Verfahren zur Herstellung einer Enzymzubereitung und ihre Verwendung zum Isomerisieren von Glukose
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Enzymzubereitung, welche Glukoseisomerase mindestens zum Teil extrazellular enthält sowie ihre Verwendung zur Herstellung von Lävulose durch Isomerisieren von Glukose mittels der Enzymzubereitung.
Insbesondere wird durch die Erfindung eine Glukoseisomerase-Enzymzubereitung gewonnen, worin mindestens ein Teil des Glukoseisomerase-Enzyms extrazellularen Ursprungs ist.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass in einem Kulturmedium, welches eine geeignete Kohlenstoffquelle enthält, ein Mikroorganismus der Gattung Streptomyces gezüchtet wird, welcher zur Erzeugung des mindestens zum Teil extrazellular vorliegenden Enzyms fähig ist.
Die erfindungsgemäss erhältliche Enzymzubereitung kann für die Zubereitung von Lävulose durch Isomerisieren von Glukose verwendet werden, wobei man z. B. folgendermassen vorgeht:
Gewinne einer Glukoseisomerase-Enzymzubereitung, welche eine Enzymaktivität extrazellularen Ursprungs besitzt, indem einem Kulturmedium, welches eine geeignete Kohlenstoffquelle enthält, ein Mikroorganismus der Streptomyces-Art gezüchtet wird, welcher die Enzymzubereitung erzeugen kann, und dann Glukose der Einwirkung der Enzymzubereitung unterworfen wird.
Die Isomerisation von Glukose durch die Einwirkung von wässrigem Alkali ist schon seit langem bekannt. Katalysatoren, z. B. Natriumhydroxyd, Natriumcarbonat, Calciumhydroxyd, Erdalkalicarbonate, Alkali-Ionenaustauscher, Ammoniak, Pyridin usw., wurden zum Isomerisieren von Glukose benutzt. Jedoch die Ausbeute an hierbei gebildeter Fruktose beläuft sich höchstens auf 20-30 %, was dieses Verfahren vom wirtschaftlichem Standpunkt aus reizlos macht Ferner kann die Isolierung von Fruktose aus dem Reaktionsgemisch, wenn erwünscht, nur mit grosser Schwierigkeit und beträchtlichen Verlusten durchgeführt werden, was das Gesamtverfahren noch weniger tech- nisch ausführbar macht
Bei Versuchen zur Verbesserung dieses Verfahrens wurde eine Anzahl von Glukoisomerisationsverfahren vorgeschlagen, welche auf der Wirkung von Enzymen beruhten.
Diese Vorschläge wurden für die Technik als unannehmbar befunden aus einem oder mehreren folgender Gründe: schlechte Ausbeute, langsame Reaktion, Schwierigkeit im Erhalten der gewünschten Enzymzubereitung, Unmöglichkeit, den Fruktosebestandteil gewünschtenfalls zu gewinnen und dergleichen. Insbesondere haben derartige Enzymverfahren bisher die Verwendung von im wesentlichen intrazellularen Enzymsystemen bedingt. Das heisst, das benutzte Kulturmedium enthält das Enzym nur innerhalb der Organismuszelle oder dicht daranhängend.
Während die Zellen künstlich aufgebrochen werden können, um eine extrazellulare Enzymquelle zu erzeugen, z. B.
durch ihr Zerkleinern mit einem Schall- oder Überschalldisintegrator, so ist diese Extrastufe zeitraubend und mitunter schwierig durchzuführen und verursacht merklich erhöhte Produktionskosten des lsomerisierungsverfahrens.
Daher würde es ausserordentlich vorteilhaft sein, eine Glukoisomerase-Enzym-Zubereitung zu erzeugen, welche einen hohen Grad an extrazellularer Enzymaktivität aufweist. Wenn diese Art von Aktivität unmittelbar ohne die zusätzliche lästige Stufe der Zellaufbrechung erzielt werden könnte, würde eine solche Erfindung einen beträchtlichen technischen Fortschritt darstellen. Es wird bevorzugt, dass eine Enzymzubereitung aus verschiedenen Gründen einen hohen Grad an extrazellularer Enzymaktivität besitzt. Beispielsweise ist allgemein anerkannt, dass intrazellulare Enzyme langsamer in ihrer besonderen Rolle im Vergleich zur extrazellularen Klasse wirken.
Die extrazellularen Enzymmaterialien werden im allgemeinen für wirksamer gehalten sowohl im Hervorbringen eines höheren lsomerisierungsgrades wie auch in der Erzielung höherer prozentueller Ausbeuten in weniger Zeit im Vergleich zu der Verwendung von intrazellularen Quellen. Was noch wichtiger ist, es besteht theoretisch eine niedrigere Grenze für die Menge an extrazellularen Enzym, welche ein Organismus hervorbringen kann. Andererseits ist die Menge an vorhandenem intrazellularem Enzym naturgemäss von der Menge an vorhandenen Organismuszellen abhängig, wie sie biologisch erzeugt werden. Bis jetzt je doch wurde noch keine Glukoisomerase-Enzym-Zubereitung gefunden, welche gänzlich extrazellular in ihrer Art ist, oder auch nur eine Zubereitung, welche einen höheren Grad an extrazellularer Enzymaktivität zusätzlich zur intrazellularen aufwiese.
Im Hinblick auf das Vorhergehende besteht ein Hauptvorteil der Erfindung darin, dass eine Enzymzubereitung hergestellt wird, welche dadurch gekennzeichnet ist, dass sie vor allem einen hohen Grad an extrazellularer Aktivität aufweist.
Das erfindungsgemässe Verfahren führt zu hohen Enzymausbeuten im Vergleich zu ähnlichen Verfahren, welche andere bekannte Kohlenstoffquellen in dem Kulturmedium benutzen.
Ein weiterer Vorteil der Erfindung besteht darin, dass das obige lsomerisierungsverfahren dem Arbeiten mit hohen Konzentrationen an erhaltenem Glukosesubstrat angepasst werden kann und auch ausgezeichnete Ausbeuten an Fruktose in verhältnismässig kurzen Zeiten liefert.
Ein weiterer Vorteil der Erfindung besteht darin, dass man durch das Glukoseisomerisierungsverfahren Fruktose in Mengen erzeugen kann, welche die theoretische Grenze erreichen, die durch Gleichgewichtserwägung bestimmt ist.
Weitere Vorteile der Erfindung werden sich noch aus dem folgenden ergeben.
Gemäss der Erfindung wurde eine neue Enzymzubereitung hergestellt. Allgemein gesprochen ist diese Enzymzubereitung eine mindestens zum Teil extrazellular-derivierte Glukoseisomerase-Enzym-Zubereitung. Die erfin dungsgemäss herstellbare Glukoseisomerase-Enzymzubereitung kann auch aus einer Kulturflüssigkeit stammen, die einen wesentlichen Anteil an extrazellularer Isomeraseaktivität besitzt. Das erfindungsgemässe Verfahren bezieht sich insbesondere auf die Herstellung einer Glukoseisomerase-Enzym-Zubereitung, welche nur aus dem extrazellularem Anteil der Kulturflüssigkeit eines Glukoseisomerase bildenden Organismus stammt.
Vor allem bevorzugte Glukoisomerase-Enzym-Zubereitungen dieser Art stammen von Mikroorganismen, wie beispielsweise der Streptomyces venezuelae-Art, ab.
Unter dem Ausdruck extrazellular-deriviert wird verstanden, dass in der Kulturflüssigkeit ein wesentlicher Anteil an Glukoisomeraseaktivität sich innerhalb der Flüssigkeit ansammelt, welche die Zellen umgibt, zum Unterschied von der Aktivität innerhalb der Zellen selbst. Die extrazellularderivierte Enzymaktivivtät kann leicht abgetrennt werden von der zellularen Aktivität durch Filtration oder andere einfache Methoden. Intrazellular derivierte Enzymaktivität andererseits ist diejenige, welche sich innerhalb der Zellen findet. Um diese Aktivität freizumachen und anzusammeln, muss man gewöhnlich die Zellmembrane aufbrechen, durch physikalische oder chemische Zerreissverfahren.
Allgemein gesprochen umfasst das Verfahren zur Gewinnung des obigen Enzymsystems folgende Stufen: Züchten in einem Kulturmedium, welches eine geeignete Kohlenstoffquelle enthält, eines Organismus, welcher imstande ist, dieses Enzym zu erzeugen, und anschliessende Bildung, des Enzyms durch diesen Organismus. Der Organismus kann aus einer pflanzlichen, tierischen oder cerealischen Quelle stammen und von mikroskopischem oder makroskopischem Charakter sein. Es wird bevorzugt, dass das proteinartige Enzym durch Verwendung eines Mikroorganismus des Bakterien- oder Pilztyps erzeugt wird.
Geeignet für das erfindungsgemässe Verfahren sind Mikroorganismen der Gattung Streptomyces. Besonders bevorzugte Spezies unter dieser Art sind Streptomyces venezuelae und Streptomyces olivochromogenes. Kulturen von einem Stamm jeder dieser Organismen befinden sich in der American Type Culture Collection von Mikroorganismen. Sie haben die folgenden Bezeichnungen erhalten: Streptomyces venezuelae: ATCC No. 21113, Streptomyces olivochromogenes: ATCC No. 21114. Es wurde gefunden, dass durch Verwendung dieser Kulturstämme oder anderer man ein brauchbares Glukoisomerase-Enzym erhält, welches eine extrazellulare Enzymaktivität besitzt, wie sie bisher nicht verfügbar war bei einer Enzymklasse, welche diesen Typus der Aktivität der Isomerisierung von Glukose besitzt.
Das gewünschte Enzym kann in üblicher Weise hergestellt werden. Ein lmpfmaterial, hergestellt beispielsweise auf einem Agar-Substrat, wird gewöhnlich zum Impfen eines Kolbens benutzt, welcher ein geeignetes Medium bzw. Nährstoff enthält. So wird z. B. eine Kultur, welche einen Streptomyces-Spezies enthält, die imstande ist, eine Glukoisimerase-extrazellulare-Enzymzubereitung zu erzeugen, dazu verwendet, ein Substrat zu impfen, welches eine geeignete Kohlenstoffquelle enthält. Hier lässt man den Organismus wachsen, um das gewünschte Enzym zu erzeugen. Die Inkubationszeit kann über einen weiten Zeitbereich schwanken, in Abhängigkeit von dem besonderen eingesetzten Mikroorganismus und auch dem benutzten besonderen Kulturmedium. Im allgemeinen kann die Inkubationszeit von etwa 4 bis 48 Stunden dauern.
Gewöhnlich wird ein aliquoter Teil oder die gesamte Organismusmasse dann dazu benutzt, ein grösseres Volumen an Nährstoff zu impfen. Dies kann ein oder mehrere Male wiederholt werden. Die Endkultur wird vor allem mit oder ohne Reinigungsverfahren, dazu benutzt, um die Isomerisierung von Glukose zu Fruktose durchzuführen.
So kann man das gesamte Medium unmittelbar als Quelle an Glukoisomerase verwenden, oder das Medium kann filtriert oder in anderer Weise behandelt werden.
Das Filtrat oder Zentrifugat enthält gewöhnlich die extrazellulare Enzymzubereitung, welche dann unmittelbar verwendet oder noch weiter durch eine Anzahl bekannter Verfahren gereinigt werden kann. In gleicher Weise kann die intrazellulare Fraktion, welche üblicherweise als eine feste zellulare Masse zurückbleibt, entweder verworfen oder getrennt in der Glukoisomerisierungsstufe benutzt werden. Aus wirtschaftlichem Grund verwendet man normalerweise das gesamte Medium ohne weitere Trennung, wenn die Isomerisierung in grosstechnischem Massstab ausgeführt werden soll.
In der üblichen Praxis werden von 20 0Io der gesamten Glukoisomerase-Enzym-Aktivität bis zu etwa 60 % oder sogar mehr der extrazellularen Enzymquelle zugeschrieben.
Es soll hier bemerkt werden, dass nicht alle Streptomyces-Spezies oder -Stämme hier aktiv sind, um eine Glukoisomerase-Enzym-Zubereitung zu erzeugen, welche mindestens zum Teil extrazellulare Enzymaktivität besitzt. Ie- doch soll das erfindungsgemässe Verfahren nicht auf die Verwendung eines beliebigen besonderen Organismus oder Mikroorganismus beschränkt werden, solange dieser Organismus die Fähigkeit besitzt, eine Enzymzubereitung zu erzeugen, welche dadurch gekennzeichnet ist, dass sie mindestens eine extrazellulare Enzymquelle enthält, welche Aktivität in der Isomerisierung von Glukose zu Fruktose besitzt. Wie bereits erwähnt, waren solche Enzymzubereitungen bisher unbekannt.
Bei einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens wurde eine besonders geeignete Kohlenstoffquelle oder ein Nährstoff gefunden, welcher für die Gewinnung der oben beschriebenen Enzymzubereitun gen benutzt werden kann. Diese Kohlenstoffquelle ist vorzugsweise eine Mischung aus Xylose und Stärke, welche als einzige Kohlenstoffquelle oder in Kombination mit einer Vielzahl von anderen Kohlenstoffquellen, wie z. B.
Mannitol, Glukonsäure, Galaktose, Glycerin, Sorbitol, Glukose und anderen reinen oder unreinen Quellen von Kohlenhydraten verwendet werden kann. Wie noch aus dem Folgenden ersichtlich ist, ist diese Mischung aus Xylose und Stärke als ein Ganzes insbesondere besser als Kulturmediumnährstoff, als einer der beiden Bestandteile einzeln in gleicher Menge. Die Nährstoffmischung erzeugt vor allem eine aktivere Enzymzubereitung als Xylose, welche in grossem Umfang als Kohlenstoffquelle bei der Herstellung von Glukoisomerase-Enzym benutzt wurde. Auch Stärke allein ist als Kohlenstoffquelle weniger geeignet.
Der Stärkenährstoff, welcher bei der Ausführung des erfindungsgemässen Verfahrens benutzt wird, kann aus einer beliebigen pflanzlichen Quelle abgeleitet sein, z. B.
Mais, Weizen, Kartoffel, Tapioka, Reis, Sago und Sorghumkorn. Wachsstärken können ebenfalls verwendet werden. Die Bezeichnung Stärke wird hier ganz allgemein gebraucht und umfasst unmodifizierte Stärke und Rückstände, und auch Stärke, welche durch Behandlung mit Säuren, Alkali, Enzymen oder Oxydationsmitteln modifiziert wurde. Lösliche oder teillösliche modifizierte Stärken, Dextrine, vorgelatinierte Produkte und Stärkederivate, z. B. gewisse kationische, anionische und nichtionische Stärkederivate, sind ebenfalls vorzugsweise verwendbar. Typische hier brauchbare Stärken sind Mais- und Kartoffelstärke.
Der Xyloseanteil des Materials kann Xylose selbst sein oder auch ihre nativen Formen, welche in den Zellwänden von fast allen Pflanzen in der Form von Xylanpolymeren vorkommen, die Xylosezucker als Hauptbestandteil enthalten. Somit kann Xylose benutzt werden, so wie sie in unreiner Form in Stroh, Spreu, Holz, Maiskolben, Weizenkleie und dergleichen zugegen ist. Üblicherweise werden die erwähnten oder andere Materialien mit Alkali behandelt, um die Hemizellulose aus den verschiedenen Abfallmaterialien. die als Medien benutzt werden, zu entfernen.
Um die Monosaccharidxylose zu erhalten wird die Hemizellulose üblicherweise hydrolysiert. Somit soll unter dem hier verwendeten Ausdruck Xylose verstanden werden, dass er sowohl das reine Material wie auch die unreinen, dieses Kohlenhydrat enthaltenden Quellen einschliesst.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens ist die Kohlenstoffmischung üblicherweise aus 25-75 OIo Stärke und 25-75 O/o Xylose zusammengesetzt, bezogen auf das gesamte Mischungsgewicht der Kohlenstoffquelle. Anders ausgedrückt umfasst die Xylose und Stärke enthaltende Kohlenstoffquelle üblicherweise 0,2-10 und öfters 0,5-2 Gew.-% des Kulturmediums. Bei einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens kann ein Kulturmedium auch Mais-Weichwasser als Proteinquelle enthalten. Diese Kombination zusätzlich zu der gerade beschriebenen Mischung aus Xylose und Stärke als Kohlenstoffquelle ist besonders erwünscht. Üblicherweise macht das Mais-Wei."- wasser angesetzt aus verschiedenen Aminosäuren, 0,1-5,0 Gew.-% des Kulturmediums aus.
Bei der Gewinnung des erfindungsgemäss herstellbaren Enzyms ist es insbesondere selbstverständlich, dass das Saatmedium und die nachfolgenden Zellwachstumsmedien zusätzlich zu den oben beschriebenen oder anderen Kohlenstoffquellen eine geeignete Stickstoffquelle, anorganische Salze, z. B. Magnesiumsulfat, Kaliumdihydrogenphosphat usw., und andere Materialien gewünschtenfalls enthalten. Üblicherweise wird die Kultur, z. B. Streptomyces venezuelae, bei einem pH-Wert im Bereich von etwa 7 bis etwa 9 und bei einer Temperatur von etwa 20 bis etwa 40 "C gezüchtet.
Die tatsächliche lsomerisierungsstufe, in Abhängigkeit von der Quelle der Enzymzubereitung, Konzentration an Glukose, Temperatur, Anwesenheit oder Abwesenheit von Enzymkofaktoren und dergleichen kann in der erforderlichen Zeit, um höchste Fruktoseausbeuten zu erzielen, schwanken. Üblicherweise werden angemessene Ausbeuten in einer Zeit von etwa 1 bis etwa 36 Stunden erhalten.
Während dieser Stufe kann die Temperatur Raumtemperatur sein oder auf etwa 50-70 C gesteigert werden.
Üblicherweise wird der pH-Wert des der Isomerisierung unterworfenen Glukosesystems auf etwa 7-9 durch Verwendung geeigneter Puffersysteme, z. B. eines Phosphatpuffers, eingestellt. Andere Aktivatoren, z. B. Magnesiumoder Manganionen, könen auch anwesend sein. Es kann mitunter möglich sein, Nebenreaktionen auf einem Mindestmass durch Zusatz von Inhibitoren zu halten, beispielsweise von Natriumarsenat, Natriumarsenit und Natriumfluorid. Es wurde festgestellt, dass die Enzymaktivität auf ein Maximum durch Verwendung eines Enzymkofaktors, wie z. B. Kobalt, in Form von Kobaltchloridsalz, erhöht werden kann.
Die Glukose selbst ist üblicherweise in Form einer konzentrierten Lösung zugegen. Ausgezeichnete Ergebnisse wurden vor allem festgestellt, wenn die Glukosekonzentration 0,5-5,0 molar ist. Selbstverständlich können auch verdünntere Glukosequellen, ebenso wie übersättigte Lösungen, isomerisiert werden.
Die folgenden Beispiele erläutern typische Ausführungsformen der Erfindung. Selbstverständlich werden die Beispiele nur zur Erläuterung und nicht zur Beschränkung gegeben. Alle Bezugnahmen auf Teile und Prozentsätze sind gewichtsmässige, wenn nichts anderes angegeben.
Beispiel 1
Extrazellulare Glukoisomerase-Enzym-Zubereitungen wurden hergestellt aus zwei Spezies, nämlich S. venezuelae ATCC No. 21113 und S. Olivochromogenes, ATCC No. 21 114, und die Enzymzubereitungen wurden zum Isomerisieren von Glukosemustern verwendet.
Das bei diesem Versuch benutzte Kulturmedium hatte folgende Zusammensetzung:
Xylose 0,5 g
Löslich gemachte
Kartoffelstärke 0,5 g
Pepton 1,0 g
Fleischextrakt 0,5 g
Hefeextrakt 0,25 g
Natriumchlorid 0,5 g
Magnesiumsulfat 0,05 g
Kobaltchlorid 0,005 g Das pH des Kulturmediums wurde auf etwa 7,0 vor der Impfung eingestellt.
Nach dem Sterilisieren und Abkühlen auf 25 "C wurden 100 ml Muster des vorstehenden Xylose-Stärke-Mediums mit der gerade erwähnten Spezies geimpft. Die Impfungen wurden in spezifischer Weise durchgeführt durch Beimpfen des Mediums mit drei Ösen voll an Zellen aus Xylose-Stärke-Agarzüchtung. Nach 48stündiger Inkubation bei 28 "C auf einem Shaker zum Lüften der Kultur wurden Zellen durch Zentrifugieren des Kulturmediums mit 10 000 Umdrehungen pro Minute während 10 Minuten geerntet. Die Zellen wurden zweimal mit 0,850/oiger Salzlösung gewaschen und in 5 ml von 0,05 molarer Phosphatpufferlösung (pH 7,5) suspendiert.
Die Zellsuspension wurde dann in einem wassergekühlten Schalloszillator während 20 Minuten bei 10 KC behandelt und dann nochmals mit 12 000 Ltmdrehungen pro Minute während 30 Minuten geschleudert. Die überstehende Flüssigkeit wurde als eine Rohquelle von intrazellularer Glukoisome rase-Enzym- Lösung verwendet.
Rohe extrazellulare Glukoisomerase wurde hergestellt durch Aussalzen von 50 ml Kulturzentrifugat mittels Ammoniumsulfat von 60 /o Sättigung. Nach dem Zentrifugieren wurde die partiell gereinigte extrazellulare Enzymlösung erhalten durch Auflösen der Ausfällung in 4 ml von 0,05 molarer Phosphatpufferlösung (pH 7,5) und Dialysieren der Lösung gegen den Puffer während eines Tages bei 5 "C.
Die Isomerisierung selbst wurde durchgeführt durch Zubereiten einer 1,6 molaren wässrigen Lösung von Glukose, welche auch 0,05 molaren Phosphatpuffer, 0,2 molares Magnesiumsulfat und 0,05 molares Kobaltchlorid enthielt. 2 ml der oben erwähnten Enzymlösungen wurden zu 2 ml der Glukoselösung zugesetzt.
Nach einer Inkubation von 3 Stunden bei 60 "C wurden 0,5 ml der Reaktionsmischung abgezogen in 4,5 ml von 0,5 N Perchlorsäurelösung. Die Menge an in dem aliquoten Teil gebildeter Fruktose wurde nach der Cystein Carbazol-Methode bestimmt, wie sie in 1 Biol. Chem., 192, 583 (1951) beschrieben ist. In diesem Test wurde Farbintensität während 10 Minuten bei 60 "C nach dem Zusatz der Reagentien entwickelt. Die Intensität wurde dann in einem Spektrophotometer bei 560 um abgelesen und die Menge an vorhandener Fruktose aus Standardwerten berechnet. Die erhaltenen Ergebinsse folgen. Enzymaktivitäten sind berechnet, um die Aktivität pro ml an ursprünglichem Kulturmedium zu zeigen.
Tabelle I Mikroorganismus Intrazellulare Glukoisomeraseaktivität /0 gebildeter mg Fruktose /0 Fruktose
Fruktose pro ml Kul- pro ml Kul turflüssig- turflüssig keit keit S. olivochromogenes 38,9 5,6 0,97 S. venezuelae 37,5 5,4 0,94 Mikroorganismus Extrazellulare Glukoisomeraseaktivität /0 gebildeter mg Fruktose /0 Fruktose
Fruktose pro ml Kul- pro ml Kul turflüssig- turflüssig keit keit S. olivochromogenes 5,6 1,3 0,22 S. venezuelae 24,8 5,8 0,99
Beispiel 2
Hier wurde die Wirkung der Kulturperiode auf die Isomeraseaktivität von S. venezuelae ATCC Nr. 21113 untersucht. Das Kulturmedium und die anderen Bedingungen waren die gleichen wie in Beispiel 1 beschrieben mit der Abänderung, dass 10 ml einer Vorkulturbrühe als eine Impfung zu den 100 ml Hauptkulturgemisch zugesetzt waren.
Sowohl Zellen wie Kulturfiltrat wurden nach 16, 20, 24, 48, 72 und 168 Stunden Inkubation geerntet und als Glukoisomeraselösungen benutzt. Die Ergebnisse folgen in Tabelle II.
Wie ersichtlich zeigte die intrazellulare Enzymaktivität aus S. venezuelae Höchstaktivität nach nur 16 Kulturstunden und behielt diese Aktivität im wesentlichen auf einer konstanten Höhe während etwa 7 Tagen. Die intrazellulare Glukoisomerase-Enzym-Aktivität von S. venezuelae nahm allmählich zu und blieb im allgemeinen nach etwa 2 Tagen konstant. Somit ist ersichtlich, dass eine stark bevorzugte Enzym erzeugende Spezies S. venezuelae für die Zwecke der Erfindung ist infolge der hervorragenden Aktivität im Erzeugen sowohl erheblicher Mengen von extrazellular- und intrazellular-derivierter Aktivität.
Tabelle II Mikro - Kultur- Intrazellulare Glukoisomerase-Enzymorganismus periode Aktivität (Stun- /o gebildeter Mg Fruktose /0 Fruktose den) Fruktose pro ml Kul- pro ml Kul turmedium turmedium
S. venezuelae 16 39,3 5,6 0,98
20 - - -
24 39,9 5,7 1,0
48 36,4 5,2 0,91
72 38,0 5,5 0,95
168 38,0 5,5 0,95 Mikro Kultur- Extrazellulare Glukoisomerase-Enzymorganismus periode Aktivität (Stun- /o gebildeter Mg Fruktose % Fruktose den) Fruktose pro ml Kul- pro ml Kul turmedium turmedium S. venezuelae 16 7,0 1,6 0,28
20 11,0 2,5 0,44
24 17,3 4,0 0,69
48 19,6 4,5 0,78
72 19,7 4,5 0,79
168 16,0 3,7 0,64
Beispiel 3
Hier wurde die Wirkung der Kohlenstoffquelle auf die Enzymerzeugung untersucht.
In einem Kulturmedium wurde 1,0 /0 Xylose verwendet. In einem anderen wurden 0,5 % Xylose und 0,5 /o Kartoffelstärke benutzt. Wie aus Tabelle III ersichtlich, lieferte das Stärke-Xylose enthaltende Medium eine höhere Fruktose bildende Aktivität im Vergleich zur Xylose, und insbesondere in bezug auf die Lieferung von intrazellularer Glukoisomerase-Enzym-Aktivität.
Tabelle III Mikroorganismus Kohlen- Intrazellulare Extrazellulare stoff- Glukoisomerase- Glukoisomerase quelle Enzym-Aktivität Enzym-Aktivität /o gebildeter % gebildeter
Fruktose Fruktose S. venezuelae ATCC Xylose- 39,3 5,0 Nur. 21113 Stärke S. venezuelae ATCC Xylose 24,5 3,5 Nur. 21 113 S. olivochromogenes Xylose- 26,6 ATCC Nr. 21 114 Stärke S. olivochromogenes Xylose 14,9 ATCC Nr. 21 114
Es ist nicht ganz aufgeklärt worden, welche besondere Wirkung Stärke auf die Fruktosegewinnung hat, wenn als Kulturmedium verwendet. Es wird jedoch angenommen, dass die Stärke in irgendeiner Weise das Wachstum des Mikroorganismus veranlasst und aktiviert und infolgedes sen die sich darauf ergebende Enzymaktivität vergrössert.
Beispiel 4
In einer weiteren Versuchsreihe wurde die Enzym erzeugende Aktivität von S. venezuelae über verschiedene Kulturzeiten verfolgt. Wie im nachstehenden gezeigt, wurde die intrazellulare Glucoisomerase-Aktivität wiederum auf einer im wesentlichen konstanten Höhe sogar während 7 Tagen beibehalten. Die extrazellulare Enzymaktivität dieser Spezies nahm zu während der ganzen Wachstumsperiode und erreichte ein konstantes Maximum nach etwa 5 Kulturtagen. Da während des Verlaufs dieser Zeit die intrazellulare Enzymaktivität nicht proportional verringert wurde, betont dies insbesondere die Tatsache, dass die extrazellulare Aktivität sich nicht ableitet aus intrazellularer Enzymaktivität, die aus Zellautolyse freigesetzt wurde.
Bei der Ausführung dieser Untersuchungen wurden die folgenden Wachtumsmedien für die Kultur von S. venezuelae ATCC Nr. 21 113 verwendet. Der Zusatz von Maiseinweichflüssigkeit zu den Xylose-Stärke enthaltenden Medien als eine Stickstoffquelle schien die Glukoseisomerisierung weiter zu begünstigen.
Es folgt die Zusammensetzung der beiden benutzten
Kulturmedien: Medium mit Maiseinweich- Medium ohne Maiseinweichflüssigkeit g flüssigkeit g Xylose 0,5 Xylose 0,5 Kartoffelstärke 0,5 Kartoffelstärke 0,5 Maiseinweichflüssigkeit 1,0 Pepton 1,0 Pepton 0,5 Fleischextrakt 0,5 Fleischextrakt 0,5 Hefeextrakt 0,25 Hefeextrakt 0,25 Magnesiumsulfat 0,05 Magnesiumsulfat 0,05 Kobaltchlorid 0,0024 Kobaltchlorid 0,0024 Das pH dieser Medien war in beiden Fällen 7,2.
Tabellen IV und V zeigen die Ergebnisse dieser verschiedenen Untersuchungen. Tabelle IV bezieht sich auf Enzymaktivität von S. venezuelae, welche aus einem Maiseinweichflüssigkeit enthaltenden Medium bestand. Tabelle V zeigt die Aktivität aus einem Maiseinweichflüssigkeit nicht enthaltenden Medium stammenden Enzym. Etwas bessere Ergebnisse wurden erhalten, wenn Maiseinweichflüssigkeit einen Teil des Nährmediums bildet.
Tabelle IV
Zeit 16 20 24 30 2 3 5 7 10
Std. Std. Std. Std. Tage Tage Tage Tage Tage pH 7,1 7,5 8,0 7,9 8,4 8,4 8,8 8,9 9,0
Intrazellulare
Enzymaktivität % gebildeter Fruktose 44,4 43,8 45,9 40,8 43,8 42,8 45,2 45,2 30,2
Extrazellulare
Enzymaktivität % gebildeter Fruktose 4,4 9,6 8,9 9,5 13,9 13,6 17,8 16,8 15,1
Tabelle V
Zeit 16 20 24 30 2 3 5 7 10
Std. Std. Std. Std.
Tage Tage Tage Tage Tage pH 7,3 7,6 7,75 8,1 8,2 8,4 8,6 9,0 9,0
Intrazellulare
Enzymaktivität /o gebildeter Fruktose 39,3 40,3 41,2 37,0 40,3 40,8 32,2 40,3 34,5
Extrazellulare
Enzymaktivität /o gebildeter Fruktose 3,2 - 4,3 5,4 5,0 11,6 14,6 13,4 8,0
Beispiel 5
Auch hier wurden verschiedene Kohlenstoffquellen verwendet für die Gewinnung eines Glukoisomerase-Enzyms, in diesem Fall einer intrazellularen Glukoisomerase Enzym-Zubereitung. Wie aus den Werten der folgenden Tabelle VI entnehmbar, war die Xylose-Stärke-Nährstoffmischung deutlich überlegen in der Erzeugung von aktiveren Glukoisomerase-Enzym-Zubereitungen im Vergleich zu Xylose oder Stärke allein als Nährstoffmedium.
Tabelle VI Mikroorganismus *Kohlen- o/0 Mg Enzym stoff- Fruk- pro ml quelle tose Reaktions
Gemisch S. venezuelae, ATCC Nr. 21113 Xylose
Stärke (Mischung
50-50 Gew.-0/o) 35,5 12,5 S. venezuelae, ATCC Nr. 113 Xylose 9,2 6,8 S. venezuelae, ATCC Nr. 113 Stärke 0 5,9 S. venezuelae, ATCC Nr. 21 113 Glukose 0 13,5 Die Gesamtmenge an verwendetem Nährstoff war die gleiche in allen Fällen.
Beispiel 6
Hier wurde eine Anzahl von Variablen untersucht mit Bezug auf die Gewinnung von extrazellularen und intrazellularen Glukoisomerase-Enzym-Zubereitungen durch die S.
venezuelae Spezies ATCC Nr. 21113.
Zuerst wurden die extrazellularen und intrazellularen Enzymaktivitäten untersucht in bezug auf die Wirkung des pH. Die Umwandlungsreaktion aus dem extrazellularen Typ erreichte ein Optimum bei einem pH von etwa 9,0. Die intrazellulare Aktivität war auch optimal bei einem pH von etwa 9,0.
Auch wurden verschiedene Versuche durchgeführt, um festzustellen, welche Wirkung die Temperatur auf die Aktivitäten von extrazellularen und intrazellularen Enzymen von S. venezuelae hinsichtlich der Begünstigung der Umwandlung besitzt. Die intrazellulare Aktivität nahm li- near über einen Temperaturbereich von 40 "C bis zu etwa 70 OC bei Reaktionszeiten von 1 und 3 Stunden zu. Das Optimum wurde bei etwa 70 "C gefunden. Bei einer halbstündigen Reaktionszeit war die optimale Temperatur 80 "C. Wenn die Reaktionszeit über etwa 1 Stunde dauert nimmt die intrazellulare Aktivität oberhalb einer Temperatur von etwa 70 "C ab.
Die gleiche Einwirkung der Temperatur wurde auch auf die extrazellulare Aktivität festgestellt mit der Ausnahme, dass Inaktivierung bei einer etwas höheren Temperatur auftritt.
Bei einer anderen Reihe von Untersuchungen wurden 0,5, 1,0, 2,0, 3,0 und 4,0 molare Konzentrationen von Glukose sowohl mit extrazellularen wie auch intrazellularen Glukoisomerase-Enzymen von S. venezuelae behandelt. Es wurde gefunden, dass sogar bei der aussergewöhnlich hohen Konzentration von 4,0 Molen Glukose pro Liter, fast eine gesättigte Lösung, sowohl die intrazellulare wie die extrazellulare Enzymreaktion fortschritt und sich dem theoretischen Gleichgewicht näherte, wenn die Reaktionszeit ausgedehnt wurde. Somit ist ersichtlich, dass die Erfindung geeignet war, sogar hochkonzentrierte Glukoselösung zu isomerisieren, was sie noch reizvoller für ein technisch ausführbares Verfahen macht.
In einer noch anderen Versuchsreihe wurde die Isomerisierungsreaktion während einer verhältnismässig langen Zeit durchgeführt, um einen annähernden Gleichgewichtszustand zu bestimmen. In bezug auf Intraumwandlung unter Verwendung intrazellularen Enzyms aus S. venezuelae erreichte der Fruktosegehalt etwa 48 /0 des zugesetzten Zuckers unter Ausgehen von Glukose. Andererseits wenn Fruktose das Substrat war, war der schliessliche Fruktosegehalt etwa 50 010. Somit scheint es, dass der Gleichgewichtspunkt in der Nachbarschaft von etwa 48-50 /0 Intraumwandlung liegt.
Beispiel 7
Es wurde bei Laboruntersuchungen festgestellt, dass, während eine Anzahl von Streptomyces-Spezies extrazellular-derivierte Glukoisomeraseaktivität entfaltet, eine überraschende Anzahl keine Glukoisomerase-Enzym-Aktivität extrazellularen Charakters besitzt. Untersuchungen, wie im allgemeinen in Beispiel 1 angegeben, wurden mit einer sehr grossen Anzahl von Streptomyces-Spezies durchgeführt. Die Ergebnisse bei einigen wenigen von diesen folgen in der Tabelle VII.
Tabelle VII Mikroorganismus Extrazellulare Glukoisomerase
Aktivität mg Fruktose /e Fruktose pro ml Kultur pro ml Kultur flüssigkeit flüssigkeit S. aureus 0 0 S. flaveolus 0 0 S. coelicolor 0 0 S. parvus 1,4 0,24 S. roseochromogenus 0 0 S. purpurascens 0 0 S. scabies 1,3 0,23 S. vinaceus 1,6 0,28 S. Tanashiensis 1,9 0,33
Während die Erfindung an besonderen Ausführungsbeispielen beschrieben wurde, ist es selbstverständlich, dass sie weiterer Abwandlungen fähig ist. Sie umfasst alle Abwandlungen, Verwendungen oder Anpassungen, wobei sie grundsätzlich benutzt wird und schliesst solche Abweichungen von der vorstehenden Offenbarung ein, die sich aus der üblichen Praxis auf dem in Frage kommenden technischen Gebiet für den Fachmann ergeben.