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Glukcisomerase-Enzym-Zubereitung und -gewinnung und ihre Verwendung
zum Isomerisieren von Glukose.
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Die Erfindung betrifft eine Glukoisomerase-Enzym-Zubereitung, ein
Verfahren zur Gewinnung der Ensym-Zubereitung und ein Verfahren zum Isomerisieren
von Glukose -zu Fruktose unter Verwendung der Enzyn-Zubereitung.
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Insbesondere schafft die Erfindung eine Glukoisomeraze-Enzym-Zubereitung,
worin mindestens ein Teil des Glukoisomerase-Enzyms extrazellularen Ursprungs ist.
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Die Glukoisomerase-Enzym-Zubereitung wird dadurch gewonnen, dass in
einem geeigneten Kulturmedium, welches eine geeignete Kohlenstoffquelle enthält,
ein Nikroorganisaus der Streptomyces-Art , welcher die Enzymsubereitung hervorbringen
kann, geachtet und der Glukoisomerase-Enzym-Zubereitung ermöglicht wird, von dem
Mikroorganismus gebildet zu werden0 Die Erfindung schafft ferner insbesondere ein
Verfahren für die Zubereitung von Lävulose durch Isomerisieren von Glukose, welches
umfasst: Gewinnen oder Glukoisomeraze-Enzym-Zubereitung, welche eine Enzymaktivität
extrasel@@@@ren Ursprungs besitzt, inden in einem Kulturmodinn, welches eine geeignete
Kohlenstoffquelle enthält,
ein Mikroorganismus der Streptomyces-Art
gezüchtet wird, welcher die Enzymzubereitung erzeugen kann, und dann Glukose der
Einwirkung der Enzymzubereitung unterworfen wird.
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Die Isomerisation von Glukose durch die Einwirkung von wässrigem Alkali
ist schon seit langem bekannt. Katalysatoren, z.B. Natriumhydroxyd, Natriumcarbonat,
Calciumhydroxyd, Erdalkalicarbonate, Alkali-Ionenaustauscher Ammoniak, Pyridin usw.,
wurden zum Isomerisieren von Glukose benutzt. Jedoch die Ausbeuter an hierbei gebil
deter Pruktose beläuft sich höchstens auf 20-30%, was dieses Verfahren vom wirtschaftlichem
Standpunkt aus reizlos macht. Werner kann die Isolierung von Fruktose aus dem Reaktionsgemisch,
wenn erwünscht, nur mit grosser Schwierigkeit und beträchtlichen Verlusten durchgeführt
werden, was das Gesamtverfahren noch weniger technisch ausführbar macht.
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Bei Versuchen zur Verbesserung dieses Verfahrens wurde eine Anzahl
von Glukoisomerisationsverfahren vorgeschlagen, welche auf der Wirkung von Enzymen
beruhten.
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Diese Vorschläge wurden für die Technik als unannehmbar befunden aus
einem oder mehreren folgender Gründe: schlechte Ausbeute, langsame Reaktion, Schwierigkei.
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im Erhalten der gewünschten Enzymzubereitung, Unm lichkeit, den Pruktosebestandteil
gewünschtenfall zu gewinnen u.dgl. Insbesondere haben derartige Es verfahren-bisher
die Verwendung von im wesentlichen intrazellularen Enzymsystemen bedingt. Das heisst,
und benutzte Kulturmedium enthält das Enzym nur innerhalb der Organismuszelle oder
dicht daranhängend. Während die Zellen künstlich aufgebrochen werden können, um
eine extrazellulare Enzymquelle zu erzeugen, z. B.
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durch ihr Zerkleinern mit einem Schall- oder Überschalldisintegrater,
so ißt diese Extrastufe zeitraubend und mitunter schwierig durchzuführen und verursacht
merkl erhöhte Produktionskosten des Isomerisierungsverfahrenz.
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Daher wurde es ausserordentlich vorteilhaft sein, eine Glukoisomerase-Enzym-ubereitung
zu erzeugen, welche einen hohen Grad an extrazellularer Enzymaktivität aufweist0
Wenn diese Art von Aktivität unmittelbar ohne die zusätzliche lästige Stufe der
Zellaufbrechung erzielt werden könnte, würde eine solche Erfindung einen beträchtlichen
technischen Fortschritt darstellen. Es wird sehr bevorzugt, dass eine Enzymzubereitung
aus verschiedenen Gründen einen hohen Grad an -extrazellularer Enzymaktivität besitzt.
Beispielsweise ist allgemein anerkannt, dass intrazellulare Enzyme langsamer in
ihrer besonderen Rolle im Vergleich zur extrazellularen Klasse wirken. Die extrazellularen
Enzymmaterialia werden im allgemeinen für wirksamer gehalten sowohl im Hervorbringen
eines höheren Isomerisierungsgrades wie auch in der Erzielung höherer prozentueller
Ausbeuten in weniger Zeit im Vergleich zu der Verwendung von intrazellularen Quellen.
Was noch wichtiger ist,es bezers theoretisch eine niedrigere Grenze für die Menge
-n extrazellularem Enzym, welche ein Organismus hervorrie kanne Andere seits die
Menge an vorhandenem intrazelularem Enzym ist naturgemäss abhängig von der menge
an vorhandenen Organismuszellen, wie sie biologisch erzeugt werden. Bis jetzt jedoch
wurde noch keine Glukoisomerase-Enzym-Zubereitung gefunden, welche gänzlich extrazellular
in ihrer Art ist,oder auch nur eine Zubereitung, welche einen höheren Grad an extrazellularer
Enzymaktivität zusätzlich zur intrazellularen aufwiesen Im Hinblick auf das Vorhergehende
besteht ein Hauptvotteil der Erfindung darin, dass sie eine Glukoisomerase-Ensym-Zubereitung
schafft, welche dadurch gekennzeichnet ist, dass sie einen hohen Grad an extrazellulaf
rer Aktivität aufweist.
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Ein damit verwandter Vorteil der Erfindung besteht darein, dass sie
ein Verfahren schafft, dieses eben erwähnte
Enzymsystem zu gewinnen.
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Ein besonderer Vorteil der Erfindung besteht darin, dass das obige
Verfahren zur Gewinnung des gewünschten Glukoisomerase-Enzyme durch Züchten eines
geeigneten Mikroorgaaismus in einem besonderen geeigneten Kulturmedium zu hohen
Enzymausbeuten führt im Vergleich zu ähnlichen Verfahren, welche andere bekannte
Kohlenstoffquellen in dem Kulturmedium benutzen.
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Ein noch anderer Vorteil der Erfindung besteht darin, dass sie ein
Verfahren zum Isomerisieren von Glukose zu Pruktose durch Verwendung der gerade
beschriebenen Enzymzubereitung schafft.
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Ein weiterer Vorteil der Erfindung besteht darin, das das obige Isomsrisierungsverfahren
dem Arbeiten mit hohen Konzentrationen an Glukosesubstrat angepasst werden kann
und auch ausgezeichnete Ausbeuten an Fruktose in verhältnismässig kurzen Zeiten
liefert.
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Ein weiterer Vorteil der Erfindung besteht darin, dass das Glukoisomerisierungsverfahren
imstande ist, Fruktose in Mengen zu erzeugen, welche die theeretische Grenze erreichen,
die durch Gleichgewichtserwägung bestimmt ist.
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Andere Vorteile der Erfindung werden sich noch aus dem folgenden ergeben.
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Gemäss der Erfindung wurde eine neue Glukoisomerase-Enzym-Zubereitung
geschaffen. Allgemein gesprochen ist diese Enzymzubereitung eine extrazellular-derivierte
Glukoisomerase-Enzyme-Zubereitung. Die Erfindung ist auch gerichtet auf eine Glukoisomerase-Enzyme-Zubereitung,
welche aus einer Kulturfltßsigkeit stammt, die einen wesentlichen Anteil an extrazellularer
Isomeraseaktivität besitzt. Die Erfindung ist insbesondere befaßt Bit einer Glukoisomerase-Enzyme-Zubereitung,
welche nur aus dem extrazellularen Anteil der Kulturflüssigkeit eines Glukoisomerase
bildenden Organismus t-it0
Sehr bevorzugte $Glukoisomerase-Enzyme-Zubereitungen
dieser Art stammen von Mikroorganismen, wie beispielsweise der Streptomyces venzuelze-Art
ab.
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Unter dem Ausdruck "extrazellular-deriviert" wird verstanden, dass
in der Kulturflüssigkeit ein wesentlioher Anteil an Glukoisomeraseaktivität sich
innerhalb der Plilssigkeit ansammelt, welche die Zellen umgibt, zum Unterschied
von der Aktivität innerhalb der Zellen selbst Die extrazellular-derivierte Enzymaktivität
kann leicht abgetrennt werden von der zellularen Aktivität durch Filtration oder
andere einfache Methoden.
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Intrazellular derivierte Enzymaktivität andererseits ist diejenige,
welche sich innerhalb der Zellen findet.
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Um diese Aktivität freizumachen und enzusammeln muss man die Zellmembranen
aufbrechen entweder durch physikalische oder chemische Zerreissverfahren.
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Allgemein gesprochen umfasst das Verfahren zur Gewinnung des obigen
Enzymsystems folgenden Stufen: Züchten in einem Kulturmedium, welches eine geeignete
Kohlenstoffquelle enthält, eines Organismus, welcher imstande ist, dieser Enzym
zu erzeugen, und anschliessendes Bildenlassen des Enzyms durch diesen Organismus.
Der Orgemus kann aus einer pflanzlichen, tierischen oder oertalischen Quelle stammen
und von mikroskopischen oder makroskopischen Charakter sein. Es wird sehr bevorzugt,
dass das proteinartige Enzym durch Verwendung eines Mikroorganismus des Bakterien
oder Pilztype erzeugt wird.
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Besonders geeignet für das oben vorgeschlagene Verfahren sind Glieder
der Streptomyces-Art. Besonders bevorzugte Spemies unter dieser Art sind Streptemyces
venezuelae und Streptomyces olivechromogenes. Kulturen von einem Stumm jeder dieser
Organismen wurden niedergelegt in der American Type Culture Cellestion von Mikroorganismen.
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Sie haben die folgendem Bazeichungen erhalten: Streptomyces venezulae:
ATQC No. 21113, Streptomyces
olivochromogenes ATOC No. 21114. Es
wurde gefunden, dass durch Verwendung dieser Kulturstämme oder anderer man ein brauohiares
Glukoisomerase-Enzym erhält, welches eine extrazellulare Enzymaktivität besitzt,
wie sie bisher nicht verfügbar war bei einer Enzymklasse, welche diesen Typus der
Aktivität der Isomerisierung von Glukose besitzt.
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Die Erfindung befasst sich auch im allgemeinen mit einem Verfahren
der Herstellung von Fruktose durch Isomerisieren von Glukose. Die zu diesem Aspekt
der Erfindung gehörenden Stufen schliessen ein die soeben beschriebene Stufe der
Gewinnung des extrazellularen Glukoisomerase-Enzyme und anschliessendes Unterwerfen
von Glukose der Einwirkung dieser Enzymzubereitung.
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Das gewünschte Enzym wird in der üblichen Weise hergestellt. Ein Impfmaterial,
hergestellt beispielsweise auf einem Ager-Substrat, wird benutzt zum Impfen eines
Kolbens, welches ein geeignetes Medium bzw. Nährstoff enthält. So wird z.B. eine
Kultur, welche einen Streptomyces Spezies enthält* die imstande ist, eine Glukoiszimerase-extrazellulare-Enzymzubereitung
zu erzeugen, dazu verwendet, ein Substrat au impfen, welches eine geeignete Kohlenstoffquelle
enthält. Hier Wird der Organismus wachsen und du gewünschte Enzym erzeugen gelassen.
Die Inkubationszeit kann über einen weitet Zeitbereich schwanken in Abhängigkeit
von dem besonderen eingesetzten Mikroorganismus und auch dem benutzten besonderen
Kulturmedium. Im allgemeinen kann die Inkubationszeit von etwa 4 bis 48 Stunden
dauern. Im üblichen Fall wird ein aliquator Teil oder die gesamte Organismusmasse
dann dazu benutzt, ein grösseres Volumen an Nährstoff zu impfen. Die kann ein oder
mehrere Male wiederholt werden.
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Die Endkultur wird, mit oder ohne Reinigungsverfahren, benutzt, um
die Isomerisierung von Glukose zu Fruktose durchzuführen. So kann man das gesamte
Medium unmittelbar als Quelle an Glukoisomerase verwenden, oder das Medium kann
filtriert oder in anderer Weise behandelt werden. Das Filtrat oder Zentrifugat enthält
gewöhnlich die extrazellulare Enzymzubereitung, welche dann unmittelbar verwendet
oder noch
weiter durch eine Anzahl bekannter Verfahren gereinigt
werden kann. In gleicher Weise kann die intrazellulare Fraktion welche üblicherweise
als eine feate zellulare Masse zurdekbleibt, entweder verworfen oder getrennt in
der Glukoisomerisierungsstufe benutzt werden. Aus wirtschaftlichem Grund verwendet
man normalerweise das gesamte Medium ohne weitere Trennung, wenn die Isomerisierung
in großtechnischem Maßstab ausgeführt werden soll.
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In der üblichen Praxis der Erfindung werden von 20% der gesamten Glukoisomerase-Enzyme-Aktivität
bis zu etwa 60* oder sogar mehr der extrazellularen Enzymquelle zageschrieben Es
soll hier bemerkt werden, dass nicht alle Streptomyces Spezies oder Stämme hier
aktiv sind,um eine Glukoisomerase-Enzym-Zubereitung zu erzeugen, welche mindestens
extrazellulare Enzymaktivität besitzt Jedoch soll die Erfindung nicht beschränkt
werden auf die Verwendung eines beliebigen besonderen Organismus oder Mikroorganismus,
solange dieser Organismus die Fähigkeit besitzt, eine Enzymzubereitung zu erzeugen,
welche dadurch gekennzeichnet ist, dass sie mindestens eine extrazellulare Enzymquelle
enthält, welche Aktivität in der Isomerisierung von Glukose zu Fruktose besitzt.
Wie bereits erwähnt waren solche Enzymzubereitungen bisher unbekannt. Bei einer
anderen Ausführungsform der Erfindung wurde eine besonders geeignete Kohlenstoffquelle
oder ein Nährstoff gefunden, welcher für die Gewinnung der oben beschriebenen Enzymzubereitungen
benutzt werden kann.
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Diese Kohlenstoffquelle ist eine Mischung aus Xylose und Stärke, welche
als einzige Kohlenstoffquelle oder in Kombination mit einer Vielzahl von anderen
Kohlenstoffquellen, wie z.B. Mannitol, Glukonsäure, Galaktose, Glycerin, Sorbitol,
Glukose,und anderen reinen oder unreinen Quellen von Kohlenhydraten verwendet werden
kann. Wie noch aus dem Polgenden ersichtlich ist diese Mischung aus Xylose und Stärke
als ein Ganzes basses als Kulturmediumnährstoff als einer der beiden Bestandteile
in gleicher Menge. Die Nährstoffmischung erzeugt insbesondere eine aktivere Enzymzubereitung
als Xylolze, welche in grosses Umfang als tohlenstoffquelle
bei
der Herstellung von Glukoisomerase-Enzym benutzt wurde. Auch Stärke allein ist als
Kohlenstoffquelle weniger geeignet.
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Der Stärkenährstoff, welche bei der Ausführung der Erfindung benutzt
wird, kann abgeleitet sein aus einer beliebigen pflanzlichen Quelle, z.B. Mais,
Waizen, Kartoffel, Tapioca, Reis, Sago und Sorghumkorn. Wachsstärken können ebenfalls
verwendet werden. Die Bezeichnung "Stärke" wird hier ganz allgemein gebraucht und
umfasst unmodifizierte Stärke und Rückstände, und auch Stärke, welche modifiziert
wurde durch Behandlung mit Säuren, Alkali, Enzymen oder Oxydationsmitteln. Lösliche
oder teillösliche modifizierte Stärken, Dextrine, vorgelatinierte Produkte und Stärkederivate,
z.D, gewisse kationische, anionische und nichtionische Stärkederivate, sind ebenfalls
verwendbar. Typische hier brauchbare Stärken sind Mais- uEd Kartoffelstärke.
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Der Xylolseanteil des Materials kann Xylose selbst sein oder auch
ihre nativen Formen, welche in den Zellwänden von faßt allen Pflanzen in der Form
von Xylanpolymeren vorkommen, die Xylosezucker als Hauptbestandteil enthalten.
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Somit kann Xylose benutzt werden, so wie sie in unreiner Form in Stroh,
Spreu, Holz, Maiskolben, Weizenkleie u.dgl., zugegen ist. Üblicherweise werden die
erwähnten oder andere Materialien mit Alkali behandelt, um die Hemizellulose aus
den verschiedenen Abfallmaterialien, die als Medien benutzt werden, zu entfernen.
Um die Monosaccharidxylose zu erhalten wird die Hemizellulose üblicherweise hydrolysiert.
Somit soll unter dem hier verwendeten Ausdruck "Xylose" verstanden werden, dass
er einschliesst sowohl das reine Material wie auch die unreinen,dieses Kohlenhydrat
enthaltenden Quellen.
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In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Kohlenstoffmischung üblicherweise
zusammengesetzt aus 25-75* Stärke und 25-75% Xylose, bezogen nur auf das gesamte
Mischunggewicht der Kohlenstoffquelle. In anderer Weise ausgedrückt umfasst die
Xylose und Stärke enthaltende Kohlenstoffquelle üblicherweise 0,2-10 und öfters
0,5-2 Gew.% des Kulturmedium.
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Beineiner anderen Ausführungsform der Erfindung enthält ein besonders
erwünschtes Kulturmedium auch Maiseinweichwasser als Proteinquelle. Diese Kombination
zusätzlich zu der gerade beschriebenen Mischung aus Xylose und Stärke als Kohlenstoffquelle
ist besonders erwünscht. Üblicherweise macht die Maisenweichflüssigkeit, zusammengesetzt
aus verschiedene Aminosäuren 0,1-5,0 Gew.% des Kulturmediums aus.
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Bei der Gewinnung des erfindungsgemässen Enzyms ist es selbstverständlich,
dass das Saatmedium und die nachfolgenden Zellwachstumsmedium zusätzlich zu den
oben beschriebenen oder anderen Kohlenstoffquellen eine geeignete Stickstoffquelle,
anorganische Salze, Be Magnesiumsulfat, Kaliumdihydrogenphosphat usw., und andere
Materialien gewünschtenfalls enthalten können. Ublicherweise wird die Kultur, z.B.
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Streptomyces venezuelae, bei einem pH im Bereich von etwa 7 bis 9
und bei einer Temperatur von etwa 20 bis etwa 40°C gezüchtet.
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Die tatsächliche Isomerisierungsstufe, in Abhängigkeit von der Quelle
der Enzymzubereitung, Konzentration an Glukose, Temperatur, Anwesenheit oder Abwesenheit
von Enzymkofaktoren u,dgl., kann in der erforderlichen Zeit, um höchste Pruktoseausbeuten
zu erzielen, schwanken. Übericherweise werden angemessene Ausbeuten erhalten in
einer Zeit von etwa 1 bis etwa 36 Stunden. Während dieser Stufe kann die Temperatur
Raumtemperatur sein oder auf etwa 50-70°C gesteigert werden.
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Überlicherweise wird das pH des der Isomerisierung unterworfenea Glukesesystems
auf etwa 7-9 durch Verwendung geeigneter Puffersysteme, z.B. eines Phosphatpuffers,
eingestellte Andere Aktivateren, z.B. Magnesium- oder Manganionen kennen auch anwesend
sein. Es kann mitunter möglich sein, Nebenreaktionen auf einem Mindestenss zu halten
durch Zusatz von Inhibitoren, beispielsweise von Natriumersennt, Natriumersenit
und Natriumfluorid. Es wurde festgestellt, dass Enzymaktivität auf ein Maximum durch
Verwendung einen Enzymkefaktores, wie z.B. Kobalt, in Form von Kekalteblebidsalz,
erhöht werden kann.
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Die Glukose selbst ist üblicherweise zugegen in Form einer konzentrierten
Lösung, Ausgezeichnete Ergebnisse wurden festgestellt, wenn die Glukosekonzentration
0,5-5,0 molar ist. Selbstverständlich können auch verdünntere Glukosequellen ebenso
wie übersättigte Lösungen isomerisiert werden.
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Die folgenden Beispiele erläutern typische Ausführungsformen der Erfindung.
Selbstverständlich werden die Beispiele nur zur Erläuterung und nicht zur Beschränkung
gegeben, Alle Bezugnshmen auf Teile und Prozentsätze sind gewichtemässige, wenn
nichts anderes angegeben.
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Beiespiel 1 Extrazellulare Glukoisomerase-Enzyme-Zubereitungen wurden
hergestellt aus zwei Spezies, nämlich S. venezulae ATCC No. 21113 und S. Olivochromogens,
ATCC No. 2114, und die Enzymzubereitungen wurden zum Isomerisieren von Glukose-Mustern
verwendet.
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Das bei diesem Versuch benutzte Kulturmedium hatte folgende Zusammensetzung:
Xylose o,5g Löslich gemachte Karteffelstärke 0,5g Pepton 1,0 g Fleischextrakt 0,5
g Hefeextrakt 0,25 g Natriumchlorid 0,5 g Magnesiumsulfat 0,05 g Kebaltchklorid
0,005 g.
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Das pH des Kulturmediums wurde auf etwa 7,0 für der Impfung eingestellt.
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Nach dem Sterilisieren WLd abkühlen auf 25°C wurden 100 ml Muster
des verstehenden Xylese-Stärke-Mediums mit der gerade erwähnten Spezies geimpft.
Die Imfungen wurden in spezifischer Weise durchgeführt durch Beimpfen des Mediums
mit drei Ösen voll an Zellen aus Xylese-Stärke-Agerzüchtung.
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Nach 48 stündiger Inkubation bei 2806 auf einemShaker zum Lüften der
Kultur wurden Zellen durch Zentrifugieren des Kulturmediums mit 10 000 Umdrehungen
pro Minute während 10 Minuten geerntet, Die #### Zellen wurden zweimal mit 0,85%iger
Salzlösung gewaschen und in 5 ml von 0,05 molarer Phosphatpufferlösung (pH 7,5)
suspendiert, Die Zellsuspension wurde dann in einem wassergekühlten Schalloszillator
während 20 Minuten bei 10 KO behandelt und dann nochmals mit 12 000 Umdrehungen
pro Minute während 30 Minuten geschleudert. Die überstehende Flüssigkeit wurde als
eine Rohquelle von intrazellularer Glukoisomerase-Enzym-Lösung verwendet.
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Rohr extrazellulare: Glukoisomerase wurde hergestellt durch Aussalzen
von 50 ml Kulturzentrifugat mittels Ammoniumsulfa von 60 Sättigung Nach dem Zentrifugieren
wurde die partiel gereinigte extrazellulare Enzymlösung erhalten durch Auflösen
der Ausfällung in 4 ml von 0,05 molarer Phosphatpufferlösung (pH 7,5) und Dialysieren
der Lösung gegen den Puffer während eines Tages bei 5°C.
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Die Isomerisierung selbst wurde durchgeführt durch Zubereiten einef
1,6 molaren wässrigen Lösung von Glukose, welche auch 0,05 molaren Phosphatpuffer,
0,2 molares Magnesiumsulfat und 0,05 molares Kobaltchlorid enthielt. 2 ML der oben
erwähnten Enzymlösungen wurden zu 2 ml der Glukose.
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lösung zugesetzt.
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Nach einer Inkubation von 3 Stunden bei 600C wurden 0,5 ml der Reaktionsmischung
abgezogen in 4,5 ml von 0,5 N Perchlorsäurelösung. Die Menge an in dem aliquoten
Teil gebildeter Fruktose wurde nach der Cystein-Carbazol-Methode bestimmt, wie sie
in J.Biol.Chem., 192 , 583(1951) beschrieben ist. In diesem Test wurde Farbintensität
während 10 Minuten bei 6000 nach dem Zusatz der Reagentien-entwickelt. Die Intensität
wurde dann in einem Spektrophotometer bei 560 au abgelesen und die Menge an vorhandener
nur Fruktose aus Standartwerten berechnet. Die erhaltenen Ergebnisse folgen. Enzylmaktivitäten
sind berechnet, um die
Aktivität pro ml an ursprünglichem Kulturmedium
zu zeigen.
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Tabelle I Mikroorganismus Intrazellulare Glukoisomeraseaktivität
ffi gebildeter mg Fruktose % Fruktose Fruktose pro ml Eul- pro ml Kulturflüssig-
turflüssigkeit keit S.olivochromogenes 38,9 5,6 0,97 S.venezuelae 37,5 5,4 0,94
Mikroorganismus Extrazellulare Glukoisomeraseaktivität % gebildeter mg Fruktose
% Fruktose Fruktose pro ml Kul- pro ml Sulturfldssig- turflüssigkeit ~~~~~~~~~~~~~~
S.olivochomogenes 5,6 1,3 0,22 S.venezuelae 24.8 5,8 0,99 Beispiel 2 Hier wurde
die Wirkung der Kulturperiode auf die Isomerase aktivität von S.venezuelae ATCC
Nr. 21113 untersucht. Das Kulturmedium und die anderen Bedingungen waren die gleiche
wie in Beispiel 1 beschrieben mit der Abhänderu dass 10 ml einer Vorkulturbrühe
als eine Impfung su den 100 ml Hauptkulturgemisch zugesetzt waren. Sowohl Zellen
wie Kulturfiltrat wurden nach 16, 20, 24, 48, 72 und 168 Stunden Inkubation geerntet
und als Glukoisomeraselösungen benutzt. Die Ergebnisse folgen in Tabelle II.
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Wie ersichtlich zeigte die intrazellulare Enzymaktivität aus S.venezuelae
Höchstaktivität nach nur 16 Kulturstunden und behielt diese Aktivität im wesentliohen
auf einer konstanten Höhe während etwa 7 Tagen. Die Extrazellulare Glukoisomerase-Enzym-Aktivität
von S.venezuelae nähm allmählich zu und blieh im allgemeinen nach etwa 2 Tagen konstant.
Somit ist ersichtlich, dass eine stark bevorzugte Enzym erzeugende Spezies S.venezuelae
fUr die Zwecke der Erfindung ist infolge der hervorragenden Aktivität ii
Erzeugen
sowohl erheblicher Mengen von extrazellular-und intrazellular-derivierter Aktivität.
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Tabelle II Mikroorganismus Kultur- Intrazellulare Glukoisomerase-Enzymperiode
Aktivität (Stunden) % gebildeter Mg Fruktose % Fruktose Fruktose pro ml Kul- pro
ml Kulturmedium turmedium S.venezuelae 16 39,3 5,6 0,98 20 - -24 39,9 5,7 1,0 48
56,4 5,2 0,91 72 38,0 5p5 0,95 168 38,0 5,5 0,95 Mikroorganismus Kultur- Extrazellulare
Glukoismerase-Enzymperiode Aktivität (Stunden) % gebildeter Mg Fruktose ffi Fruktose
Fruktose pro ml Kul- pro ml Kulturmedium turmedium S.venezuelae 16 7,0 1,6 0,28
20 11,0 2,5 0,44 24 17,3 4,o 056s 48 19,6 4,5 0,78 72 19,7 4s5 0,79 168 16,0 3,7
0,64 Beispiel 3 Hier wurde die Wirkung der Kohlenstoffquelle auf die Enzymerzeugung
untersucht. In einen Kulturmedium wurde 1,0% Xylose verwendet. In einem anderen
wurden 0,5% Xylose und 0,5% Kartoffelstärke benutzt. Wie aus Tabelle III ersichtlich,
lieferte das Stärke-Xylese enthaltende Mdium eine höhere Fruktose bildende Aktivität
im Vergleich zur Xylose, und insbesondere in Bezug auf die Lieferung von intrazellularer
Glukoisomerase-Enzym-Aktivität.
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Tabelle III Mikroorganismus Kohlenstoff- Intrazellulare Extrazellulare
quelle Glukoisomerase- Glukoisomerase-Enzym-Aktivität Enzym-Aktivität % gebildeter
% gebildeter Fruktose Fruktose S.venezuelae ATOO Xylose- 39,3 5,0 Nr. 21113 Stärke
39,5 5,0 S.venezuelae ATCC Xylose 24,5 3,5 Nr. 21113 S.olivochromogenes Xylose-
26,6 ATCC Nr. 21114 Stärke S.olivochromogenes Xylose. 14,9 ATCC Nr. 21114 Es ist
nicht ganz aufgeklärt worden, welche besondere Wirkung Stärke auf die Fruktosegewinnung
hat, wenn als Kulturmedium verwendet. Es wird Jedoch angenommen, dass die Stärke
in irgendeiner Weise das Wachstum des Mikroorganismus veranlasst = aktiviert und
infolge die sich darauS ergebende Enzymaktivität vergrössertv Beispiel 4 In einer
weiteren Versuchsreihe wurde die Enzym erzeugende Aktivität von S.venezuelae tiber
verschiedene Kulturzeiten verfolgt. Wie im nachstehenden gezeigt, wurde die intrazellulare
Glucoisomerase-Aktivität wiederum auf einer im wesenthohen konstanten Höhe sogar
während 7 Tagen beibehalten. Die extrazellulare Enzymaktivität dieses Spezies nahm
zu während der ganzen Wachstumsperiode und erreichte ein konstantes Maximum nach
etwa 5 Kulturtragen. Da während des Verlaufs diese Zeit die intrazellulare Enzymaktivität
nicht proportional verringert wurde, betont dies insbesondere die Tatsache, dass
die extrazellulare Aktivität sich nicht ableitet aus intrazellularer Enzymaktivität,
die aus Zellulatolyse freigesetzt wurde.
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Bei der Ausführung dieser Untersuchungen wurden die folgenden Wachstumemedien
für die Kultur von S.venezuelae ATCC Nr.21113 verwendet. Der Zusatz von Maisenweichflüssigkeit
zu den
Xylose-Stärke enthaltenden Medien als eine Stickstoffquelle
schien die Glukoseisomerisierung weiter zu begünstigen.
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Es folgt die Zusammensetzung der beiden benutzten Kulturmedien: Medium
mit Maiseinweich- Medium ohne Maiseinweichflüssigkeit g flüssigkeit g Xylose 0,5
Xylose 0,5 Kartoffelstärke 0,5 Kartoffelstärke 0,5 Maiseinweichflüssigkeit 1,0 Pepton
1,0 Pepton 0,5 Fleischextrakt 0,5 Fleischextrakt 0,5 Hefeextrakt 0,25 Hefeextrakt
0,25 Magnesiumsulfat 0,05 Magnesiumsulfat 0,05 Kobaltchlorid 0,0024 Kobalt chlorid
0,0024 Das pH dieser Medien war in beiden Fällen 7,2.
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Tabellen IV und V zeigen die Ergebnisse dieser serschiedenen Untersuchungen.
Tabelle IV bezieht sich'auf Enzymaktivität von SOvenezuelae, welche aus einem Maiseinweichflüssigkeit
enthaltenden Medium bestand Tabelle V zeigt die Aktivität aus einem Maiseinweichflüssigkeit
nicht enthaltenden Medium stammenden Enzym. Etwas bessere Ergebnisse wurden erhalten,
wenn Maiseinweichflüssigkeit einen Teil des Nährmediums bildete.
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Tabelle IV Zeit 16 20 24 30 2 3 5 7 10 Std. Std. Std. Std. Tage Tage
Tage Tage Tage pH 7,1 7,5 8,0 7,9 8,4 8,4 8,8 8,9 9,0 Intrazellulare Enzymaktivität
% gebildeter Fruktose 44,4 43,8 45,9 40,8 43,8 42,8 45,2 45,2 30,2 EXtrazellulare
Enzymaktivität % gebildeter Fruktose 4,4 9,6 8,9 9,5 13,9 13,6 17,8 16,8 15,1 Tabelle
V Zeit 16 20 24 30 2 3 5 7 10 Std. Std. Std. Std. Tage Tage Tage Tage Tage pH 7,3
7,6 7,75 8,1 8,2 8,4 8,6 9,0 9,0 Intrazellulare Enzymaktivität % gebildeter Fruktose
39,3 40,3 41,2 37,0 40,3 40,8 32,2 40,3 34,5 EXtrazellulare Enzymaktivität % gebildeter
Fruktose 3,2 - 4,3 5,4 5,0 11,6 14,6 13,4 8,0
Beispiel 5 Auch hier
wurden verschiedene Kohlenstoffquellen verwendet für die Gewinnung eines Glukoisomerase-Enzyms,
in diesem Fall einer Intrazellularen Glukoisomerase-Enzym-Zubereitung Wie aus den
Werten der folgenden Tabelle VI entnehmbar, war die Xylose-Stärke-Nährstoffmi deutlich
überlegen in der Erzeugung von aktivaren Glukoisomerase-Enzym-Zubereitungen im Vergleich
zu Xylose oder Stärke allein als Nährstoffmedium.
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Tabelle VI Mg Enzym *Kohlenstoff- % pro ml Mikroorganismus quelle
Fruktose Reaktion Gemisch S.venezuelae, ATCC Nr. 21113 Xylose-Stärke (Mischung 50-50
Gew.%) 35,5 12,5 Xylose 9,2 6,8 " Stärke 0 5,9 " Glukose 0 13,5 * Die Gesamtmenge
a: verwendetem Nährstoff war die gleiche in allen Fällen.
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Beispiel 6 Hier wurde eine Anzahl von Variablen untersucht mit Bezug
auf die Gewinnung von extrazellularen und Intrazellularen Glukoisomerase-Enzym-Zubereitungen
durch die S.venezuelae Spezies ATCC Nr. 21113.
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Zuerst wurden die extrazellulare und intrazellulare Enzymaktivitäten
untersucht in Bezug auf die Wirkung despH.
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Die Umwandlungsreaktion aus dem extrazellularen Typ erreichte ein
Optimum bei einem pH von etwa 9,0. Die in zellulare Aktivität war auch optimal bei
einem pH von etwa 9,0.
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Auch wurden verschiedene Versuche durchgeführt, um fest zustellen,
welche Wirkung die Temperatur auf ic Aktivitäten von extrazellularen und intrazellularen
Enzymen von S.venezulae hinsichtlich der Begünstigung der Umwandlung
besitzt.
Die intrazellulare Aktivität nahm til linear über einen Temperaturbereich von 4000
bis zu etwa 7Q°O bei Reaktionszeiten von 1 und 5 Stunden zu. Das Optimum wurde bei
etwa 70°C gefunden. Bei einer halbstündigen Reaktionszeit war die optimale Temperatur
80°C. Wenn die Reaktionszeit über etwa 1 Stunde dauert nimmt die intrazellulare
Aktivität oberhalb einer Temperatur von etwa 70°C ab. Die gleiche Einwirkung der
Temperatur wurde auch auf die extrazellulare Aktivität festgestellt mit der Ausnahme,
dass Inaktivierung bei einer etwas höheren Temperatur auftritt.
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Bei einer anderen Reihe von Untersuchungen wurden 0,5, 1,0, 2,0,'
3,0 und 4,0 Molare Konzentrationen von Glukose sowohl mit extrazellularen wie auch
intrazellularen Glukoisomerase-Enzymen von S.venezuelae behandelt. Es wurde gefunden,
dass sogar bei der aussergewöhnlich hohen Konzentration von 4,0 Molen Glukose pro
Liter, fast eine gesättigte Lösung, sowohl die intrazellulare wie die extrazellulare
Enzymreaktion fortschritt und sich dem theoretischen Gleichgewicht näherte, wenn
die Reaktionszeit ausgedehnt wurde. Somit ist ersichtlich, dass die Erfindung geeignet
war, sogar hochkonzentrierte Glukosellösungen zu isomerisieren, was sie noch reizvoller
für ein technisch ausführbare Verfahren macht.
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In einer noch anderen Versuchsreihe wurde die Isomerisierungsreaktion
während einer verhältnismässig langen Zeit durchgeführt, um einen annähernden Gleichgewichtszustand
zu bestimmen. In Bezug auf Intra Umwandlung unter Verwendung intrazellularen Enzyms
aus .venezuelae erreichte der Fruktosegehalt etwa 48% des sugesetzten Zuckers unter
Ausgehen von Glukose. Andererseits wenn Fruktose das Substrat war, war der schliessliche
Fruktosegehalt etwa 50%. Somit scheint es, dass der Gleichßewichtspunkt in der Nachbarschaft
von etwa 48-50% Extra Umwandlung liegt.
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Beispiel 7.
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Es wurde bei Laboruntersuchungen festgestellt, dass,während eine Anzahl
von Strentomyces Species extrazellular-derivierte Glukoisomeraseaktivität entfaltet,
eine überraschende Anzahl keine Glukoisomeras e-Enzlym-Aktivität extrazellularen
Charakters besitzt. Untersuchungen, wie im allgemeinen in Beispiel 1 angegeben,
wurden mit einer sehr grossen Anzahl von Strentomyces Spezies durchgeführt. Die
Ergebnisse bei einigen wenigen von diesen folgen in der Tabelle VII.
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Tabelle VII Mikroorganismus Extrazellulare Glukoisomerase-Aktivität
mg Fruktose * Fruktose pro ml Kultur- pro ml Kulturflüssigkeit flüssigkeit S.aureus
0 0 B.flaveolus O 0 S.coelicolor O 0 S.parvus 1,4 0,24 S.roseochromogenus O 0 S.purpurascens
D 0 S.scabies 1,3 0,23 S.vinaceus 1,6 0,28 S.@anaschiensis 1,9 0,33 Während die
Erfindung an besonderen Ausführungsbeispielen besenrieben wurde,ist es selbstverständlich,
dass sie weitererAbwandlungen fähig ist. Sie umfasst alle Abwandlungen, Verwendungen
oder Anpassungen, wobei sie grundsätzlich benutzt wird und schließt solche Abweichungen
von der vorstehenden Offenbarung ein, die sich aus der üblichen Praxis auf dem infrage
kommenden technischen Gebiet für den Fachmann ergeben.