CH412755A

CH412755A - Verfahren zur Herstellung von gereinigten salzfreien Enzympräparaten

Info

Publication number: CH412755A
Application number: CH487162A
Authority: CH
Inventors: Ziegler Fritz; Frommer Werner
Original assignee: Bayer Ag
Priority date: 1961-05-23
Filing date: 1962-04-24
Publication date: 1966-05-15
Also published as: GB1259627A

Description

Verfahren zur Herstellung von gereinigten salzfreien Enzympräparaten
Es ist bekannt, dass man Eiweissstoffe aus ihren Lösungen in Form von wasserunlöslichen Verbindungen mit Tannin ausfällen kann. Darauf beruht die Verwendung des Tannins als Gruppenreagenz für Eiweissstoffe. Bei dieser Fällung werden jedoch ausser den Eiweissstoffen auch noch andere Verbindungen mitausgefällt, deren Tannate ebenfalls unlöslich sind. Die völlige Abtrennung des Tannins aus den so erhaltenen gemischten Niederschlägen ist im allgemeinen sehr schwierig, da sich diese Niederschläge oft nur unvollständig in ihre Komponenten zerlegen lassen. Es gelingt zwar, durch oftmaliges Auswaschen mit Aceton oder mit Alkoholen den grössten Teil des Tannins aus reinen Eiweissfällungen herauszuwaschen, ohne dass dabei jedoch eine Trennung der Eiweissstoffe ermöglicht wird.

Aus diesem Grunde wurde die Methode der Tanninfällung nur selten zur Reinigung und Anreicherung von Eiweissstoffen herangezogen. Auch für die Herstellung von Enzympräparaten wurde sie wegen ihrer Unspezifität kaum angewendet.

Es wurde nun gefunden, dass man gereinigte salzfreie Enzympräparate dadurch herstellen kann, dass man Enzymlösungen mit Tannin fällt, aus dem noch andere Eiweissstoffe und Ballaststoffe enthaltenden Niederschlag nach dem Auswaschen mit Wasser die Enzym-Tannate mit wässrigen Lösungen von mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln extrahiert, und aus den Extrakten die Enzyme durch mit Wasser mischbare Ketone oder Alkohole frei von Tannin ausfällt.

Es hat sich nämlich gezeigt, dass die Tannate vieler Enzyme im Gegensatz zu den Tanninverbindungen der meisten übrigen Eiweisskörper und der oft mitanfallenden Ballaststoffe überraschenderweise in wässrigen Lösungen von mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln leicht löslich sind, so dass sie in verhältnismässig einfacher Weise von den übrigen Tanninverbindungen abgetrennt werden können.

Die Gewinnung der tanninfreien Enzyme aus den dabei erhaltenen Extrakten wird erfindungsgemäss in einfacher Weise dadurch vorgenommen, dass man mit Wasser mischbare Alkohole oder Ketone zusetzt. Dabei fallen die Enzyme aus, während das Tannin gelöst bleibt. Die Enzyme können dabei frei von löslichen Salzen erhalten werden, wenn man die Tanninniederschläge zuvor mit Wasser auswäscht.

Das erfindungsgemässe Verfahren kann deshalb auch dazu verwendet werden, bereits vorgereinigte, aber noch wasserlösliche Verbindungen, vor allem Salze enthaltende Enzympräparate, ohne Vorschaltung umständlicher Massnahmen von diesen Ballaststoffen zu befreien. Zu diesem Zweck kann der Tanninniederschlag nach dem Auswaschen mit Wasser z. B. mit etwa 50 Sigem Aceton extrahiert und der Extrakt dann zur Ausfällung der Enzyme z. B. mit der 3-6fachen Menge Aceton weiter behandelt werden.

Anstelle von Aceton sind zur Extraktion auch andere mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel, z. B. Alkohole, Glykole, Glykoläther, Ketone, Dioxan, Tetrahydrofuran, Milchsäureäthylester, Formamid, geeignet, während zur Ausfällung der Enzyme aus den Extrakten mit Wasser mischbare Ketone und Alkohole verwendet werden.

Für die Extraktion stellt man den Wassergehalt des Gemisches in der Regel auf 20-80 S ein. Bei Verwendung von Glykolen sind geringere Wassergehalte als bei der Verwendung von Alkoholen und insbesondere Ketonen zweckmässig.

Nach dem erfindungsgemässen Verfahren werden Enzympräparate in verhältnismässig reiner Form in Ausbeuten erhalten, die wesentlich über denjenigen liegen, die nach den früheren Verfahren, z. B. bei Tannin, in etwa 7 Liter Wasser gelöst, eingerührt.

Nach dem Einstellen eines pH-Wertes von etwa 5,8 in der Lösung blieb diese 2 Stunden stehen. Nach dieser Zeit wurde der entstandene Niederschlag ab geschleudert, einmal mit dem mehrfachen Volumen Wasser aufgeschlämmt und wieder abgeschleudert.

Der stark aufgequollene Niederschlag wurde nun nach. einander mit 7 Liter 60 "igem, 5 Liter 50 Sigem und 3 Liter 40 9igem wässrigem Aceton eluiert, die Elutionen vereinigt (etwa 17 Liter) und nach dem völligen Klären durch ein Druckfilter in die 5fache Menge Aceton gegossen. Der entstehende Niederschlag wurde mit Aceton nochmals ausgewaschen und dann getrocknet. Ausbeute 538 g mit etwa 94,5 TVE pro Milligramm entsprechend etwa 50,48 Mill. TVE oder 845S der im Kulturfiltrat vorhandenen Enzymmenge.

Beispiel 3
Eine aus Pankreatin hergestellte durch Filtration geklärte Lösung enthielt pro Kubikzentimeter 168 TVE. 490 cm3 dieser Lösung wurden nach Zugabe von 20 cm3 gesättigter Ammonsulfatlösung mit 50 cm3 1OXiger Tanninlösung gefällt. Der Niederschlag wurde nach einstündigem Stehen abgeschleudert, einmal mit destilliertem Wasser ausgewaschen und dann mit 50 obigem Aceton eluiert. Die von den unlöslichen Anteilen getrennte und durch Filtration geklärte Elution, etwa 80 cm3, wurde mit etwa dem 6fachen Volumen Aceton gefällt, der Niederschlag mit Aceton ausgewaschen und dann getrocknet. Es wurden 1,4 g eines Präparates erhalten, das pro Milligramm 42,8 TVE, insgesamt also etwa 73 % der in der Lösung enthaltenen proteolytischen Enzyme aufwies.

Durch Versetzen der Acetonrestlösung mit einer acetonischen Lösung von Salicylsäure wurde noch eine kleinere Menge (0,330 g) eines Präparates ausgefällt, das pro Milligramm etwa 13,0 TVE enthielt.

Die Prüfung der Amylase-Aktivität der Hauptfällung ergab, dass sie etwa 162 Ampere-Einheit im Gramm enthielt, gegenüber etwa 8 Ampere-Einheiten im Gramm des Ausgangspräparates, von dem bei der Herstellung der Lösung aber ein Teil ungelöst geblieben war.

Beispiel 4
50 g eines Rohpräparates von Pilzprotease, das pro Milligramm 11,8 TVE - insgesamt also etwa 590 000 TVE - enthielt, wurden in 700 cm3 destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wurde mit 5 g Tannin, das ; in 50 cm3 Wasser gelöst worden war, versetzt und dann auf einen pH-Wert von etwa 5,8 eingestellt. Nach zweistündigem Stehen wurde der Niederschlag abgeschleudert und einmal mit dem mehrfachen Volumen destillierten Wassers ausgewaschen. Der abgeschleuderte, feuchte Niederschlag wurde nun mit etwa 200 cm3 50 % igem kaltem Äthanol eluiert, wobei er zum grössten Teil in Lösung ging. Nach dem Klären durch Filtration wurde die Elution (200 cm3) in zwei gleiche Teile der Sprühtrocknung oder bei der Ausfällung mit Ammonsulfat erhalten werden.

Das erfindungsgemässe Verfahren hat ausserdem den grossen Vorteil, dass es ein sehr schonendes Verfahren ist und daher nicht die Gefahr einer ganzen oder teilweisen Zerstörung der Enzyme in sich birgt.

Beispiel 1
410 Liter der filtrierten Kulturbrühe eines cellulose-abbauende Enzyme produzierenden Schimmelpilzes, die pro Kubikzentimeter etwa 3,2 LVE (Lichenase-Vergleichs -Einheiten nach W. Grassmann) enthielt, insgesamt also etwa 1,30 Mill. LVE, wurden im Vakuum bei 300 etwa auf 100 Liter eingeengt. Das Konzentrat wurde unter Rühren mit 10 kg Ammonsulfat und 600 g Tannin, in 6 Liter Wasser gelöst, versetzt. Nach Einstellen eines pH Wertes von etwa 5*8 blieb die Lösung mit dem Niederschlag etwa 2 Stunden stehen. Dann wurde der in feuchtem Zustand mehrere Kilogramm ausmachende Niederschlag abgeschleudert, durch Aufschlämmen in Wasser und nochmaliges Abschleudern ausgewaschen und dann zuerst mit 50 50igem, dann mit 40Sigem, wässrigem Aceton eluiert.

Die durch Passieren eines Druckfilters geklärten und vereinigten Eluate, etwa 15 Liter, wurden mit etwa 65 Liter Aceton versetzt; zur Beschleunigung der Ausflockung der Proteinstoffe wurde eine geringe Menge einer acetonischen Lösung von Salicylsäure hinzugegeben, die zugleich eine Aufhellung der Lösung bewirkte. Nach kurzem Stehen wurde der Niederschlag abgeschleudert, nochmals mit Aceton ausgewaschen und dann getrocknet. Es hinterblieben 360 g eines in Wasser löslichen Präparates, das pro Gramm etwa 1875 LVE, insgesamt also 0,675 Mill.

LVE, enthielt. Da die Tanninfällung noch nicht vollständig war, wurde die Mutterlauge von der Tanninfällung mit weiteren 300 g Tannin versetzt. Der sich bildende Niederschlag wurde in der gleichen Weise wie der erste aufgearbeitet und lieferte noch 270 g eines Trockenpräparates mit etwa 940 LVE/g, insgesamt etwa 0,252 Mill. LVE. Die Gesamtausbeute betrug somit 0,928 Mill. LVE, das sind etwa 71 % der in der Ausgangslösung vorhandenen Enzymmenge.

Beispiel 2
In 540 Liter eines aus der Züchtung eines Proteasen erzeugenden Schimmelpilzes stammenden Kulturfiltrates, das pro Kubikzentimeter etwa 110 TVE (TVE = Tyrosin-Vergleichs-Einheit, eine für die Routine-Bestimmung von uns verwendete kleine Protease-Einheit, die wie die von Anson eingeführte T.-U. [Tyrosin-Unit] auf der Freilegung von Tyrosin aus Kasein unter der Einwirkung von Proteasen beruht und nach der gleichen Methode bestimmt wird, aber wesentlich kleiner ist und den bei der spektrophotometrischen Bestimmung herrschenden Grössenverhältnissen angepasst ist) enthielt, insgesamt also etwa 59,4 Mill. TVE, wurden 50 kg Ammonsulfat gelöst und dann in die Lösung 750 g mit 40 cm3 etwa 60 % igem Äthylenglykol eluiert.

Nach dem Klären wurde die Elution mit dem 8fachen Volumen Aceton gefällt, der Niederschlag mit Aceton gewaschen und getrocknet. Ausbeute etwa 2,2 g Trockenpräparat mit etwa 77 TVE/mg, entspricht etwa 169 000 TVE oder etwa 72 % der in der Ausgangslösung enthaltenen Protease.

Beispiel 7
25 g eines rohen Protease-Präparates mit 11,8 TVE/mg wurden in 250 cm3 destilliertem Wasser gelöst und nach Zugabe von etwas Ammonsulfat mit 5 g Tannin bei pH etwa 5,7 gefällt. Nach dem Auswaschen des Niederschlages mit Wasser wurde er mit etwa 60 cm3 einer 510 % eigen Lösung von Äthylenglykol-mono -äthyl äth er (= Äthyl glykol) eluiert, die Elution geklärt und mit etwa 450 cm3 Aceton gefällt. Der Niederschlag wurde mit Aceton ausgewaschen und getrocknet. Ausbeute 2,85 g Trockenpräparat mit etwa 71,5 TVE/mg, entspricht etwa 70 % Ausbeute.

Claims

PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung von gereinigten salzfreien Enzympräparaten, dadurch gekennzeichnet, dass man Enzymlösungen mit Tannin fällt, aus dem noch andere Eiweissstoffe und Ballaststoffe enthaltenden Niederschlag nach dem Auswaschen mit Wasser die Enzym-Tannate mit wässrigen Lösungen von mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln extrahiert, und aus den Extrakten die Enzyme durch mit Wasser mischbare Ketone oder Alkohole frei von Tannin ausfällt. geteilt, von denen 100 cm3 mit 600 cm3 Aceton und 100 cm3 mit 600 cm3 kaltem Äthanol gefällt wurden. Die Ausflockung wurde durch Zugaben geringer Mengen von Ammoniumsalicylat unterstützt.

Die Niederschläge wurden mit den Fällungsmitteln ausgewaschen und dann getrocknet. Es ergaben sich bei der Acetonfällung 3,25 g Trockenpräparat mit etwa 68,0 TVE/mg, entsprechend etwa 75% Ausbeute, während bei der Äthanolfällung 2,90 mg Präparat mit etwa 67,5 TVE/mg, entsprechend etwa 66 1% Ausbeute erhalten wurden.

Beispiel 5 250 cm3 der Lösung eines rohen Proteasepräparates, die pro Kubikzentimeter etwa 94,5 TVE insgesamt etwa 236000 TVE-enthielt, wurden unter Zugabe von etwa 5 % Ammonsulfat mit 5 g Tannin bei pH 5,9 gefällt. Nach 2 Stunden wurde der Niederschlag abgeschleudert und mit destilliertem Wasser ausgewaschen. Der feuchte Niederschlag wurde mit etwa 60 cm3 50% dem Isopropylalkohol eluiert und die Elution durch Filtration geklärt. Das klare Filtrat wurde mit 360 cm3 kaltem Isopropylalkohol gefällt, der Niederschlag durch Abschleudern abgetrennt und nach dem Auswaschen mit Aceton getrocknet. Es ergaben sich etwa 2,0 g eines Trokkenpräparates mit etwa 83,0 TVE/mg, entsprechend etwa 70 S Ausbeute.

Beispiel 6 250 cm3 der für Beispiel 5 verwendeten Proteaselösung wurden in gleicher Weise mit Tannin gefällt, der Niederschlag mit Wasser gewaschen und dann