine Spur Wasser unter Verwendung von Alkohol oder Äther entfernt, wobei 66 mg des Tetranatriumsalzes von Coproporphyrin III erhalten wurden. Die Reinheit des Natriumsalzes wurde aus seiner Adsorption im Ultraviolett-Adsorptionsspektrum bestimmt und betrug 99%.

Herstellungsverfahren Nr. 2 der Aktivsubstanz Das Herstellungsverfahren Nr. 1 wurde wiederholt mit der Ausnahme, dass Arthrobacter cremus (FERM-P Nr. 3126) anstelle des dort genannten Stammes verwendet wurde. Die gebildete Menge Coproporphyrin III betrug 12,8 mg/Liter.

Unter Verwendung der erhaltenen Kulturbrühe wurde eine Aktivsubstanz gemäss der Erfindung in der folgenden Weise hergestellt:

Zehn Liter der erhaltenen Kulturbrühe wurde zur Entfernung der microbiellen Zellen und anderer unlöslicher Bestandteile zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde mit Salzsäure auf ein pH von 3,6 eingestellt, wobei eine Ausfällung im isoelektrischen Punkt von Coproporphyrin III gebildet wurde. Die Ausfällung wurde durch ein Glasfilter filtriert und die Veresterung durch Zugabe von Salzsäure-Methanol durchgeführt, wobei ein Tetramethylester von Coproporphyrin III erhalten wurde. Der Ester wurde in einer Kolonne von Aluminiumoxid chromatographiert und ergab 85 mg des Tetramethylesters von Coproporphyrin III in Form von Kristallen.

85 mg der Kristalle des Tetramethylesters von Coproporphyrin III wurden in 100 ml Pyridin gelöst und eine kleine Menge 3n Kaliumhydroxid zugefügt. Die Reaktion wurde eine Stunde bei 90 °C durchgeführt. Eine schwarze Ausfällung wurde durch Filtration abgetrennt und mit Alkohol oder Äther gewaschen, wobei das Tetrakaliumsalz von Coproporphyrin III erhalten wurde. Die Reinheit des Kaliumsalzes wurde aus seiner Adsorption im Ultraviolett-Spek-trum bestimmt und betrug 99%.

Herstellungsverfahren Nr. 3 der Aktivsubstanz

Das Herstellungsverfahren Nr. 1 wurde wiederholt mit der Ausnahme, dass Arthrobacter resinosus (FERM-P Nr. 3131) verwendet wurde. Die gebildete Menge Coproporphyrin III betrug 16,0 mg/Liter.

Unter Verwendung der erhaltenen Kulturbrühe wurde gemäss der Erfindung eine Aktivsubstanz in der folgenden Weise hergestellt:

In derselben Weise wie beim Verfahren Nr. 2 wurden

110 mg des Tetramethylesters von Coproporphyrin III in Form von Kristallen aus 10 Litern der erhaltenen Kulturbrühe erhalten. 110 mg der Kristalle des Tetramethylesters von Coproporphyrin III wurden in 10 ml Benzol gelöst und eine kleine Menge von 3n Ammoniumhydroxid zugefügt. Die Reaktion wurde eine Stunde bei 80 °C durchgeführt. Es wurde eine schwarze Ausfällung gebildet, die durch Filtration abgetrennt und mit Alkohol gewaschen wurde, wobei 106 mg des Tetraammoniumsalzes von Coproporphyrin III erhalten wurden. Die Reinheit des Tetraammoniumsalzes wurde aus seiner Adsorption im Ultraviolett-Adsorptions-spektrum bestimmt und betrug 98%.

Herstellungsverfahren Nr. 4 der Aktivsubstanz

Das Verfahren Nr. 1 wurde wiederholt mit der Ausnahme, dass Arthrobacter isopropanolophila (FERM-P Nr. 3129) verwendet wurde und 1,0 g Glukose in zwei Portionen anstelle von 2,0 ml Isopropylalkohol als Kohlenstoffquelle verwendet wurden. Die gebildete Menge Coproporphyrin III betrug 26 mg/Liter.

Dann wurden in derselben Weise wie beim Verfahren Nr. 2 beschrieben, 178 mg des Tetramethylesters von Coproporphyrin III in Form von Kristallen aus 10 Litern der erhaltenen Kulturbrühe hergestellt.

178 mg der Kristalle des Tetramethylesters von Coproporphyrin III wurden in 100 ml 6n Salzsäure gelöst und über Nacht in einem Kühlschrank stehen gelassen. Wenn der pH der Reaktionsmischung mit Natriumhydroxid auf 3,6 eingestellt wurde, fiel freies Coproporphyrin III aus. Die Ausfällung wurde durch Filtration abgetrennt. Das erhaltene freie Coproporphyrin III wurde in einer kleinen Menge Wasser gelöst und Natriumhydroxid zur Einstellung des pH des Lösungsmittels auf 10 zugefügt. Das Wasser wurde abgedampft und der Rückstand mit Alkohol und einem Ester gewaschen, wobei 181 mg des Tetranatiumsalzes von Coproporphyrin

111 erhalten wurden. Die Reinheit des erhaltenen Tetranatriumsalzes wurde aus seiner Adsorption im Ultraviolett-Adsorptionsspektrum bestimmt und betrug 97%.

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Herstellungsverfahren Nr. 5 der Aktivsubstanz

Das Verfahren Nr. 1 wurde wiederholt mit der Ausnahme, dass Brevibacterium eburneus (FERM-P Nr. 3128) verwendet wurde. Die Menge des gebildeten Coproporphyrin III betrug 19,2 mg/Liter.

In derselben Weise wie bei Verfahren Nr. 4 wurden 134 mg des Tetranatriumsalzes von Coproporphyrin III mit einer Reinheit von 97% aus 10 Litern der erhaltenen Kulturbrühe hergestellt.

Der karzinostatische Effekt von Coproporphyrin III wird durch die folgenden Beispiele dargestellt.

Beispiel 1

1,0 ml AH-41C (Karzinom Ascites hepaticus) in einer Konzentration von 107 Karzinomhellen/ml wurde geimpft in die Venen des Schwanzes von Donryu-Ratten ($), eingeteilt in Gruppen von 6 Ratten. Nach einer Unterbrechung von 72 Stunden wurde das Natriumsalz von Coproporphyrin III, erhalten nach dem Herstellungsverfahren Nr. 1, den Ratten intraperitoneal in den in Tabelle 1 angegebenen Dosierungen s einmal am Tag während 10 aufeinanderfolgenden Tagen injiziert. Dann wurden die Ratten 60 Tage beobachtet. Die Ergebnisse sind zusammen mit Vergleichs versuchen einer Kontrollgruppe, die keine Injektion erhielten, in Tabelle 1 angegeben.

io Wenn der vorgenannte Test unter Verwendung des Natriumsalzes von Coproporphyrin III, des Kaliumsalzes von Coproporphyrin III und des Ammoniumsalzes von Coproporphyrin III, erhalten nach den Herstellungsverfahren Nr. 2, 3,4 und 5, durchgeführt wurde, wurden im wesentli-15 chen dieselben Ergebnisse wie in Tabelle 1 erhalten.

Tabelle 1

Verweil

Kontrolle

Dosierung bei einer Verabreichung

zeit

Anzahl der

Prozent

1 mg/kg

20 mg/kg

50 mg/kg

(Tage)

über

Über

Anzahl der

Prozent

Anzahl der

Prozent der

Anzahl der

Prozent lebenden lebende

über der Über

über

Über

über der Über

Ratten

lebenden lebenden lebenden lebenden lebenden lebenden

Ratten

10

6

100

6

100

6

100

6

100

15

4

67

6

100

6

100

6

100

20

0

5

83

6

100

6

100

25

3

50

2

33

3

50

30

3

50

2

33

3

50

40

2

33

2

33

3

50

2

33

2

33

3

50

60

2

33

2

33

3

50

Vergleichsbeispiele 1 und 2 Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt mit der Ausnahme, dass ein Natriumsalz von Coproporphyrin I und ein Natriumsalz von Proporphorin IX verwendet wurden

35 anstelle des Natriumsalzes von Coproporphyrin III und die Dosierung pro Verabreichung auf 1 mg/kg begrenzt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammen mit dem Ergebnis von Beispiel 1 bei derselben Dosierung angegeben.

Tabelle 2

Verweil

Kontrolle

Natriumsalz von

Natriumsalz von zeit

Anzahl der

Prozent der

Coproporphyrin III

Coproporphyrin I

Protoporphyrin IX

(Tage)

über

Über

(gem. der Erfind.)

(Vergleichsbsp. 1)

(Vergleichsbsp. 2)

lebenden lebenden

Anzahl der

Prozent der

Anzahl der

Prozent der

Anzahl der

Prozent

Ratten

über

Über

über

Über

über der Über

lebenden lebenden lebenden lebenden lebenden lebenden

Ratten

10

6

100

6

100

6

100

6

100

15

4

67

6

100

5

83

5

83

20

0

5

83

3

50

2

33

25

3

50

2

33

2

33

30

3

50

1

17

2

33

40

2

33

1

17

2

33

50

2

33

1

17

1

17

60

2

33

1

17

1

17

Beispiel 2

Beispiel 1 wurde wiederholt mit der Ausnahme, dass ein Natriumsalz von Coproporphyrin III hergestellt wurde durch Kultivierung von Arthrobacter globiformis ATCC 8010, Arthrobacter pascens ATCC 13346, Arthrobacter au-rescens ATCC 13344, Arthrobacter ureafaciens ATCC 7562 und Arthrobacter tumescens ATCC 6947 und dass eine Dosierung von 1 mg/kg pro Mal verabreicht wurde. Die erhaltenen Ergebnisse sind im wesentlichen dieselben wie die in Tabelle 1 angegebenen.

Beispiel 3

Beispiel I wurde wiederholt mit der Ausnahme, dass im m Handel erhältliches Tetranatriumsalz von Coproporphyrin III (aus menschlichen Fäces) verwendet und in einer Dosierung von 1 mg/kg pro Mal verabreicht wurde. Die Ergebnisse waren im wesentlichen dieselben wie diejenigen von Tabelle 1.

65

s

Claims

636 010

PATENTANSPRÜCHE 1. Mittel zur Behandlung von Tumoren, enthaltend als Aktivsubstanz Coproporphyrin Typus III der Formel

CHgCHgCOOH CH.

H,0—H"-C_ OH,

5 1 " " 5

HOOCHgCH^C

CH2CH2C00H

oder dessen pharmazeutisch annehmbare wasserlösliche Alkalisalze und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder ein Verdünnungsmittel.
2. Mittel gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge der Aktivsubstanz 0,01 bis 95 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht des Präparates, beträgt.