AT329746B - Verfahren zur herstellung von cephalothin - Google Patents

Description

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   Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Cephalothin   (7- (2-Thienylacetamid) -cephalo-   sporansäure) durch enzymatische Acylierung von 7-Aminocephalosporansäure (nachstehend als 7-ACS bezeichnet),   u. zw.   ein solches enzymatisches Verfahren zur Herstellung von Cephalothin, in welchem 7-ACS mit Thienylessigsäure oder einem seiner Derivate in einem wässerigen Medium in Gegenwart eines die Aminogruppe von 7-ACS acylierenden Enzympräparates, das aus einem Mikroorganismusstamm von Bacillus megaterium NRRL B-5385 stammt, umgesetzt wird. 



   Die nachstehend genannten acylierenden Enzympräparate umfassen   z. B.   die Kulturbrühe, Enzymextrakte, Festphasen-Enzympräparate oder unlösliche Enzympräparate. 



   Bisher wurde Cephalothin durch Acylierung von 7-ACS mit Thienylessigsäure (brit. Patentschrift   Nr. 982, 252, USA-Patentschrift Nr. 3, 252, 973, brit. Patentschrift Nr. 1, 206, 626   und USA-Patentschrift Nr. 3, 536, 698) hergestellt. Diese vorbekannten Verfahren haben jedoch Nachteile ; so tritt   z. B.   bei der chemischen Acylierung von 7-ACS eine unvermeidbare Verschmutzung der Umgebung, wie Luftverschmutzung, üble Gerüche oder Abwasserverschmutzung, auf. 



   Es wurde nun gefunden, dass sich bei Verwendung eines Enzympräparates aus Bacillus megaterium B-400 NRRL B-5385 zur Herstellung von Cephalothin durch Acylieren von 7-ACS der Schutz gegen üble Gerüche und die Abwasserbehandlung leicht bewerkstelligen lassen. 



   Aufgabe der Erfindung war es daher, ein für die Industrie interessantes enzymatisches Verfahren zur Herstellung des chemotherapeutisch wertvollen Cephalothins aus 7-ACS zur Verfügung zu stellen, bei dem keine üblen Gerüche und keine Luftverschmutzung auftreten. 



   Aufgabe der Erfindung war es ferner, ein Verfahren zur Herstellung von Cephalothin unter Verwendung eines Festphasen-Enzympräparates zur Verfügung zu stellen. 



   Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von Cephalothin durch Acylieren von 7-Aminocephalosporansäure, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man 7-Aminocephalosporansäure mit einem 2-Thienylessigsäureester in einem wässerigen Medium in Gegenwart eines die Aminogruppe von 
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 und 2241091 sind zwar enzymatische Verfahren bekannt, die jedoch sämtlich die Einführung von aromatischen Aminosäuren in Position 7 des Cephalosporingerüstes betreffen, somit zu andern Endverbindungen führen als das gegenständliche Verfahren, und hiebei zum Teil zusätzlich andere Mikroorganismen verwenden als im erfindungsgemässen Verfahren, das die Einführung einer heterocyclischen Carbonsäure vorsieht.

   Es war nicht zu erwarten, dass der erfindungsgemäss verwendete Mikroorganismus hiezu imstande sein würde, da bekanntlich Aminosäuren von andern Enzymen umgesetzt werden als Carbonsäuren. In diesem Zusammenhang ist zu berücksichtigen, dass Aminosäuren biochemisch als   Aminosäure-Adenylsäure-Anhydrid   aktiviert werden, ehe sie eine Säureamidbindung eingehen, während Carbonsäuren zur Aktivierung in Coenzym-A-Derivate überführt werden ; enzymatisch werden also völlig verschiedene Wege durchlaufen. Aus der Tatsache, dass im gleichen Mikroorganismus ein Enzym, welches Aminosäuren an das Cephalosporingerüst anzuhängen imstande ist, vorkommt, liess sich daher nicht vorhersehen, dass im gleichen Organismus auch ein Enzym vorhanden sein könnte, welches eine Verknüpfung mit einer heterocyclischen Carbonsäure herstellen würde. 



   Bei der Suche nach Bakterien, die ein acylierendes Enzym produzieren, das eine Thienylacetylgruppe an die Aminogruppe der 7-ACS bindet, wurde nun gefunden, dass Mikroorganismen von Bacillus   megaterium NRRL B-5385   eine starke acylierende Wirkung auf die Aminogruppe der 7-ACS haben und dass Cephalothin fast quantitativ aus 7-ACS und einem Thienylessigsäureester gebildet wird. 



   Zur Bindung einer Thienylacetylgruppe an die Aminogruppe der 7-ACS wird Thienylessigsäure oder eines seiner Derivate verwendet. Spezielle Beispiele solcher Derivate sind   2-Thienylessigsäuremethylester   und   2-Thienylessigsäureäthylester.   



   Der erfindungsgemäss verwendbare, das acylierende Enzym produzierende Mikroorganismus kann durch 12bis   60stündige   aerobe Züchtung bei 25 bis   370C   in einem Nährmedium erhalten werden, das organische oder anorganische Stickstoffquellen, wie Pepton, Fleischextrakt, Maisquellwasser, Hefeextrakt, Trockenhefe, Nitrat oder ein Ammoniumsalz, eine Kohlenstoffquelle, wie Melasse, Glucose oder Stärkehydrolysat, und anorganische Salze und, falls dies erwünscht ist, weitere wachstumsanregende Verbindungen enthält. Bei der Produktion im industriellen Massstab wird im allgemeinen die Züchtung in aerober Submerskultur durchgeführt. 



   Das die Aminogruppe der 7-ACS acylierende Enzym liegt im allgemeinen als Exoenzym vor. Zur Durchführung der Enzymreaktion können als Enzympräparate die mikrobiellen Kulturen, Kulturfiltrate oder ein daraus hergestelltes Enzympräparat verwendet werden. Ferner können unter der Voraussetzung, dass die acylierende Enzymaktivität nicht verlorengeht, im   erfindungsgemässen   Verfahren chemisch oder physikalisch behandelte Kulturfiltrate,   z.

   B.   durch bekannte Trenn- und Reinigungsverfahren, wie Aussalzen, fraktioniertes Ausfällen, Dialyse, Adsorptionschromatographie, Ionenaustauschchromatographie oder Gelfiltration des Kulturfiltrats, erhaltene gereinigte Enzyme und Festphasen-Enzympräparate oder unlöslich gemachte Enzyme, die durch Adsorption des acylierenden Enzyms an einem dieses Enzym nicht inaktivierenden inerten Träger hergestellt wurden, eingesetzt werden. 

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   Die Acylierung wird durch Umsetzung der 7-ACS mit Thienylessigsäure oder einem seiner Derivate in Gegenwart eines acylierenden Enzympräparats durchgeführt. Im allgemeinen wird hiezu freie, saure 7-ACS in Konzentrationen von 0, 1 bis 20 mg/ml und vorzugsweise von 2 bis 5   mg/ml   eingesetzt. Die Thienylessigsäure in Form der freien Säure wirkt nicht als Substrat, so dass eines ihrer aktiven Derivate, wie ein Ester mit einem niedrigen Alkohol, vorzugsweise Methanol, verwendet wird. Das Thienylessigsäurederivat wird im allgemeinen, 
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 wird beendet, wenn die höchste Cephalothinmenge produziert worden ist. 



   Bei Durchführung der Acylierung unter Verwendung eines Festphasen-Enzympräparats wird das acylierende
Enzym zunächst an einem Träger adsorbiert. Die Adsorption kann durch Zugabe des Kulturfiltrats des das acylierende Enzym produzierenden Stammes zu einem Träger vorgenommen werden. Die erfindungsgemäss verwendeten Träger werden unter Berücksichtigung der Eigenschaften der das Enzym adsorbierenden und nicht inaktivierenden Träger ausgewählt. Das adsorbierte Enzym darf nicht ausgewaschen werden, der Träger muss in bezug auf jedes Substrat inert sein und darf das Cephalothin nicht adsorbieren. Spezielle Beispiele von Trägern, die sich vorteilhaft zur Adsorption eines Enzyms in wässeriger Lösung verwenden lassen, sind aktives Aluminiumoxyd, Kieselgur, aktiver Ton, Calciumphosphat und Hydroxyapatit. 



   Bei der Adsorption des Enzyms an einem Träger empfiehlt es sich, zunächst den PH auf einen solchen Wert einzustellen, bei dem das acylierende Enzym stabil ist. Die Adsorption kann absatzweise oder in einer Säule durchgeführt werden, wobei das zuletzt genannte Verfahren für eine kontinuierliche Enzymreaktion bevorzugt ist. Die verwendete Trägermenge variiert mit dem Volumen des   Kulturfiltrats,   der Enzymaktivität und des Adsorptionsverhältnisses des Trägers. Bei der absatzweisen Adsorption beträgt die Trägermenge im allgemeinen 5 bis   15Gew. Vol.-%   der Kulturfiltrate. Bei Durchführung der Adsorption mittels einer Säule wird diese mit dem Träger gefüllt und mit Wasser oder einer auf den für das Enzym optimalen pH-Wert eingestellten Pufferlösung gewaschen.

   Anschliessend wird die Kulturbrühe oder eine Enzymlösung über die Säule gegeben, und dann wird die Säule zur Herstellung des Säulen-Festphasen-Enzympräparats mit Wasser oder einer Pufferlösung gewaschen. 



   Der das adsorbierte acylierende Enzym enthaltende Träger, d. h., das Festphasen-Enzympräparat, kann denaturiert werden oder seine Aktivität verlieren, wenn es zu trocken wird. Es soll daher feuchtgehalten werden. 



   Die 7-ACS wird dann mit einem Thienylessigsäurederivat in Gegenwart eines Festphasen-Enzympräparats umgesetzt. Da die Substratkonzentration vor allem je nach der Enzymaktivität oder der Durchflussgeschwindigkeit durch die Säule variieren kann, soll sie vorzugsweise bestimmt werden, so dass im Eluat keine nicht umgesetzte 7-ACS oder Thienylessigsäure auftritt. Die Acylierungsreaktion soll bei dem für die Enzymaktivität optimalen PH-Wert und der optimalen Temperatur durchgeführt werden. Die Umsetzungszeit kann bei dem Säulenverfahren durch Ändern des Ausströmvolumens des Substrats eingestellt werden. Die Umsetzung kann gewöhnlich beim Durchgang durch eine ein Festphasen-Enzympräparat enthaltende Säule durchgeführt werden. Das Verfahren kann durch kontinuierliche Zugabe der Substrate in einfacher Weise kontinuierlich gestaltet werden.

   Wenn jedoch in der aus der Säule austretenden Flüssigkeit die Substrate festgestellt werden, soll die Ausströmgeschwindigkeit reduziert oder die aus der Säule austretende Flüssigkeit in die Säule zurückgeführt werden. Diese Operationen können in automatisch gesteuerten Anlagen durchgeführt werden. Wenn die Enzymaktivität abnimmt oder verlorengegangen ist, soll das Verfahren natürlich beendet werden. 



   Das bei der Umsetzung entstandene Cephalothin wird nach bekannten Isolierungsverfahren abgetrennt. 



   Bestimmung des   Cephalothins :  
Eine Cephalothin enthaltende Testlösung wird mikrobiologisch mittels der Papierscheibchenmethode oder der Schalenmethode unter Verwendung von Bacillus subtilis PCI-219 16 h bei   370C   geprüft. Die erhaltene Hemmzone ist ein Mass für die Cephalothinkonzentration, die mit Hilfe einer Eichkurve berechnet wird. 



   Die Beispiele erläutern die Erfindung. 
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 s pie I 1 : 100 m1(PH 7, 5) versetzt. Das so erhaltene Gemisch wird 30 min bei   370C   gerührt. Nach der Umsetzung wird das Enzympräparat abgetrennt und das Filtrat durch Dünnschichtchromatographie auf Siliciumdioxydgel unter Verwendung von Benzol-Aceton-Essigsäure (40 : 56 : 4) als Entwickler auf einen Fleck mit einem Rf-Wert von 0, 54 geprüft, welcher identisch mit dem mit einer authentischen Cephalothinprobe erhaltenen Fleck ist. Das Verhältnis der Cephalothinbildung beträgt 75%. 

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 wässeriger Natriumchloridlösung gewaschen und dann mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Filtrieren werden 3 ml einer   30% eigen   Lösung von Natrium-2-äthylhexanoat in Essigsäureäthylester zugegeben. 



  Das Gemisch wird dann zum Ausfällen des Natriumsalzes des Produkts mit Eis gekühlt. Der Niederschlag wird mit Essigsäureäthylester gewaschen und getrocknet. Ausbeute 1, 0 g. Das Infrarotspektrum des Produkts ist identisch mit dem einer authentischen Probe des Cephalothin-Natriumsalzes. 
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 Aussenmantel versehene Säule (Durchmesser 12 cm) gepackt. Die Säule wird mit 0, 1 m Phosphatpuffer (PH 7, 5) gewaschen. über die Säule wird mit einer spezifischen Geschwindigkeit von 0, 5 eine Lösung gegeben, die 1 kg 7-ACS (10 mg/ml), 151 2-Thienylessigsäuremethylester und   100l 0, 1m   Phosphatpuffer (PH 7, 5) enthält. Das Eluat wird zweimal mit 201 Essigsäureäthylester und die Säule wird ebenfalls mit 15l Essigsäureäthylester gewaschen.

   Der Essigsäureäthylester wird verworfen, und die wässerige Schicht wird durch Zugabe von 6 n Salzsäure auf PH 1 bis 2 eingestellt. Die so erhaltene wässerige Lösung wird wieder zweimal mit   20 I   Essigsäureäthylester extrahiert und unter vermindertem Druck eingedampft, wobei 1, 86 kg rohes Cephalothin (Reinheit 80% ; Gesamtausbeute   96%)   erhalten werden. Das Rohprodukt wird umkristallisiert, wobei 1, 34 kg kristallines Cephalothin (Reinheit 98%, Gesamtausbeute 85%) erhalten werden. 



   PATENTANSPRÜCHE : 
1. Verfahren zur Herstellung von Cephalothin durch enzymatisches Acylieren von 7-Aminocephalosporan- 
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Claims (1)

1. Kulturbrühe von Bacillus megaterium, das daraus hergestellte Kulturfiltrat oder ein daraus hergestelltes Enzympräparat einsetzt. EMI3.4 Enzympräparat einen Träger einsetzt, der adsorbierte Kulturbrühe von Bacillus megaterium NRRL B-5385, ein daraus hergestelltes Kulturfiltrat oder ein daraus hergestelltes acylierendes Enzym enthält. EMI3.5 bei einer 7-Aminocephalosporansäure-Konzentration von 0, 1 bis 20 mg/ml und bei einem 5- bis 10fachen molaren überschuss von 2-Thienylessigsäureester, bezogen auf 7-Aminocephalosporansäure, bei 35 bis 400C und PH 7 bis 8 durchführt. EMI3.6