Die Erfindung betrifft das neue wasserunlösliche Antibiotikum Lysolipin, das in Form seiner Komponenten X und I oder von Mischungen dieser Komponenten vorliegt, und-De- rivate des Antibiotikums sowie Präparate, welche diese Verbindungen enthalten und Verfahren zur Herstellung dieser Stoffe.
Das Antibiotikum Lysolipin entsteht bei der Züchtung des Stammes Streptomyces violaceoniger (Waksman et Curtis) Waksman et Henrici Tü 96, der unter dieser Bezeichnung im Institut für Mikrobiologie der Universität Tübingen (Deutschland) aufbewahrt wird. Der Stamm ist unter der Bezeichnung NRRL 8097 beim Nothern Regional Research Lab., US.-Department of Agriculture, Peoria, Illinois, hinterlegt.
Der Stamm S. violaceoniger Tü 96 bildet noch ein weiteres Antibiotikum, Ropalocidin, das in der Dissertation von Dietmar Mahl Ropalicidin ein antifungisches Antibiotikum aus Streptomyces violaceoniger , Stuttgart, 1971, beschrieben ist.
Der Stamm S. violaceoniger Tü 96 bildet ein anfangs weis ses, später aschgraues Luftmycel. Die Sporenketten sind monopodial verzweigt und haben die Form von engen, regelmäs sigen Schrauben, die selten mehr als drei Windungen umfassen. Die Sporen sind ellipsoid, etwa 0,9 mm breit und 1,2 nm lang und haben eine glatte Oberfläche. Beim Wachstum auf peptonhaltigen Nährböden (Pepton-Eisenagar) wird auch nach mehrtätiger Inkubation keine melanoide Verfärbung beobachtet. Der Stamm zeigt also keine Chromogenität, da er keine Tyronase zu bilden vermag.
Das Antibiotikum Lysolipin wird gewonnen, indem man den Stamm S. violaceoniger Tü 96 oder eine Lysolipin bildende Mutante dieses Stammes in einer wässerigen, eine Kohlenstoff- und Stickstoffquelle sowie anorganische Salze enthaltenden Nährlösung aerob züchtet, bis die Nährlösung eine wesentliche antibiotische Wirkung aufweist, und das Antibiotikum Lysolipin hierauf aus dem Kulturfiltrat isoliert.
Das Antibiotikum bildende Mutanten können zum Beispiel unter der Einwirkung von Ultraviolett- oder Röntgenstrahlen oder von Stickstoff-Senfölen gewonnen werden.
Als Kohlenstoffquelle sind beispielsweise zu nennen: assimilierbare Kohlenhydrate, zum Beispiel Glucose, Saccharose, Lactose, Mannit, Stärke, Glycerin. Als stickstoffhaltige Nährstoffe seien genannt: Aminosäuren, Peptide und Proteine sowie deren Abbauprodukte wie Pepton oder Trypton, ferner Fleischextrakte, wasserlösliche Anteile von Getreidekörnern, wie Mais und Weizen, von Destillationsrückständen der Alkoholherstellung, von Hefe, Bohnen, insbesondere der Sojapflanze, von Samen, beispielsweise der Baumwollpflanze usw., aber auch Ammoniumsalze und Nitrage. Von anderen anorganischen Salzen kann die Nährlösung beispielsweise Chloride, Carbonate, Sulfate, Phosphate von Alkali- oder Erdalkalimetallen, von Magnesium, Eisen, Zink und Mangan ent halten.
Die Züchtung erfolgt aerob, also beispielsweise in ruhender Oberflächenkultur oder vorzugsweise submers unter Schütteln oder Rühren mit Luft oder Sauerstoff in Schüttelkolben oder den bekannten Fermentern. Als Temperatur eignet sich eine solche zwischen 18 und 40 "C, vorzugsweise etwa 27 "C. Eine wesentliche antibiotische Wirkung zeigt die Nährlösung dabei im allgemeinen nach 3 bis 7 Tagen. Vorzugsweise kultiviert man in mehreren Stufen, das heisst, man stellt zunächst eine oder mehrere Vorkulturen in flüssigem Nährmedium her, die dann in das eigentliche Produktionsmedium, zum Beispiel im Verhältnis 1:20, überimpft werden.
Die Vorkultur erhält man beispielsweise, indem man ein durch etwa 14tägiges Wachstum auf einem Nährboden erhaltenes versportes Mycel in ein flüssiges Medium überimpft und 72 Stunden wachsen lässt.
Das Antibiotikum ist im Kulturfiltrat enthalten. Die Isolierung des Antibiotikums aus dem Kulturfiltrat erfolgt nach an sich bekannten Methoden unter Berücksichtigung der chemischen, physikalischen und biologischen, insbesondere der li- pophilen Eigenschaften des Antibiotikums. Zum Testieren der Antibiotikawirkung (das heisst des Vorhandenseins des Antibiotikums) eignet sich als Testorganismus besonders gut Bacillus subtilis.
Aus dem Kulturfiltrat kann das Antibiotikum mit einem mit Wasser nicht mischbaren lipophilen Lösungsmittel, zum Beispiel mit Essigester, Kohlenwasserstoffen, wie Cyclohe xan, Benzol, oder mit halogenierten Kohlenwasserstoffen, zum Beispiel Methylenchlorid, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Tetrachloräthylen, extrahiert werden.
Zur Reinigung des nach Abdampfen des Lösungsmittels erhaltenen Rohproduktes kann man sich zum Beispiel der Extraktion, der Fällung, der Verteilung zwischen nicht-mischbaren Lösungsmittelphasen oder der Adsorption, vor allem Chromatographie bedienen. Ein grosser Teil der lipophileren Begleitstoffe kann durch Extraktion des Rohproduktes mit Petroläther entfernt werden. Man kann auch das Rohprodukt lösen, zum Beispiel in Methanol, und durch Adsorptionsmittel wie Aktivkohle, Kieselgel, Magnesiumsilikat, Aluminium- oxid oder Mischungen davon oder Adsorptionsharze, zum Beispiel vernetzte Dextrane wie Sephadex (der Firma Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala) von Begleitstoffen abtrennen. Beispielsweise kann das Rohprodukt durch wiederholte Säulenchromatographie unter Verwendung von Kieselgel, zweckmässig mit geringen Zusätzen von Aktivkohle, gereinigt werden.
Das Antibiotikum wird vorzugsweise nach dem Gradientenverfahren mit Mischungen von Chloroform oder Tetrakohlenstoff und Methanol eluiert, wobei der prozentuale Gehalt des schwächer polaren Lösungsmittels stufenweise gesteigert wird.
Die oben erwähnte Verteilung zwischen nicht-mischbaren Lösungsmittelphasen kann auch als Gegenstromverteilung mit einer Craig-Apparatur vorgenommen werden. Als Lösungsmittelsystem dient beispielsweise eine Mischung von Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Methanol und Wasser
Zur Gewinnung der einzelnen einheitlichen Komponenten des Antibiotikums kann ihre Trennung und Isolierung zum Beispiel nach der Methode der präparativen Dünnschichtchromatographie unter den für den analytischen Nachweis beschriebenen Bedingungen erfolgen. Vorteilhafter ist die Trennung mittels Säulenchromatographie, wobei als Adsorptionsmittel zum Beispiel Kieselgel mit einem Gehalt von 1 bis 5 Prozent Aktivkohle benutzt und die Elution vorzugsweise nach dem Gradientenverfahren mit einer Mischung von Chloroform und Methanol bewirkt wird.
Die Steigerung der Konzentration des weniger polaren Lösungsmittels erfolgt zweckmässig in kleineren prozentualen Abstufungen, zum Beispiel 5 bis 20% Chloroform, oder man arbeitet nach der kontinuierlichen Gradientenelutionsmethode. Das Reinigungsverfahren kann gegebenenfalls wiederholt werden.
Im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagelplatten der Firma Merck (Kieselgel 60, F 254) zeigen die Komponenten folgende Rf-Werte: in Chloroform-Methanol (9:1): X = 0,58; I = 0,81; in Benzol-Methanol (9:1): X = 0,26; 1 = 0,30; in Chloroform-Aceton (5:5): X = 0,40; I = 0,53; in Benzol-Aceton (5:5): X = 0,47; I = 0,74.
Für Lysolipin I wurden im Reihenverdünnungstest folgende minimale Hemmkonzentrationen (MIC) gefunden:
Mikroorganismen MIC in y/ml
Lysolipin I
Eubacteriales (gram-negativ)
Achromobacter geminiani (27 ) > 0,0025 < 0,005
Salmonella minnesota (37 ) > 0,5 Mikroorganismen MIC in y/mi
Lysolipin I
Salmonella typhimurium (37 ) > 100
Proteus vulgaris (37 ) > 0,001 < 0,0025
Eubacteriales (gram-positiv)
Arthrobacter aurescens (27 ) > 0,001 < 0,0025
Arthrobacter crystallopoietes (27 ) > 0,001 < 0,0025
Arthrobacter simplex (27 ) > 0,001 <
0,0025
Bacillus brevis (37 ) > 0,025 < 0,05
Bacillus megaterium (37 ) > 0,001 < 0,0025
Bacillus subtilis (37 ) > 0,001 < 0,0025
Brevibacterium flavum (27 ) > 0,001 < 0,0025
Clostridium pasteurianum (30 ) > 0,001 < 0,0025
Chromobacterium violaceum (27 ) > 0,1 < 0,5
Corynebacterium poinsettiae (27 ) > 0,001 < 0,0025
Corynebacterium rathayi (27 ) > 0,001 < 0,0025
Micrococcus luteus (27 ) > 0,001 < 0,0025
Micrococcus roseus (27 ) > 0,001 < 0,0025
Sarcina lutea (27") > 0,001 < 0,0025
Staphylococcus aureus (37 ) > 0,001 <
0,0025
Pseudomonadales
Pseudomonas fluorescens (27 ) > 0,001 < 0,0025
Pseudomonas saccharophila (27 ) > 0,001 < 0,0025
Für Lysolipin X liegt die MIC um den Faktor 10-50 höher.
Die Komponente I des Lysolipins weist folgende chemi sche und physikalische Eigenschaften auf:
Es ist eine tiefgelbe kristalline Substanz, die in Wasser und wässerigen Säuren und Basen praktisch unlöslich ist; in
Niederalkanolen wie Methanol, Athanol, n-Propanol, sowie Äther und Petroläther ist sie teilweise löslich. In Aceton, Di methylformamid, Dimethylsulfoxid, Essigester, Kohlenwasser stoffen, zum Beispiel Cyclohexan, Benzol, und halogenierten
Kohlenwasserstoffen, wie oben erwähnt, ist sie gut löslich.
Lysolipin I, aus Aceton-Äther kristallisiert, schmilzt bei 260-262 unter Zersetzung. [a]20 = 50,20 (Chloroform). Bei
Dünnschichtchromatographie auf Silicagel im System Chloro form-Methanol (19:1) ist Rf = 0,6.
Die Elementaranalyse ergibt folgende Werte: C2gH24CINO1 (597,95):
Ber. C 58,25 H 4,05 Cl 5,93 N 2,34 3 OCH3 15,57%
Gef. C 58,36 H 4,22 Cl 6,03 N 2,48 OCH3 15,43%
C 58,30 H 4,27 N 2,38 (OCH3: Bestimmung nach Zeisel)
Mol.-Gew. durch Dampfdruckisometrie in Äthylacetat: gef. 536. Mikrotitration mit 0,1 N Tetramethylammoniumhy droxid in Methylcellosolve-Wasser (8:2): gef. pK1,,,9,72, Äq.-G. 545 Titration mit 0,1 N HCI: keine Stufe (N-Atom dem nach nicht basisch).
Fig. 1 zeigt das IR-Spektrum von Lysolipin I in KBr,
Fig. 2 das UV-Spektrum in Äthanol (960/zig). Fig. 3 zeigt das
NMR-Spektrum in CDCI3 (100 MHz); durch Austausch mit
D2O verschwinden nur die beiden Signale im Offset-Gebiet sowie das breite Signal bei etwa 2,7 ppm. Fig. 4 zeigt das 3C-NMR-Spektrum In CDC13 und wenig Dimethylsulfoxid mit vollständiger Rauchentkopplung, Fig. 5 das i3ÖNMR
Spektrum, Off-Resonance. Tabelle 1 gibt eine Zusammenstel lung der Maxima von Fig. 4 wieder. Tabelle 2 zeigt das Mas senspektrum von Lysolipin I.
Zum NMR-Spektrum (Fig. 3) sind folgende Ergänzungen anzubringen:
1. Spinentkopplung
Einstrahlung bei 4,43: das Dublett bei 5,02 ppm wird zu einem Singlett. Einstrahlung bei 5,02 ppm: die Dublette bei 4,43 und 4,68 ppm werden gleichzeitig zu Singuletten.
Das Signal bei 5,02 ppm entspricht im Integral 2 Protonen und kann als Überlagerung eines Dubletts und eines breiten Multipletts aufgefasst werden. Das Dublett steht zu dem bei 4,43 ppm in Wechselwirkung, das Multiplett zum Dublett bei 4,68 ppm.
2. Die exakten Kopplungskonstanten wurden in einem vierfach gedehnten Spektrum ausgemessen und ergaben:
4,43 (d): 3,0 Hz., 4,68 (d): 4,1 Hz., 5,02 (d): 3,0 Hz., 5,40 (d): 5,7 Hz., 5,62 (d): 5,7 Hz. Die letzten beiden Signale bilden zusammen ein AB-Spektrum, ebenso die beiden Dubletten bei 7,36 und 7,90 ppm (JAB = 8 Hz., o-ständige Wasserstoffatome an einem aromatischen Ring).
Lysolipin I weist mindestens zwei acylierbare Hydroxylgruppen auf. Durch längere Acetylierung (2 Wochen bei Raumtemperatur) erhält man das Di-O-acetyl-lysolipin I, das aus Aceton-Wasser kristallisiert wurde; blassgelbe Kristallprismen vom F. 216-224". Fig. 6 zeigt das NMR-Spektrum in CDCI3 (100 MH). Die verwendete Substanzprobe enthielt noch Äthylacetat. Dieses verursacht folgende Signale: das Triplett bei 1,2 ppm; ein teilweise von OCH3-Signalen überdecktes Quartett bei etwa 3,5 ppm und einen Teil des Signals bei etwa 2,35 ppm. Tabelle 3 gibt das Massenspektrum von Di-O-acetyl-lysolipin I wieder.
Wenn die Acylierung nur wie üblich über Nacht durchgeführt wird, erhält man ein Gemisch zweier Produkte, die durch Kristallisation nicht getrennt werden konnten, offenbar ein Mono- und das Diacetat. Im Massenspektrum dieses Gemisches erscheinen die Signale bei 683 und 681 Masseneinheiten (M+ des Diacetats) mit wesentlich geringerer Intensität auf.
Durch Röntgenspektrometrie wurde für die Komponente I von Lysolipin folgende Strukturformel ermittelt:
EMI2.1
Auch hat sich erwiesen, dass das oben genannte durch längere Acetylierung erhaltene Acetylderivat vom Smp.
216-224 (vergleiche auch Beispiel 4) kein Di-O-acetyl-Lysolipin I, sondern das Tri-O-acetyl-Lysolipin I darstellt.
Lysolipin X wurde als farbloses amorphes Pulver erhalten. Es bildet Lysolipin I beim Erhitzen oder bei Bestrahlung mit UV-Licht. Es ist sehr instabil; beim Aufbewahren an der Luft, insbesondere bei Raumtemperatur oder höherer Temperatur, geht es allmählich in Lysolipin I über. Eine teilweise Trennung von Lysolipin X und I liess sich durch Craig-Verteilung im System Tetrachlorkohlenstoff-Chloroform-Methanol Wasser (3,42:2,28:4:1) erreichen. Das so erhaltene fast farblose amorphe Pulver, Lysolipin X, konnte nicht kristallisiert werden. Im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel im Sy stem Chloroform-Methanol (39:1) ist Rf = 0,22 (Rf von Lysolipin list = 0,39). Fig. 7 zeigt das NMR-Spektrum von Lysolipin X in CDCI3 (100 MHz). Die Signale bei 0,9 und 1,3 ppm sind wahrscheinlich einer fettartigen Verunreinigung zuzuschreiben.
Die meisten Signale im Gebiet von 3 bis 8 ppm sind aber sehr ähnlich denen des Lysolipins I und weisen auf die nahe Verwandtschaft der beiden Verbindungen hin.
Fig. 8 zeigt das UV-Spektrum von Lysolipin X in Chloroform.
Lysolipin und seine Derivate weisen neben ihrer antibakteriellen Wirkung gegen Bakterien auch eine geringe Wirkung gegenüber hefeartigen Pilzen wie Candida albicans, Candida lipolytica und Saccharomyces cerevisiae auf. Es ist sowohl gegen wachsende und ruhende mikrobielle Zellen wie auch gegen deren Spheroplasten wirksam. Seine Wirkung beruht wahrscheinlich auf einer Hemmung der Zellwandsynthese. Die Wirkung wird durch einen Überschuss an Lipiden, zum Beispiel Sphingolipiden, Phosphoglyceriden, Bakterienzellwandlipiden, teilweise aufgehoben.
Lysolipin und seine Derivate können allein oder in Kombination mit anderen Zellwandsynthese hemmenden Antibiotika wie Penicillinen, Cephalosporinen, Cycloserin, zur Bekämpfung von Infektionen, die durch Bakterien wie die genannten hervorgerufen werden, ferner als Futtermittelzusatz, zur Konservierung von Nahrungsmitteln und als Desinfektionsmittel verwendet werden. Mit einigen Antibiotika, zum Beispiel mit Penicillinen, wurde eine synergistische Wirkung beobachtet.
Zwecks Herstellung pharmazeutischer Präparate wird das Antibiotikum mit einem für die topicale, enterale oder parenterale Applikation geeigneten anorganischen oder organischen Trägermaterial vermischt. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Betracht, die mit der neuen Verbindung nicht reagieren, wie zum Beispiel Gelatine, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat, pflanzliche Öle, Benzylalkohole, oder andere Arzneimittelträger. Die pharmazeutischen Präparate können zum Beispiel als Tabletten, Dragees, Pulver, Suppositorien, oder in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Cremen oder Salben vorliegen. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und/oder enthalten Hilfsstoffe wie Konservierungsmittel, Stabilisierungs-, Netz- oder Emulgiermittel.
Sie können auch noch andere therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten. Auch die Futtermittelzusätze, Konservierungsund Desinfektionsmittel können mit geeigneten Trägerstoffen, wie bekannt, vermischt werden.
Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen beschrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.
Die Figuren stellen dar:
Fig. 1: IR-Spektrum von Lysolipin I in KBr.
Fig. 2: UV.-Spektrum von Lysolipin I in Feinsprit.
Fig. 3: NMR.-Spektrum von Lysolipin I in CDCI3.
Fig. 4: l3C-NMR.-Spektrum von Lysolipin I mit vollständiger Rauschentkopplung.
Fig. 5: l3C-NMR.-Spektrum von Lysolipin I, off-resonance.
Fig. 6: NMR.-Spektrum von Di-O-acetyllysolipin 1.
Fig. 7: NMR.-Spektrum von Lysolipin X, nicht völlig rein.
Fig. 8: UV.-Spektrum von Lysolipin X in CHCl3.
Die Tabellen stellen dar:
Tab. 1: Massenspektrum von Lysolipin I.
Tab. 2: 13C-NMR.-Spektrum von Lysolipin I.
Tab. 3: Massenspektrum von Di-O-acetyllysolipin I.
Beispiel 1
Eine Lyoampulle mit 5 ml Sporensuspension von S. violaceoniger Tü 96 wird mit 5 ml 0,2-m. Phosphatpuffer pH 7 aufgeschwemmt. 3 Erlenmeyerkolben mit 1 Schikane (Einbuchtung) mit je 100 ml Nährlösung, welche pro Liter Leitungswasser 4 g Hefeextrakt, 10 g Malzextrakt und 4 g Glucose enthält und deren pH vor der Sterilisation mit l-n. Natronlauge auf 7,3 eingestellt wurde, werden mit je 2 ml der Streptomyces-Suspension beimpft und 24 Stunden auf einer rotierenden Schüttelmaschine mit 250 upm bei 27 inkubiert. Je 25 ml der so gewonnenen Kultur werden in 6 2-Liter-Erlenmeyerkolben mit 4 Schikanen und 500 ml der obigen Nährlösung geimpft. Die Kolben werden anschliessend bei 27 auf einer rotierenden Schüttelmaschine mit 120 upm 48 Stunden inkubiert.
0,75 Liter der Kultur aus den 2-Liter-Kolben werden in einen 50-Liter-Fermenter, der 30 Liter der obigen Nährlösung enthält, übertragen und 24 Stunden bei 27 inkubiert.
Dann werden 15 Liter der Kultur in einen Fermenter mit 300 Liter der obigen Nährlösung übertragen. Dieser Fermenter weist ein Totalvolumen von 500 Liter auf und besitzt einen 6blättrigen Turbinenrührer und 4 Schikanen (Prallbleche baffles ). Die Züchtungsbedingungen im Fermenter sind: Druck 0,5 atü, Rührgeschwindigkeit 450 upm, Temperatur 27 "C, Luftdurchsatz 1 Liter V/VMin. Die Bedingungen entsprechen einer in Sulfitlösung gemessenen Sauerstoffabsorptionsrate von 150 mM O2/1/h. Die optimale Bildung des Antibiotikums Lysolipin erfolgt nach etwa 100 Stunden Inkubation. Die Kulturlösung weist dann ein pH von 7,5 auf. Sie zeigt im Agradiffusionstest mit Bacillus subtilis im einen Hemmhof von 14-15 mm unter Verwendung von Whatmann A Filterrondellen mit einem Durchmesser von 6 mm.
Beispiel 2
600 Liter der nach Beispiel 1 erhaltenen Kulturlösung werden unter Zugabe von 2% Filterhilfsmittel Dicalite (Diatomeenerde) filtriert. 560 Liter Kulturfiltrat werden mit Natronlauge auf pH 9,0 gestellt und auf einem kontinuierlichen Extraktor zweimal mit Chloroform in Verhältnis 2:1 ex extrahiert Das inaktive wässrige Raffinat wird verworfen. 600 Liter Chloroformphase werden im Vakuum konzentriert. Es resultieren 290 g Trockenrückstand. Dieser wird mit 2 Liter Petroläther digeriert. Der inaktive Petrolätherextrakt wird verworfen und der unlösliche Anteil im Vakuum getrocknet.
Es bleibt ein gelbbrauner, halbfester Rückstand zurück (46 g).
Beispiel 3
2,8 g des nach Beispiel 2 erhaltenen Rohproduktes werden an einer Säule von Sephadex LH-20 (alkyliertes vernetz tes Dextran), Länge 73 cm, Durchmesser 3 cm, mit Chloroform-Methanol (1:1) mit einer Geschwindigkeit von 20 ml pro Stunde chromatographiert. Es werden Fraktionen zu 5 ml aufgefangen. Der relative Gehalt der Fraktionen an Lysolipin I wird photometrisch bei 360 nm bestimmt; der in den Fraktionen 40-47 ermittelte Gehalt an Lysolipin I wird willkürlich als 1 angenommen. Es ergibt sich folgende Verteilung: Fraktion mg relat Gehalt an
Trockenrückstand Lysolipin l
1-27 40 unter 0,05 28-29 30 0,46 30-39 524 0,58 40-47 618 1 48-55 234 0,29 56-80 233 unter 0,1
Die Fraktionen 40-47 geben aus Aceton-Äther 416 mg tiefgelbe Kristalle von Lysolipin I, F. 260-262 (Zers.).
Weitere chemische, physikalische und biologische Eigenschaften sind im allgemeinen Teil der Beschreibung.
Aus den Mutterlaugen der Kristallisation und aus den Nachbarfraktionen lassen sich bei erneuter Chromatographie an Sephadex LH-20 weitere 360 mg Kristalle gewinnen.
Beispiel 4
300 mg Lysolipin I werden mit 10 ml Pyridin und 10 ml Essigsäureanhydrid 2 Wochen bei Raumtemperatur stehengelassen, dann wird die Lösung im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird an 30 g Kieselgel mit Chloroform-Essigester (4:1) chromatographiert. Die ersten 150 ml Eluat enthalten 48 mg uneinheitliches Material. Die nachfolgenden 210 ml geben 220 mg blassgelbes öliges Material, das im Dünnschichtchromatogramm (Kieselgel, Essigester als Fliessmittel; Anfärben mit Joddampf) einen Hauptfleck mit Rf 0,33 und zwei schwache Verunreinigungen zeigt. Durch langsames Kristallisieren aus Aceton-Wasser bilden sich blassgelbe Kristallprismen mit einem unscharfen F. 216-224". NMR. Spektrum in CDCl3 (100 MHz) siehe Fig. 6. Die Probe enthält noch etwas Äthylacetat (von der Chromatographie) Chromatographie), sich im NMR.-Spektrum bemerkbar macht.
Aufgrund des Massenspektrums (siehe Tab. 3) liegt ein Diacetat vor.
Wenn die Acetylierung nur wie üblich über Nacht durchgeführt wird, erhält man ein Gemisch zweier Produkte, die durch Kristallisation nicht getrennt werden konnten, offenbar ein Mono- und das Diacetat. Im Massenspektrum dieses Gemisches erscheinen die Signale bei 683 und 681 Massenein heiten (M+ des Diacetats) mit wesentlich geringerer Intensi tät auf.
Beispiel 5
1,5 g des nach Beispiel 2 erhaltenen Rohproduktes wer den einer Craig-Verteilung über 190 Stufen im Lösungsmittel system Tetrachlorkohlenstoff (3,42 Liter)-Chloroform (2,28 Li ter)-Methanol (4 Liter)-Wasser (1 Liter) unterworfen. Die stark gelb gefärbten Fraktionen 26-54 enthalten vor allem
Lysolipin 1. Es wird isoliert, indem man die Fraktionen mit dem doppelten Volumen Wasser verdünnt, die organische
Phase abtrennt. die wässerige Phase dreimal mit Methylen chlorid ausschüttelt, die organischen Phasen vereint, mit Natri umsulfat trocknet und im Vakuum eingedampft. Man erhält
258 mg dünnschichtchromatographisch einheitliches Lysoli pin 1, das durch Chromatographie an Sephadex LH-20 und
Umkristallisieren, wie oben beschrieben, weitergereinigt wird.
Die Fraktionen 76-100 geben bei analoger Aufarbeitung ein fast farbloses amorphes Pulver (393 mg), Lysolipin X, das sich nicht durch Kristallisation reinigen lässt. NMR- und
UV-Spektrum siehe Fig. 7 und 8. Bei Dünnschichtchromato graphie an Kieselgel in Chlorform-Methanol (39:1) ist Rf
0,22 (gegenüber 0,39 für Lysolipin I). Auf der Dünnschicht platte wird der anfänglich sehr blasse, kaum erkennbare
Fleck von Lysolipin X beim Stehen an der Luft, rascher beim Erwärmen, tiefgelb. Bei Elution des Flecks und erneu ter Dünnschichtchromatographie zeigt sich, dass Lysolipin
X in Lysolipin I übergegangen ist.
Eine Probe Lysolipin X wird mit Methanol an Sephadex
LH-20 chromatographiert. Eine anfangs blassgelbe Zone wird bei fortschreitendem Chromatographieren immer inten siver gelb. Die gelben Eluatfraktionen erweisen sich in der
Dünnschichtchromatographie als identisch mit Lysolipin I.
Ein anfangs fast farbloses Präparat von Lysolipin X wird mehrere Monate im Kühlschrank aufbewahrt. Es nimmt in dieser Zeit eine intensiv gelbe Farbe an. Durch eine Craig
Verteilung (siehe oben) werden aus dem Präparat noch ge ringe Mengen Lysolipin X erhalten. Die Hauptmenge kann als Lysolipin I identifiziert werden.
Tabelle 1 Lysolipin I.
13C-NMR.-Spektrum (25,2 MHz). Lösungsmittel: CDCI3 + etwas DMSO Nr G(ppm) m Nr G(ppm) m
1. 181,26 s 15. 117,77 s
2. 168,26 s 16. 116,15 d
3. 158,60 s 17. 111,24 s
4. 151,26 s 18. 110,37 s
5. 149,65 s 19. 108,54 s
6. 144,95 s 20. 92,63 d
7. 143,17 s 21. 90,95 t
8. 140,53 s 22. 78,87 d
9. 138,86 s 23. 75,31 d 10. 134,06 s 24. 67,70 d 11. 133,09 s 25. 61,55 q OCH3 12. 127,91 s 26. 58,42 q OCH3 13. 125,48 d 27. 57,67 q OCH3 14. 120,62 ? 28. 35,55 q o: Chemische Verschiebung gegenüber Tetramethylsilan als internem Standard. m: Aufspaltung im off resonance Spektrum. Von den 29 C-Atomen sind 28 als selbständige Signale erkennbar.
Tabelle 2 Lysolipin I Gelbe Kristalle, C29H24ClNO, Massenspektrum. Di = 140 "C.
m/e o/0 m/e % 601 0,2 524 0,3 600 1,0 523 0,2 599 3,2 522 0,15 598 2,7 521 0,3 597 8,0 520 0,35 596 0,2 519 0,35
518 0,35 579 und 581: Spur, 507 0,3 weit unter 506 0,7 0,1% 505 0,7 570 0,3 504 1,4 569 1,2 503 0,2 568 1,3 502 0,2 567 4,0 566 1,0 497 0,2 565 2,2 496 0,6
495 0,4 552 0,2 t94 1,2 551 0,1 +93 0,3 550 0,15 +92 0,2 549 0,2 f91 0,15 490 0,2 539 0,7 489 0,3 538 2,5 488 0,3 537 2,7 487 0,2 536 6,5 486 0,2 535 2,2 534 0,3 478 0,15 533 0,4 477 0,2 m/e 010 mle 010 m/e % 476 0,25 225 0,2 113 0,4 475 0,25 224 0,2 112 0,5 474 0,20 223 0,35 111 0,4 473 0,3 110 0,9
219 0,2 109 0,7 471 0,1 218 0,2 108 0,4 470 0,1 217 0,5 197 1,0 469 0,2 216 0,2 106 0,7 468 0,6
215 0,35 105 2,5 467 0,4 214 0,1 104 0,4 466 1,5 213 0,3 103 0,8 465 0,2 212 0,25 102 0,4 464 0,4 211 0,3 101 0,6 463 0,3 210 0,5 100 0,2 462 0,4 99 0,5 461 0,25 191 0,2 98 0,8
190 0,3 97 1,5 450 0,1 189 0,6 96 0,8 449 0,15 188 0,3 95 1,6 448 0,2 187 1,0 94 0,6 447 0,2 186 0,2 93 1,2 446 0,2 185 0,4 92 0,6 445 0,3 91 3,4
178 0,2 90 0,2 441 0,1 177 0,35 89 0,5 440 0,4 176 1,0 88 0,2 439 0,3 175 0,5 87 0,9 438 1,1 86 0,2 437 0,1 151 0,4 85 1,2 436 0,3 150 2,7 84 1,2 435 0,2 149 3,5 83 3,7 434 0,25 148 0,8 82 0,9
147 0,6 81 1,5 433 0,2 146 0,25 80 0,3 432 0,1 145 1,2 79 1,3 431 0,1 144 0,3 78 0,7 430 0,1 143 0,7 77 1,9
142 0,3 76 0,5 423 0,1 141 0,6 75 0,6 422 0,2 140 0,2 74 6,3 421 0,2 139 0,35 73 2,1 420 0,4 138 0,3 72 0,3 419 0,2 137 0,35 71 1,7 418 0,25 136 0,5 70 1,6 417 0,35 135 1,2 69 3,5
134 0,2 68 0,9 410 0,05 133 0,4 67 1,4 409 0,1 132 0,6 66 0,3 408 0,2 131 4,5 65 0,9 407 0,25
130 0,5 64 0,3 406 0,3 129 1,6 63 0,4 405 0,3 128 1,2 62 0,15 404 0,2 127 0,6 61 0,5 403 0,1 126 0,3 60 1,8 402 0,2 125 0,4 59 4,8 380 0,1 124 0,35 58 8,5 379 0,2 123 0,6 57 3,2 378 0,3 122 0,5 56 1,5 377 0,1 121 0,6 55 5,5
120 0,4 54 0,5 von 376 bis 226 119 0,8 53 1,0 keine klar aus dem 118 0,7 52 0,5 Background 117 3,9 51 0,8 hervortretenden 116 0,8 50 1,2 Peaks, kein Peak 115 2,2 über 0,1% 114 0,3 46 0,3 mle % mle % m/e o0 45 4,8 33 2,3 18- 6,0 44 3,3 32 89 17 1,5 43 45 31 100 16 0,3 42 2,6 30 15 15 26 41 6,1 29 67 14 2,2 40 0,5 28 5,7 39 2,3 27 2,6 38 0,6 26 0,8 Ablesung auf der 37 0,3 ersten 36 0,8 19 0,7 Spur: 1%= 27 mn
Tabelle 3 Di-O-acetyl-lysolipin I Massenspektrum.
Di = 1200 m/e 1(0/0) m/e 1(0/0) m/e 1(0/0) 685 2 549 4,0 473 2,0 684 8 548 2,5 472 1,2 683 24 547 1,7 471 1,7 682 21 546 3,7 470 1,7 681 58 469 1,2
537 2,5 468 3,3 653 0,8 536 3,3 652 1,2 535 6,7 467 1,7 651 3,0 534 3,7 466 4,0 650 2,5 526 3,7 465 3,7 649 5,5 525 4,6 464 5,1
524 10,2 463 6,0 643 5 523 6,2 462 10 642 20 522 1,7 461 8 641 40 521 2,5 460 2,5 640 37 520 4,6 639 100 519 5,4 Von 460 bis 85
518 7,1 keine signifi612 5 kanten Peaks 611 16 507 3 610 17 506 4 85 3,3 609 50 505 6,2 84 2,0 608 15 504 6,7 83 4,4 607 27 503 3,3 82 1,7
502 1,6 81 2,0 600 metastab. Ion 581 metastab.
Ion 497 2,5 74 12
496 9 73 1,7 581 5,5 495 11 72 1,2 580 15 494 23 71 5,4 579 17 493 16 70 3,0 578 40 492 5,4 69 9,5 577 7 491 3,7 576 2 490 3,3 61 2,5
489 3,7 60 6,3 568 1 488 6,3 567 1,3 487 4 57 7,5 566 2,5 486 6 56 2,5 565 2 55 5,4 564 1,7 479 1,2 563 0,9 478 3,0 45 12 562 1,3 477 3,3 44 5
476 3,7 43 48 551 1,2 475 4,0 42 13 550 1,7 474 2,5 41 7 mle 1(0/0) m/e 1, (ovo) mle 1(010) 32 33 28 10 16 1,2 31 43 15 15 30 12 18 8 14 5 29 39 17 2