Verfahren zur Herstellung von S-Benzoylthiamin-o-monophosphat
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines neuen Thiaminderivates, nämlich S-Benzoylthiamin-o-monophosphat der folgenden Strukturformel
EMI1.1
Diese Verbindung, wie auch deren Salze, sollen als Arznei- und Nahrungsmittel Verwendung finden.
Wenn diese Verbindungen verabreicht werden, werden sie zu einem grossen Teil absorbiert und produzieren eine sehr hohe und dauerhafte Erhöhung des Thiaminspiegels im Körper, verglichen mit Thiaminhydrochlorid. Es ist wohlbekannt, dass Thiaminhydrochlorid für die Therapie und die Ernährung eine wichtige Verbindung ist. Wegen der niedrigen Absorption und dem kurzen Verbleib von Thiaminhydrochlorid im Körper war es erwünscht, ein Thiaminderivat zur Verfügung zu haben, das eine höhere Absorption zeigt und länger im Körper verbleibt als Thiaminhydrochlorid.
Die folgenden experimentellen Daten zeigen deutlich, dass S-Benzoylthiamin-o-monophosphat und Salze davon, wie z. B. das Natriumsalz, nach der Verabreichung sehr leicht absorbiert werden können und eine hohe dauerhafte Zunahme des Thiaminspiegels im Körper bewirken im Vergleich mit bekannten Thiaminderivaten, wie z. B. Thiaminhydrochlorid. 1. Blutspiegel bei Hunden (1) Methode
Als Versuchssubstanzen wurden Kristalle von S-Benzoylthiamin-o-monophosphat und dessen Natriumsalz und Thiaminhydrochlorid (nach der japanischen Pharmakopoe) verwendet. Sie wurden den Hunden in Mengen von 4,49 mg S-Benzoylthiamino-monophosphat 2 H,O (entsprechend 3 mg Thiaminhydrochlorid), 4,54 mg Dinatriumsalz des genannten Thiaminesters (die äquivalente Menge) und 3 mg Thiaminhydrochlorid pro kg Körpergewicht des Hundes verabreicht.
Weibliche Inzuchthunde mit einem Gewicht von 14,4 kg, 13,4 kg und 7,9 kg wurden als Versuchstiere verwendet. Es wurde ihnen Hundefutter (hergestellt durch: Japan Cold-Storage Company, Ltd.) während zwei Tagen vor der Verabreichung der Versuchsverbindung verabreicht und 24 Stunden vor und während der Blutentnahme wurde ihnen keine Nahrung mehr verabreicht, um den Blutthiaminspiegel so konstant wie möglich zu halten und um eine Veränderung der Versuchsbedingungen zu verhindern.
Das Blut wurde der Vene des Vorderbein-Cubitus des Versuchstieres in Mengen von je 2 cms vor und in bestimmten Intervallen nach der Verabreichung des oben erwähnten Versuchsmusters entnommen.
Das Blut aus jeder Entnahme wurde unmittelbar in 12 cm3 destilliertem Wasser aufgelöst und die Totalmenge an Thiamin wurde nach der thiochromfluorimetrischen Methode bestimmt.
(2) Ergebnis
Die Versuchsergebnisse sind aus Tabelle I ersichtlich.
Tabelle I
Blutspiegel des Gesamtthiamins bei Hunden nach oraler Verabreichung
Körper- Blutthiamiospiegel, γ % Ver- gewicht Versuchssubstanz und Dosis suchs- des Vor mg/kg Körpergewicht Nach Verabreichung, Stunden
Nr. Hundes Verab- in kg reichung 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Thiaminhydrochlorid 1 14,4 9,0 18,6 26,5 - 19,1 - 12,0 - - - 9,0
3 mg/kg 2 13,4 9,0 26,7 22,4 - 14,7 - 12,0 - - - 9,0 S-Benzoylthiamin-o-mono phosphat (2H2O),
4,49 mgikg 3 13,4 9,0 157,1 81,4 - 46,9 - 37,4 - - - 24,8 Dinatrium-S-benzoylthiamin o-monophosphat
4,54 mg/kg 4 7,9 8,8 78,1 - 53,6 - 36,0 - - 26,9 - -
Wie aus der Tabelle hervorgeht,
erreicht der Blutthiaminspiegel bei der Verabreichung von S-Benzoylthiamin-o-monophosphat und dessen Dinatriumsalz das Maximum innerhalb von ein bis zwei Stunden.
Es ist überraschend, dass die maximalen Thiaminmengenzunahmen im Blut bei der Verabreichung von S-Benzoylthiamin-o-monophosphat und dessen Dinatriumsalz ungefähr 4- bis 8mal grösser sind als diejenigen nach der Verabreichung von Thiaminhydrochlorid. Sie betragen im Falle der beiden erfindungsgemäss hergestellten Verbindungen 148,1 und 69,3 γ%, während sie im letzteren Falle 17,5 und 17,7 γ% betragen. Im weiteren sind die Thiaminblutspiegelwerte nach der Verabreichung der erfindungsgemäss hergestellten Verbindungen wesentlich höher, selbst 6 bis 8 Stunden nach der Verabreichung, als selbst diejenigen, die unmittelbar nach der Verabreichung von Thiaminhydrochlorid festgestellt werden können.
2. Urinabscheidung beim Menschen (1) Methode
Die verwendeten Versuchsmuster und die Methode der Thiamingehaltsprüfung waren dieselben wie im vorhergehenden Experiment. Die Thiamtn- ausscheidung im Urin des erwachsenen Menschen in einem Zeitraum von 24 Stunden nach der oralen Verabreichung wurde ohne Einschränkung der Arbeit oder der Nahrung bestimmt.
(2) Ergebnisse
Die Ergebnisse sind aus Tabelle II ersichtlich.
Tabelle II Körpergewicht (kg) Thiaminausscheidung im Urin Versuchssubstanz Versuchsund Alter in 24 Stunden (Dosis in mg/kg Körpergewicht) Nr. des Mannes γ Thiaminhydrochlorid 1 60 24 1,029
1 mg/kg 2 72 32 1,008 S-Benzoylthiamin-o-mono- 3 60 24 14,230 phosphat # (2H2O) 4 72 32 25,250
1,49 mg/kg
Die in der Tabelle angegebenen Daten zeigen, dass die im Urin nach der Verabreichung von S-Benzoylthiamin-o-monophosphat ausgeschiedenen Thiaminmengen 14- bis 25mal so gross sind wie nach der Verabreichung von Thiaminhydrochlorid, was deutlich zeigt, dass die erstgenannte Verbindung viel besser im Körper absorbiert werden kann als die letztere.
3. Andere biologische Merkmale von S-Benzoyl thiamin-o-monophosphat
S-Benzoylthiamin- o-monophosphat hat eine niedrigere Toxizität als Thiaminhydrochlorid, wie aus Tabelle III hervorgeht.
Tabelle III
Akute Toxizität bei Inzuchtmäusen (A-Klasse) LD50 in mg/g Körpergewicht
Verabreichungsmethode
Per os Intravenöse Injektion
Thiaminhydrochlorid 9 0,1
S-Benzoylthiamin o-monophosphat 15 2,2
S-Benzoylthiamin-o- monophosphat ist gegen Aneurinase I und II und gegen thiaminzerstörende Enzyme resistent, wie sie durch Kultivierung von Bacillus thiaminolyticus Matsukawa et Misawa und Bacillus aneurinolyticus Kimura et Aoyama produziert werden.
S-Benzoylthiamin-o-monophosphat ist deshalb so bedeutungsvoll, weil es im Körper ohne weiteres in die aktive Form von Thiamin übergeführt werden kann und somit vom Körper unmittelbar als Thiaminquelle verwendet werden kann. Im weiteren kann dieses Thiaminderivat im Körper sofort absorbiert werden, wobei für lange Zeiten hohe Thiaminspiegel in den inneren Organen aufrechterhalten werden. Die erfindungsgemäss hergestellten Verbindungen sind deshalb besonders nützlich als Arzneimittel, insbesondere in jenen Fällen von Erkrankungen, bei denen die bekannten Thiaminderivate, wie z. B. Thiaminhydrochlorid, nicht wirksam sind.
Das S-Benzoylthiamin-o-monophosphat kann beispielsweise wie folgt hergestellt werden:
1. Thiaminmonophosphat wird mit Benzoylchlorid bei einem pH von 7-14 umgesetzt. Die Reaktion kann so dur igeführt werden, dass die Reaktionsteilnehmer unter alkalischen Bedingungen, also bei einem pH von 7-14, vorzugsweise 9-12 in Wasser oder einem wässrigen, organischen Lösungsmittel, wie wässrigem Methanol, wässrigem Äthanol oder wässrigem Aceton behandelt werden. Die Reaktionstemperatur kann je nach dem pH der Reaktionsmischung variiert werden und in der Praxis werden Temperaturen angewendet, die unterhalb derjenigen liegen, die eine Zersetzung des thiolartigen Thiamins beim verwendeten pH bewirken. In der Praxis ist es zweckmässig, diese Reaktion bei Temperaturen von 0-300C, insbesondere von ungefähr 250 C, durchzuführen.
Das molare Verhältnis der zu verwendenden Ausgangsprodukte ist theoretisch 1:1, aber es ist zweckmässig, ein solches von 1,5 bis 3 Mol Benzoylchlorid pro 1 Mol Thiaminmonophosphat zu wählen.
Wenn Wasser als Reaktionsmedium gebraucht wird, dann wird die Reaktionsmischung nach Beendigung der Reaktion gegebenenfalls aufkonzentriert und angesäuert (z. B. auf ein pH von 3,5 bis 4), und zwar z. B. mit Salze der Schwefelsäure. Danach wird der Niederschlag abfiltriert, um das gewünschte Produkt zu erhalten. Wenn ein wässriges, organisches Lösungsmittel als Reaktionsmedium verwendet wird, dann wird die Reaktionsmischung nach Beendigung der Reaktion konzentriert, um das organische Lösungsmittel zu entfernen. Danach wird das Konzentrat mit einer Säure angesäuert und der gebildete Niederschlag abfiltriert.
2. Thiaminmonophosphat wird bei einem pH von 7-14 mit Natriumbenzoylthiosulfat (C,H,COSSO,Na) umgesetzt. Diese Reaktion kann durch Behandlung der Reaktionsteilnehmer bei einem pH von 7-14, vorzugsweise 10-13 in Wasser oder in einem wässrigen organischen Lösungsmittel wie wässrigem Methanol, wässrigem Äthanol oder wässrigem Aceton durchgeführt werden. Die Reaktionstemperatur kann in Abhängigkeit vom Reaktions-pH variiert werden und in der Praxis wird die Reaktion unterhalb Temperaturen durchgeführt, die eine Zersetzung des thiolartigen Thiamins beim verwendeten pH bewirken.
Es ist zweckmässig, die Reaktion bei Temperaturen von 0 bis 30", vorzugsweise von 5 bis 200 C, durchzuführen. Das molare Verhältnis der Reaktionsteilnehmer ist theoretisch 1:1, jedoch werden in der Praxis vorzugsweise 1,5 bis 3 Mol Natriumbenzoylthiosulfat auf ein Mol Thiaminmonophosphat verwendet. Bei der eigentlichen kommerziellen Produktion ist es zweckmässig, das Thiaminmonophosphat mit dem Natriumbenzoylthiosulfat in einem molaren Verhältnis von 1:1,5 bis 2 und bei einem pH von ungefähr 11 bis 12 und bei einer Temperatur von ungefähr 200 C während 1 bis 2 Stunden zu behandeln. Nach Beendigung der Reaktion wird das S-Benzoylthiamin-o-monophosphat in derselben Weise aus der Reaktionsmischung erhalten, wie dies vorne unter 1. beschrieben ist.
Wenn Wasser als Reaktionsmedium verwendet wird, dann wird die Reaktionsmischung gegebenenfalls aufkonzentriert und dann angesäuert (z. B. auf ein pH 3,5-4), und zwar beispielsweise mit Salze der Schwefelsäure. Der darauf gebildete Niederschlag wird durch Filtration isoliert. Wenn ein wässriges, organisches Lösungsmittel als Reaktionsmedium verwendet wird, dann wird die Reaktionsmischung konzentriert, um das organische Lösungsmittel zu entfernen. Danach wird in derselben Weise angesäuert, wie das oben beschrieben wurde. Der gebildete Niederschlag wird durch Filtration isoliert.
Der Gebrauch von Natriumbenzoylthiosulfat als Acylierungsmittel ist bisher nicht unbekannt. Es ist gefunden worden, dass diese Verbindung im vorliegenden Falle wirksam als Acylierungsmittel verwendet werden kann. Überdies gibt dieses Acylierungsmittel höhere Ausbeuten als Benzoylchlorid.
3. Thiaminmonophosphat wird mit Dibenzoyldisulfid (CGH5COSSCOC6H5) wie folgt umgesetzt: Zur Durchführung der Reaktion wird ein pH von 7 bis 14, vorzugsweise 11-13, gewählt, um die Reaktionsmischung alkalisch zu erhalten. Es ist zweckmässig, die Reaktion unterhalb denjenigen Temperaturen durchzuführen, die eine Zersetzung des thiolartigen Thiamins beim verwendeten pH bewirken, also z. B. im Bereiche von 5-300 C, vorzugsweise von 5 bis 20 C.
Diese Reaktion wird durchgeführt, indem man Thiaminmonophosphat einem wässrigen, organischen Lösungsmittel, wie wässrigem Methanol, wässrigem Äthanol oder wässrigem Aceton, zufügt, das pH innerhalb des oben beschriebenen Bereiches hält und dann der resultierenden Mischung eine Lösung von Dibenzoyl-disulfid in einem organischen Lösungsmittel wie Chloroform oder Dichloräthan zu setzt.
Nach Beendigung der Reaktion kann das S-Benzoylthiamin-o-monophosphat nach dem folgenden Verfahren aus der Reaktionsmischung isoliert werden: Die Chlorofomischicht wird, wenn nötig nach Zusatz von Wasser zu der Reaktionsmischung, abgetrennt und die wässrige Schicht wird gegebenenfalls nach einer Konzentrierung angesäuert mit beispielsweise Salze der Schwefelsäure (z. B. auf ein pH von 3,5 bis 4). Der Niederschlag an S-Benzoylthiamin-o-monophosphat wird durch Filtration isoliert.
Das nach dem oben beschriebenen Verfahren erhaltene S-Benzoylthiamin-o-monophosphat ist eine stabile, kristalline, nicht hygroskopische und gegen Hitze und Wärme widerstandsfähige Verbindung. Es besitzt keine Geruchscharakteristik wie die gebräuchlichen Thiaminderivate. Es kann daher in therapeutischen und Nahrungsmittelpräparaten vielfältig verwendet werden. Im weiteren kann es in bekannter Weise in Salze übergeführt werden. Es kann z. B. mit Calcium- und Natriumhydroxyd in die entsprechenden Calcium- und Natriumsalze übergeführt wer den.
Beispiel 1
Einer Lösung von 4,3 Teilen Thiaminmonophosphathydrochlorid in 16 Teilen Wasser werden unter Eiskühlung 11 Teile einer 150/obigen Lösung von Natriumhydroxyd zugegeben. Der Mischung wer den unter Rühren 2,1 Teile Benzoylchlorid tropfen weise zugegeben, während die Reaktionsmischung durch gelegentliches Zufügen einer wässrigen Natriumhydroxydlösung alkalisch gehalten wird. Die erhaltene Lösung wird neutralisiert, im Vakuum konzentriert und das pH wird dann mit konzentrierter Salzsäure auf 3,5 bis 4 eingestellt, um das rohe S-Benzoyl thiamin-o-monophosphat auszufällen. Das erhaltene
Produkt wird in Wasser suspendiert und das pH durch Zusatz von Natriumhydroxyd zur Lösung auf
7,0 eingestellt.
Das pH der Lösung wird mit Salz säure auf 4,0 eingestellt, um das reine Produkt zu erhalten, das 3,4 g wiegt und einen Schmelzpunkt von 1650 C (unter Zersetzung) aufweist.
Analyse:
Berechnet für C19H23O0N4SP 2H2O :
C 45,49 H 5,42 N 11,15
Gefunden: C 45,56 H 5,37 N 11,02.
Das als Ausgangsmaterial verwendete Thiaminmonophosphat-hydrochlorid ist in der folgenden Weise hergestellt worden: 28,6 g einer 840/cigen Orthophosphorsäure wurden auf 2700 C erhitzt. Nach dem Abkühlen auf ungefähr 1000 wurden der erhaltenen Säure 4,0 g Thiaminhydrochlorid zugefügt und die Erhitzung wurde fortgesetzt, bis die Entwicklung des Chlorwasserstoffgases aufhörte. Die Reaktionsmischung wurde dann in Eiswasser geworfen und dem Gemisch wurde Aceton zugefügt, zur Ausfällung des Thiaminphosphates. Der Niederschlag wurde in 17 cm5 In Salzsäure aufgelöst und die Lösung bei Raumtemperatur während ungefähr 7 Tagen stehengelassen. Während dieser Zeit wird das Thiaminpolyphosphat zum Monophosphat hydrolysiert.
Danach wurde der Lösung Aceton zugefügt und die Mischung in einen Eisschrank gestellt, um das Thiaminmonophosphat-hydrochlorid zu erhalten.
Beispiel 2
Einer Lösung von 3,5 Gew.-Teilen Thiaminmonophosphat in 10 Gew.-Teilen Wasser wird unter Eiskühlung eine Lösung von 1,2 Teilen Natriumhydroxyd in 2,8 Teilen Wasser zugefügt. Der resultierenden Lösung werden in kleinen Portionen 3,6 Teile pulverisiertes Natriumbenzoylthiosulfat unter Rühren zugegeben. Während der Reaktion wird gelegentlich Natriumhydroxyd-Lösung zugefügt, um die Reaktionsmischung alkalisch zu halten. Die Reaktionsmischung wird dann filtriert, das pH auf 3,5 bis 4 eingestellt und dann stehengelassen, wobei sich ein kristalliner Niederschlag von S-Benzoylthiamin-o-monophosphat bildet, welcher derselben Nachbehandlung unterworfen wird, wie in Beispiel 1 beschrieben. Ausbeute 4,0 Teile. Schmelzpunkt ungefähr 1650 C (unter Zersetzung).
Das in der obigen Reaktion verwendete Natriumbenzoylthiosulfat kann nach der folgenden Methode erhalten werden: Einer Lösung von 3,2 Teilen Natriumthiosulfat (mit 5 Molekülen Kristallwasser) in 3,2 Teilen Wasser werden 5,2 Teile Äthanol zugefügt. Der entstehenden Mischung werden 2,1 Teile Benzoylchlorid zugegeben, wobei die Temperatur während der Zugabe bei ungefähr 15"C gehalten wird, damit ein kristallines Natriumbenzoylthiosulfat entsteht. Schmelzpunkt oberhalb 1200 C (unter Zersetzung).
Beispiel 3
50 Teile Äthanol werden einer Lösung von 3,5 Teilen Thiaminmonophosphat in 10 Teilen Wasser zugefügt. Der erhaltenen Lösung wird eine Lösung von 1,2 Teilen Natriumhydroxyd in 2,8 Teilen Wasser zugegeben. Die erhaltene Mischung wird mit Natriumbenzoylthiosulfat in derselben Weise behandelt, wie dies in Beispiel 2 beschrieben ist. Nach Beendigung der Reaktion wird das Äthanol abdestilliert und der Rückstand in derselben Weise behandelt, wie dies im obigen Beispiel beschrieben ist.
Es werden 3,7 Teile eines kristallinen Produktes erhalten.
Beispiel 4
Eine Lösung von 1,2 Teilen Natriumhydroxyd in 4,0 Teilen Wasser wird einer Lösung von 3,5 Teilen Thiaminmonophosphat-hydrochlorid in 7 Teilen Wasser unter Eiskühlung zugegeben. Nach der Zugabe von 10 Teilen Methanol wird die Mischung mit einer Lösung von 5 Teilen Dibenzoyldisulfid in ungefähr 30 Teilen Chloroform in kleinen Portionen vermischt.
Während der Reaktion wird gelegentlich wässriges Natriumhydroxyd zugefügt, um das pH bei ungefähr 12 zu halten. Nach der Zugabe von 9 Gew.-Teilen Wasser wird die Reaktionsmischung filtriert und dem Filtrat wird Salzsäure zugefügt, um die Lösung schwach sauer zu machen. Die Chloroformschicht wird entfernt und die wässrige Schicht wird konzentriert. Das pH des Konzentrates wird dann auf ungefähr 4 eingestellt. Dann wird stehengelassen, damit sich die Kristalle von S-Benzoylthiamin-o-monophosphat ausscheiden können, welche in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 gereinigt werden. Ausbeute 3,0 Teile, Schmelzpunkt ungefähr 1650 C (unter Zersetzung).
Analyse:
Berechnet für C,0H23O6N4SP 2H2O:
C 45,49 H 5,42 N 11,15
Gefunden: C 45,74 H 5,59 N 11,10.
Beispiel 5
Einer Mischung von 20 Teilen S-Benzoylthiamino-monophosphat mit 1000 Teilen Wasser werden allmählich 3 Teile Calciumhydroxyd zugesetzt, welches mit einer geringen Menge Wasser vermischt ist, damit sich ein pH der Mischung von ungefähr 7 einstellt.
Die resultierende Mischung wird filtriert und das Filtrat stehengelassen, damit sich die Kristalle des Calciumsalzes von S-Benzoylthiamin-o-monophosphat abscheiden können. Der Niederschlag wird filtriert, mit einer geringen Menge von Wasser gewaschen und getrocknet. Ausbeute 19,6 Teile, Schmelzpunkt ungefähr 1700 C (unter Zersetzung).
Analyse:
Berechnet für ·0H21O6N4SPCa.2H2O:
Ca 7,41 H2O 6,67
Gefunden: Ca 7,38 H2O 6,63.
Beispiel 6
Einer Mischung von 10 Teilen S-Benzoyl-thiamino-monophosphat mit 35 Teilen Wasser wird unter Rührung und Eiskühlung eine 100/obige Lösung von Natriumhydroxyd zugegeben, um das pH auf ungefähr 8 einzustellen. Die resultierende Lösung wird filtriert, mit Aceton versetzt und an einem kalten Ort stehengelassen, damit sich die Kristalle des Natriumsalzes von S-Benzoylthiamin-o-monophosphat abscheiden können. Die Kristalle werden in der Kälte abfiltriert und in einer kleinen Menge Wasser aufgelöst. Dieser Lösung wird Aceton zugesetzt, um eine Rekristallisation eines gereinigten Produktes zu bewirken. Dieses wird im Vakuum über Phosphorpentoxyd getrocknet. Ausbeute 8 Teile. Dieses Produkt ist hygroskopisch und zersetzt sich bei ungefähr 1500C.
Analyse:
Berechnet für C19H21O6N4SPNa2:
C 44,71 H 4,15 Na 9,01
Gefunden: C 44,53 H 4,10 Na 9,16.