CH617227A5 - Process for the preparation of the antibiotic B-98891 - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums mit der Bezeichnung B-98891, das durch Kultivieren eines das Antibiotikum B-98891 bildenden Stammes der Gattung Streptomyces erhalten wird, und ein Verfahren zur Herstellung von Salzen dieses Antibiotikums.

Auf der Suche nach neuen antibiotischen Substanzen wurde von der Inhaberin eine grosse Zahl von Bodenmikroorganismen isoliert und ihre biologisch aktiven Metaboliten untersucht. Die Untersuchungsarbeit führte zu der Feststellung, dass gewisse Bodenorganismen ein neues Antibiotikum, das als B-98891 bezeichnet wird, zu bilden vermögen, dass diese Mikroorganismen zur Gattung Streptomyces gehören, und dass es möglich ist, dieses Antibiotikum durch Kultivieren dieser Mikroorganismen in einer solchen Weise, dass das Antibiotikum im Kulturmedium angehäuft wird, zu gewinnen.

Gegenstand der Erfindung ist demgemäss ein Verfahren, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man einen Mikroorganismus, der das Antibiotikum B-98891 bildet und zur Gattung Streptomyces gehört, in einem Kulturmedium, das eine assimilierbare Kohlenstoffquelle und eine verwertbare Stickstoffquelle enthält, unter aeroben Bedingungen kultiviert, bis das Antibiotikum im Fermentationsmedium angehäuft ist, und das Antibiotikum aus dem Fermentationsmedium isoliert.

Ferner wurde überraschenderweise gefunden, dass das neue Antibiotikum B-98891 sich hervorragend zur Bekämpfung von Pflanzenkrankheiten, z.B. das Mehltaupilzes, eignet.

Die Erfindung umfasst demnach auch seine Verwendung in einem zur Bekämpfung von Pflanzenkrankheiten dienende Pflanzenschutzmittel, das keine wesentliche Phytotoxizität zeigt und für Tiere einschliesslich der Fische im wesentlichen ungiftig s ist. Besonders geeignet ist ein Konzentrat des Pflanzenschutzmittels, das nach einfacher Verdünnung vor dem Gebrauch für die vorstehend genannten Zwecke auf Pflanzen angewendet werden kann und lagerbeständiger und einfacher und bequemer zu lagern oder zu transportieren ist als das gebrauchsfertige m verdünnte Präparat.

Das Antibiotikum B-98891 wird also durch Kultivieren eines zur Gattung Streptomyces gehörenden und das Antibiotikum B-98891 bildenden Stammes hergestellt, vorzugsweise solange dieser das Antibiotikum zu bilden vermag. Beispiels-i s weise können der als Stamm von Streptomyces rimofaciens eingestufte Stamm, der aus einer von der Inhaberin in Neuguinea genommenen Bodenprobe isoliert wurde und als Streptomyces rimofaciens Nr. B-98891 bezeichnet wurde, und sein verwandter Stamm mit besonderem Vorteil verwendet werden. :o Nachstehend sind einige mikrobiologische Merkmale und Kulturmerkmale von Streptomyces rimofaciens Nr. B-98891 genannt.

1 ) Morphologische Eigenschaften j5 Auf verschiedene Kulturmedien bildet dieser Stamm ein Luftmycel, und der sich verzweigende Typ der sporentragenden Hyphen ist doppelquirlig. Auf Glucose-Asparaginagar, werden, wenn auch selten, auch Schleifen und Haken (nicht an den Vertizillen) gefunden. Die Sporen sind oval bis zylindrisch. Ihre m Grösse liegt im Bereich von 0,6 bis 0,8 X 0,7 bis 1,3 [i,. Die Sporen treten normalerweise in Ketten von 3 bis 16 auf. Die Oberfläche jeder Spore ist glatt oder warzig. Auf verschiedenen Kulturmedien sind weder Sporangien noch Geissein noch Skle-rotium usw. festzustellen.

15

2) Kulturmerkmale

Die Kulturmerkmale der erfindungsgemäss verwendeten Stammes sind nachstehend in Tabelle 1 genannt. Falls nicht anders angegeben, wurden die Merkmale als Ergebnis der Kul-40 tivierung bei 28° Cfür21 Tage festgestellt. Die Farbbezeichnungen in den Tabellen wurden dem Color Harmony Manual, 4. Auflage, Container Corporation of America, entnommen.

Tabelle 1

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Kulturmerkmale von Sterptomyces rimofaciens Nr. B-98891 auf verschiedenen Medien Medium Merkmale*

Saccharoseni- W: Farblos, dringt in das Medium ein. 50 tratagar R: Weiss bis hellelfenbein (Light Ivory)

(2ca)

LM: Spärlich, flaumig, Shell (3 ca) LP: Nicht vorhanden

Glucoseni-tratagar

Glycerinni-tratagar

65

W: Farblos, dringt in das Medium ein. R: Gelb-Ahorn (Yellow Maple) (3 ng) LM: Mässig, perlfarben (Pearl) (2 ba) bis hellelfenbein (2 ca)

LP: Braun

W: Farblos, dringt in das Medium ein. R: Honiggold (2 ic) bis senfgold (Mu-

stard Gold) (2 pg)

LM: Mässig, cremefarben (l'A ca) LP : Blassgelbilchbraun (Pale yellowish brown)

3

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Glucose- W: Farblos, dringt in das Medium ein.

Asparaginagar R: Hellelfenbein (2 ca) bis Chamois (2 gc) bis zimtfarben (3 le)

LM: Dünn, weiss mit gelbem Stich oder mässig, wollig Shell (3 ca) bis perlfar- s ben (3 ba) Möhrenstich-

LP: Nicht vorhanden oder sehr schwach, kultur gelblichbraun.

Glycerin- W: Chamois (2 gc) bis lohfarben (tan) (3

Asparaginagar ie), dringt in das Medium ein. Nähragar

R: Zimtfarben (3 le)

LM: Dünn, weiss bis hellelfenbein (2 ca)

oder mässig, flaumig, weiss mit einem Stich ins Gelblichrosa, (withe with a tinge of pinkish yellow) Glucose-

LP: blassbraun Nähragar

Calciummaleat- W: Cremefarben (IV2 ca), später cha-Agar mois (2 gc)

R: Honiggold (2 ic) bis zimtfarben (3 le)

LM: Nicht vorhanden oder dünn, hellel- Glucose-fenbein (2 ca) Pepton-

LP: Blassbraun Gelatine

Anorganische Salze

Stärkeagar

W: Farblos, dringt in das Medium ein

R: Cremefarben ( 1 ' h ca) bis hellelfenbein (2 ca)

LM: Reichlich, flaumig, weiss bis perlfar-ben (2 ba), später perlfarben (3 ba) bis perlmutterfarben (Shell) (3 ca) bis hellbeige (3 ec)

LP: Blassgelb

Hefeextrakt- W: Farblos, faltig Agar R: Honiggold (2 ic) bis gelbahorn (yel low maple) (3 ng)

LM: Mässig, stumpfgelb (dusty yellow) (1 'A gc) oder flaumig, weiss bis perlfarben (white to pearl) (3 ba) LP: Hellbraun (3 lg)

Hefe-Malzagar

Hafer-mehlagar

î5 Magermilch

♦Abkürzungen:

cb), teilweise perlmuttfarben (Shell) (3 ca)

LP: Farbe des Stichs schlägt nach gräulichbraun um

W: Gut, perlmuttfarben (3 ca) LM: Reichlich, flaumig, weiss bis perlfarben (3 ba) bis perlmuttfarben (3 ca) LP: Farbe des Stichs ändert sich kaum

W: Farblos

R: Hellmaisfarben (light maize) (2 ea)

LM: Dünn, weiss

LP: Blassbraun

W: Gut, farblos, faltig R: Honiggold (2 ic) bis topas (3 ne) LM: Mässig, perlfarben (3 ba) bis hellelfenbein (2 ca)

LP: Blassbraun

W: Oberflächenwachstum gut, farblos, Wachstum im Medium spärlich, farblos

LM: Mässig, cremefarben ( 11 h ca) LP: Braunes Pigment, nur um das Wachstum. Nach Bebrütung für etwa 10 Tage erschien bläulich-grünes Pigment in der Nähe der Oberfläche, später Übergang in dunkelbläulich-grün und nach unten diffundierend. Gelatine nicht verflüssigt.

W: Oberfläche ringförmig, hellelfenbein

(2 ca) bis hellmaisfarben (2 ea) LM: Nicht vorhanden LP: Ahornfarben (Maple) (4 le), Koagulierung und Peptonisierung wurden beobachtet.

W: Wachstum R: Rückseite LM: Luftmycel LP: Lösliches Pigment

W: Gut, farblos, dringt in das Medium ein;

R: hellelfenbein (2 ca) bis goldbraun

(goldenbrown) (3 pi)

LM: Mässig, hellelfenbein (2 ca) bis pastellgelb (pastel yellow) (1 db) bis chamois (2 gc) oder flaumig, weiss bis perlfarben (3 ba)

LP: Blassbraun

W: Gut, farblos

R: Gelbahorn (yellow maple) (3 ng) LM: Reichlich, flaumig, weiss bis perlfarben (3 ba) bis hellbeige (3 ec) LP: Blassgelblichbraun

Kartoffel- W: Maisfarben (Maize) (2 ga) bis cha-

Stichkultur mois (2 gc)

LM: Reichlich, flaumig, weiss bis perlfarben (3 ba) bis sandfarben (Sand) (3

3) Physiologische Eigenschaften

1) Wachstumstemperaturbereich Wachstum findet bei 15 bis 38° C statt ; besseres Wachstum und Bildung von Luftmycel wird bei 28 bis 36° C festgestellt. 50 2) Verflüssigung von Gelatine (Kultivierung 28 Tage bei 24° C:

Nicht verflüssigt.

3) Hydrolyse von Stärke: positiv

4) Reduktion von Nitraten: negativ

55 Bactonitratbrühe (ISP-Nr. 8: Methode: Manual of International Cooperative Project for Description and Déposition of Type Cultures of Streptomycetes, 1964) und Czapek-Lösung

5) Koagulierung von Magermilch: positiv Peptonisierung von Magermilch: positiv

(,o 6) Bildung von schwarzem Pigment:

positiv (Pepton-Hefe-Eisen-Agar)

negativ (Tyrosinagar)

7) Assimilierung von Kohlenstoffquellen (Methode von Pridham und Gottlieb): Gut assimilierte Kohlenstoffquellen: ss Inosit, D-Galactose, D-Glucose, Maltose, D-Mannose, Stärke, Glycerin, Natriumacetat, Natriumsuccinat und Natriumeitrat. Ziemlich gut assimilierte Kohlenstoffquellen: D-Fructose, Tre-halose;

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4

nicht assimilierte Kohlenstoffquellen:

Erythrit, Adonit, D-Sorbit, D-Mannit, Dulcit, D-Xylose, L-Arabinose, L-Sorbose, Rhamnose, Melibiose, Saccharose, Lactose, Raffinose, Salicin, Esculin, Inulin.

Wie bereits erwähnt, hat das vegetative Mycel dieses Stammes eine farblose bis blassgelbe Oberfläche. Die Rückseite ist blassgelb bis gelblichbraun bis braun. Das Luftmycel ist entweder gelblichweiss oder im flaumigen Teil gelblich-orangefarben bis gelblich mit einem Stich ins Graue. Hellgelblichbraunes bis braunes lösliches Pigment wird auf gewissem synthetischem Agar gebildet.

Die Farbstoffbildung dieses Stamms auf proteinhaltigen Medien ist zwar gering, jedoch ist die Bildung eines schwärzlichbraunen löslichen Pigments in Pepton-Hefe-Eisen-Agar deutlich erkennbar, ein Zeichen, dass der Stamm melaninpositiv ist. Auf Glucose-Pepton-Gelatine werden ein lösliches braunes Pigment und ein lösliches bläulichgrünes Pigment gebildet.

Auf der Grundlage der so beobachteten Kulturmerkmale wurde der erfindungsgemäss verwendete Stamm mit den bekannten Spezies verglichen, die in der Literatur beschrieben werden, beispielsweise von S.A. Waksman «The Actinomyce-tes» II (The William and Wilkins Co., 1962), Cooperative Description of Type Cultures of Streptomyces II (International Journal af Systematic Bacteriology 18, S. 69), dto. III (loc.cit. 18, S. 279), dto. IV (loc.cit. 22, S. 265), Rocci et al «The Genus Streptoverticillium: A Taxonomic Study» (Giornale di Microbiologia 17 (1969) 1) und andere. Als Ergebnis wurde festgestellt, dass der erfindungsgemäss verwendete Stamm der Spezies Streptomyces rimofaciens ähnlich ist (japanische Patentveröffentlichung Nr. 7598/1967).

Die Unterschiede zwischen S.rimofaciens und dem erfindungsgemäss verwendeten Stamm sind in Tabelle 2 genannt. Was die anderen Merkmale anbelangt, die nicht in der Tabelle genannt sind, so sind die meisten morphologischen Merkmale, Kultureigenschaften und physiologischen Eigenschaften beider Stämme einander ähnlich.

Die in der Tabelle genannten Unterschiede genügen nicht, um den erfindungsgemäss verwendeten Stamm als neue Spezies anzusehen. Angesichts der Tatsache, dass der erfindungsgemäss verwendete Stamm kein Destomycin A und B, jedoch das erfindungsgemässe neue Antibiotikum B-98891 bildet, wird von der Inhaberin jedoch angenommen, dass dieser Mikroorganismus und Streptomyces rimofaciens verschiedene Stämme sind. Der neue Stamm wird nachstehend als Streptomyces rimofaciens Nr. B-98891 bezeichnet und ist am 21. März 1974 unter der Nr. IFO-13592 beim Institute for Fermentation, 17-85 Juso-honmachi 2-chome, Yodogawa-ku, Osaka 532 (Japan), am 26. März 1974 unter der Nr. FERM-P 2549 beim Fermentation Research Institute, Agency of Industriai Science and Technology, 8-1 Inage-Higashi 5-chome, Chiba City 281 (Japan) und am 20. Januar 1975 unter der Nr. ATCC-31120 bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 (USA) hinterlegt worden.

Tabelle 2

Vergleich vonS. sp. Nr. B-98891 mit S.rimofaciens Medium S.rimofaciens S. sp.Nr.B-98891

Gebildetes Antibiotikum

Destomycin A & B B-98891

Bouillonagar und Glucosebouillon-agar

Möhrenstich-kultur

Risse im Wachstum gebildet; lösliches Pigment dunkelbraun kein Wachstum keine Risse; lösliches Pigment blassbraun gutes Wachstum mit Luftmycel

Assimilierung von Sorbit und Mannit weder Sorbit noch Kohlenstoffquellen werden assimiliert Mannit werden assimiliert

Als gemeinsame Merkmale zeigen die Spezies von Strepto-5 myces die Bereitschaft zu gewissen Veränderungen der Kulturmerkmale und physiologischen Eigenschaften, und dies gilt auch für Streptomyces rimofaciens Nr. B-98891. So sind die vorstehend genannten Merkmale des neuen Stamms nicht konstant, sondern es können verschiedene Mutanten leicht erzeugt wer-i„ den. Solange jedoch die Fähigkeit zur Bildung von Antibiotikum B-98891 nicht verlorengeht, können auch diese Mutanten für die Zwecke der Erfindung verwendet werden. Es spielt natürlich keine Rolle, ob diese Mutation spontan stattgefunden hat oder künstlich durch mutagene Behandlung hervorgebracht i5 worden ist.

Beim Verfahren gemäss der Erfindung wird die Kultivierung unter Verwendung eines Mediums durchgeführt, das nebst einer assimilierbaren Kohlenstoffquelle und einer verwertbaren Stickstoffquelle im allgemeinen anorganische Salze usw. enthält. 2ii Dem Medium können nach Bedarf Spurennährstoffe, wachstumfördernde Mittel (z.B. Vitamine, Aminosäuren, tierisches öl, Pflanzenöl und Mineralöl), Vorstufen und andere Materialien, die in geringen Mengen wirksam sind, zugesetzt werden. Als assimilierbare Kohlenstoffquellen kommen beispielsweise 25 Glucose, Saccharose, Melasse, Stärke, Dextrin, Glycerin in Frage. Als verwertbare Stickstoffquellen eignen sich beispielsweise Fleischextrakt, Sojabohnenmehl, Maisquellwasser, Pepton, Casein und Baumwollsaatmehl sowie anorganische Stickstoffverbindungen, z.B. Nitrate und Ammoniumverbindungen, î» Ausser diesen Komponenten können dem Medium nach Bedarf auch Schaumverhütungsmittel usw. zugesetzt werden. Alle diese Materialien können vorteilhaft verwendet werden. Die Oberflächenkultur ist zwar durchführbar, jedoch ist die aerobe Sub-merskultur im allgemeinen vorteilhafter. Bei der Durchführung i5 der aeroben Submerskultur wird der pH-Wert des Mediums vorzugsweise in der Nähe des Neutralpunktes) d.h. pH 6,0-8,0) und die Bebrütungstemperatur vorzugsweise bei etwa 20° bis 37° C gehalten. Diese Kultivierungsbedingungen wie Zusammensetzung und pH-Wert des Mediums, Kultivierungstempera-4d tur, Grad der Bewegung oder Belüftung usw. können natürlich in Abhängigkeit vom jeweils verwendeten Stamm des Mikroorganismus, den äusseren Bedingungen und anderen Faktoren so geregelt und gewählt werden, dass gute Ergebnisse erhalten werden.

45 In j edem Fall ist jedoch die höchste Konzentration von Antibiotikum B-98891 im Medium im allgemeinen 96 bis 144 Stunden nach Beginn der Kultivierung zu finden.

Das erhaltene Kulturmedium enthält das Antibiotikum B-98891 in hoher Konzentration. Zur Isolierung des Antibioti-5o kums in optimaler Reinheit aus diesem Kulturmedium können die üblicherweise zur Isolierung von mikrobiellen Metaboliten aus Kulturen angewandten Trennverfahren mit Vorteil zur Anwendung kommen. Da beispielsweise das Antibiotikum B-98891 als wasserlösliche Base zum grössten Teil im filtrierten 55 Kulturmedium vorhanden ist, wird zunächst dem Kulturmedium ein Filterhilfsmittel zugesetzt, das dann zur Entfernung der Zellen abfiltriert wird. Das Filtrat wird dann mit einem geeigneten Adsorptionsmittel behandelt, an dem die aktive Fraktion adsorbiert und anschliessend mit einem geeigneten Lösungsmit-60 tel desorbiert wird. Ein solches Fraktionierverfahren ist vorteilhaft anwendbar.

Als Adsorptionsmittel eignen sich beispielsweise Aktivkohle, als Adsorptionsmittel wirksame Harze, Kationenaus-tauschharze, aktiviertes Aluminiumoxyd und Kieselgel. Ausser-65 dem sind auch Trenn- und Reinigungsverfahren geeignet, die die Unterschiede im Molekulargewicht ausnutzen, z.B. ein unter Verwendung von Molekularsieben durchgeführtes Verfahren. Die Art des desorbierenden Lösungsmittels hängt von der Art

5

617 227

und den Eigenschaften des Absorptionsmittels ab, jedoch können zweckmässig beispielsweise wässriges Aceton, wässriges Methanol, wässriges Äthanol, wässriges Propanol, wässriges Butanol usw. sowie saure und alkalische Puffer und wässrige Lösungen von anorganischen oder organischen Salzen verwendet werden.

Wenn beispielsweise als Adsorptionsmittel Aktivkohle oder ein adsorptionsfähiges Harz verwendet wird, wird die aktive Substanz im filtrierten Kulturmedium unter neutralen oder schwach basischen Bedingungen adsorbiert und beispielsweise mit Wasser, das eine geeignete Menge Aceton, Methanol, Propanol o.dgl., Wasser, das ein Salz oder eine Säure enthält, oder einer Pufferlösung desorbiert.

Da das Antibiotikum eine basische Substanz ist, kann es an einem Kationenaustauschharz adsorbiert und mit einer geeigneten sauren oder alkalischen Lösung oder Pufferlösung eluiert werden. Als Kationenaustauschharz eignet sich beispielsweise das Produkt «Amberlite IRC-50» oder «Amberlite CG-50» (Hersteller Rohm and Haas Co., USA). Beispielsweise kann das Antibiotikum B-98891 an einer Säule des Harzes adsorbiert und dann beispielsweise mit verdünntem wässrigem Ammoniak oder einer Pufferlösung eluiert werden. Ausser den vorstehend genannten Verfahren eignet sich zur Reinigung des Antibiotikums B-98891 die Adsorptionschromatographie an Kieselgel (Hersteller Merck, Westdeutschland). Beispielsweise kann das aktive Eluat durch Entwickeln des Chromatogramms mit einem geeigneten Lösungsmittelsystem, z.B. einem Gemisch von Methanol, Methylamin und Wasser, erhalten werden. Die gewünschte Reinigung ist ferner möglich durch Adsorption des Antibiotikums an einem Trägermaterial, das die Eigenschaft eines Molekularsiebs hat, z.B. an dem Produkt «Sephadex G-15» Hersteller Pharmacia, Schweden) und Elution beispielsweise mit Wasser oder einer Pufferlösung. Die Reinigung kann auch unter Verwendung eines solchen Adsorptionsmittels und eines Molekularsiebes in geeigneter Kombination vorgenommen werden.

Das in dieser Weise gereinigte Antibiotikum B-98891 kann dann aus Methanol, Aceton o.dgl. als farbloses Pulver gewonnen werden.

Die Eigenschaften des pulverförmigen freien Antibiotikums B-98891, das auf die in Beispiel 2 beschriebene Weise hergestellt worden ist, werden nachstehend genannt.

Physikalische und chemische Eigenschaften

1) Schmelzpunkt: allmähliche Verfärbung beginnt bei etwa 220° C; das Pulver zeigt keinen scharfen Schmelzpunkt.

2) Spezifische Drehung:

[oc] 20= + 91,8° ± 10° (c= 0,5 in Wasser);

+ 68,5° ± 10° (c = 0,5, 0,ln-HCl).

3) pKa: 4,2 ± 0,2,7,0 ± 0,2 (ermittelt nach der Titrationsmethode)

4) Molekulargewicht: 529 ± 100 (ermittelt nach der Titrationsmethode)

5) Zusammensetzung nach Elementen und Elementaranalyse: bestehend aus Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff und Sauerstoff ohne Halogen, Phosphor und Schwefel.

C: 42,73 ± 1,5 H: 6,01 ± 0,5 N: 20,48 ± 1,0 O: 30,05 ± 2,0

6) UV-Absorptionsspektrum:

Das UV-Absorptionsspektrum ist in Fig. 1 dargestellt. Im Diagramm stellt die ausgezogene Linie das in wässriger Lösung bei pH 7 gemessene Spektrum, die punktierte Linie das Spektrum O.ln-NaOH und die gestrichelte Linie das Spektrum in 0,ln-HC1 dar.

Die Absorptionsmaxima liegen wie folgt:

\pH7 271 ±2nm(E]%m =157)

max

, 0,ln-NaOH 271 ± 2 nm (eI^L = 154)

I fi A» *■ cm

II max

X.0,ln-HCl 280 ± 2nm (E\fm = 228)

15

7) IR-Absorptionsspektrum

Das IR-Absorptionsspektrum, das nach der KBr-Scheiben-methode aufgenommen wurde, ist in Fig. 2 dargestellt. Die signifikanten Absorptionen (Wellenzahlen) liegen wie folgt: 1(1 3330, 3160 (Schulter), 2900, 2850,1660,1600,1505,1485, 1400,1375,1295,1230,1180,1130,1065, 910,780,700, 580 cm-1.

8) Dünnschichtchromatographie (Kieselgel F2S4, Hersteller Merck)

25

Lösungsmittelsystem Rf- Wert

Chloroform-Methanol-17 %iges wässriges

Ammoniak (2:2:1 - obere Schicht) 0,34

.m

Propanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser 0,15 (15:10:3:10)

Äthylacetat-Aceton-Essigsäure-Wasser 0,37 15 (45:5:5:45-untereSchicht)

9) Papierchromatographie (Whatman-Filterpapier Nr. 1)

Lösungsmittelsystem Rf- Wert

4(| Butanol-Essigsäure-Wasser (2:2:1) 0,13

Propanol-Wasser (7:3) 0,27 Isopropanol-5%iges wässriges Ammoniak (6:4) 0,26

10) Papierelektrophorese Whatman-Filterpapier Nr. 1, 500 -V; in 2 Stunden vollständig zur Kathodenseite gewandert)

cm -0,7

-1,1

-3,3 11) Löslichkeit

In Wasser leicht löslich, aber in organischen Lösungsmitteln (z.B. Methanol, Butanol, Pyridin, Essigsäure, Dimethylsulfoxyd und Tetrahydrofuran) schwer löslich.

12) Farbreaktionen

Positive Reaktionen bei Greig-Leaback-, Sakaguchi- und Kaliumpermanganatreagentien ; ungewisse positive Reaktionen bei Anilinphthalat und Ninhydrin; negative Reaktionen mit Pauly-, Ehrlich-, Dragendorff-, Barton-, Benzidin-Perjodat-und Eisen (III)-chlorid-Sulfosalicylsäure-Reagentien.

(.5

13) Stabilität

Leicht instabil in saurer wässriger Lösung, jedoch stabil in neutraler oder basischer wässriger Lösung.

Pufferlösung

1/10-molares Glycin-NaCl-NaOH (pH 9,32) 5H 1/15-molarer Phosphatpuffer (pH 7,05) 1/10-molarer Citrat-HCl-Puffer (pH 3,62)

617 227

6

Biologische Eigenschaften 1 ) Antimikrobielles Spektrum (in vitro)

Das antimikrobielle Spektrum von Antibiotikum B-98891, ermittelt nach der Agarverdünnungsmethode und -Diffusionsmethode ist in Tabelle 3 angegeben. Der in der Tabelle angege-Tabelle 3

Antimikrobielles Spektrum

Test-Mikroorganismus Testbedingungen bene «Durchmesser der Hemmhöfe» ist der Durchmesser der Hemmhöfe, die um eine Papierscheibe (7 mm Durchmesser), gebildet werden, die in eine 5000 (xg/ml des erfindungsgemäss hergestellten Antibiotikums enthaltende Lösung getaucht sind.

Hemmende Mindestkonzentration

Durchmesser des Hemmhofes

Medium

Temperatur

Zeit

([ig/ml.)

(mm)

(°C)

Aspergillus niger IFO-4066

A

28

40

>500

+

Pénicillium chrysogenum IFO-4626

A

28

40

>500

13

Pénicillium expansum IFO-7813

A

28

40

100

25

Pyricularia oryzae IFO-5279

A

28

40

>500

-

Cochliobolus miyabeanus IFO-5277

A

28

40

>500

15

Sclerotinia sclerotiorum IFO-9395

A

28

40

500

20

Botrytis cinerea TKF-12

A

20

88

250

15

Guignardia laricina IFO-7888

A

28

88

100

18

Trichophyton mentagrophytes IFO-5809

D

28

88

500

+

Candida albicans IFO-0583

A

28

40

>500

—

Saccharomyces cerevisiae IFO-0209

A

28

40

>500

12

Rhodotorula rubra IFO-0870

A

28

40

50

80

Bacillus subtilis IFO-3513

B

37

20

>500

14

Staphylococcus aureus IFO-3061

B

37

20

>500

10

Escherichia coli IFO-3044

B

37

20

500

14

Proteus vulgaris IFO-3045

B

37

20

>500

11

Pseudomonas aeruginosa IFO-3080

B

37

20

>500

—

Mycobacterium phlei IFO-3158

C

37

40

50

27

Mycobacterium smegmatics ATCC-607

C

37

40

250

24

Testmedien ,s

A 3,0% Saccharose, 0,2% L-Asparagin, 0,3% NH4N03,

0.1,% KH2P04,0,1 % MgS04.7 H20,0,001 % Eisengelatverbin-dung « Versenol» (Hersteller Dow Chemical Co. ; Gehalt an Eisen-Natrium-Äthanol-Äthylendiamintriacetat 57,04%) 1,5% Agar (pH 7). Vor dem Gebrauch werden die folgenden Vita- 4() mine dem Medium bis zu den genannten Endkonzentrationen in (ig/ml zugesetzt: Thiamin 1, Riboflavin 1, Calciumpantothenat

1, Niacin 1, Biotin 0,005, Folsäure 0,5, Pyridoxinhydrochlorid

2, p-Aminobenzoesäure 0,5, Cyanocobalamin 0,0002

B 0,5 % Ehrlich-Fleischextrakt, 0,5 %, Polypepton, 0,5 % 4S NaCl, 1,5% Agar (pH 7)

C3,0% Glycerin, 0,5 % Ehrlich-Fleischextrakt, 0,5% Polypepton, 0,5% NaCl, 1,5% Agar (pH 7,0)

D 1,0% Glucose, 0,4% (NH4)2HP04, 0,07% MgS04.7 H20,0,1% KH2P04, 0,1% NaCl, 0,003 % FeS04,1,5% Agar (pH 7,0)

Die Werte in Tabelle 3 zeigen, dass das Antibiotikum B-98891 gegen gewisse grampositive Bakterien, gramnegative Bakterien, phythogene Pilze und gewisse Hefen schwach wirksam ist. 55

Die Austestung des Antibiotikums B-98891 wurde nach der Diffusionsmethode unter Verwendung von Kartoffel-Saccharose-Agar (3 % Saccharose, pH 5) als Testmedium und Rhodo-torula rubra IFO-0907 als Test-Mikroorganismus durchgeführt.

net, um die Wirkung des Testpräparats zu ermitteln. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 4 genannt.

Tabelle 4

Wirkung gegen den Mehltau der Gerste

Konzentration

Fläche der Läsion, %

50 ppm

0

25

0

12.5

0

6,25

26

3,12

40

62,5**

14

100

Testverbindung

B-98891

Netzbares Pulver «Benomyl»*

Kontrolle unbehandelt

♦Landwirtschaftliches chemisches Präparat, das Methyl-1-(butylcarbamoyl)-2-benzimidazolcarbamat als Wirkstoff enthält.

♦♦Konzentration als Methyl-l-(butyIcarbamoyl)-2-benzimi-dazolcarbamat.

Die Ergebnisse zeigen, dass das Antibiotikum B-98891 eine grössere Wirksamkeit hat als das im Handel erhältliche Präparat.

2) Wirksamkeit gegen den Mehltau der Gerste

Sieben Tage alte Gerstensämlinge wurden verwendet. Die Wurzeln wurden mit kleinen Wattestücken bedeckt, die mit einer vorbestimmten Konzentration von Antibiotikum B-98891 befeuchtet waren. Die entfalteten Blätter wurden mit Konidien von Erysiphe graminis mit einem kleinen Pinsel geimpft. Jeder Sämling wurde 7 Tage in einem Reagensglas bei 18° C gehalten. Die prozentuale Fläche der ausgebildeten Läsion wurde berech-

3) Toxizität

Die Ermittlung der akuten Toxizität bei Mäusen und Ratten hatte folgende Ergebnisse:

Verabreichung

Mäuse

Ratten

LD5() (mg/kg) Intravenös oral

> 500 > 2000

> 500 > 2000

7

617 227

Bei der Ermittlung der Wirkung des Präparats auf die Hornhaut und Haut von Kaninchen wurde bei 10-tägiger Beobachtung keine Veränderung bei einer Konzentration von 1000 ppm festgestellt.

Beim Toxizitätstest an Fischen wurde keine toxische Wirkung auf den japanischen Kerpfling (killifish) bei 7-tägiger Beobachtung bei einer Konzentration von 20 ppm festgestellt.

Vergleich mit bekannten Antibiotika

Die vorstehend genannten Eigenschaften zeigen, dass das Antibiotikum B-98891 ein Nucleosid-Antibiotikum ist. Von den bekannten Antibiotika dieses Typs haben Gougerotin, Anthelmycin, Blasticidin S, Aspiculamycin, Hikijimycin, Moroyamycin A, B (Gougerotin-Analoge) und C und Cytovirin im UV-Absorptionsspektrum eine gewisse Ähnlichkeit mit dem Antibiotikum B-98891. Die UV-Absorptionsspektren dieser bekannten Antibiotika zeigen sämtlich Maxima bei 268 nm (in alkalischer wässriger Lösung) und 276 nm (in saurer wässriger Lösung), während das Antibiotikum B-98891 Maxima bei 271 ± 2 nm (in alkalischer wässriger Lösung) und 280 ± 2 mm (in saurer wässriger Lösung) zeigt. Ferner enthalten von den genannten bekannten Antibiotika alle Verbindungen, deren chemische Struktur aufgeklärt worden ist, Cytosin als Chromo-phor, während als Chromophor im Antibiotikum B-98891 5-Hydroxymethylcytosin bestimmt wurde. Nach den vorstehenden Ergebnissen ist das Antibiotikum B-98891 mit Sicherheit als neues Antibiotikum anzusehen.

Wie seine biologischen Eigenschaften zeigen, ist dieses neue Antibiotikum B-98991 gegen grampositive und gramnegative Bakterien schwach wirksam.

Seine Toxizität bei Mäusen und Ratten ist ebenfalls gering, und es ist praktisch keine Reizwirkung auf die Hornhaut und Haut von Kaninchen festzustellen. Das Antibiotikum ist somit als schwach toxisch anzusehen.

Anderseits hat das Antibiotikum eine charakteristisch starke Wirkung gegen den Verursacher des Mehltaus der Gerste (Erysiphe graminis) und ausserdem die überaus vorteilhafte Eigenschaft, dass es für Fische im wesentlichen unschädlich ist.

Mehltau ist weit verbreitet, und bei den bekannten Bekämpfungsmitteln gegen Mehltau gibt es verschiedene Probleme, z.B. Wirksamkeit (einschliesslich des Problems der Resistenz), Schädigung der Pflanze, Rückstände, die mit ihrer Herstellung verbundenen Probleme der Verunreinigung und Gefährdung usw. Das Antibiotikum trägt viel zur Lösung dieser Probleme bei.

In zum Pflanzenschutz bestimmten fungiziden Präparaten ist das Antibiotikum B-98891 als Wirkstoff enthalten.

Das Antibiotikum B-98891 kann entweder allein oder in Kombination mit anderen Chemikalien, deren Anwendbarkeit auf Pflanzen bekannt ist, verwendet werden. Als Antibiotikum B-98891 kann das Fermentationsmedium selbst oder auch ein beliebiges Konzentrat, das das Antibiotikum B-98891 in einer Konzentration von mehr als etwa 50% enthält, verwendet werden. Als Konzentrate kommen das Filtrat, das Kondensat des Filtrats oder ein beliebiges Material, das als Zwischenprodukt der Reinigung erhältlich ist, in Frage.

Alle Anwendungsformen, in denen übliche Fungizide gewöhnlich eingesetzt werden, sind für das Antibiotikum geeignet. Beispielsweise kann das Antibiotikum in einem flüssigen Träger (z.B. in einem Lösungsmittel) gelöst oder dispergiert oder mit einem geeigneten Träger (z.B. Streckmittel, Hilfsstoff usw.) gemischt oder daran adsorbiert werden. Gegebenenfalls können Emulgatoren, Dispergiermittel, Suspendiermittel, Streumittel, Penetrationshilfsstoffe, Netzmittel, Verdickungsmittel, Stabilisatoren und andere Zusätze in die Präparate eingearbeitet werden, so dass diese in Anwendungsformen wie ölige Suspensionen, Emulsionen, netzbare Pulver, Stäubemittel, Tabletten, Granulat, Aerosol usw. verwendet werden können.

Der bevorzugte Konzentrationsbereich des Hauptwirkstoffs liegt in Präparaten wie Emulsionen und netzbaren Pulvern im Bereich von etwa 1 bis 70 Gew.-% und bei ölen, Stäubemittel und anderen Anwendungsformen im Bereich von etwa 0,01 bis 10 Gew.-%. Im Falle von Emulsionen und netzbaren Pulvern werden die Präparate vor der Anwendung mit Wasser bzw. anderen Streckmitteln auf eine geeignete Konzentration (z.B. 100- bis 10000-fach) verdünnt bzw. gestreckt.

Als Beispiele der vorstehend genannten Lösungsmittel, die in den oben erwähnten Präparaten geeignet sind, seien genannt: Wasser, Alkohole (z.B. Methanol, Äthanol und Äthylenglykol), Äther (z.B. Dioxan, Tetrahydrofuran und Cellosolve), aliphatische Kohlenwasserstoffe (z.B. Benzin, Kerosin, Heizöl und Maschinenöl), aromatische Kohlenwasserstoffe (z.B. Benzol, Toluol, Xylol, Lösungsbenzin und Methylnaphthalin), organische Basen (z.B. Pyridin und Aldehyd-Collidin), halogenierte Kohlenwasserstoffe (z.B. Chloroform und Tetrachlorkohlenstoff), Säureamide (z.B. Dimethylformamid), Ester (z.B. Äthyl-acetat, Butylacetat und Fettsäureglyceridester) und Nitrile (z.B. Acetonitril). Diese Lösungsmittel können allein oder in Kombination verwendet werden.

Als Streckmittel und/oder Hilfsstoffe eignen sich beispielsweise pflanzliche Pulver (z.B. Sojabohnenmehl, Tabakmehl, Weizenmehl und Sägemehl), Mineralpulver (z.B. Kaolin, Ben-tonit, saurer Ton und andere Tonminerale, Talkumpulver, Pagodit und andere Talkumtypen, Diatomeenerde, Glimmerpulver und andere Siliciumdioxyde), Aluminiumoxyd, Schwefelpulver und Aktivkohle. Diese Materialien können allein oder in Kombination verwendet werden.

Als oberflächenaktive Mittel, die als Emulgatoren, Ausbreitmittel, Penetrationshilfsstoffe, Dispergiermittel usw. verwendet werden, können nach Bedarf verschiedene Seifen, Ester von Schwefelsäure mit höheren Alkoholen, Alkylsulfonsäuren, Alkylarylsulfonsäuren, quaternäre Ammoniumsalze, Oxyalkyl-amine, Fettsäureester, oberflächenaktive Polyalkylenoxyde, oberflächenaktive Mittel auf Basis von Anhydrosorbit usw. zugesetzt werden. Für die gleichen Zwecke können Casein, Gelatine, Stärke, Alginsäure, Agar, Polyvinylalkohole, Holzterpentinöl, Reiskleieöl, Bentonit, Kresolseife usw. verwendet werden.

Die in dieser Weise hergestellten Präparate können weiter durch andere Typen von Fungiziden und Schädlingsbekämpfungsmitteln (z.B. Kupferfungiziden, Quecksilberfungiziden, organischen Schwefelfungiziden, Fungiziden vom Phenoltyp usw.), Herbiziden, Insektiziden (organischen Chlorinsektiziden, Organophosphorinsektiziden und natürlichen Insektiziden), anderen Mitiziden, Nematoziden, Pflanzenwachstumsreglern, Synergisten, insektenanziehenden oder -abweisenden Mitteln, Duftstoffen, Pflanzennährstoffen, Düngemitteln u.dgl. ergänzt werden.

Die richtige Menge der fungiziden Präparate, die Arten anderer Chemikalien, die mit den Präparaten zu mischen sind, und die Mengenanteile der Wirkstoffe im endgültigen Präparat hängen beispielsweise von der Art der Pflanzen, auf die das Präparat angewandt werden soll, von der Wachstumsphase und vom Zustand der Pflanze, von der Anbaumethode der Pflanze, der Art der Krankheit, dem Zustand des Befalls, der Zeit, zu der das Präparat angewandt wird, und gewissen Faktoren der äusseren Umgebung, der Anwendungsart, der Wirtschaftlichkeit der Anwendung und anderen Bedingungen ab. Im allgemeinen genügt jedoch eine Aufwandmenge von 1 bis 300 g pro 100 Ar, gerechnet als Verbindung B-98891. Hinsichtlich der effektiven Konzentration ist es zweckmässig, dass die Endkonzentration der Verbindung im Bereich von 1 [ig bis 10mg/ml liegt. In der Praxis können die fungiziden Präparate unmittelbar auf den aufgelaufenen Teil der Pflanze oder auf den Boden angewandt werden.

S

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

()5

617 227

8

Es ist lediglich erforderlich, sicherzustellen, dass die Präparate sicher, zuverlässig und wirksam auf die Pflanzen angewandt werden.

Die fungiziden Präparate sind gegen die verschiedensten Pflanzenkrankheiten und ausserdem als Mitizide wirksam. Beispielsweise sind die Präparate besonders wirksam gegen den Mehltau von Feldfrüchten (z.B. Gerste), industriell verwerteten Pflanzen (z.B. Tabak und japanische Maulbeere), Obstbäumen (z.B. Apfel und Traube), Waldpflanzen (z.B. Eiche), Gemüse (z.B. Gurke, orientalische Melone, Pfeffer, Tomaten, Erbse und Stachelbeere), Zierpflanzen (z.B. Rose) usw. sowie der Braunfäule der Tomate, Kartoffel und anderer Pflanzen. Die Präparate sind praktisch ungiftig (z.B. geringe akute Toxizität, keine Reizwirkung auf Hornhaut und Haut, keine Toxizität bei Fischen usw.) und ist äusserst sicher in der Anwendung.

Nachstehend werden einige Prüf daten und Beispiele gegeben, die die vorteilhaften Wirkungen der Präparate im Vergleich zu verschiedenen Chemikalien, die als Pflanzenschutzmittel zur Bekämpfung der vorstehend genannten Pflanzenkrankheiten im Handel erhältlich sind, veranschaulichen.

Die bei den Versuchen zum Vergleich verwendeten verschiedenen Chemikalien sind handelsübliche Produkte, deren Wirkstoffe nachstehend genannt sind. Die in den Tabellen genannten Konzentrationen sind die Konzentrationen dieser Wirkstoffe.

Tabelle 5

Wirkung von Antibiotikum B-98891 gegen den Mehltau der orientalischen Melone Testver-s bindung

B-98891

Karathane EM Kontrolle (unbe-; handelt)

Konzen

Fläche der Läsion,

%

tration

7 Tage 14 Tage

21 Tage ppm

40

0

19,0

40,0

80

1,5

7,0

24,0

160

0,6

0,6

5,0

148

0,5

5,0

14,5

—

65,0

97,0

100

Phyto-toxizität

Karathane EM

(Hersteller Sanyo Boeki Co ; Japan) Dinitromethylheptylphenylcrotonat 37 %

Takeda-Mycin Conc.

(hergestellt von der Anmelderin) Dihydrostreptomycinsulfat Benlate WP (Hersteller duPont, USA)

Methyl-1 -(butylcarbamoyl)-2-benzimidazol-carbamat Polyoxin AL WP

(Hersteller Kumiai Chemical Co., Japan) als Polyoxinkomplex B Morestan WP

(Hersteller Nihon Tokushunoyaku Co., Japan) 6-Methylchinoxalin-2,3-dithiocarbonat 25 %

Versuch 1

Bekämpfung des Mehltaus der orientalischen Melone

Die entfalteten Blätter von orientalischen Melonenpflanzen (Cucumis melo L-var.makuwa Makino, f.Ginsen), die in Töpfen gezüchtet wurden (Phase mit 6 bis 7 Blättern) wurden mit Sphaerotheca fuliginea (Schlechtendahl) Pollacci durch Bestäuben der befallenen Blätter mit den Sporen des Pilzes infiziert. Das Antibiotikum B-98891 wurde mit Wasser bis zu einer bestimmten Konzentration verdünnt. Ein Ausbreitmittel («Dyne», hergestellt von der Anmelderin) wurde in einer solchen Menge zugesetzt, dass sich eine 3000-fache endgültige Verdünnung ergab. Das Vergleichsprodukt wurde in der gleichen Weise mit Wasser verdünnt.

Alla fungiziden Lösungen wurden in ausreichender Menge auf die genannten Pflanzen der orientalischen Melone 2 Tage nach der Infizierung gesprüht. Die Pflanzen wurden dann in üblicher Weise in einem Gewächshaus weiter gezüchtet und gepflegt. In bestimmten Zeitabständen wurde die prozentuale Fläche des Pilzwachstums auf den Blättern bestimmt, die sich zu der Zeit des Spritzens bereits entfaltet hatten. Der Versuch wurde für jede Gruppe doppelt durchgeführt.

Versuch 2

Bekämpfung des Mehltaus von Pfeffer

Die Rückseiten von entfalteten Blättern von in Töpfen gezüchteten Pfefferflanzen (Phase mit 9 bis 10 Blättern), Capsi-cum annuum L.f.California Wonder) wurden durch Bestäuben mit den pathogenen Pilzen von befallenen Blättern infiziert. 2 Tage später wurden die Blätter mit einer ausreichenden Menge der Testlösungen wie beim Versuch 1 gespritzt. Die Pflanzen 25 wurden dann im Gewächshaus weiterkultiviert und gepflegt. In gewissen Zeitabständen wurde die prozentuale Fläche des Pilzwachstums ermittelt. Dieser Test wurde für jede Gruppe doppelt durchgeführt.

,d Tabelle 6

Wirkung von Antibiotikum B-98891 gegen den Mehltau von Pfeffer

Testpräparat

Konzentration

Fläche der Läsion, %

Phyto-toxizität

12,5%

ppm

7 Tage

10 Tage

B-98891

80

7,9

10,3

-

50%

160

5,0

4,6

-

Karathane EM

148

7,2

18,1

-

4o Kontrolle

10%

(unbehandelt)

-

24,6

76,2

-

Versuch 3

Bekämpfung der Braunfäule der Tomate 45 Für den Versuch wurden Tomatenpflanzen (Lycopersicon esculentum Mill, f.Ohgata Fukuju) verwendet, die 30 Tage in 12 cm-Töpfen kultiviert worden waren. Der Versuch wurde pro Gruppe von 4 Töpfen doppelt durchgeführt. Die in der gleichen Weise wie beim Versuch 1 angesetzten fungiziden Lösungen 5o wurden in ausreichender Menge aufgespritzt. 2 Tage später wurde ausserdem eine Suspension der Sporen von Phytophthora infestans (Montagne) de Bary über die Pflanzen gesprüht. Die Töpfe wurden 4 Tage im Feuchtzimmer gehalten, worauf die prozentuale Fläche der Läsionen (am dritten und vierten Blatt) 55 ermittelt wurde.

Tabelle 7

Wirkung von Antibiotikum B-98891 gegen die Braunfäule der Tomate

Testpräparat Konzen- Läsions-

fläche, %

B-98891

,,5 Takeda-Mycin Conc. Kontrolle (unbehandelt)

Konzentration, ppm 250 500 500

100 0 28

100

Grad der Sporenbildung mässig Null spärlich gut

Phyto-

toxi-

zität

9

617 227

Versuch 4

Bekämpfung des Mehltaus der Gerste

Gerstensämlinge mit 5 oder 6 Blättern (Hordeum vulgare L.f. Shiga Hakkoku Nr.5) wurden in Töpfen in einem Kasten, der mit Lampen versehen war (Plant-Lux, Hersteller Tokyo Shibaura Electric Co.Ltd., Japan), bei 20° C kultiviert. Die Töpfe wurden so neben die Töpfe von befallenen Gerstepflanzen gestellt, dass die Sämlinge die Krankheit übernahmen. Die in der gleichen Weise wie beim Versuch 1 angesetzten fungiziden Lösungen wurden in ausreichender Menge in Abständen von 10 Tagen auf die Sämlinge gesprüht. Nach der dritten Anwendung wurden die Pflanzen in der oben beschriebenen Weise bis zum 10. Tag gepflegt. Um den Grad des Befalls mit der Krankheit festzustellen, wurde die prozentuale Fläche der Läsionen gemäss den amtlichen japanischen Bestimmungen für die Ermittlung der prozentualen Fläche von Mehltauläsionen bei Weizen, Hafer, Gerste und Roggen (erhältlich vom Büro des Ministeriums für Landwirtschaft und Forsten, Japan) ermittelt.

Tabelle 8

Wirkung von Antibiotikum B-98891 gegen den Gerstenmehltau

Versuch 6

Bekämpfung von Rosenmehltau

Für diesen Versuch wurden Rosenpflanzen (Rosa spp.) in Töpfen im Gewächshaus kultiviert. Die Testpflanzen (Spezies: s Super Star und Arlene Francis) wurden in Gruppen von je 3 Töpfen für jede Behandlung verwendet. Die in der gleichen Weise wie beim Versuch 1 angesetzten fungiziden Lösungen wurden in genügenden Mengen in Abständen von 7 Tagen aufgesprüht. Die Pflanzen wurden unter den gleichen Bedingungen gehalten, bis spontaner Befall mit der Krankheit stattfand. Die Zahl der befallenen Blätter an drei Zweigen pro Topf wurden 7 Tage nach der dritten Anwendung untersucht. Der Prozentsatz befallener Blätter im Verhältnis zur Gesamtzahl der untersuchten Blätter wurde berechnet.

15

Tabelle 10

Phyto-toxizität

Test

Konzen

Läsionsfläche, %

präparat tration,

6. Blatt

9. Blatt

ppm

Untersuchungs

Untersuchungs

tag

tag

A

B C

B C

B-98891

15,6

0,4

2,1 0,8

2,3 10,5

31,2

0,3

2,0 1,3

0,3 ' 1,3

62,5

0,1

0,1 0

0,5 0,4

Benlate WP

125

0,3

0,4 0,2

1,3 1,6

Kontrolle

-

8,4

100 Mehltau

68,5 Mehltau

(unbehan

delt)

Untersuchungstag:

Test-

Konzen

Befallene Blätter, °A

0

Präparat tration

Super

Phyto-

Arlene

2(1

(ppm)

Star toxizität

Francis

B-98891

40

5,6

_

14,9

80

3,2

-

6.7

Karathane EM 160

2,6

—

2,2

25

148

52,8

—

59,9

Kontrolle

-

100

88,8

A: 10 Tage nach der ersten Anwendung B: 10 Tage nach der zweiten Anwendung C: 10 Tage nach der dritten Anwendung Die erste Anwendung wurde in der Sechsblattphase vorgenommen.

Versuch 5

Bekämpfung des Mehltaus der Tabakpflanze

In Töpfen kultivierte Tabakpflanzen (Nicotiana tabacum L.f. MC), deren viertes reifes Blatt genügend entfaltet war, wurden in einem Gewächshaus in Gruppen von je 2 Töpfen für diesen Versuch vorbereitet. Um den Befall mit der Krankheit zu begünstigen, wurden Töpfe mit befallenen Pflanzen zur Selbst-infizierung neben die Versuchstöpfe gestellt. Die fungiziden Lösungen wurden in der gleichen Weise wie beim Versuch 1 angesetzt und in zwei unterteilten Dosen jeweils in genügenden Mengen in Abständen von 10 Tagen auf die Testpflanzen gesprüht. Die prozentualen Flächen der Läsion wurden 9 Tage bzw. 15 Tage nach der letzten Anwendung ermittelt.

Tabelle 9

Wirkung von Antibiotikum B-98891 gegen den Tabakmehltau

45

(unbehandelt)

Versuch 7

Bekämpfung des Apfelmehltaus

Apfelsämlinge (Malus pumila Miller var.domestica Schneider f.Rall's Janet) in der Fünf- bis Achtblattphase wurden verwendet. Pathogene Pilze von befallenen Blättern einer Apfelpflanze wurden über die Sämlinge gestäubt, die dann im Gewächshaus gehalten wurden. Nach 2 Tagen wurden die in der gleichen Weise wie beim Versuch 1 angesetzten fungiziden Lösungen in genügender Menge aufgesprüht. Nach der Anwendung wurden die Sämlinge weiter im Gewächshaus kultiviert. Nach 12 Tagen wurde die prozentuale Fläche der Läsion ermittelt. Der Test wurde für jede Gruppe 6-fach durchgeführt.

Tabelle 11

Wirkung von Antibiotikum B-98891 gegen Apfelmehltau Testpräparat

B-98891

Karathane EM

Kontrolle

(unbehandelt)

Konzen

Läsions

Phyto-

tration,

fläche, %

toxizität ppm

12 Tage

40

0,9

-

80

0,6

-

160

0

-

148

0,9

—

-

27,9

-

Test

Konzen

Läsionsfläche, %

Phyto-

Versuch 8

präparat tration,

toxizität

Bekämpfung von Eichenmehltau ppm

Dieser Versuch wurde mit Schösslingen von etwa 10 Jahre

9 Tage

15 Tage

M) alten natürlich gewachsenen Eichenbäumen (Quercus glauca

B-98891

40

11,6

20,4

-

Thunb.) durchgeführt. Die in der gleichen Weise wie beim

80

10,0

13,2

-

Versuch 1 angesetzten fungiziden Lösungen wurden in Nebel

160

6,0

8,5

-

form angewandt. Die alten ausgewachsenen Blätter waren

Polyoxin

160

61,5

90,0

—

bereits stark befallen, so dass Selbstinfizierung der jungen Blät-

AL WP

65 ter an den Schösslingen erwartet wurde. Die Zahl der behandel

Kontrolle

—

95,0

100

ten Blätter betrug 50 pro Gruppe. Die prozentuale Fläche der

(unbehan

Läsion auf den behandelten Blättern wurde 7 Tage nach der delt)

Behandlung ermittelt.

617 227

10

Tabelle 12

Wirkung von Antibiotikum B-98891 gegen Eichenmehltau

Testpräparat Konzen- Läsionsfläche, % Phyto-

tration toxität ppm

7 Tage 14 Tage

B-98891 40 8,3 26,4

80 1,1 1,5

160 0,6 0,5

Karathane EM 148 1,8 3,4 -

Morestan WP 83 7,5 22,1

Kontrolle - 16,7 35,8 (unbehandelt)

Versuch 9

Wirkung gegen einen gegen Schädlingsbekämpfungsmittel resistenten Stamm

Die Blätter einer von Mehltau befallenen Gurkenpflanze (Cucumis sativus L.f.Suyo) wurden leicht über eine einen Monat alte Gurkenpflanze in einem Topf geschlagen, so dass die Pflanze mit Sphaerotheca fuliginea Pollacci infiziert wurde.

Nach einem Tag wurden die in der gleichen Weise wie beim Versuch 1 angesetzten fungiziden Lösungen in genügender Menge auf die Pflanze gesprüht. Nach etwa 14 Tagen wurde das gebildete Pilzwachstum verwendet, um gesunde Gurkenpflanzen zu infizieren. Einen Tag nach der Infizierung wurde die gleiche fungizide Lösung aufgesprüht und nach 7 Tagen die prozentuale Fläche der Läsion ermittelt.

Tabelle 13

Wirkung von Antibiotikum B-98891 gegen Mehltau, der gegen Bekämpfungsmittel resistent ist.

Läsionsfläche, %

Benlate WP

Läsionen nach Anwendung von Benlate WP (250 ppm) 78,3

Läsionen nach Anwendung von B-98891 0,8 (80 ppm)

Kontrolle (unbehandelt) 5,0

B-98891 Kontrolle

(unbehandelt)

21.7

18,3

15.8

100

66,7 76,7

Die in der gleichen Weise wie beim Versuch 1 angesetzten fungiziden Lösungen wurden in ausreichender Menge in Abständen von 7 Tagen auf Erdbeerpflanzen (var.Hogyoku), die im Gewächshaus kultiviert wurden, im Blütenstadium gesprüht. Die prozentuale Fläche der Läsionen wurde 7 Tage nach der zweiten Anwendung ermittelt. In der Gruppe, die mit dem das Antibiotikum B-98891 enthaltenden Präparat in einer Konzentration von 20 ppm behandelt wurde, wurde eine bemerkenswerte Wirkung im Vergleich zur Kontrollgruppe festgestellt. Die Wirkung war stärker als bei Anwendung von Morestan WP in einer Konzentration von 80 ppm und von Polyoxine AL WP in einer Konzentration von 100 ppm auf die Testpflanzen in der gleichen Weise.

Es wurde ferner festgestellt, dass das oben erwähnte Präparat ausgezeichnete Wirkungen gegen den Mehltau der Gartenerbse, Weintraube und anderer Pflanzen zeigt.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert. In diesen Beispielen beziehen sich die Teile auf das Gewicht, falls nicht anders angegeben. Gewichtsteile verhalten sich zu Raumteilen wie Gramm zu Kubikzentimeter.

Beispiel 1

In einen 31-Sakaguchi-Kolben wurden 500 ml eines Mediums gefüllt, das 1,0% Glucose, 0,3 % Hefeextrakt und

0,5 % Bacto-tryptone (pankreatisch digeriertes Casein, das als Nährstoff in der Mikrobiologie verwendet wird, Hersteller Difco Laboratories, USA) (pH 7) enthielt, worauf das Medium sterilisiert wurde. Der Kolben wurde dann mit einer Impfnadel-5 menge von Streptomyces rimofaciens Nr. B-98891 (IFO-13592) aus einer Schrägkultur geimpft und aud einer hin- und hergehenden Schüttelvorrichtung (120 Zyklen/Min.) 48 Stunden bei 28° C bebrütet.

Getrennt hiervon wurden in einen 501-Tank aus nichtro-iii Stendern Stahl 301 eines Mediums gegeben, das 3,0% Glucose, 2,2% Sojabohnenmehl, 0,3% Polypepton, 0,4% gefälltes Calciumcarbonat und 0,05% eines Schaumverhütungsmittels («Antifroth F 102», Hersteller Daiichi Kogyo Seiyaku K.K., Japan) enthielt. Nach Sterilisation wurde das Medium mit der i ? gesamten Menge (500 ml) der vorher angesetzten Kultur aus dem Sakaguchi-Kolben geimpft.

Submerskultur unter Belüftung mit 301 Luft/Min. wurde bei 100 UpM und 28° C 48 Stunden durchgeführt, wobei eine Impfkultur erhalten wurde.

2(i In einen 2001-Tank aus nichtrostendem Stahl wurden 100 1 eines Mediums gegeben, das die gleiche Zusammensetzung wie das bei der vorstehend genannten Tankkultur verwendete Medium hatte. Nach der Sterilisation wurden 10 1 der vorstehend genannten Impfkultur zugesetzt. Dann wurde die Sub-25 merskultur unter Belüftung mit 501/Min. bei 100 UpM und 28° C 114 Stunden durchgeführt. j

Zu 80 1 des in dieser Weise erhaltenen Fermentationsmediums wurden 1,6 kg Filterhilfsmittel («Hyflo-supercel», Hersteller Johnes-Manville, USA) gegeben, worauf filtriert wurde. 30 Hierbei wurden 60 1 Filtrat erhalten. Das erhaltene Filtrat war in einer Konzentration, die 32-facher Verdünnung entsprach, gegen Erysiphe graminis wirksam. Dieser Versuch wurde in der oben beschriebenen Weise durchgeführt.

Das in der beschriebenen Weise erhaltene Filtrat wurde auf " pH 8 eingestellt und durch eine Säule gegeben, die mit 7 1 Ionenaustauschharz «Amberlite IRC-50» (Hersteller Rohm & Haas Co., U.S.A.) gefüllt war. Die Säule wurde mit 40 1 Wasser und dann mit 40 10,5 %igem wässrigem Ammoniak gewaschen. Dann wurde die aktive Komponente mit 4012%igem wässri-40 gern Ammoniak eluiert. Das erhaltene Eulat wurde durch eine Säule geleitet, die mit 3 1 chromatographischer Aktivkohle (hergestellt von der Anmelderin) gefüllt war. Die Säule wurde mit 20 1 Wasser und dann mit 2015 %igem Aceton gewaschen. Die aktive Komponente wurde mit 15 130%igem Aceton und 15 1 45 50%igem Aceton eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden zusa-mengegossen und eingeengt. Nach Zusatz von 0,51 Methanol wurden 38 g eines braunen rohen Pulvers erhalten.

Das so erhaltene rohe Pulver hemmte vollständig das Wachstum von Erysiphe graminis in einer Konzentration von 25 so bis 50 ppm. Dieser Versuch wurde in der oben beschriebenen Weise durchgeführt. Das rohe Pulver wurde in Wasser gelöst und die wässrige Lösung durch eine Säule geleitet, die mit 351 Ionenaustauschharz «Amberlite CG-50» gefüllt war. Die Säule wurde mit 2,51 Wasser und dann mit 1,510,5%igem wässrigem 55 Ammoniak gewaschen. Die aktive Komponente wurde dann mit 1,5 1 Pyridin-Essigsäure-Wasser-Puffer (2:1:97) und dann mit 1,5 1 Pyridin-Essigsäure-Wasser-Puffer (4:2:94) eluiert. Das erhaltene Eluat wurde eingeengt und Methanol zum Konzentrat gegeben. Hierbei wurden 16 g B-98891-Acetat als farbloses 6o Pulver erhalten.

Beispiel 2

In einem 2001-Tank aus nichtrostendem Stahl wurden 1001 f,5 eines Mediums (pH 7) hergestellt, das 3,0% Glucose, 2,2% Sojabohnenmehl, 0,3% Polypepton, 0,4% gefälltes Calciumcarbonat und 0,05 % Schaumverhütungsmittel («Antifroth F102», Hersteller Daiichi Kogyo Seiyaku, K.K., Japan) enthielt. Nach

11

617 227

Sterilisation wurde das Medium mit der gesamten Menge einer Kultur geimpft, die auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise in einem Sakaguchi-Kolben hergestellt worden war. Die Submers-kultur wurde unter Belüftung mit 50 1 Luft/Minute und bei 100 UpM 48 Stunden bei 28° C durchgeführt wobei eine Impfkultur 5 erhalten wurde.

In einem 2000 1-Tank aus nichtrostendem Stahl wurden 1000 1 eines Mediums (pH 7) hergestellt, das 5,0% Glucose, 3,5% Sojabohnenmehl, 1,0% «Pharmamedia» (von Baumwollsaat erhaltener Proteinnährstoff, der in der Mikrobiologie ver- m wendet wird, Hersteller Trader's Oil Mill Company, USA), 0,5 % NaCl und 0,5 % gefälltes Calciumcarbonat enthielt. Nach der Sterilisation wurden 100 1 der vorstehend beschriebenen Impfkultur zugesetzt, worauf die Submerskultur unter Belüftung mit 500 1 Luft/Min. bei 100 UpM 114 Stunden bei 28° C 15 durchgeführt wurde.

Das in dieser Weise erhaltene Fermentationsmedium wurde auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise behandelt, wobei 7501 Filtrat erhalten wurden. Aus diesem Filtrat wurden 225 g eines rohen Pulvers erhalten. 211

Dieses rohe Pulver wurde in Wasser gelöst und die wässrige Lösung durch eine Säule geleitet, die mit 5 1 Ionenaustauschharz «Amberlite CG-50» gefüllt war. Die Säule wurde mit 25 1 Wasser und dann mit 25 10,5%igem wässrigem Ammoniak gewaschen und anschliessend mit 17 11 %igem wässrigem 25 Ammoniak eluiert. Das erhaltene Eluat wurde durch eine Säule von 10 1 chromatographischer Aktivkohle geleitet, die mit 2%igem wässrigem Ammoniak vorbehandelt worden war. Die Säule wurde mit 50 12%igem wässrigem Ammomiak und dann mit 5015 %igem Aceton-2 %igem wässrigem Ammoniak und mi abschliessend mit 50 15 %igem Aceton gewaschen. Dann wurde mit 80 120%igem Aceton eluiert. Das erhaltene Eluat wurde eingeengt. Durch Zusatz von Methanol zum Konzentrat wurde das freie Antibiotikum B-98891 als farbloses Pulver erhalten (150 g). «

Beispiel 3

Aus 700 1 eines filtrierten Fermentationsmediums, das durch Kultivieren und Filtration auf die in Beispiel 2 beschriebene Weise hergestellt worden war, wurde ein rohes Pulver erhalten. Das rohe Pulver wurde in Wasser gelöst und die wässrige Lösung mit dem Ionenaustauschharz «Amberlite CG-50» gereinigt. Das Produkt wurde anschliessend durch eine Säule von 5 1 chromatographischer Aktivkohle geleitet. Die Säule wurde mit 25 1 Wasser und dann mit 25 15 %igem Aceton gewaschen. Die aktive Substanz wurde dann mit 35 120%igem Aceton-0,5 %iger Ameisensäure eluiert. Das erhaltene Eluat wurde eingeengt. Durch Zusatz von Methanol zum Konzentrat wurde B-98891-Formiat als farbloses Pulver (115 g) erhalten. Dieses Formiat hatte die folgenden Kennzahlen:

Schmelzpunkt: 228° C (Zers.)

[«]£ 4- 88,4° ± 10° (c = 0,5 in Wasser)

+ 66,9° ± 10° (c = 0,5 in 0,In HCl)

UVXmax:nm(E}c%

pH 7 271(142)

0,ln-NaC)H271 (139)

0,ln-HCl 280 (210)

Elementaranalyse :

C40,50 ± 1,5; H 5,77 ± 0,5 ;N 18,55 ± 1,0 Das entsprechende Hydrochlorid wurde durch Elution mit 20% Aceton-0,05n-Salzsäure an Stelle von 20% Aceton-0,5 %

Ameisensäure erhalten. Dieses Hydrochlorid hatte die folgenden Kennzahlen:

Schmelzpunkt: 224° C (Zers.)

[ex] ^ + 81,3° ± 10° (c = 0,5 in Wasser)

+ 63,3° ± 10° (c = 0,5 in 0,1 n-HCl)

UV?w: nm (e}%

pH 7 272 (142)

0,ln-HaOH 272 (147)

0,ln-HCl 280 (213)

Elementaranalyse:

C 38,81 ± 1,5; H 5,75 ± 0,5 ;N 18,25 ± 1,0.

Diese Salze hatten im wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie das freie B-98891.

Beispiel 4

Ein netzbares Pulver wurde durch Mischen von 10 Teilen Antibiotikum B-98891,2 Teilen Natriumligninsulfonat, 3 Teilen Polyoxyäthylen-alkylaryläther und 85 Teilen Ton hergestellt. Dieses Pulver wurde mit Wasser 500- bis 1000-fach verdünnt und die Verdünnung in einer Aufwandmenge von 100 bis 200 1/10 Ar gleichmässig auf landwirtschaftliche Pflanzen oder Gartenbaupflanzen gespritzt.

Beispiel 5

Ein Stäubemittel wurde durch Mischen von 0,5 Teilen Antibiotikum B-98891 und 99,5 Teilen Ton hergestellt. Dieses Produkt wird in einer Aufwandmenge von 3 bis 5 kg/10 Ar direkt angewandt.

Beispiel 6

Ein wasserlösliches Präparat wurde durch Mischen von 10 Teilen Antibiotikum B-98891,5 Teilen Polyoxyäthylenalkyl-aryläther und 85 Teilen Lactose unter Rühren hergestellt. Das Präparat wurde mit Wasser auf eine geeignete Konzentration verdünnt und in einer Aufwandmenge von 100 1/10 Ar gleichmässig auf landwirtschaftliche Pflanzen und Gartenbaupflanzen gespritzt.

Beispiel 7

Eine wässrige Lösung wurde durch Mischen von 50 Teilen Antibiotikum B-98891, 5 Teilen Methanol, 5 Teilen Aminstea-rat und 40 Teilen Wasser hergestellt. Die Lösung wurde auf die in Beispiel 4 beschriebene Weise mit Wasser verdünnt und auf die Pflanzen gesprüht.

Beispiel 8

Ein Granulat wurde durch Mischen von 0,5 Teilen Antibiotikum B-98891, 5 Teilen Gummiarabikum, 30 Teilen Bentonit und 64,5 Teilen Talkum und Granulieren des erhaltenen Gemisches hergestellt. Das Produkt wird in einer Aufwandmenge von 3 bis 5 kg/10 Ar direkt angewandt.

Ebenso wie das bei den vorstehend beschriebenen Versuchen verwendete Produkt zeigten die in den vorstehenden Ausführungsbeispielen beschriebenen Präparate hervorragende Wirkungen als Schädlingsbekämpfungsmittel gegen Mehltau der Gerste, Rosenmehltau und Tabakmehltau, den gegen Benlate resistenten Gurkenmehltau, die Braunfäule der Tomate und andere Pflanzenkrankheiten.

1 Blatt Zeichnungen

Claims (10)

617 227

1. Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums B-98891, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Mirkoorganismus, der das Antibiotikum B-98891 bildet und zur Gattung Streptomyces gehört, in einem Kulturmedium, das eine assimilierbare Kohlenstoffquelle und eine verwertbare Stickstoffquelle enthält, unter aeroben Bedingungen kultiviert, bjs das Antibiotikum im Fermentationsmedium angehäuft ist, und das Antibiotikum aus dem Fermentationsmedium isoliert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man einen zu Streptomyces rimofaciens gehörenden Mikroorganismus verwendet.

2

PATENTANSPRÜCHE

3. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als Mikroorganismus Streptomyces rimofaciens Nr. B-98891, IFO 13592, verwendet.

4. Verfahren zur Herstellung von Salzen des neuen Antibiotikums B-98891, dadurch gekennzeichnet, dass man nach dem Verfahren gemäss Anspruch 1 das besagte Antibiotikum herstellt und letzteres durch Umsetzung mit einer anorganischen oder organischen Säure in das entsprechende Salz überführt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man das Hydrochlorid, Formiat oder Acetat von Antibiotikum B-98891 herstellt.

6. Verwendung des neuen Antibiotikums B-98891 als Komponente in einem zur Bekämpfung von Pflanzenkrankheiten dienenden Pflanzenschutzmittel.

7. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Pflanzenschutzmittel rohes Antibiotikum B-98891 in einer Reinheit von mehr als 50% enthält.

8. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Pflanzenschutzmittel in flüssiger Form ist und den Wirkstoff in einer Menge von 1 bis 70 Gew.-% enthält.

9. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Pflanzenschutzmittel in Pulverform ist und den Wirkstoff in einer Menge von 0,01 bis 10 Gew.- % enthält.

10. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Pflanzenschutzmittel in Form eines Öls ist und den Wirkstoff in einer Menge von 0,01 bis 10 Gew.-% enthält.