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Verfahren zur Herstellung einer bakteriostatisch bis bakterizid wirkenden Verbindung der Askorbinsäure Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines bakteriostatischen bis bakteriziden Wirkstoffes, der bereits in geringen Dosen angewandt hohe bakterizide Wirkungen aufweisen kann, ohne, im Gegensatz zu ähnlichen bekannten Wirkstoffen, im Körper schädliche Nebenerscheinungen hervorzurufen.
Es ist an sich bekannt, dass Askorbinsäure als Vitamin C günstige Wirkungen auf den menschlichen oder tierischen Körper ausübt und bei Zufuhr grosser Mengen in gewissem Grad auch geeignet ist, die Entzündungsbereitschaft herabzusetzen. Allerdings ist das Vitamin C ausserordentlich empfindlich und unterliegt von den bekannteren Vitaminen am leichtesten der Zerstörung. Das gilt sowohl für die Einflüsse, die der Organismus auf die Askorbinsäure ausübt, wie auch für äussere Einflüsse, wie zum Beispiel chemische Angriffe durch Sauerstoff oder erhöhte Temperatur.
Die vorliegende Erfindung geht nun von der Erkenntnis aus, dass es möglich ist, die Askorbinsäure nicht nur gegen äussere chemische oder physikalische Einflüsse, sondern auch gegenüber einem vorzeitigen Abbau im Organismus zu stabilisieren. Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass Askorbinsäure oder ein Salz derselben mit einer in menschlichem oder tierischem Protein vorkommenden Aminosäure oder einem Salz oder funktionellen Derivaten einer solchen in Gegenwart eines wasserfreien Lösungs- oder Verteilungsmittels unter ver- esternden Bedingungen zur Reaktion gebracht wird.
überraschenderweise hat sich gezeigt, dass die Umsetzungsprodukte der Askorbinsäure mit Amino- säuren im Körper nicht einem so schnellen und starken Abbau unterliegen wie die Askorbinsäure allein, sondern vielmehr auf Grund ihrer erhöhten Beständigkeit ihre Wirkung dort ausüben können, wo sie vom Körper zur Verhütung von Schäden oder zur Bekämpfung von Krankheiten gebraucht werden.
Ebensowenig war auch vorauszusehen, dass, wie im Tierversuch bewiesen wurde, bereits die Zuführung kleiner Mengen, zum Beispiel von 0,03 bis 1 mg pro Maus, dieser Umsetzungsprodukte von Askorbin- säure mit Aminosäuren genügen würde, um therapeutische Wirkungen zu entfalten, die die der bekannten bakterizid wirkenden Heilmittel, wie beispielsweise Sulfonamide oder Antibiotika, etwa erreichen .oder ihnen sogar weit überlegen sind. Es handelt sich also hier um eine ausgesprochen potenzierte Wirkung, wie sie mit gleichzeitigen oder aufeinanderfolgenden Gaben der Komponenten ebensowenig erreicht werden kann, wie etwa mit der Applizierung blosser Gemische.
Als besonderer Vorteil ist jedoch hervorzuheben, dass die Anwendung der erfindungsgemäss hergestellten Umsetzungsprodukte praktisch keine schädliche Nebenwirkungen, wie zum Beispiel Blutschädigungen, Schädigung der Darmflora, allergische Erscheinungen oder Dermatiden, nach sich zieht.
Im Interesse einer schnellen und vollständigen Umsetzung zu hochwirksamen Produkten wird bevorzugt bei erhöhten Temperaturen, zum Beispiel bei solchen zwischen 30 und 130 , insbesondere bei 35 bis 80 , gearbeitet. Als wasserfreies Lösungs- oder Verteilungsmittel wird vorzugsweise eine organische Flüssigkeit benutzt, und man kann die eine oder andere Reaktionskomponente als feinteilige Dispersion zur Anwendung bringen.
Geht man beispielsweise von Natriumaskorbinat aus, so wird zweckmässig in alkoholischer Suspension gearbeitet.
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Die Umsetzungsbedingungen werden so gewählt, dass die Reaktion in Richtung einer Veresterung verläuft, wobei man nach einer vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens die Umsetzung in Gegenwart von die Veresterung fördernden Stoffen, wie Säuren, durchführt. Insbesondere kommen hierfür Zusätze wie Thionylchlorid oder Bortrifluorid in Betracht.
Die Trennung des Reaktionsproduktes vom Reaktionsgemisch kann durch teilweises oder vollständiges Abdampfen der Lösungs- bzw. Dispersions- mittel, gegebenenfalls mit nachfolgender Kristallisation, erfolgen, wobei man die Abscheidung des festen Umsetzungsproduktes besonders durch Ausfällung mit organischen Flüssigkeiten, wie zum Beispiel Äther, Petroläther, befördern oder vervollständigen kann.
Da die Askorbinsäure erst nach erfolgter Umsetzung mit der Aminosäure eine erhöhte Stabilität gegen äussere und organische Einflüsse zeigt, ist es vorteilhaft, die Umsetzung unter Ausschluss von Sauerstoff vorzunehmen, indem die Reaktion beispielsweise in einer Stickstoffatmosphäre durchgeführt oder durch das flüssige Reaktionsgemisch Stickstoff hindurchgeleitet wird. Es haben sich besonders Aminosäuren mit einer oder mehreren schwefeltragenden Gruppen im Molekül bewährt.
Möglicherweise kann deren hervorragende Eignung, die vor allem bei Sulfhydrylgruppen enthaltenden Amino- säuren in Erscheinung tritt, darauf zurückzuführen sein, dass durch den Schwefelgehalt der durch das Ferment Askorbinase hervorgerufene Abbau verhindert oder doch wenigstens verzögert wird.
Von den für das Verfahren der Erfindung in Betracht kommenden Aminosäuren seien beispielsweise genannt Glykokoll, Alanin, Glutaminsäure und bevorzugt Methionin, Acetylmethionin, Äthionin, Cy- stin, vor allem Cystein, sowie Glutathion oder Homo- cystein. Selbstverständlich kann man auch von Gemischen dieser oder anderer Aminosäuren ausgehen.
Wie schon erwähnt, können die Säuren als solche für die Reaktion verwendet werden oder auch in Form ihrer funktionellen Derivate oder Salze. Es hat sich gezeigt, dass bei vielen Aminosäuren die Umsetzung am glattesten verläuft, wenn sie zunächst in Säurechlorid überführt und dann, gegebenenfalls in Gegenwart von Halogen abspaltenden Mitteln, etwa vor. Natriumcarbonat oder Pyridin, mit Askorbin- säure oder Natriumaskorbinat zur Umsetzung gelangen.
Das Verhältnis der Aminosäurekomponente zu der Askorbinsäurekomponente kann in gewissen Grenzen schwanken. Man kann diese Komponenten etwa äquimolikulär einsetzen, wird jedoch zweckmässig sich in Molverhältnissen zwischen 2:1, und 1:2 halten.
Beispiel 1 3,52 Teile wasserfreie Askorbinsäure und 3,15 Teile wasserfreies Cysteinhydrochlorid werden unter einer Stickstoffatmosphäre in 40 Teilen absolutem Alkohol in der Wärme gelöst. Nach dem Abkühlen auf Zimmertemperatur werden 0,2 Teile frisch de- stilliertes Thionylchlorid zugesetzt. Dann bleibt der Ansatz 24 Stunden stehen. Unter vermindertem Druck wird bis auf ein Volumen von etwa 25 Teilen eingeengt und im Anschluss daran mit 250 Teilen getrocknetem Äther gefällt. Der Niederschlag fällt zuerst ölig an, erstarrt dann aber nach einiger Zeit zu einer weissen kristallinen Masse. Der Niederschlag wird abgesaugt und getrocknet. - Ausbeute fast quantitativ.
Beispiel 2 3,52 Teile wasserfreie Askorbinsäure und 3,15 Teile wasserfreies Cysteinhydrochlorid werden in 40 Teilen absolutem Alkohol in der Wärme gelöst. Nach dem Abkühlen werden etwa 0,3 Teile Bor- trifluorid eingeleitet. Die weitere Aufarbeitung erfolgt wie im Beispiel 1 beschrieben.
Beispiel 3 1 Teil wasserfreies Cysteinhydrochlorid und 8 Teile wasserfreie Askorbinsäure werden unter Stickstoffatmosphäre mit 25 Teilen Aceton übergossen und 0,1 Teile Thionylchlorid zugesetzt. Dann bleibt der Ansatz 48 Stunden im Dunkeln bei Zimmertemperatur stehen. Dann wird abgesaugt, der Niederschlag mit wenig Aceton gewaschen und das Filtrat mit 150 Teilen absolutem Äther gefällt. Nach 24 Stunden ist der Niederschlag kristallin geworden. Das Lösungsmittel wird abgesaugt und der Niederschlag mit wenig Äther gewaschen.
Beispiel 4 3,1 Teile feinpulverisiertes, wasserfreies Cystein- hvdrochlorid werden bei 20 im Verlauf von 10 Minuten tropfenweise mit 6 bis 8 Teilen reinstem, frisch destilliertem Thionylchlorid versetzt. Hierauf wird im Wasserbad auf 37 erwärmt. Die einsetzende Gasentwicklung ist nach 25 bis 30 Minuten beendet. Zur Vervollständigung der Reaktion wird 3 bis 4 Stunden geschüttelt und das erhaltene Produkt mit trockenem Pretroläther gewaschen. Die Petrolätherreste werden im Vakuum entfernt, 1,5 Teile des auf diese Weise gewonnenen Produktes werden mit 2 Teilen Natrium- askorbinat versetzt, welches zuvor in 250 Teilen absolutem Alkohol fein suspendiert wurde.
Das Reaktionsgemisch wird 1 Stunde bei 40 bis 45 unter einer Stickstoffatmosphäre gerührt. Am folgenden Tag wird von dem Niederschlag dekantiert und der Alkohol im Vakuum bei 25 bis 30 abdestilliert. Bei beginnender Trübung der Lösung wird mit trockenem Äther ausgefällt und das abgetrennte Fällungsprodukt aus absolutem Alkohol umkristallisiert.
Beispiel 5 1,49 g fein pulverisiertes Methionin werden mit 200 ml absolutem Äthylalkohol versetzt und durch Zugabe von weiteren, insgesamt 0,36 g Chlorwasserstoff enthaltenden 20 ml Äthylalkohol unter Schütteln und leichtem Erwärmen in Lösung gebracht. Die noch etwa 40 warme Lösung versetzt man mit einer
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Suspension von 1,98 g Natriumaskorbinat in 20 ml absolutem Äthylalkohol und schüttelt nach Verdrängen des im Gefäss enthaltenen Sauerstoffes durch trockenen, reinen Stickstoff 30 Minuten lang bei einer Temperatur von 40 .
Nach Abkühlen filtriert man vom Ungelösten, engt das Filtrat bei schwachem Vakuum bis auf 75 ml ein, gibt 250 ml trockenen Äther zu und lässt 48 Stunden bei Kühlschrank- temperatur stehen. Es haben sich daraufhin 0,7 g feine, schuppenförmige, farblose Kristalle ausgeschieden, die sich ab 200 leicht bräunen, aber bei 260 noch nicht geschmolzen sind. Der Stickstoffgehalt der gefundenen Verbindung beträgt 4,5 0/0, der Schwefelgehalt 10,3 0/0.
Beispiel 6 Nach dem von S. Levine im I. Am. Chem. Soc., 76, 1382 (1954), beschriebenen Verfahren wird aus Methionin und Phosphorpentachlorid in Tetrachlor- kohlenwasserstoff das Methionin-Säurechlorid-Hydro- chlorid dargestellt.
1,92 g dieser stark hygroskopischen Verbindung schlämmt man unter Feuchtigkeitsausschluss in 100 ml trockenem Äther auf, gibt eine Suspension von 1,98 g Natriumaskorbinat in 100 ml Äther zu und verfährt weiter, wie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben.
Nach Reinigung erhält man wasserlösliche, farb- lose Prismen, deren Schwefelgehalt mit 9,1% und Stickstoffgehalt mit 4,2 % einer Bruttoformel C1oH1 1O-NS - HCl entsprechen würde.
Mit den nach den vorstehenden Beispielen darQestellten Produkten wurde eine grössere Reihe vergleichender Tierversuche durchgeführt. Zu diesen Versuchen wurden hochvirulente, von Menschen stammende Kulturen der folgenden Bakterienarten verwendet, nachdem sie zur Erhöhung der Virulenz noch fünf Tierpassagen unterworfen waren:
Pneumococcus, Streptococcus haemolyticus, Sta- phylococcus pyogenes (haemolyticus) und Bacterium coli haemolyticum. Es handelte sich teilweise um Staphylococcus, Stamm Oxford, sowie um Strepto- coccus haemolyticus Aronson. Mit diesen Bakterien wurden Mäuse (Kontrolltiere und Versuchstiere) mit jeweils drei Ösen intraperitoneal infiziert.
Die Versuchstiere erhielten nach verschiedenen Zeitabständen (bis 41/2 Stunden nach der Infektion) nur eine Gabe des Behandlungsmittels, und zwar je nach Zeitabstand steigende Mengen von 0,5 bis 5 mg in 0,3 ml physiologischer Kochsalzlösung. Die unbehandelten Kon- trolltiere starben, während die mit den Produkten nach Erfindung behandelten Versuchstiere sämtlich ohne erkennbare Schäden überlebten.