CH617939A5 - Process for the preparation of cephalosporin compounds - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Herstellung einer neuen Gruppe von 7a-Methoxy-cephalospo-rinverbindungen der folgenden Formel :

och, 3

cooh worin X die Acetoxygruppe, die Carbamoyloxygruppe, die Hydroxylgruppe oder das Wasserstoffatom und R die Gruppe —COCOOH oder die Carboxylgruppe bedeuten, sowie auf ein Verfahren zur Herstellung von Salzen dieser Verbindungen.

Verbindungen vom Cephalosporintypus sind weitgehend als antibiotische Substanzen mit antibakteriellen Wirkungen geprüft worden, wobei sich eine gewisse Zahl davon in der Praxis bewährt hat. Überdies wurden unlängst in der 7 a-Stellung des Cephemkernes eine Methoxygruppe aufweisende Verbindungen auf ihre ausgezeichneten antibakteriellen Wirkungen geprüft. Derivate solcher 7a-Methoxycephalosporin-verbindungen sind ebenfalls ausführlich erprobt worden. Unter diesen Umständen wurden Ausgangsmaterialien für diese 7 a-Methoxycephalosporinderivate nach verschiedenen Methoden hergestellt. So ist beispielsweise ein Verfahren bekannt,

gemäss welchem 3-Acetoxymethyl-7a-methoxy-7ß-(5-amino-5-carboxyvaleramido)-3-cephem-4-carbonsäure durch Züchtung von Streptomyces lipmani (U. S. Patent Nr. 3 719 563) erzeugt wird. Ferner ist ein Verfahren bekannt geworden, gemäss welchem 7ß-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-carba-moyloxymethyl-7 a-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure durch Züchtung von Streptomyces lactamdurans (vgl. Japanische Offenlegungsschrift Nr. 3287/1971) erzeugt wird. Andere Verfahren sind gleichfalls geoffenbart worden. Es ist aber ausserordentlich schwierig, solche durch einen Fermentie-rungsvorgang der oben erwähnten Art aus Kulturbrühen erhaltene 7a-Methoxycephalosporinverbindungen zu isolieren, weil im Molekül eine Carboxylgruppe und eine Aminogruppe vorhanden sind.

Bei Versuchen hinsichtlich der Oxydation der in 7 a-Stellung vorhandenen 5-Ammo-5-carboxyvaleramidogruppe zwecks Eliminierung der Aminogruppe und leichteren Isolierung der 7a-Methoxycephalosporinverbindungen aus der Kulturbrühe wurde nun festgestellt, dass man die 5-Amino-5-carboxyvale-rylamidogruppe spezifisch zur 4-Carboxybutyrylamido- bzw. 5-Carboxy-5-oxo-valerylamidogruppe oxydieren kann, indem man Zellmassen oder Enzympräparate von Trigonopsis variabilis einwirken lässt. Auch wurde festgestellt, dass die neuen, erfindungsgemäss erhältlichen Verbindungen der Formel I wertvolle Zwischenprodukte für die 7a-Methoxycephalospo-rinderivate darstellen, welche gegen verschiedene Infektionskrankheiten wirksam sind.

Ziel der vorliegenden Erfindung ist daher die Schaffung von neuen 7a-Methoxycephalosporinverbindungen der Formel I, welche für die Synthese von wertvollen Cephalosporinderiva-ten wertvoll sind.

Dabei geht die vorliegende Erfindung von der Erkenntnis aus, dass man durch einen Fermentationsprozess aus Verbindungen der nachfolgenden Formel II die 7a-Methoxycephalo-sporinverbindungen der Formel I erhalten kann.

Gemäss den Verfahren der vorliegenden Erfindung erhält man eine neue Gruppe von 7a-Methoxycephalosporinverbin-

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düngen der Formel I und ihre Salze. Unter den Verbindungen der Formel I sind vor allem jene hervorzuheben, bei welchen das Symbol X die Carbamoyloxygruppe und R die -COCOOH Gruppe oder die Carboxylgruppe bedeuten. Als Salze von Verbindungen der Formel I sind Alkalimetall- und s Erdalkalimetallsalze, z.B. die Natrium-, Kalium-, Calcium-oder Bariumsalze, und vorzugsweise die Natriumsalze zu nennen.

Erstes Ziel der vorliegenden Erfindung ist also die Schaffung eines neuen Verfahrens zur Herstellung einer Mischung 10 der Verbindungen der Formeln:

qch3 (ia)

hoocco-(ch2) 3-conh—;—

0^~N^- CH„X ■

und cooh och,

(ib)

hoog - ( ch2 ) 7 -conh h—f

CH2X 25

cooh oder von Salzen davon, welches darin besteht, dass man eine Verbindung der Formel:

och-

00C

+ uh(ch ) conh

/t y n

h3n

(ii)

ch2x cooh

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worin X die obige Bedeutung hat, oder ein Salz davon, der Einwirkung von Zellmassen oder Enzympräparaten der Hefe Trigonopsis variabilis unterwirft. 45

Gemäss diesem Verfahren kann man die in einer Kulturbrühe durch Fermentierung gewonnene Mischung von 7 a-Methoxycephalosporinverbindungen der Formel I leicht in guter Ausbeute gewinnen.

Die Ausgangsmaterialien beim vorliegenden Verfahren so können beliebige Verbindungen der Formel II sein, welche durch Synthese oder durch Gärungsverfahren erhältlich sind. Beispiele hierfür sind

3-Acetoxymethyl-7ß-(5-amino-5-carboxyvalerylamido)-7a-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure, ss

7 ß-(5-Amino-5-carboxyvalerylamido)-

3-carbamoyloxymethyl-7a-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure, 7 ß-(5-Amino-5-carboxyvalerylamido)-3-methyl-7a-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure, 7 ß-(5-Amino-5-carboxyvalerylamido)-3- «o hydroxyrnethyl-7a-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure sowie deren Salze, z.B. deren Alkalimetallsalze oder Erdalkalimetallsalze. Diese Verbindungen sind bereits geoffenbart. Als Ausgangsmaterial für das vorliegende Verfahren kann man mit Vorteil 3-Acetoxymethyl-7ß-(5-amino-5-carboxyvaleryla- «s mido)-7a-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure (erhältlich durch Züchtung von Streptomyces lipmani, U. S. Patent Nr. 3 719 563), 7ß-(5-Amino-5-carboxyvalerylamido)-3-

carbamoyloxymethyl-7a-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure (erhältlich durch Züchtung von Streptomyces lactamdurans, Streptomyces clavurigenes, Streptomyces jumonjinensis usw., Japanische Offenlegungsschriften Nr. 3286/1971 und 42 8937 1974 und holl. Patent Nr. 7 011 805), 7ß-(5-Amino-5-carb-oxyvalerylamido)-3-methyl-7a-methoxy-3-cephem-4-carbön-säure (erhältlich durch Züchtung von Streptomyces, Stamm WS-3442, Japanische Offenlegungsschritt Nr. 26 488/1974) u. dgl. verwenden.

Die erfindungsgemässe Oxidation der in 3-Stellung substituierten 7 ß-(5-Amino-5-carboxyvalerylamido)-3-cephem-4-carbonsäure der Formel II beruht auf der Einwirkung einer unter aeroben Bedingungen durch einen Mikroorganismus herstellbaren D-Aminosäureoxydase; dabei wird die Amino-gruppekomponente oxydiert und eine Mischung der Cephalo-sporinverbindungen der obigen Formeln IA und IB erhalten.

Die Hefe Trigonopsis variabilis ist öffentlich zugänglich und zwar beispielsweise beim Institute of Applied Microbiology of Tokyo University, Japan, als Stamm IAM 4443.

Bei der Durchführung des vorliegenden Verfahrens wird mit Vorteil der oben erwähnte Trigonopsis variabilis-Stamm in bekannter Weise aktiviert.

Im allgemeinen umfasst das Züchten eines Mikroorganismus eine Impfkultur und eine Hauptkultur. Bei der vorliegenden Erfindung kann die Impfkultur gewöhnlich durch Gebrauch eines relativ dichten Kulturmediums hergestellt werden, welches die üblichen Nährquellen, wie Kohlenstoffquelle, Stickstoffquelle, anorganisches Salz u. dgl. enthält, worauf man die Hauptkultur gewöhnlich unter Verwendung eines Kulturmediums, welches eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, ein anorganisches Salz und eine D-Aminosäure zwecks Erhöhung der enzymatischen Wirkung und zur Steigerung der gewünschten Reaktion des Mikroorganismus in wirksamer und effizienter Weise enthält, herstellen kann.

Die Impfkultur umfasst gewöhnlich als Kohlenstoffquelle beispielsweise einen Zucker, z.B. Glucose, Saccharose, Maltose, Glycerin oder andere Nichtkohlehydrate, z.B. Paraffin, in der Natur vorkommende Materialien und Extrakte davon. Die Stickstoffquelle kann beispielsweise eine organische Stickstoffverbindung, z.B. Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, verschiedene Aminosäuren und anorganische Stickstoffverbindungen, wie Ammoniumnitrat, Natriumnitrat oder Ammoniumsulfat, enthalten. Nötigenfalls kann man auch anorganische Salze, wie Magnesiumsulfat, Zinksulfat, Kaliumchlorid u. dgl., zugeben. Der Trigonopsis variabilis-Stamm wird vorzugsweise in ein Impfkulturmedium inokuliert, welches die oben erwähnten Komponenten enthält, wobei die Züchtung dann üblicher-. weise bei 15 bis 37°C durchgeführt wird. Die Dauer für ein reichliches Wachstum des Stammes beträgt normalerweise 1 bis 5 Tage.

Hierauf erfolgt die Hauptzüchtung zweckmässig unter Verwendung eines Kulturmediums, welches Zucker, D-Aminosäuren, Salze zur Steigerung der Oxydasewirkung des Trigonopsis variabilis-Stammes, welche in der oben erwähnten Impfkultur erzielt worden ist, wobei die in 3-Stellung substituierte 7ß-(5-Amino-5-carboxyvalerylamido)-7a-methoxy-3-cephem-4-car-bonsäure oxydiert wird; dadurch wird der in der 7ß-Stellung vorhandene Substituent in eine 4-Carboxybutyrylamido-bzw. 5-Carboxy-5-oxovalerylamidogruppe übergeführt.

Die Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und Salze, welche man für die Züchtung verwenden kann, können die gleichen sein, wie im Falle der zuvor erwähnten Impfkultur. Als D-Aminosäure kann man eine beliebige D-Aminosäure, wie d-Alanin, DL-Alanin u. dgl., verwenden. Insbesondere D-a-Aminoadipinsäure wird man als Teilkomponente der gewünschten Verbindung bevorzugen.

Der in der Impfkultur erhaltene Trigonopsis variabilis-Stamm wird vorzugsweise einem Kulturmedium inokuliert,

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welches die oben erwähnten Komponenten enthält, worauf man die Züchtung mit Vorteil unter aeroben Bedingungen und üblicherweise bei 15 bis 37°C bewirkt. Die Züchtungsdauer beträgt normalerweise ungefähr 1 bis 7 Tage. Nach erfolgter Züchtung können die erzeugten Zellen in an sich bekannter Weise, z.B. durch Zentrifugieren, gesammelt werden. Bei der vorliegenden Erfindung kann man die Zellen als solche verwenden. Man kann aber auch aktivierte Zellen, welche durch Zellenaufschluss erhalten worden sind, verwenden, um auf diese Weise einen innigeren Kontakt zwischen dem Enzym und dem Substrat zu erzielen. Eine solche Aufschlussmethode kann beispielsweise eine Ultraschallbehandlung, eine Behandlung mit einer sogenannten «Frenchpress», eine Behandlung mit einem oberflächenaktiven Mittel, z.B. Cetyltrimethylam-moniumbromid, Natriumdeoxycholat, Natriumdodecylsulfat, Digitonin, Triton X 100 (Marke der Firma Rohm & Haas Co., USA) u. dgl., eine Autolyse mit einem Alkohol, z.B. Äthanol, einem Ester, z.B. Äthylacetat, einem organischen Lösungsmittel, z.B. Benzol oder Toluol, eine Schockbehandlung durch osmotischen Druck, eine Methode durch Gefrierenlassen bei einer Temperatur zwischen -20°C und -50°C und Auftauenlassen u. dgl. umfassen. Wegen der leichten Handhabung wird man unter diesen Methoden der Gefrier- und Auftaumethode den Vorrang geben, weil auch gleichzeitig eine ausreichende Enzymaktivierung und Durchführbarkeit gewährleistet werden. Diese Gefrier- und Auftaumethode kann durch Erhitzen der in einem Gefrierbehälter in gefrorenem Zustand gehaltenen Zellen nach der Zentrifugierung erfolgen, doch wird man, wenn möglich, ein Enzym durch allmähliches Auftauen bei Zimmertemperatur aktivieren.

Das erfindungsgemässe Verfahren kann auch so durchgeführt werden, dass man die nach den obigen Angaben erhaltenen aktivierten Zellen dem Einfluss einer in 3-Stellung entsprechend substituierten 7ß-(5-Amino-5-carboxyvaleryl-amido)-7a-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure oder einem Salz davon unterwirft. Diese Behandlung erfolgt gewöhnlich in einer destilliertes Wasser, physiologische Kochsalzlösung oder einen Puffer enthaltenden Flüssigkeit, deren pH-Wert bei 6 bis 10 und vorzugsweise bei 7,5 bis 8,5 liegt. Die als Ausgangsmaterial verwendete Cephalosporinverbindung wird der oben erwähnten Flüssigkeit hinzugegeben, worauf man die oben erwähnten, gesammelten und aktivierten Zellen hinzugibt und dann das Reaktionsgemisch unter aeroben Bedingungen gewöhnlich bei 15 bis 37°C behandelt. Zu diesem Zweck kann man eine beliebige synthetische oder durch Gährungsprozess erhältliche Cephalosporinverbindung der Formel II als Ausgangsmaterial verwenden. Die erfindungsgemäss eintretende Enzymreaktion besteht darin, dass das Substrat, nämlich die in 3-Stellung substituierte 7ß-(5-Amino-5-carboxyvalerylamido)-7a-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure durch das Enzympräparat von Trigonopsis variabilis oxydiert wird, wodurch die in der 7 ß-Stellung vorhandene 5-Amino-5-carboxyvalerylamido-gruppe in die 5-Carboxy-5-oxovalerylamidogruppe übergeführt wird, wobei die gewünschte, in 3-Stellung substituierte 7 ß-(5-Carboxy-5-oxovalerylamido)-7 a-methoxy~3-cephem-4-carbonsäure erhalten wird. Die so erhaltene Verbindung kann durch die Einwirkung von Wasserstoffperoxyd, welches im Verlaufe des Reaktionsablaufes gebildet wird, weiter oxydiert werden, wobei sich eine in 3-Stellung substituierte 7ß-(4-Carboxybutyrylamido)-7a-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure bildet. Somit bildet sich gewöhnlich eine Mischung beider Verbindungen. Diese beiden Verbindungen können in an sich üblicher Weise getrennt und gewonnen werden, um auf diese Weise die gewünschten Verbindungen zu isolieren.

Zur Erzielung einer besseren Ausbeute an Verbindung der Formel IA (in 3-Stellung substituierten 7ß-(5-Carboxy-5-oxovalerylamido)-7 a-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure) wird die Wirkung des Wasserstoffperoxyds, d. h. die Weiteroxida-

tion der ersterstandenen Verbindung, aufgrund des gegebenen Enzymreaktionsmechanismus der oben beschriebenen Art gehemmt; diese Hemmwirkung wird durch Katalaseeinwirkung erreicht. Im erfindungsgemäss zur Anwendung gelangenden Mikroorganismus, nämlich Trigonopsis variabilis, ist Katalase enthalten, doch wird man eine weitere ausreichende Menge Katalase zusetzen müssen, um die Zersetzung des in situ durch die Enzymreaktion gebildeten Wasserstoffperoxyds zu bewirken und dadurch die Einwirkung derartigen Wasserstoffperoxyds zu verhindern.

Für eine bessere Ausbeute an in 3-Stellung substituierter 7 ß-(4-Carboxybutyrylamido)-7 a-methoxy-3-cephem-4-car-bonsäure ist es notwendig, die oxydative Wirkung des während der Enzymreaktion in situ gebildeten Wasserstoffperoxyds auf die zuerst gebildete in 3-Stellung substituierte 7ß-(5-Carboxy-5-oxovalerylamido)-7 a-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure zu erhöhen. Es ist daher erforderlich, die Katalase zwecks Anreicherung an Wasserstoffperoxyd zu inaktivieren. Die Inaktivie-rung der Katalase kann so bewirkt werden, dass man eine Suspension der in Frage kommenden Zellen mit einem Inakti-vator behandelt oder einen Inaktivator der Enzymreaktionsmischung zugibt. Inaktivatoren der Katalase umfassen anorganische Azide, wie Natriumazid, Ascorbinsäure, 3-Amino-l,2,3-triazol, usw.. Natriumazid wird aus praktischen Erwägungen bevorzugt.

Die in Frage stehende Enzymreaktion kann unter aeroben Bedingungen bei 15 bis 37°C durchgeführt werden. Der Ablauf der Reaktion kann durch Verschwinden der antibakteriellen Wirkung des Substrates oder durch eine zeitweise durchgeführte Prüfung durch Dünnschichtchromatographie einer Probe des gebildeten neuen Reaktionsproduktes, z.B. 7 ß-(4-Carboxybutyrylamino)-cephalosporin oder 7 ß-(5-Carboxy-5-oxovalerylamido)-Cephalosporin, erfolgen, wobei man auf diese Weise den Reaktionsabschluss feststellen kann. Zur Beurteilung der antibakteriellen Wirkung kann man sich beliebiger üblicher Methoden bedienen, wie sie zum Auffinden einer antibiotischen Substanz üblicherweise verwendet werden. Verwendet man beispielsweise als Substrat eine Cephalosporinverbindung, wie 7ß-(5-Amino-5-carboxyvalerylamido)-3-carbamoyloxymethyl-7a-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure, so kann man als Testmikroorganismen grampositive Bakterien, z.B. solche der Gattung Staphylococcus oder Bazillus, und gramnegative Bakterien, z.B. Coliformbazillen oder solche der Gattung Proteus, verwenden. Als einfache Testmethode wird üblicherweise die Plattenmethode angewandt.

Nach beendeter Umsetzung können die Zellen unmittelbar unter kühlen Bedingungen durch Zentrifugieren entfernt werden, worauf man im allgemeinen die gewünschten Produkte isoliert und reinigt. Das Isolieren und die Reinigung können durch verschiedene Kombinationen bekannter Massnahmen, wie sie in den Beispielen genannt werden, durchgeführt werden.

Wie aus dem obigen ersichtlich ist, erhält man erfindungsgemäss solche Cephalosporinverbindungen, welche der obigen Formel I entsprechen. Beispiele hierfür sind 7 ß-(5-Carboxy-5-oxovalerylamido)-3-carbamoyloxymethyl-7a-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure, 3 - Acetoxymethyl-7 ß-(5 -carboxy-5 -oxovalerylamido) -7 a-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure, 7 ß-(5-Carboxy-5-oxovalerylamido)-7 a-methoxy-3-methyl-3-cephem-4-carbonsäure, 7ß-(5-Carboxy-5-oxovalerylamido)-3-hydroxymethyl-7a-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure, 7ß-(4-Carboxybutyrylamido)-3-carbamoyloxymethyl-7a-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure, 3-Acetoxymethyl-7ß-(4-carboxybutyryl-amido)-7a-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure,

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7 ß-(4-Carboxybutyrylamido)-7 a-methoxy-3-methyl-3-cephem-4-carbonsäure,

7 ß-(4-Carboxybutyrylamido) -3 -hydroxymethyl-7 a-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure,

sowie deren Salze mit Alkalimetallen oder Erdalkalimetallen.

Die 7a-Methoxycephalosporinverbindungen der Formel I sind als Zwischenprodukte für die Synthese von verschiedenen 7a-Methoxycephalosporinverbindungen, welche antibakterielle Wirkungen haben, wertvoll. So kann man beispielsweise eine Verbindung der Formel I leicht durch Umsetzung mit Thienylacetylchlorid in Cefoxitin, d. h. 7ß-(2-Thienylacet-amido)-3-carbamoyloxymethyl-7a-methoxy-3-cephem-4-car-bonsäure, gemäss Angaben in der Japanischen Offenlegungsschrift Nr. 931/1972, überführen. Man kann auch die Verbindungen der Formel I leicht in solche Cephalosporinderivate, wie sie in der Japanischen Offenlegungsschrift Nr. 83 386/ 1975 beschrieben sind, nach der zuvor genannten Methode überführen. Beispiele von auf diese Weise erhaltenen, wertvollen Verbindungen sind

3-Carbamoyloxymethyl-7ß-cyanomethylthioacetamido-

7a-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure,

7 ß-Azidomethylthioacetamido-3 -carbamoyloxymethyl-

7 <x-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure,

3-Carbamoyloxymethyl-7 ß-propargyl-

thioacetamido-7a-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure,

3-Carbamoyloxymethyl-7ß-(3-isoxazolyloxy)-acetamido-

7 a-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure,

3-Carbamoyloxymethyl-7ß-2-(l,3,4-thia-

diazolyl)-thioacetamido-7a-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure usw..

Auch die 2,4-Dinitrophenylhydrazonverbindung des 7 a-Methoxycephalosporins, welches in der 7 ß-Stellung die 5-Carboxy-5-oxovaIerylamidogruppe trägt, zeigt eine 2- bis 3-fach stärkere antibakterielle Wirkung gegenüber grampositiven Bakterien, wie Staphylococcus aureus, als die als Ausgangsma-terial verwendete 5-Amino-5-carboxyvalerylamidoverbin-dung.

Die vorliegende Erfindung besitzt ferner den Vorteil, dass 7a-Methoxycephalosporinverbindungen, deren Isolierung und Reinigung aus Kulturbrühen bisher schwierig waren, nunmehr leicht isoliert und in hohem Reinheitsgrad bei guter Ausbeute erhalten werden können.

Die Erfindung sei durch die folgenden Beispiele erläutert.

Beispiel 1

(1) Trigonopsis variabilis (SANK 59 963 = IAM 4443) wurde in einem in einem Testrohr vorhandenen Medium auf schräger Platte inokuliert, welches dadurch erhalten worden ist, dass man 15 g Agar einem Medium, welches sich aus 1 Liter Rübensaftextrakt, 20 g Glucose, 1 g Ammoniumsulfat und 5 g Kaliumdihydrogenphosphat zusammensetzte, hinzugab, worauf man die Züchtung bei 30°C während 7 Tagen vornahm. Getrennt wurde ein Medium hergestellt, welches 20 g Glucose, 5 g Hefeextrakt, 4 g Kaliumdihydrogenphosphat, 1 g Mägnesiumsulfat • 7 H20,2 g Ammoniumsulfat, 25 mg Eisensulfat • 7 H2O, 500 mg/Liter Calciumchlorid enthielt, wobei der pH-Wert auf 6,0 eingestellt wurde. Dann wurden jeweils 100 ml-Portionen dieses Mediums in 5 Kolben mit 500 ml Fassungsvermögen eingetragen, worauf man unter Druck bei 121°C (15 lbs.) während 20 Minuten sterilisierte. Eine geringfügige Menge des oben erwähnten Schrägkulturmediums wurde als Impfstoff dem soeben genannten Medium hinzugegeben und die Kultur während 3 Tagen bei 28°C und bei 120 Umdrehungen pro Minute geschüttelt, wobei man eine Impfkulturbrühe erhielt.

5 Liter eines Mediums, welches 20 g Glucose, 3 g DL-Alanin, 4 g Kaliumdihydrogenphosphat, 1 g Magnesiumsulfat • 7 H20,0,5 g Calciumchlorid, 0,1 g Borsäure, 40 mg

Ammoniummolybdat, 40 mg Mangansulfat • 7 H20,40 mg Zinksulfat ■ 7 H20,45 mg Kupfersulfat • 5 H2O, 25 mg Eisensulfat • 7 H2O, 20 ug Biotin, 100 (ig/liter Thiaminhydrochlorid (pH = 6,0) enthielt, wurden jeweils in Mengen von 100 ml Portionen in 50 Kolben gegossen, worauf man den Kolbeninhalt unter Druck (15 lbs.) während 20 Minuten bei 121°C sterilisierte. Nach dem Kühlen wurde mit 3 ml der oben erwähnten Impfkulturbrühe geimpft und die Kulturbrühe während 3 Tagen bei 28°C und bei 120 Umdrehungen pro Minute geschüttelt. Nach erfolgter Züchtung wurde die Kulturbrühe aus den 50 Kolben gesammelt, auf 0 bis 5°C gekühlt und bei 10 000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Die so gesammelten Zellen wurden zweimal mit Wasser gewaschen, wobei man 100 g feuchte Zellen erhielt. Diese Zellen wurden unmittelbar in einer Gefriervorrichtung bei -20°C eingefroren, wodurch man eine gefrorene Zellmasse erhielt. Die so eingefrorenen und aufgetauten Zellen zeigten eine D-Aminosäure-oxydasewirkung von 400 bis 600 Einheiten pro mg Protein.

(2) 20 g einer Zellpaste, welche durch Gefrieren und Auftauen der nach dem obigen Verfahren erhaltenen gefrorenen Zellen erhalten worden war, wurden zu 500 ml einer 1/10 molaren Pyrophosphatpufferlösung (pH-Wert 8,1), welche eine 1/10 molare Konzentration an Natriumazid in gelöstem Zustande enthielt, hinzugegeben, worauf man das Reaktionsgemisch während 60 Minuten behandelte, um die Katalase in der aufgetauten Zellensuspension zu inaktivieren. Diese gegenüber Katalase inaktivierte Zellensuspension wurde mit 4 g Cephamycin C, d. h. 7ß-(5-Amino-5-carboxyvaleryla-mido) -3 -carbamoyloxymethyl-7 a-methoxy-3 -cephem-4-car-bonsäure, von einem Reinheitsgrad von 50% versetzt und die enzymatische Reaktion unter Schütteln während 3 Stunden durchgeführt. Neue Stellen wurden bei der Dünnschichtchromatographie mit der Abnahme von Cephamycin C festgestellt. Nach beendeter Umsetzung wurden der obenauf schwimmende, klare Teil und die Zellen unmittelbar durch Zentrifugieren voneinander getrennt. Der obenauf fliessende Teil wurde durch Zugabe von 2n-Salzsäure unter Eiskühlung auf einen pH-Wert von 1,5 eingestellt und achtmal mit gleichen Mengen Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatschicht wurde mit Diphenyldiazomethan behandelt und das veresterte Gemisch unter vermindertem Druck eingeengt. Das Konzentrat wurde der Dünnschichtchromatographie unter Verwendung eines Entwicklers, welcher aus Benzol und Äthylacetat im Mischungsverhältnis von 3:2 bestand, unterworfen und die gewünschten Fraktionen gesammelt, extrahiert und eingeengt, wobei man 788 mg Diphenylmethyl-7ß-(4-carboxybutyryl-amido)-3-carbamoyloxymethyl-7a-methoxy-3-cephem-4-carb-oxylat erhielt.

UV-Spektrum Vax 263 nm

IR-Spektrum vmax^3 cm_11780 (ß-Lactam) N.M.R.-Spektrum (CDCI3) òppm

1,7-2,7 (6H Multiplett)

3,3 (2H AB-Quartett, J= 18 Hz)

3,5 (3H Singulett)

4.85 (2H AB-Quartett, J= 12 Hz) 5,05 (1H Singulett)

6.86 (1H Singulett) 6,94 (1H Singulett) 7,35 (20H Singulett)

Beispiel 2

In 300 ml 1/10 Mol Pyrophosphatpuffer (pH 8,1) wurden 10 g der Zellenpaste, welche durch Gefrierenlassen und Auftauen der gemäss Angaben im obigen Beispiel 1(1) erhaltenen s

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gefrorenen Zellen erhalten worden ist, und 3 g Cephamycin C von einem Reinheitsgrad von 50% gelöst und diese Lösung hierauf mit 30 000 Einheiten Katalase versetzt. Die Enzymreaktion wurde unter Schütteln während 3 Stunden bei 28 °C fortgesetzt. Nach beendeter Umsetzung wurden der oben-auffliessende Teil und die Zellen durch Zentrifugieren voneinander getrennt und der obenauffliessende Teil durch Zugabe von 2n-Salzsäure unter Eiskühlung auf einen pH-Wert von 1,5 eingestellt und hierauf in 10 gleichen Portionen Äthylacetat extrahiert. Auf diese Weise erhielt man die 7 ß-(5-Carboxy-5-oxovalerylamido)-3-carbamoyloxymethyl-7a-methoxy-3-ceph-em-4-carbonsäure.

Um die Struktur der so erhaltenen Verbindung zu bestätigen, wurde eine konzentrierte Lösung dieser Verbindung in Äthylacetat zur Trockne eingeengt und der Rückstand unmittelbar in 6 ml destilliertem Wasser gelöst und diese Lösung mit einem Überschuss mit einer 0,35%igen 2,4-Dinitrophenylhy-drazinlösung in 2n-Salzsäure versetzt und hierauf die Umsetzung während 6 Stunden bei Zimmertemperatur durchgeführt. Nach beendeter Umsetzung wurde das Reaktionsgemisch durch Zugabe von 2n-Natriumhydroxydlösung auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und zweimal mit jeweils 100 ml Äthylacetat extrahiert, um das überschüssige 2,4-Dinitrophe-nylhydrazin zu beseitigen. Die wässrige Schicht wurde hierauf erneut durch Zugabe von 2n-Salzsäure auf einen pH-Wert von 1,5 bis 2,0 eingestellt und anschliessend viermal mit jeweils 200 ml Äthylacetat extrahiert. Die vereinigten Äthylacetat-extrakte wurden eingeengt, wobei man 1,38 g des Konzentrats erhielt.

xMeOH 263 max

UV-Spektrum

IR-Spektrum vmax^ cm-11780 (ß-Lactam)

N.M.R.-Spektrum (Aceton-dô) ôppm

1,5-2,6 (6H Multiplett)

3,3 (2H AB-Quartett, J= 18 Hz)

3,5 (3H Singulett)

4,9 (2H AB-Quartett, J= 12 Hz)

5,1 (1H Singulett)

8,1 (1H AB-Quartett, J= 18 Hz)

8,5 (1H AB-Quartett, J= 18 Hz, 2Hz)

9,05 (1H Dublett, 3=2 Hz)

Beispiel 3

Eine Kulturbrühe mit einer Produktivität an Cephamycin C von 750 (xg/ml, welche durch Züchtung eines Cephamycin C erzeugenden Mikroorganismus (Streptomyces jumonjinensis) erhalten worden war, wurde zentrifugiert, um den obenauffliessenden Anteil von den Zellen zu trennen. Der obenauffliessende Teil wurde in 2 Fraktionen aufgeteilt.

(a) Zu 50 ml der ersten Fraktion (pH 7,60) wurden 2 g der aufgetauten Zellenpaste von Trigonopsis variabilis, erhalten nach den Angaben gemäss obigem Beispiel 1 (1), und 5000 bis 10 000 Einheiten überschüssiger Katalase zugegeben, worauf man die enzymatische Reaktion während 180 Minuten bei 28°C durchführte. Der Schluss-pH-Wert betrug 6,98. Auf diese Weise erhielt man die 7ß-(5-Carboxyl-5-oxovaleryl-amido)-3-carbamoyloxymethyl-7a-methoxy-3-cephem-4-car-bonsäure bei einer 50%igen Umwandlungsrate.

(b) 50 ml der zweiten Fraktion (pH 7,60) wurden mit 50 ml einer 1/10-molarenPyrophosphatpufferlösung (pH 8,1) versetzt und das erhaltene Gemisch hierauf gründlich gerührt und anschliessend mit 2 g einer gemäss obigem Beispiel 1(1) erhaltenen aufgetauten Trigonopsis variabilis Zellenpaste und 5000 bis 10 000 Einheiten Katalase versetzt. Die enzymatische Reaktion wurde hierauf durchgeführt, wobei man 7ß-(5-Carboxy-5-oxovalerylamido)-3-carbamoyloxymethyl-7a-meth-oxy-3-cephem-4-carbonsäure bei einem End-pH-Wert von

8,1 und einem Umwandlungsverhältnis von ungefähr 70% erhielt.

Beispiel 4

s Eine Kulturbrühe (mit einer Produktivität an Cephamycin C von 750 fig/ml), erhalten durch Züchtung eines Cephamycin C erzeugenden Mikroorganismus, wurde zentrifugiert, um den obenauffliessenden Teil und die Zellen zu trennen. Getrennt davon wurden 500 ml einer 1/10-molaren Pyrophosphatpuffer-10 lösung (pH 8,1), welche Natriumazid derart gelöst enthielt,

dass die Konzentration 1/10 Mol betrug, zu 20 g der aus den gefrorenen Zellen gemäss obigem Beispiel 1 (1) erhaltenen, aufgetauten Zellenpaste hinzugegeben und das erhaltene Gemisch während 60 Minuten bei Zimmertemperatur stehen-ls gelassen, um die Katalase der aufgetauten Zellenpaste zu inaktivieren.

Zu dieser so erhaltenen Paste wurden 500 ml der Cephamycin C Lösung, welche man nach vorhergehender Einstellung des pH-Wertes auf 8,1 erhalten hatte, hinzugegeben, worauf 20 man die Enzymreaktion während 180 Minuten bei 28°C durchführte, um die 7ß-(4-Carboxybutyrylamido)-3-carba-moyloxymethyl-7 a-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure bei einer 80%igen Umwandlungsquote zu erhalten.

Das Enzymreaktionsgemisch wurde zentrifugiert, um den 25 obenauffliessenden Teü abzutrennen. Der so abgetrennte, obenauffliessende Teil wurde auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt und über 9 g Aktivkohle gegossen, um das gewünschte Produkt zu adsorbieren. Das auf diese Weise erhaltene Produkt wurde mit einer 30%igen wässrigen Ace-30 tonlösung eluiert und die Eluate durch 100 ml eines Kationen-austauschharzes, nämlich Dowex 50 W (H+-Form; Warenzeichen der Firma Dow Chemical Co., U. S. A.) geführt. Die ausfliessende Flüssigkeit wurde gefriergetrocknet, wobei man 660 mg (E 5 cm = 70; Reinheit = 44%) der gewünschten 7ß-(4-35 Carboxybutyrylamido)-3-carbamoyloxymethyl-7a-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure als blassgelbes Pulver in einer Ausbeute von 77 % erhielt.

Die Verwendung einer Verbindung der Formel I zur Herstellung von nützlichen Cephalosporinverbindungen gemäss 40 dieser Erfindung wird nachstehend beschrieben.

(1) 7 ß-(4/-Benzhydryloxycarbonylbutyramido)-3-carbamoyloxymethyl-7 a-methoxy-3-cephem-4-carbonsäurebenzhydrylester 45 Eine Lösung von 1,5 g Diphenyldiazomethan in 10 ml Tetrahydrofuran wurde einer Lösung von 1,3 g schwach roher 7 ß-(4'-Carboxybutyramido)-3-carbamoyloxymethyl-7 a-meth-oxy-3-cephem-4-carbonsäure in 20 ml Tetrahydrofuran bei Zimmertemperatur zugegeben. Dann wurde das Reaktionsge-50 misch über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt. Die Losung wurde unter vermindertem Druck eingedampft. Der entstandene Rückstand wurde in Benzol gelöst und mit n-Hexan ausgefällt, wobei man 2,1 g einer öligen Substanz erhielt. Das Öl wurde durch Kieselgelsäulenchromatographie gereinigt, 55 wobei man 1,71 g 7ß-(4/-Benzhydryloxycarbonylbutyramido)-3-carbamoyloxymethyi-7a-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure-benzhydrylester in Form eines Schaums erhielt. NMR (CDCI3+D2O):

1,80-2,65 (6H, Multiplett),

3,20 und 3,40 (2H, AB-Quartett, J= 18 Hz),

3,44 (3H, Singulett),

4.87 (2H, breites Singulett), 5,02 (1H, Singulett),

6.88 (1H, Singulett), 6,93 (1H, Singulett),

7,10-7,50 (20H, Multiplett).

7

617 939

(2) 3-Carbamoyloxymethyl-7cc-methoxy-7 ß-(2'-thienylacetamido)-3-cephem-4-carbonsäurebenzhydrylester

(Cefoxitin-benzhydrylester)

Ein Gemisch von 300 mg 7ß-(4'-Benzhydryloxycarbonylbu-tyramido)-3-carbamoyloxymethyl-7a-methoxy-3-cephem-4-carbonsäurebenzhydrylester, 300 mg N-Trimethylsilyltrichlor-acetamid, 2,3 ml Thienylacetylchlorid und 7 ml 1,2-Dichlor-äthan während 15 Stunden auf 500 C erwärmt. Das so erhaltene Gemisch wurde dann mit 0,35 ml Methanol bei 0°C versetzt und anschliessend während 2 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Hierauf wurde das Reaktionsgemisch mit Äthylacetat verdünnt und die feste Substanz abfiltriert und mit Methanol gewaschen. Das vereinigte Filtrat wurde zweimal mit einer Natriumbicarbonatlösung und hierauf zweimal mit einer gesättigten Kochsalzlösung gewaschen. Nach dem Trocknen über Natriumsulfat wurden die organischen Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt, wobei man 576 mg eines

15

Öls erhielt. Diese rohe Substanz wurde durch präparative Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Kieselgelplatten (20x40 cm, 2 mm Dicke) gereinigt, wobei die Entwicklung mit einer Mischung von Chloroform, Äther und Aceton im Mischungsverhältnis von 2:2:1 erfolgte. Die Bande Rf = 0,51 wurde mit Äthylacetat gesammelt, wobei man 83 mg 3-Carbamoyloxymethyl-7a-methoxy-7ß-(2'-thienylacet-amido)-3-cephem-4-carbonsäurebenzhydrylester in Form eines Oels erhielt. NMR (CDCI3 + D2O):

3,22 und 3,29 (2H, AB-Quartett, J= 18 Hz),

3,40 (3H, Singulett),

3,76 (2H, Singulett),

ca. 4,83 (2H, ein teilweise aufgelöstes Peak),

4,99 (1H, Singulett),

6,80-7,00 (1H+2H, Multiplett),

7,05-7,50 (11H, Multiplett).

B

Claims (9)

1. 617939
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass X die Carbamoyloxygruppe bedeutet.

   2

   cooh und och

   (ib)

   hooc-(ch2)3~conh cooh in welchen X jeweils die Acetoxy-, Carbamoyloxy- oder Hydroxylgruppe oder das Wasserstoffatom bedeutet, oder ihrer Salze, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Verbindung der Formel:

   (ii)

   och «

   ooc ch-(cho),-c0nh gooh in welcher X obige Bedeutung hat, oder ein Salz derselben der Einwirkung einer Zellmasse oder eines Enzympräparates der Hefe Trigonopsis variabilis unterwirft.

   2

   PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Herstellung einer Mischung der Verbindungen der Formeln:

   (ia)

   och hoocco-(ch2)3-conh gh
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Salz ein Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalz herstellt.
4. 4. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der im Anspruch 1 gegebenen und definierten Formel IA oder ihrer Salze, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Verbindung der obigen Formel II oder ein Salz derselben der Einwirkung einer Zellmasse oder eines Enzympräparates der Hefe Trigonopsis variabilis in Gegenwart einer für die Zersetzung des in situ gebildeten Wasserstoffperoxids ausreichenden Menge Katalase unterwirft.
5. 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass X die Carbamoyloxygruppe bedeutet.
6. 6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man als Salz ein Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalz herstellt.
7. 7. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der im Anspruch 1 gegebenen und definierten Formel IB oder ihrer Salze, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Verbindung der obigen Formel II oder ein Salz derselben der Einwirkung einer Zellmasse oder eines Enzympräparates der Hefe Trigonopsis variabilis in Gegenwart eines InaktivatoTS der Katalase unterwirft.
8. 8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass X die Carbamoyloxygruppe bedeutet.
9. 9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass man als Salz ein Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalz herstellt.