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Eli Lilly and Company, Indianapolis, Indiana, V.St.A.
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Verfahren zur Herstellung von Cephalosporinverbindungen Die Erfindung
betzieht sich auf ein enzymatisches Acylierungsverfahren zur Herstellung von 7-alpha-Aminobenzylcephalosporinen,
das dadurch gekennzeichnet ist, daß eine Verbindung mit dem 7-Amino-3-cephem-Grundgerst
und D-Phenylglycinmethylester oder einen hydroxysubstituierten D--Pluenylglycinmethylester
mit Zellen von Pseudomonas melanoplenum ATCC 17808 inkubiert ird. 7-alpha-Aminobenzylcephalosporne
sind bekannte Antibiotica.
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Die Herstellung von 7-alpha-Aminobenzylcephalosporinverbindungen erfolgte
durch Acylierung einer Verbindung mit dem 7-Aminocephalosporin-Gerüst mit einer
alpha-Amdnophenylessigsäure oder einem reaktiven Derivat derselben. Beispielsweise
ist das allgemein bekannte Antibioticum Cephalexin durch Acylierung von 7-Aminodeacetoxycephalosporansäure-trichloräthylester
mit N-tert. -Butoxycarbonyl-D-alpha-phenylglycin hergestellt worden. Nach der Acylierungsreaktion
wird die N-tert. -Butoxycarbonyl-Schutzgruppe von der Seitenkettenaminogruppe und
die Trichloräthylestergruppe von der Carboxylgruppe an C4 entfernt, wodurch das
Antibioticum erhalten wird.
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/R.R. Chauvette et al. J. Org. Chem., 36, 1259 (1971)].
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6-alpha-Aminobenzylpenicillin-Antibiotica sind durch enzymatische
Acylierung von 6-Aminopenicillansäure (6APA) hergestellt worden (vergleiche US-PS
3 682 777). Eine enzymatische Transacylierung zur Synthese des Antibioticums Cephalexin
ist in der BE-PS 781 205 beschrieben.
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Die Erfindung bezieht sich auf ein Acylierungsverfahren zur Herstellung
von 7-alpha-Aminobenzylcephalosporinen. Insbesondere bezieht sie sich auf ein enzymatisches
Verfahren zur Acylierung bestimmter in 3-Stellung substituierter 7-Amino-3-cephem-4-carbonsäuren
und Salzen-dieser Säuren mit dem Methylester von D-Phenylglycin, wobei die Acylase
von Zellen des Mikroorganismus Pseudomonas melanogenum ATCC 17 808 erzeugt wird.
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Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird ein Überschuß des D-Phenylglycin-methylesters
und eine in 3-Stellung substituierte 7-Amino-3-cephem-4-carbonsäure oder ein Salz
dieser Säure der allgemeinen Formel r
bei einer Temperatur von etwa 30 0C in einer wässrigen Suspension von Zellen von
Psuedomonas melanogenum ATCC 17808 etwa 1 bis 3 Stunden inkubiert, wodurch das entsprechende
7-(D-Phenylglycylamido)-3-cephem-4-carbonsäure-N-Acylierungsprodukt der Formel
IcbLldet wir'!
Die enzymatische Acylierung wird bei einem pH-Wert
zwischen etwa 6 und 7,5 durchgeführt. P. melanogenum wird in einem wässrigen Nährmedium,
das assimilierbare Kohlenstoff-, Stickstoff- und anorganische Salzquellen enthält,
unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen gezüchtet, die erzeugten Zellen
werden in einer Zentrifuge abgetrennt, gewaschen und entweder direkt für die Herstellung
wässriger Suspensionen in dem Acylierungsverfahren verwendet, oder eingefroren und
für die spätere Verwendung bei dem Acylierungsverfahren aufgehoben.
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In den Formeln I und II bedeuten R Wasserstoff oder eine Hydroxygruppe
und vorzugsweise 3-Hydroxy und 4-Hydroxy, R1 eine Methoxygruppe oder eine Gruppe
der Formel -CH2-Z, in der Z eine Hydroxygruppe, eine niedere Alkoxy- oder Alkylthiogruppe
mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, eine Carbamoyloxygruppe oder eine Gruppe der Formel
ist, worin Q ein Sauerstoff- oder Schwefelatom und R2 eine niedere Alkylgruppe mit
1 bis 4 Kohlenstoffatomen -ist, und M Wasserstoff oder ein Alkalimetallkation.
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Die im vorstehenden verwendete Bezeichnung Alkoxygruppe mit 1 bis
4 Kohlenstoffatomen bezieht sich auf Methoxy, Athoxy, n-Propoxy, Isopropoxy oder
n-Butoxy; Alkylthiogruppen mit
1 bis 4 Kohlenstoffatomen bezieht
sich auf Methylthio, Äthylthio, n-Propylthio, Isopropylthio oder n-Butylthio.
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Beispielhaft für die thiosubstituierten heterocyclischen Gruppen,
die Z sein kann, sind die Reste von 2-Thio-5-methyl-1,3,4-thiadiazol, 2-Thio-1 -methyltetrazol,
2-Thio-5-methyl-1,3,4-oxadiazol und den höheren Alkylhomologen davon, beispielsweise
5-Äthyl-, 5-Isopropyl- und 5-n-Butyloxadiazol und -thiadiazol und die höheren Alkylhomologen
des 1-Methyltetrazols, beispielsweise seine 1-0thyl-, 1-Isopropyl- und 1-n-Butylhomologen.
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Die enzymatische Acylierung gemäß der Erfindung kann durch Züchten
von P. melanogenum in Gegenwart des 7-Amino-3-cephemgerüsts und von D-Phenylglycinmethylester
durchgeführt werden.
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Vorzugsweise wird der Mikroorganismus zur Erzielung einer geeigneten
Zellenpopulation gezüchtet, worauf die Zellen geerntet werden und die Acylierung
in einem synthetischen Medium, wie es im folgenden beschrieben wird, durchgeführt
wird.
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Es wird also eine Samenkultur von P. melanogenum, wobei es sich um
eine lyophilisierte Kultur oder um eine Schrägagarkultur handeln kann, zum Inokulieren
oder Beimpfen einer geringen Menge eines vegetativen Mediums mit hoher Nährkraft
verwendet. Das vegetative Medium wird dann bis zur Erzielung eines vollen Wachstums
inkubiert. Dann wird es als Inokulum für die Fermentation in größerem Maßstab verwendet.
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Der die Acylase gemäß der Erfindung erzeugende Mikroorganismus Pseudomonas
melanogenum wurde von der American Type Culture Collection 12301 Parklawn Drive,
Rockville, Maryland 20852, bezogen, wo er unter der Nummer ATCC 17808 allgemein
zugänglich ist.
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Der Mikroorganismus wird in einem wässrigen Nährmedium, das assimilierbare
Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält, gezüchtet. Die
Fermentation wird unter aeroben Bedingungen durchgeführt. Zu Kohlenstoffquellen
gehören beispielsweise die Zucker wie Glucose, Saccharose, Fructose und Maltose,
doch können für Fermentationsmedien in großem Maßstab wirtschaftlich günstige zuckerhaltige
Stoffe wie Melasse und Stärkehydrolysate verwendet werden. Geeignete Stickstoffquellen
sind die Aminosäuren, und zu wirtschaftlich günstigen Stickstoffquellen gehören
Fleischextrakt, Pepton, Hefeextrakt, Maisquellwasser, Casaminosäure, lösliche Fischbestandteile,
Fischmehl und Caseinhydrolysat. Anorganische Salze, die als Bestandteile des Fermentationsmediums
verwendet werden, sind beispielsweise Salze, die die Kationen von Natrium, Kalium,
Calcium und Ammonium und Anionen wie Chlorid, Sulfat oder Phosphat liefern.
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Ein erfindungsgemäß bevorzugtes Kulturmedium, das sowohl als vegetatives
Medium als, auch als Produktionsmedium verwendet werden kann, enthält etwa 1 % Pepton,
1 % Hefeextrakt, 0,5 * Fleischextrakt, 0,45 % L-Glutaminsäure, 0,25 % Natriumchlorid
und 0,2 % Monokaliumphosphat in entionisiertem Wasser.
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Eine Schrägagarkultur oder ein gefriergetrockneter Preßling des Organismus
wird als Inokulum für ein kleines Volumen, beispielsweise 200 ml vegetativen Mediums
verwendet. Vor der Verwendung wird das Medium sterilisiert, und sein pH-Wert wird
mit Natriumhydroxid auf etwa 7,0 bis 7,5 eingestellt. Das beimpfte Medium wird dann
16 bis 24 Stunden bei einer Temperatur von etwa 28 bis 32°C inkubiert. Während der-Inkubation
wird das Fermentationsgefäß bewegt, beispielsweise mittels einer Rundschüttelvorrichtung.
Nach dem Reifen wird die vegetative Kultur als Inokulum für das Fermentationsmedium
verwendet. Dieses kann die gleiche Zusammensetzung wie das vegetative Kulturmedium
haben, es kann
aber auch wirtschaftlich günstigere Stickstoff- und
Kohlenstoffquellen als Bestandteile enthalten. Das beimpfte großtechnische Fermentationsmedium
wird dann bei einer Temperatur von etwa 28 bis 34 OC während 16 bis 18 Stunden inkubiert.
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Während der Fermentation wird ständig gerührt und belüftet.
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Nach der Fermentation werden die gebildeten Bakterienzellen in einer
Zentrifuge gesammelt. Die abgetrennten feuchten Zellen werden durch gelindes Rühren
einer Suspension dieser Zellen in Phosphatpuffer von pH 6, zum Beispiel 0,03 molarem
Phosphatpuffer vom pH 6, gewaschen. Danach werden die Zellen wiederum in einer Zentrifuge
abgetrennt und entweder direkt für die enzymatische Acylierungsreaktion verwendet
oder für eine spätere Verwendung eingefroren.
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Die wie oben beschrieben gewonnenen Bakterienzellen werden in Wasser
vom pH 7 suspendiert, und die Säure mit dem 7-Amino-3-cephem-GerUst und der D-Phenylglycinmethylester
werden der Zellsuspension zugesetzt. Die Suspension wird dann 1 bis 2 Stunden, vorzugsweise
etwa 90 Minuten, bei einer Temperatur zwischen 30 und 35 OC unter ständigem Rühren
inkubiert. Während der Inkubationsdauer wird der pH auf 6 eingestellt.
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Die Bakterienzellen werden im allgemeinen in großem Überschuß, beispielsweise
in Mengen von 50 bis 200 g der feuchten Bakterienzellen je Gramm Säure mit 7-Amino-3-cephem-Gerüst
verwendet. Bei der Acylierung wird auch der D-Phenylglycinmethylester im Überschuß
über die stöchiometrische Menge verwendet.
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2 bis 3 Gramm Phenylglycinmethylester / Gramm Substanz mit dem 7-Amino-3-cephem-GerUst
stellen einen geeigneten Überschuß dar.
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Nach dem Inkubationsabschnitt, während dessen das 7-(D-Phenylglycylamido)-cephalosporin
erzeugt wird, werden die
Bakterienzellen in eine Zentrifuge abgetrennt,
und die das Reaktionsproduk-t enthaltende überstehende Flüssigkeit wird gewonnen.
Die Zellen werden mit Wasser gewaschen, und die Waschflüssigkeiten werden mit der
gewonnenen überstehenden Flüssigkeit vereint. Das acylierte Produkt wird aus den
vereinigten Flüssigkeiten gewonnen und durch Chromatographie von dem in der Reaktionsmischung
vorhandenen überschüssigen D-Phenylglycinmethylester abgetrennt. Alternativ kann
das Produkt durch Einengen der vereinigten Flüssigkeiten und Ausfällen am isoelektrischen
Punkt des Produkts isoliert werden. Säulenchromatographie ist der bevorzugte Weg
der Produktgewinnung. Für die Trennung des Produkts von dem überschüssigen Phenylglycinmethylester
geeignete chromatographische Stoffe sind beispielsweise Cellulose, Aluminiumoxid
und neutrale nichtionische organische Harze, wie die vernetzten Polymeren von Styrol
und Divinylbenzol. Ein bevorzugtes Harz für die Isolierung der 7-(D-Phenylglycylamido)-cephalosporine
ist XAD-2-Harz, bei dem es sich um ein-Copolymer aus Styrol und Divinylbenzol ohne
funktionelle Gruppen handelt, das-im Handel erhältlich ist (Rohm and Haas Co., Philadelphia,
Pa. V.St.A.).
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Während der enzymatischen Acylierung kann die Konzentration des acylierten
Produkts durch bioautographische Prüfung mit dem Organismus Sarcina lutea verfolgt
werden.
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Die als Substrat in dem erfindungsgemäßen enzymatischen Verfahren
verwendeten in 3-Stellung substituierten 7-Amino-3-cephem-4-carbonsäureverbindungen
der Formel I sind bekannte Verbindungen, zum Beispiel 7-Amino-3-hydroxymethyl-3-cephem-4-carbonsAure
(Desåcetyl-7-ACA), 7-Amino-3-methoxy-3-cephem-4-carbonsAurQ, 7-Amino-3-methoxymethyl-3-cephem-4-carbonsSure,
7-Amino-3-äthoxymethyl-3-cephem-4-carbonsäure,
7-Amino-3-methylthiomethyl-3-cephem-4-carbonsäure, 7 -Amino-3 -iso-propylthiomethyl-3
-cephem-4 -carbonsäure, 7-Amino-3-n-butoxymethyl-3-cephem-4-carbonsäure, 7-Amino-3-carbamoyloxymethyl-3-cephem-4-carbonsäure,
7-Amino-3-(1-methyltetrazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carbonsSure, 7-Amino-3-(5-methyl-1,3,4-thiadiazol-2-ylthiomethyl)-3
-cephem-4-carbonsäure 7-Amino-3-(5-methyl-1,3,4-oxadiazol-2-ylthiomethyl-3 -cephem-4
-carbonsäure und 7-Amino-3-(1-äthyltetrazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carbonsAure.
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Das 7-Amino-3-cephem-Gerüst kann in Form der freien Säure oder von
Salzen mit Alkalimetallkationen, zum Beispiel der Natrium- oder Kaliumsalze, eingesetzt
werden.
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Die Produkte des erfindungsgemäßen Verfahrens sind bekannte antibiotisch
wirkende Verbindungen. Beispielhaft für diese Produkte sind die folgenden Verbindungen:
7-(D-alpha-Amino-alpha-phenylacetamido)-3-methoxymethyl-3-cephem-4
-carbonsäure, 7-(D-alpha-Amlno-alpha-phenyla¢etsmido)-3-§thoxymethyl-3-cephem-4-carboxylat,
7- (D-alpha-Amino-alpha-phenylacetamido) -3 -methylthiomethyl-3-cephem-4-carbonsäure,
7- (D-alpha-Amino-alpha-phenylacetamido) -3 -methoxy-3-cephem-4-carbonsAure, 7-(D-alpha-Amino-alpha-phenylacetamldo)-3-hydroxymethyl-3-cephem-4
-carbonsäure' 7-(D-alpha-Amino-alpha-phenylacetamido)-3-(5-methyl-1,3,4-oxadiazol-2-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carbonsäure,
7-(D-alpha-Amino-alpha-phenylacetamldo)-3-(1-methyltetrazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carbonsäure,
7-(D-alpha-Amino-alpha-phenylacetamido)-3-(5-methyl-1,3,4-thladiazol-2-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carbonsäure,
7-(D-alpha-Amino-alpha-phenylacetamldo)-3-carbamoyloxymethyl-3-cephem-4-carbonsäure,
7-(D-alpha-Amino-alpha-4-hydroxyphenylacetamido)-3mmethoxy-3-cephem-4-carbonsäure
7-(D-alpha-Amino-alpha-4-hydroxyphenylacetamido)-3mmethoxymethyl-3-cephem-4-carbonsäure,
7-(D-alpha-Amino-alpha-3-hydroxyphenylacetamido)-3-methylthiomethyl-3-cephem-4-carbonsäure,
7-(D-alpha-Amlno-alpha-4-hydroxyphenylacetamido)-3-(5-methyl-1,3,4-thiadiazol-2-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carbonsäure
und 7-(D-alpha-kzino-alpha-4-hydroxyphenylacetamido)-3-(1-methyltetrazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carbongXurQ.
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Die vorstehend aufgeführten Verbindungen können als 7-(D-Phenylglycylamido)-3-cephem-Verbindungen
bezeichnet werden.
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Die, acylierten Produkte entsprechend der oben angegebenen Formel
II, worin R1 eine niedere Alkylthiomethylgruppe, beispielsweise eine Methylthiomethylgruppe,
bedeutet, sind in der US-PS 3 668 203 beschrieben. Die Verbindungen, für die R1
eine niedere Alkoxymethylgruppe, beispielsweise eine Methoxymethylgruppe, bedeutet,
sind in der US-PS 3 665 003 beschrieben.
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Die Verbindungen, für die R1 die 1,3,4-Thiadiazolthiomethyl-und die
1-Methyltetrazol-5-ylthiomethylgruppe bedeutet, sind in der US-PS 3 641 021 beschrieben.
Bedeutet R1 einen 1,3,4-Oxadiazolthiomethyl-Substituenten, dann ergibt sich eine
Verbindung, die in der US-PS 3 734 907 beschrieben ist.
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Die Verbindung, die sich ergibt, wenn R1 ein direkt an die 3-Stellung
des Cephemgerüsts gebundener Methoxysubstituent ist, nämlich 7-(D-alpha-Amino-phenylacetamido)-3-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure,
ist bereits in der Patentanmeldung P 23 59 354.6 beschrieben. In der gleichen Patentanmeldung
ist auch das 7-Amino-3-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure-Gerllst beschrieben.
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Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden 7-Amino-3-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure
und D-Phenylglycinmethylester 16 Stunden gemeinsam bei einer Temperatur von 34 °C
in einer wässrigen Zellsuspension von P. melanogenum bei einem pH-Wert von 6 bebrütet,
wodurch 7-(D-alpha-Aminoalpha-phenylacetamldo)-3-methoxy-3-cephem-4-aarbonsMure
erhalten wird.
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Bei einer weiteren bevorzugten Ausfüiirungsfori der Erfindung wird
eine Verbindung der Formel I, worin R1 eine 1-Methyltetrazol-5-ylthiomethyl-gruppe,
eine 5-Methyl-1,3,4-thiadiazol-2-ylthioaethyl-gruppe oder eine 5-Methyl-1,3,4-oxadiazol-2
-ylthic-thyl-gruppe bedeutet, itt D-Phenylglycinmethylester
in
einer wässrigen Suspension von Zellen von P. melanogenum 18 Stunden bei einer Temperatur
zwischen etwa 30 und 34 °C bei einem pH-Wert zwischen etwa 6 und 7 inkubiert, wodurch
das entsprechende Acylierungsprodukt mit dem 7-(D-alpha-Amino-alpha-phenylacetamido)-rest
entsprechend der Formel II erhalten wird.
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Durch die folgenden Beispiele wird die Erfindung weiter erläutert.
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B e i 5 p i e 1 1 Fermentation von P. melanogenum ATCC 17808 und
Gewinnung von bakteriellen Zellen Eine 48 Stunden alte Schrägagarkultur von Pseudomonas
melanogenum ATCC 17808 dient zum Beimpfen von 200 ml eines vegetativen Mediums folgender
ZusanImensetzung: Bestandteil 8 Pepton 1 Hefeextrakt 1 Fleischextrakt 0,5 L-Glutaminsäure
0,45 Natriumchlorid 0,25 Kaliumdihydrogenphosphat 0,2 entionisiertes Wasser Der
pH-Wert des Mediums wird mit Natriumhydroxid auf 7,3 eingestellt. Dann wird das
Medium vor dem Inokulieren unter einem Überdruck von etwa 1 Kg/cm² 15 Minuten bei
120°C in einem Autoklaven gehalten.
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Das beimpfte Medium wird 16 Stunden bei 30°C auf einer mit 250 Umdrehungen
pro Minute betriebenen Rundschüttelvorrichtung bebrütet.
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Das vegetative Medium dient dann zum Inokulieren von 100 l eines Fermentationsmedium
mit der gleichen Zusammensetzung, wie das oben beschriebene vegetative Kulturmedium.
Das beimpfte Ferzentationsmedium wird unter Rühren in einem Fermentationstank 16
bis 18 Stunden bei einer Temperatur von 30 °C inkubiert. Die gebildeten bakteriellen
Zellen werden in einer Zentrifuge (Shsrples) gesatzelt. Es werden etwa 1 kg feuchte
Zellen erhalten, ie unter Rühren wit 6 1 kaltem 0,03m Phosphatpuffer von pH 6 gewaschen
werden. Die gewaschenen Zellen werden wiederum in einer Zentrifuge (Shharples) gesammelt
und eingefroren.
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Beispiel 2 7-(D-Phenylglycylamido)-3-methylthiomethyl-3-cephem-4-carbonsäure
Etwa 150 g der wie in Beispiel 1 beschrieben gewonnen gefrorenen Zellen von P. melanogenum
werden aufgetaut und in 400 ml Wasser suspendiert. Die Suspension wird mit einer
Lösung von 5 g D-Phenylglycinmethylester in 50 ml Wasser und einer Lösung von 2
g 7-Amino-3-methylthiomethyl-3-cephem-carbonsäure in 100 ml Wasser, mit Natriumhydroxid
auf pH 7 eingestellt, versetzt.
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Die erhaltene Mischung aus Zellsuspension und Substratlösung wird
dann bei 34 OC unter ständigem Rühren 90 Minuten inkubiert. Während der Inkubation
wird der pH-Wert der Mischung durch Zugabe einer wässrigen Lösung von Natriumhydroxid
auf 6 eingestellt.
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Nach der Inkubation wird die erhaltene Mischung zentrifugiert, wodurch
die Bakterienzellen von der überstehenden Flüssigkeit getrennt werden. Die Zellen
werden mit 1 Liter Wasser gewaschen und das Waschwasser wird mit der überstehenden
Flüssigkeit vereinigt. Die vereinigten Flüssigkeiten werden dann mit einer Geschwindigkeit
von etwa 7,5 ml/ Minute durch eine mit XAD-2-Harz gefüllte Säule mit den Abmessungen
4,5cmx40cm geleitet. Nach Waschen mit 2 Liter entionisiertem Wasser wird die Säule
nacheinander mit folgenden Lösungsmittelmischungen eluiert: Lösungsmittelmischung
Volumen des Eluier-% VIV. mittels (1) 10 Methanol:90 H20 4 30 Methanol:70 H20 1
50 Methanol:50 H20 2 Methanol 2
Eluatfraktionen von jeweils 20
ml werden aufgefangen und auf ihre antiobiotische Aktivität nach der Standard-Agarscheiben-Prüfmethode
unter Verwendung von Sarcina lutea geprüft. Die mit 50-prozentigem Methanol eluierten
aktiven Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft,
wodurch 80 mg des Produkts 7- (D-Phenylglycylamido) -3-methylthiomethyl-3-cephem-4-carbonsäure
erhalten werden.
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Das Produkt wird papierchromatographisch mit authentischen Material
verglichen und erweist sich als damit identisch, wie die folgenden Rf-Werte zeigen,die
mit zwei verschiedenen Lösungsmittelsystemen erhalten wurden.
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Verbindung Rf-Wert Rf² Rf3 authentisches Material 0,65 0,71 Produkt
0,65 0,70 1/ synthetisch hergestellte 7-(D-Phenylglycylamido)-3-methylthiomeehyl-3-cephem-4-carbansäure
2/ Lösungsmittelsystem - n-Bu,tanol :Essigsäure: Wasser (3:1:1 V/V/V) 3/ Lösungsmittelsystem
- Acetonitril:Wasser (4:1 V/V).
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Das magnetische Kernresonanzspektrum des Produkts ist mit dem des
authent-isch-en synthetisch hergestellten Materials vergleichbar.
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Beispiel 3 Ein Liter eines wässrigen Kulturmediums mit den gleichen
Bestandteilen und der gleichen prozentualen Zusammensetzung wie das in Beispiel
1 beschriebene Kulturmedium wird mit einem lyophilisierten Pellet von P. melanogenum
ATCC 17808 inokuliert. Vor dem Inokulieren war das Medium in einem Dampfautoklaven
sterilisiert worden.
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Der pH-Wert des Mediums war vor dem Sterilisieren mit einer Natriumhydroxidlösung
auf 7,3 eingestellt worden.
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Das Kulturmedium wird dann 20 Stunden bei 30°C auf einer mit 250 Umdrehungen/Minute
betriebenen Rundschüttelvorrichtung inkubiert. Die Zellen werden durch Zentrifugieren
mit 6000 Umdrehungen/Minute während 20 Minuten geerntet. Das überstehende Medium
wird verworfen, und die zusammengepreßten Zellen werden in 100 ml 0,03m Phosphatpuffer,
pH 6, suspendiert.
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Jeweils 10 bis 13,5 ml der Zellsuspension werden in 50 ml Erlenmeyerkolben
eingebracht, die 0,5 ml einer Lösung von 62,5mg D-Phenylglycinmethylester und 1
ml einer Lösung enthalten, die jeweils 25 ml der unten angegebenen 7-Amino-3-cephem-4-carbonsAure
enthält.
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Die Kolben werden 1 bis 2 Stunden bei 30 OC inkubiert.
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Danach wird zur Entfernung der Zellen zentrifugiert, und die überstehende
Flüssigkeit wird zur Trockne eingedampft. Das jeweils hinterbleibende trockene unreine
Produkt wird durch Chromatographie an XAD-2-Harz gereinigt und kann durch Umkristallisieren
weiter gereinigt werden.
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In der folgenden Tabelle sind die Ergebnisse wiedergegeben, die bei
einem papierchromatographischen Vergleich der 7-(D-Phenylglycyamido)-Produkte, die
-bei dem oben beschriebenen Versuch mit den angegebenen Verbindungen erhalten wurden
und von authentischen (Kontrolle) 7-(D-Phenylglycylamido)-cephalosporinen, hergestellt
durch chemische Acylierung, erhalten wurden. In der Spalte der Tabelle mit der Überschrift
R sind die 3-Substituenten des Cepha- -losporin-Substrats der Formel angegeben.
| R Rf-Wert Löungsmittel- |
| Produkt Kontrolle system |
| -OCH3 0,30 0,29 1 |
| 0,57 0,58 2 |
| -CH20H 0,44 0,45 3 |
| 0,39 0,38 2 |
| -CH2O-CH3 0,67 0,67 4 |
| 0,53 0,53 2 |
| -CH2-S-CH3 0,64 0,65 2 |
| 0 |
| SI |
| -CH2 -0-C-NH2 0,32 0,30 5 |
| 0,38 0,38 2 |
| N N |
| -CH2- T/ -N1 0,59 0,58 2 |
| L. |
| N |
| II |
| -CH2-S 0,44 0,44 2 |
| ~~ N |
| CH3 |
Die Chromatogramme wurden auf Whatmann-Papier Nr. 1 mit folgenden Lösungsmittelsystemen
erhalten: 1/Methanol: n-Propanol: Wasser (6:2:1, V:V:V) Papier mit 0,75 m KH2PO4
gepuffert, pH 4,0 2/n-Butanol: Essigsäure: Wasser (3:1:1, V:V:V) 3/n-Propanol:Wasser
(70:30, V:V) 4/Acetonitril: Wasser (4:1, V:V) 5/Äthylacetat: Essigsäure: Wasser
(3:1:1).