DE2601457A1

DE2601457A1 - Cephalosporinverbindungen und verfahren zu deren herstellung

Info

Publication number: DE2601457A1
Application number: DE19762601457
Authority: DE
Inventors: Atsushi Naito; Isao Seki; Nobufusa Serizawa; Kanagawa Yokohama
Original assignee: Sankyo Co Ltd
Current assignee: Sankyo Co Ltd
Priority date: 1975-01-20
Filing date: 1976-01-16
Publication date: 1976-07-22
Also published as: FR2297858A1; FR2297858B1; GB1488103A; JPS5733039B2; CH617939A5; JPS5186187A

Description

Dr. F. Zumstein sen. - Dr. E. Assmann - Dr. R. Koenigsberger Dipl.-Phys. R. Holzbauer - Dipl.-!rg. F. K<ingpeisen - Dr. F. Zumstein jun.

PATENTANWÄLTE

TELEFON: SAMMEL-NR. 22 53 41

TELEX 529979 TELEGRAMME: ZUMPAT

POSTSCHECKKONTO: MÜNCHEN 91139-809. BLZ 7O0100 80

BANKKONTO: BANKHAUS H. AUFHÄUSER KTO.-NR. 397997. BLZ 7OO 306 00

8 MÜNCHEN 2, BRÄUHAUSSTRASSE 4

Case FP-7530-2 1

SAKEXO COMPAFT LIMITED, Tokyo/Japan

Cephalosporinverbindungen und Verfahren zu deren Herstellung

Die Erfindung betrifft neue Cephalosporinverbindungen der Formel

OCHj

(D

COOH

worin R die Gruppe -COCOOH oder eine Carboxylgruppe darstellt und X eine Acetoxygruppe, Carbamoyloxygruppe, Hydroxygruppe oder ein Wasserstoffatom darstellt und deren Salze. Sie werden hergestellt, indem man eine Verbindung der Formel

0OC.

OCH₃

CHpX

COOH

(H)

609830/0897

worin X die vorstehend angegebene Bedeutung besitzt, der Einwirkung eines Zellen- oder Enzympräparates der Hefe Trigonopsis variabilis unterwirft und sind als Zwischenprodukte für die Synthese von Cephalosporinderivaten mit starken antibakteriellen Aktivitäten verwendbar.

Die Erfindung betrifft eine neue Gruppe von 7a-Methoxycephalosporinverbindungen und ein Verfahren zur Herstellung derselben.

Insbesondere betrifft sie neue 7a-Methoxycephalosporinverbindungen der Formel

"N .

COOH

L-CH₂Z

(D

worin X eine Acetoxygruppe, Carbamoyloxygruppe, Hydroxygruppe oder ein Wasserstoffatom darstellt und R die Gruppe -COCOOH oder eine Carboxylgruppe darstellt und deren Salze sowie ein neues Verfahren zur Oxydation der 5-Amino-5-carboxyvalerylamidogruppe in 7ß-Steilung in die 4-Carboxybutyrylamido- oder 5-Carboxy-5-oxovalerylamidogruppe, indem man eine 7oc-Methoxy-7ß-(5-2-mino-5-carboxyvalerylamido)-3-substituierte-3-cephem-4-carbonsäure oder ein Salz derselben der Einwirkung eines Zellen- oder Enzympräparates der Hefe Trigonopsis variabilis unterwirft.

Verbindungen vom Cephalosporintyp sind weitgehend als antibiotische Substanzen mit antibakterieller Wirksamkeit untersucht und viele derselben haben praktische Anwendung gefunden. Überdies wurden neuerdings 7a-Methoxycephalosporinverbindungeh mit einer Methoxygruppe in der 7a-Stellung in dem Cephem-Kern im Hinblick auf ihre ausgezeichneten antibakteriellen Aktivitäten unter den Verbindungen vom Cephalosporintyp untersucht.

609830/0897

-3- 260U57

Derivate derartiger 7a-Methoxycephalosporinverbindungen wurden auch eingehend untersucht. Unter diesen Umständen -wurden Ausgangsmaterialien für diese 7oc-Methoxycephalosporinderivate durch Verfahren hergestellt, wie z.B. durch ein Verfahren, bei dem die 3-Acetoxymethyl-7a-methoxy-7ß-(5-amino-5-carboxyvaleramido)-3-cephem-4-carbonsäure durch Kultivierung von Streptomyees lipmani hergestellt wird (US-Patentschrift 5 719 5β3), das Verfahren, bei dem 7ß-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-carbamoyloxymethyl-7a-methoxy-3-cephein-4-carbonsäure durch Kultivierung von Streptomyees lactair.durans hergestellt wird (offengelegte japanische Patentanmeldung mit der Nummer 3287/1971) und ähnliche. Jedoch ist es infolge des Vorliegens einer Carboxylgruppe und einer Aminogruppe in dem Molekül sehr schwierig, diese 7oc-Methoxy-cephalosporinverbindungen, die durch das vorstehend genannte Perrnentationsverfahren aus einer Kulturbrühe gewonnen wurden, zu isolieren.

Als Ergebnis von Untersuchungen bei einem Verfahren zur Oxydation der 5-Amino-5-carboxyvaleramidogruppe in der 7ß-Stellung, um die Aminogruppe zur leichteren Isolierung der 7a-Mefcnoxycephalosporinverbindung aus einer Kulturbrühe zu eliminieren, wurde nun gefunden, daß die 5-Amino-5-carboxyvalerylamidogruppe spezifisch zur 4-Carboxybutyrylamido- oder 5-Carboxy-5-oxovalerylamidogruppe durch Einwirkung von Zellen- oder Enzympräparaten von Trigonopsis variabilis oxydiert werden kann sowie,daß die neuen erfindungsgemäßen Verbindungen I als Zwischenprodukte für die 7oc-Methoxy-cephalosporinderivate verwendbar sind, welche eine Wirksamkeit gegenüber verschiedenartigen infektiösen Krankheiten besitzen.

Ziel der Erfindung ist es, neue 7oc-Methoxy-cephalosporinverbindungen I zur Verfügung zu stellen, die als Zwischenprodukte für die Herstellung von wertvollen Cephalosporinderivaten verwendbar sind.

Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, ein neues Verfahren zur fermentativen Herstellung von 7oc-Methoxy-cephalosporinverbindungen I aus Verbindungen II zur Verfügung zu stellen.

609830/0897

_ 4 - 260U57

Weitere Ziele und Vorteile der Erfindung gehen aus der folgenden Beschreibung hervor.

Gemäß einem Gegenstand der Erfindung wird eine neue Gruppe an 7a-Methoxy-cephalosporinverbindungen I und deren Salzen zur Verfügung gestellt. Unter den Verbindungen I können vorzugsweise diejenigen Verbindungen genannt werden, worin X eine Carbamoyloxygruppe darstellt und R die Gruppe -COCOOH oder eine Carboxylgruppe bedeutet. Die Salze der Verbindungen I umfassen die entsprechenden Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalze, z.B. Natrium-, Kalium-, Calcium- und Bariumsalze, vorzugsweise Natriumsalze.

Gemäß einem weiteren Gegenstand der Erfindung ist ein neues Verfahren zur Herstellung von Ja-Methoxy-cephalosporinverbindungen I oder deren Salzen vorgesehen, bei dem eine Verbindung der Formel

ÖOC

(II)

COOH

worin X die vorstehend angegebene Bedeutung besitzt oder deren Salze, der Einwirkung eines Zellen- oder Enzympräparates der Hefe Trigonopsis variabilis unterworfen werden.

Gemäß diesem Verfahren kann die durch Fermentation in einer Kulturbrühe gebildete Yoc-Methoxy-cephalosporinverbindung I leicht in guter Reinheit und guter Ausbeute gewonnen werden.

Die 7ß-(5-Amino-5-carboxyvalerylamido)-Ya-methoxy-3-substituierte· 3-cephem-4-carbonsäure oder deren Salze, die als Ausgangsmaterial bei der Erfindung verwendet werden können> können sämtliche der

609830/0897

.₅- 260U57

Substanzen sein, die durch synthetische oder fermentative Verfahren erhalten werden und als Beispiele können genannt werden; 3-Acetoxymethyl-7ß-(5-amino-5-carboxyvalerylamido)-7a-methoxy-3-eephem-4-carbonsäure, 7ß-(5-Amino-5-carboxy-valerylamido)-3-carbamoyloxymethyl-7a-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure_J 7ß-(5-Amino-5-carboxyvalerylamido)-3-methyl-7a-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure, 7ß-(5-Amino-5-carboxyvalerylamido)-3-hydroxymethyl-7a-metlioxy-3-cephem-4-carbonsäure und deren Salze, wie die Alkalimetallsalze und Erdalkalimetallsalze. Alle diese Verbindungen sind bekannt. Insbesondere können als Ausgangsmaterialien für das vorliegende Verfahren vorzugsweise 3-Acetoxymethyl-7ß-(5-amiJ¹o-5-carboxyvalerylamido)-7a-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure (erhältlich durch Kultivierung von Streptomyces lipmani, US-Patentschrift 3 719 565)* 7ß-(5-Amino-5-carboxyvalerylamido)-3-carbamoyloxymethyl-7a-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure (erhältlich durch Kultivierung von Streptomyces lactamudurans, Streptomyces clavurigenes, Streptomyces jumonjinensis und dergleichen, offengelegte japanische Patentanmeldung der Nummer 3286/1971 und 42893/1974 und niederländische Patentschrift 7011805), 7ß-(5-Amino-5-carboxyvalerylamido)-3-methyl-7a-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure (erhältlich durch Kultivierung von Streptomyces WS-3442-Stamm, offengelegte japanische Patentanmeldung der Nummer 26488/1974) und dergleichen verwendet werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren betrifft wie vorstehend erwähnt ein Verfahren, bei dem die genannte 7ß-(5-Amino-5-carboxyvalerylamido)-3-substituierte-3-cephem-4-carbonsäure (II) der Einwirkung einer durch einen Mikroorganismus unter aeroben Bedingungen produzierbaren D-Aminosäure-Oxydase zur Oxydation des Aminogruppenteils unterworfen wird, wobei die Cephalosporinverbindung der vorstehenden Formel I gewonnen wird.

Was den vorliegend verwendeten Mikroorganismus anbelangt, so ist der für das vorliegende Verfahren geeignete Mikroorganismus die Hefe Trigonopsis variabilis. Dieser Stamm ist allgemein vom Institute of Applied Microbiology der Tokyo University, Japan als Stamm IAM 4443 erhältlich.

609830/0897

_6- 260U57

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der vorstehend genannte Trigonopsis variabilis-Stamm in bekannter Weise aktiviert.

Im allgemeinen setzen sich Verfahren zur Kultivierung von Mikroorganismen aus einer Keimkultur und einer Hauptkultur zusammen. Bei der vorliegenden Erfindung kann man die Keimkultur durch Verwendung eines relative dichten Kulturmediums bewirken, das übliche Nährquellen wie eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, ein anorganisches Salz und dergleichen umfaßt und dann im allgemeinen die Hauptkultur durchführen, wobei ein Kulturmedium verwendet wird, das eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, ein anorganisches Salz und eine D-Aminosäure enthält, urn die Enzymaktivität für eine effektive und wirksame Förderung der gewünschten Reaktion zu vergrößern.

Bei der Keimkultur können normalerweise als Kohlenstoffquelle beispielsweise Zucker wie Glucose, Sucrose, Maltose, Glycerin oder andere Michtkohlenhydrate, wie Paraffin, natürliche Materialien und deren Extrakte verwendet werden. Als Stickstoffquelle können z.B. organische Stickstoffverbindungen, wie Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, verschiedene Aminosäuren■ und anorganische Stickstoffverbindungen, wie Ammoniumnitrat, Natriumnitrat und Ammoniumsulfat verwendet werden. Nötigenfalls können anorganische Salze wie Magnesiumsulfat, Zinksulfat, Kaliumchlorid und dergleichen verwendet werden. Der Trigonopsis variabilis-Stamm wird in ein Keimkulturmedium eingeimpft, das die vorstehend genannten Komponenten enthält und die Kultivierung wird üblicherweise bei 15 bis 37°C durchgeführt. Die Zeit für ein reichliches Wachstum des Stammes beträgt gewöhnlich 1 bis 5 Tage.

Die Hauptkultivierung wird dann unter Verwendung eines Kulturmediums durchgeführt, das Zucker, D-Aminosäuren und Salze für die Verbesserung der Oxydase-Aktivität des bei der vorstehenden Keimkultur erhaltenen Trigonopsis variabilis-Stammes bei der Oxydation der 7ß-(5-Amino-5-carboxyvalerylarnido)-7a-methoxy-

609830/0897

_₇_ 260H57

3-substituierten-3-cephem-4-carbonsäure zur Überführung des Substituenten in der 7ß-Stellung in die 4-Carboxybutyrylamidogruppe oder 5-Carboxy-5-oxovalerylamidogruppe enthält.

Die Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und Salze, die bei dieser Kultivierung verwendet werden können, können die gleichen sein wie bei der vorgenannten Keimkultur. Als D-Aminosäure kann jede D-Aminosäure wie D-Alanin, DL-Alanin und dergleichen verwendet werden. Insbesondere ist D-a-Aminoadipinsäure als Teilkomponente des gewünschten Produktes am meisten bevorzugt.

Der bei der Keimkultur erhaltene Trigonopsis variabilis-Stamm wird auf ein Kulturmedium geimpft, das die obigen Komponenten enthält und die Kultivierung wird unter aeroben Bedingungen, gewöhnlich bei 15 bis 37⁰C^durchgeführt. Die Kultivierungszeit beträgt normalerweise ca. 1 bis 7 Tage. Nach der Kultivierung werden die so gebildeten Zellen in üblicher Weise, z.B. durch Zentrifugation gesammelt. Bei der Erfindung können die Zellen als solche verwendet werden oder es können auch aktivierte Zellen verwendet werden, die durch ein Verfahren zur Disintegration der Zellen zur Erzielung eines innigereren Kontaktes zwischen dem Enzym und dem Substrat hergestellt wurden. Ein derartiges Disintegrationsverfahren kann beispielsweise eine Ultraschallbehandlung, eine "French"-Druckbehandlung bzw. -Preßbehandlung (French press treatment), eine Behandlung mit einem oberflächenaktiven Mittel, z.B. Cetyltrimethylammoniumbromid, Natriumdeoxycholat, Natriumdodecylsulfat, Digitonin, Triton X 100 (Reaktionsprodukt von Octylphenol mit A'thylenoxyd, erhältlich von Rohm & Haas Co., USA) und dergleichen, eine. Autolyse mit einem Alkohol, z,B. Äthanol, einem Ester, z.B. A'thylacetat, einem organischen Lösungsmittel, z.B. Benzol und Toluol, ein osmotischer Druckschock, eine Gefrier- (bei -20 bis -50 C) und Taumethode und dgl. sein. Unter diesen Methoden ist eine Gefrier- und Taumethode im Hinblick auf die leichte praktische Durchführung, die den Erwartungen entsprechende ausreichende Enzymaktivierung und die annehmbare Arbeitsweise vorteilhaft. Diese Gefrier- und Taumethode kann durch Erhitzen der

60983 0/0897

260H57

gefrorenen^nach der Zentrifugation im gefrorenen Zustand in einem Gefriergerät gehaltenen Zellen durchgeführt werden, jedoch ist es bevorzugt, nach Möglichkeit ein Enzym durch allmähliches Auftauen bei Raumtemperatur zu aktivieren.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann durchgeführt werden, indem man die wie vorstehend gebildeten aktivierten Zellen auf die 7ß-(5-Amino»5-carboxyvalerylamido)-7a-methoxy-3-substituierte-5-cephem-4-carbonsäure oder ein Salz derselben einwirken läßt. Diese Behandlung wird üblicherweise in einer Flüssigkeit durchgeführt, die erhalten wurde, indem man destilliertes Wasser, physiologisches Salz bzw. eine physiologische Salzlösung oder einen Puffer auf einen pH von β bis 10, vorzugsweise 7,5 bis 8,5, einstellte. Die Ausgangscephalosporinverbindung wird zu der vorstehend genannten Flüssigkeit zugegeben. Die wie vorstehend gesammelten und aktivierten Zellen werden dann zugefügt und die Behandlung wird unter aeroben Bedingungen gewöhnlich bei 15 bis 37⁰C durchgeführt. Es kann jede Cephalosporinausgangsverbindung,die synthetisch oder fermentativ erhältlich ist, verwendet werden. Die vorliegende Enzymreaktion besteht darin, daß das Substrat 7ß-(5-Amino-5-carboxyvalerylamido)-7oc-methoxy-3-subtituierte-3-cephem-4-carbonsäure durch das Trigonopsis variabilis-Enzympräparat oxydiert wird, wobei die 5-Amino-5-carboxyvalerylamidogruppe in 7ß-Stellung in die 5-Carboxy-5-oxovalerylamidogruppe unter Bildung der gewünschten 7ß-(5-Carboxy-5~oxovalerylamido)-7a-methoxy-3-substituierten-j5-cephem-4-carbonsäure übergeführt wird. Die so gebildete Verbindung kann durch Einwirkung von Wasserstoffperoxyd, das während des Reaktionsablaufes gebildet wird, unter Bildung von 7ß-(4-Carboxybutyryl- · amido )-7a-methoxy-j5-substituierter-j5-cephem-4-carbonsäure weiter oxydiert werden. Daher wird normalerweise eine Mischung beider Verbindungen gebildet und beide Verbindungen können in üblicher Weise unter Erzielung der jeweils gewünschten Verbindungen getrennt und gewonnen werden.

609830/0897

260H57

— y —

Jedoch ist es zur Erzielung einer besseren Ausbeute der erwünschten erfindungsgemäßen Verbindung, nämlich von 7ß-(5-Carboxy-5-oxovaleryl-amido) ^a-methoxy-jj-substituierter^-cephem-4-carbonsäure zweckmäßig, die Wirkung von Wasserstoffperoxyd bei der Oxydation dieser Verbindung, wie sie aus dem vorstehend angegebenen Mechanismus der vorliegenden Enzymreaktion hervorgeht, zu inhibieren und diese Inhibierung kann normalerweise durch die Einwirkung von Katalase bewirkt werden. Katalase ist in dem erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismus Trigonopsis variabilis enthalten, jedoch ist es erforderlich, eine weitere ausreichende Katalasemenge zur Zersetzung des in situ durch die vorliegende Enzymreaktion gebildeten Wasserstoffperoxyds hinzuzufügen, um die Wirkung dieses Wasserstoffperoxyds zu inhibieren.

Zur Erzielung einer besseren Ausbeute einer weiteren erfindungsgemäßen Verbindung, nämlich von 7ß-(4-Carboxybutyrylamido)-7amethoxy-J-substituierter-^-cephem-^-carbonsäure, ist es zweckmäßig, die oxydative Wirkung des in situ während der vorliegenden Enzymreaktion gebildeten Wasserstoffperoxyds in Bezug auf die vorstehend genannte 7ß-(5-Carboxy-5-oxovalerylamido)-7<xmethoxy-3-substituierte-3-cephem-4-carbonsäure zu vergrößern. Es ist daher erforderlich, eine Katalasewirkung zur Wasserstoffperoxyd-Akkumulation zu inaktivieren. Die Inaktivierung einer Katalasewirkung kann durch Behandlung der zu verwendenden Zellensuspension mit einem Inaktivator oder durch Zugabe eines Inaktivators zu einer Enzymreaktionsmischung erreicht werden. Inaktivatoren für die Katalase können anorganische Azide, z.B. Natriumazid, Ascorbinsäure, ^-Amino-1,2,5-triazol und dergleichen umfassen, wobei jedoch Natriumazid in praktischer Hinsicht zufriedenstellend ist.

Die vorliegende Enzymreaktion kann unter aeroben Bedingungen bei 15 bis 37 C durchgeführt werden und die Reaktion kann durch das Verschwinden der antibakteriollen Aktivität eines Substrats oder durch eine zeitliche Prüfung durch Dünnschichtchromatographie an einem Flecken des durch die Reaktion gebildeten neuen Reaktionsproduktes, z.B. 7ß-(ⁱ<-Carboxybutyrylamino)-cephalosporin oder 7ß-(5-Carboxy-5-oxovalerylamido)-cephalosporin, wodurch eine

609830/0897

to . 260H57

Vervollständigung der Reaktion angezeigt wird, verfolgt werden. Zur Beurteilung der antibakteriellen Aktivität können übliche Methoden zur Untersuchung einer antibiotischen Substanz verwendet werden. Beispielsweise können, wenn eine Cephalosporinverbindung wie 7ß-(5-Amino-5-carboxyvalerylamido)->-carbamoyloxymethyl-Ta-methoxy-^-cephem-^-carbonsäure als Substrat verwendet wird, grampositive Bakterien, wie diejenigen der Gattung Staphylococcus oder Bacillus und gramnegative Bakterien, wie coliform bacilli oder diejenigen der Gattung Proteus als Testmikroorganismen verwendet werden. Normalerweise wird die Scheibenmethode als einfache Testmethode verwendet.

Nach Vervollständigung der Reaktion werden unmittelbar darauf die Zellen unter kühlen Bedingungen durch Zentrifugation entfernt und die gewünschten Produkte werden isoliert und gereinigt, Die Isolierung und Reinigung kann durch verschiedenartige Kombination gut bekannter Verfahren erfolgen, von denen Anschauungsbeispiele den Beispielen zu entnehmen sind.

Wie aus dem Vorstehenden hervorgeht_s sind die nach diesem Verfahren erhaltenen Verbindungen solche Cephalosporinverbindungen, die durch die vorstehende Formell dargestellt werden, z.B. 7ß- (5-Carboxy~5-oxovalerylamido) -2-carbamoyloxyme thyl-7ot -me thoxy-3-cephem-carbonsäure, 3-Acetoxymethyl-7ß-(5-carboxy-5-oxovalerylamido)-7oc-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure, 7ß-(5-Carboxy-5-oxovalerylamido)-7a-methoxy-5-niethyl-5-cephem-²l—carbonsäure, 7ß-(5-Carboxy-5-oxovalerylamido)-^-hydroxymethyl^a-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure, 7ß-(4-Carboxybutyrylamido)-3-carbamoyloxytnethyl-7a-methoxy-5-cephem-²l—carbonsäure, J-Acetoxymethyl-7ß-(i|—carboxybutyrylamido)-7a-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure, 7ß-(4-Carboxybutyrylamido)-7a-methoxy-3-methyl-3-cephem-4-carbonsäure, 7ß-(4-Carboxybutyrylamido)-3-hydroxymethyl-7a-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure und deren Salze mit Alkalimetallen und Erdalkalimetallen.

Die 7oc-Methoxycephalosporinverbindungen I sind als Zwischenprodukte für die Synthese von verschiedenen 7oc-Methoxycephalosporinverbindungen mit antibakteriellen Aktivitäten verwendbar.

609830/0897

260H57

Beispielsweise kann eine Verbindung der Formel I gemäß der Erfindung leicht durch Umsetzung mit Thienylacetylchlorid in "Cefoxitin" [7ß-(2-Thienylacetamido)-3-carbamoyloxymethyl-7a-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure] gemäß dem in der offengelegten japanischen Patentanmeldung mit der Nummer 93"'/''972 gelehrten Verfahren übergeführt werden. Die Verbindungen I können auch leicht in die in der offengelegten japanischen Patentanmeldung mit der Nummer 83386/1975 beschriebenen Derivate gemäß der vorgenannten Methode übergeführt werden und Beispiele für so erhaltene wertvolle Verbindungen sind 3-Carbamoyloxymethyl-7ß-cyanomethylthioacetamido-7a-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure, 7ß-Azidomethylthioacetamido-3-carbamoyloxymethyl-7α-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure, 3-Carbamoyloxymethyl-7ß-propargylthioacetamido-7a-methoxy-3-cephem—4-carbonsäure,3-Carbamoyloxymethyl-7ß-(3~isoxazolyloxy)-acetamido-^a-methoxy^-cephem-^- carbonsäure, 3-Carbamoyloxymethyl-7ß-2-(1,3,4-thiadiazolyl) thioacetamido-7a-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure und dergleichen.

Auch die 2,4-Dinitrophenylhydrazonverbindung des 7ot-Methoxycephalosporins, das in 7ß-Stellung eine 5-Carboxy-5-oxovalerylamidogruppe besitzt, zeigt eine zwei- bis dreifach höhere antibakterielle Aktivität gegenüber grampositiven Bakterien wie Staphylococcus aureus als die 5-Amino-5-carboxyvalerylamido-Ausgangsverbindung.

Überdies besitzt die Erfindung den Vorteil, daß die 7ct-Methoxycephalosporinverbindungen, deren Isolierung und Reinigung aus Kulturbrühen schwierig waren, in hoher Reinheit und guter Ausbeute rasch isoliert und gereinigt werden können.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele und Vergleichsbeispiele erläutert.

Beispiel 1

1.) Trigonopsis variabilis (SANK 59963 = IAM 4443) wurde auf ein schräges Medium in einem Testrohr eingeimpft, das hergestellt worden war durch Zugabe von 15g Agar zu einem 1 1 Karottenextrakt, 20 g Glucose, 1 g Ammoniumsulfat und

6098 3 0/0897

260U57

5 g Kaliumdihydrogenphosphat enthaltendem Medium und es wurde eine Kultivierung bei J>0 C während 7 Tagen durchgeführt. Hiervon getrennt wurde ein Medium hergestellt, das 20 g Glucose, 5 g Hefeextrakt, 4 g Kaliumdihydrogenphosphat und 1 g Magnesiumsulfat · 7 HpO, 2 g Ammoniumsulfat, 25 mg Eisensulfat· 7 HgO, 500 mg/1 Calciumchlorid (pH=6,0) enthielt und das Medium wurde in Je 100 ml Anteilen in fünf 500 ml-Flaschen gegossen, die dann unter Druck bei 121°C (15 lbs.) während 20 Min. sterilisiert wurden. Es wurde eine geeignete Menge des obigen schrägen Mediums auf das Medium eingeimpft und bei 28 C und 120 Umdrehungen pro Min. während 3 Tagen unter Erzielung einer Keimkulturbrühe eine Schüttelkultur durchgeführt.

Fünf Liter eines Mediums, das 20 g Glucose, 5 g DL-Alanin, 4 g Kaliumdihydrogenphosphat, 1 g Magnesiumsulfat · 7 HpO, 0,5 S Calciumchlorid, 0,5 g Borsäure, 40 mg Ammoniummolybdat, 40 mg Mangansulfat · 7 H₃O, 40 mg Zinksulfat · J H₃O, 45 mg Kupfersulfat · 5 H₂O, 25 mg Eisensulfat· 7 H₃O, 20 ^g Biotin, 100 ^g/l Thiaminhydrochlorid (pH=6,0) enthielt, wurde hergestellt und in jeweils 100 ml Anteilen in 5 Flaschen gegossen, die dann bei 121°C unter Druck (6,8 kg (15 lbs.)) während 20 Min. sterilisiert wurden. Nach dem Abkühlen wurden 3 ml der vorstehenden Keimkulturbrühe eingeimpft und man stellte bei 28⁰C und 120 Umdrehungen pro Min. während 5 Tagen eine Schüttelkultur her. Nach der Kultivierung wurde die Kulturbrühe aus den fünf Flaschen gesammelt, auf 0 bis 5°C abgekühlt und bei 10 000 Umdrehungen pro Min. zentrifugiert. Die auf diese Weise gesammelten Zellen wurden zweimal mit Wasser unter Erzielung von 100 g nasser Zellen gewaschen. Die Zellen wurden unmittelbar darauf in einem Gefriergerät bei -20 C unter Bildung einer gefroreren Zellmasse gefroren. Die so gefrorenen und aufgetauten Zellen zeigten eine D-Aminosäure-Oxydase Aktivität von 400 bis 600 Einheiten je mg Protein.

2.) 20 g der Zellpaste, die durch Gefrieren und Auftauen der durch das vorstehend genannte Verfahren gebildeten Zellen erhalten wurde, wurde zu 5OO ml 1/10 M-Pyrophosphatpuffer (pH=8,1)

609830/0897

_₁₃- 260H57

mit einer 1/1O M-Konzentration an hierin gelöstem Natriumazid hinzugegeben und es wurde während 60 Min. zur Inaktivierung der Katalaseaktivität in der aufgetauten Zellsuspension eine Behandlung durchgeführt. Zu der Katalase-inaktivierten Zellsuspension wurden 4 g Cephamycin C [7ß-(5-Amino-5-carboxyvalerylamido)-3-carbamoyloxymethyl-7a-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure] mit einer Reinheit von 50 % hinzugegeben und es wurde während 3 Stdn. unter Schütteln eine Enzymreaktion durchgeführt. Durch DünnschichtChromatographie wurden neue Flecken bestätigt, als das Cephamycin C abnahm. Nach Vervollständigung der Reaktion wurden unmittelbar darauf durch Zentrifugation ein überstehender klarer Teil und Zellen abgetrennt. Der überstehende Teil wurde mit 2N-Salzsäure unter Eiskühlung auf pH 1,5 eingestellt und achtmal mit gleichen Anteilen Äthylacetat extrahiert. Die Sthylacetatschicht wurde mit Diphenyldiazomethan behandelt und die veresterte Mischung wurde unter vermindertem Druck konzentriert. Das Konzentrat wurde mit einem Entwicklungsmittel aus Benzol und Äthylacetat (3:2) dünnschichtchromatographisch untersucht, die gewünschten Fraktionen wurden gesammelt, extrahiert und unter Erzielung von 788 mg Diphenylmethyl-7ß-(4-carboxybutyrylamido)-3-carbamoyloxymethyl-7a-methoxy-3-cephem-4-carboxylat konzentriert.

UY-Spektrum λ ^®°^H 263 nm

IR-Spektrum ν J-JHCl^ _cm-1 ^₇₃₀ (ß__Lactam)

NMR₇Spektrum (CDCl,) δ ppm

1*7 - 2,7 (6H Multiplett)

3*3 (2H AB-Quartett, J = 18 Hz)

3_y5 (3H Singulett)

4.85 (2H AB-Quartett, J = 12 Hz) 5,05 (1H Singulett)

6.86 (1H Singulett) 6,94 OH Singulett) 7,35 (2OH Singulett)

609830/0897

-U- 260H57

Beispiel 2

Man löst in 300 ml 1/10 M-Pyrophosphatpuffer (pH 8,1) 10 g der Zellpaste, die durch Gefrieren und Auftauen der durch das Verfahren von Beispiel 1 (1) hergestellten gefrorenen Zellen erhalten wurde,und 3 g Cephamycin C mit einer Reinheit von 50 % und es wurden anschließend 300OO Einheiten Katalase hinzugefügt. Die Enzymreaktion wurde während 3 Stdn. bei 28 G unter Schütteln fortgesetzt. Nach Vervollständigung der Reaktion wurden ein überstehender Teil und Zellen durch Zentrifugation abgetrennt und der überstehende Teil wurde mit 2N-SaIzsäure unter Eiskühlung auf pH 1,5 eingestellt und dann in gleichen Anteilen zehnmal mit Äthylacetat unter Erzielung von 7ß-(5-Carboxy-5-oxovalerylamido)-3-carbamoyloxymethyl-7a-methoxy-3-cephem-4— carbonsäure extrahiert.

Zur Bestätigung der Struktur der so erhaltenen Verbindung wurde eine konzentrierte Lösung der Verbindung in Äthylacetat zur Trockne konzentriert, der Rückstand unmittelbar darauf in 6 ml destilliertem Wasser gelöst, eine 0,35 ^ige 2,4-Dinitrophenyl-hydrazinlösung in 2N-Salzsäure im Überschuß hinzugefügt und dann die Reaktion bei Raumtemperatur während 60 Min. durchgeführt. Nach Vervollständigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung mit 2N-Natriumhydroxyd auf pH 8,0 eingestellt und zweimal mit 100 ml Äthylacetat zur Entfernung überschüssigen 2,4—Dinitrophenylhydrazins extrahiert. Die wäßrige Schicht wurde wiederum mit 2N-Salzsäure auf pH 1,5 bis 2,0 eingestellt und viermal mit 200 ml Äthylacetat extrahiert. Die vereinigten Äthylacetatschichten wurden unter Erzielung von 1,38 g Konzentrat konzentriert.

UV-Spektrum λ ^Me0H 263

flüssig _Λ

IR^Spektrum ν cm"' 1780 (ß-iactara)

MR-Spektrum (Aceton-dg) δ ppm

609830/0897

26OU57

%	5 - 2,6	CbH Multiplett)	J'	= 18 Hz)
3,	3	(2H AB-Quartett,
3,	5	(3H Singulett)	, J	= 12 Hz)
4,	9	(2H AB- Quartett
5,	1	(1H Singulett)	J	= 18 Hz)
8,	Λ	(1H AB-Quartett,	J	= 18 Hz)
8,		(111 AB-Quartett,	2	Hz)
9,	05	(1H Dublett, J =

Beispiel 3

Man zentrifugierte eine KulturbrUhe (Cephamycin C-Produktivität von 750 ug/ml), die durch Kultivierung eines Cephamycin C-bildenden Mikroorganismus (Streptomyces jumonjinensis) erhalten wurde, um einen überstehenden Teil und Zellen zu trennen. Der überstehende Teil wurde in zwei Fraktionen aufgeteilt.

a) Man fügte zu 50 ml der ersten Fraktion (pH 7j6~0) 2 g der aufgetauten Zellpaste von Trigonopsis variabilis, die wie in dem vorstehenden Beispiel 1 (1) erhalten wurde und 5000 bis 10000 Einheiten an überschüssiger Katalase und führte die Enzymreaktion während 18O Min. bei 28°C durch. Der End-pH-Wert betrug 6,98 und man erhielt 7ß-(5-Carboxyl-5-oxovalerylamido)-3-carbamoyloxymethyl-7a-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure mit einem Umwandlungsverhältnis von 50 %.

b> Man fügte zu 50 ml der zweiten Fraktion (pH* 7,60) 50 ml eines I/10 M-Pyrophosphatpuffers (pH 8,1), rührte die erhaltene Mischung sorgfältig und fügte dann 2 g der aufgetauten Trigonopsis variabilis-Zellpaste, die wie in Beispiel 1 (1) erhalten wurde, und 5000 bis 10000 Einheiten Katalase hinzu. Die Enzymreaktion wurde dann unter Erzielung von 7ß-(5-Carboxy-5-oxovalerylamido)-3-carbamoyloxymethyl-7a-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure mit einem End-pH-Wert von 8,1 und einem Umwandlungsverhältnis von ca. 70 % durchgeführt.

609830/0897

260H57

Beispiel 4

Man zentrifugierte eine Kulturbrühe (Cephamycin C-Produktivität von 750 ug/ml), die durch Kultivierung eines Cephamycin C-bildenden Mikroorganismus erhalten xvurde, um einen überstehenden Teil und die Zellen zu trennen. Hiervon getrennt wurden zu 5OO ml eines I/10 M-Pyrophosphatpuffers (pH 8,1), der Natriumazid in einer Konzentration von 1/10 M gelöst enthielt, 20 g der aufgetauten Zellpaste hinzugefügt, die aus den gefrorenen Zellen wie in Beispiel (1) beschrieben erhalten wurde und die erhaltene Mischung wurde während 60 Min. zur Inaktivierung der Katalaseaktivität der aufgetauten Zellpaste bei Raumtemperatur belassen.

Zu der so erhaltenen Paste wurden 5OO ml der Cephamycin C-Lösung hinzugegeben, die wie vorstehend erhalten wurde und zuvor auf pH 8,1 eingestellt worden war, und man führte die Enzymreaktion während I80 Min. bei 28⁰C unter Bildung von 7ß-(4-Carboxybutyrylamido)-J-carbamoyloxymethyl-Ya-methoxy-^-cephem-^- carbonsäure mit einem Umwandlungsverhältnis von 80 % durch. Die Enzymreaktionsmischung wurde zentrifugiert, um einen ■ überstehenden Anteil abzutrennen. Der so hergestellte überstehende Anteil wurde auf pH 6,0 eingestellt und auf 9 g Aktivkohle zur Absorption des gewünschten Produktes gegossen. Das Produkt wurde mit 30 ^igem wäßrigen Aceton eluiert und die Eluate wurden dann über 100 ml eines Kationenaustauscherharzes Dowex 50 W (H⁺-Form, kernsulfoniertes Polystyrolharz vom kugelförmigen Typ, erhältlich von Dow Chemical Co., USA) geleitet. Die Abflüsse x^urden unter Erzielung von 660 mg (^Ei^m ⁼ ?°> Reinheit = 44 %) der gewünschten Jß- (4-Carboxybutyrylamido)-3-carbamoyloxymethyl-7a~methoxy-3-oephem-4-carbonsäure in Form eines blassgelben Pulvers gefriergetrocknet. Ausbeute 77 ^.

609830/0897

260H57

Vergleichsbeispiel

1 .) Benzhydry 1-7-3- (4' -benzhydryloxycarbonylbutyramid)-3-carba moyloxymethyl-7ffHnethoxy-3--cephem-4-carboxylat

Man fügte eine Lösung von 1,5 g Diphenyldiazomethan in 10 ml Tetrahydrofuran zu einer Lösung von 1J g leicht roher 7ß-(4' -Carboxybutyramid) -jj-carbamoyloxymethyl-^a-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure in 20 ml Tetrahydrofuran bei Raumtemperatur. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wurde unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde in Benzol gelöst und mit η-Hexan unter Erzielung von 2,1g einer öligen Substanz ausgefällt. Das öl wurde durch Siliciumdioxydgel-Säulenchromatographie unter Erzielung von 1,71 g Benzhydryl-7ß-(4'-benzhydryloxycarbonylbutyramid)-3-carbamoyloxymethyl-7a-methoxy-3-cephem-4-carboxylat in Form eines Schaums gereinigt. NMR (CDCl^ +■ DpO): 1,80 - 2,65 (6h, Multiplett), 3,20 und 3,40 (2H, AB-Quartett, J = 18 Hz), 3,44 (3H, Singulett), 4,87 (2H, breites Singulett),

5.02 (1H, Singulett), 6,88 (1H, Singulett), 6,93 (1H, Singulett), 7,10 - 7,50 (2OH, Multiplett).

2.) Benzhydryl-3-carbamoyloxymethyl-7a-methoxy-7ß-(2'- thienylacetamid ) -^-cephem-^-carboxylat (Cefoxitin-benzhydrylester)

Man erhitzte eine Mischung von 300 mg Benhydryl-7ß-(4^f-benzhydryloxycarbonylbutyramid)-3-carbamoyloxymethyl-7a-methoxy-3-cephem-4-carboxylat, 3OO mg N-Trimethylsilyltrichloracetamid,

2.3 ml Thienylacetylchlorid und 7 ml 1,2-Dichloräthan bei 5O⁰C während 15 Stdn.. Zu der erhaltenen Mischung wurden bei 0 C 0*35 ml Methanol hinzugegeben und während 2 Stdn. bei Raumtemperatur weiter gerührt. Dann wurde die Reaktionsmischung mit Äthylacetat verdünnt und der Feststoff abfiltriert, wonach mit Methanol gewaschen wurde. Das vereinigte Filtrat wurde zweimal mit Natriumbicarbonatlösung und zweimal mit gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen. Nach dem Trocknen über Natriumsulfat wurden die organischen Lösungsmittel unter vermindertem Druck unter Erzielung von 576 mg eines Öls entfernt. Diese

609830/0897

rohe Substanz wurde durch präparative DünnschichtChromatographie unter Verwendung von zwei Siliciumdioxydgelplatten (20 x 40 cm, 2 mm Dicke) gereinigt, die mit einem Chloroform-Äther¹-Aceton-Gemisch (2:2:1) entwickelt wurden. Man sammelte die Rf-Bande mit einem Wert von 0,51 mit Äthylacetat unter Erzielung von 83 mg Benzhydryl-J-carbamoyloxymethyl-Ta-methoxy-7ß-(2'-thienylacetamid)-3-cephem-4-carboxylat in Form eines Öls. NMR (CDCl₅ + D₂O): 3,22 und 3,29 (2H, AB-Quartett, J = 18 Hz), 3,40 (3H, Singulett), 3,76 (2H, Singulett), ca. 4,83 (2H, ein teilweise aufgelöster Peak), 4,99 OH, Singulett), 6,80 7,00 (1H + 2H, Multiplett), 7,05 - 7,50 (11H, Multiplett).

609830/0897

Claims

Patentansprüche

71 J) Verbindungen der Formel

R(CH₂)₅

OCH.

COOH

worin R die Gruppe -COCOOH oder die Carboxylgruppe darstellt und X eine Acetoxygruppe, Carbamoyloxygruppe, Hydroxygruppe öder ein Wasserstoffatom darstellt oder ein Salz derselben.
2.) Verbindungen gemäß Anspruch 1, worin R die Gruppe -COCOOH oder die Carboxylgruppe darstellt und X eine Carbamoyloxygruppe ist.
3.) Verbindungen gemäß Anspruch 1, worin R die Gruppe -COCOOH darstellt und X die Carbamoyloxygruppe ist.
4.) Verbindungen gemäß Anspruch 1, worin R die Carboxylgruppe darstellt und X die Carbamoyloxygruppe ist.
5·) Verbindungen gemäß Anspruch 1, worin das Salz ein Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalz ist.
6.) Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel

COOH

609830/0897