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Verfahren zur Herstellung einer bakteriostatisch bis bakterizid wirkenden Verbindung der Askorbinsäure Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines bakteriostatischen bis bakteriziden Wirkstoffes, der bereits in geringen Dosen angewandt hohe bakterizide Wirkungen aufweisen kann, ohne, im Gegensatz zu ähnlichen bekannten Wirkstoffen, im Körper schädliche Nebenerscheinungen hervorzurufen.
Es ist an sich bekannt, dass Askorbinsäure als Vitamin C günstige Wirkungen auf den menschlichen oder tierischen Körper ausübt und bei Zufuhr grosser Mengen in gewissem Grad auch geeignet ist, die Entzündungsbereitschaft herabzusetzen. Allerdings ist das Vitamin C ausserordentlich empfindlich und unterliegt von den bekannteren Vitaminen am leichtesten der Zerstörung. Das gilt sowohl für die Einflüsse, die der Organismus auf die Askorbinsäure ausübt, wie auch für äussere Einflüsse, wie zum Beispiel chemische Angriffe durch Sauerstoff oder erhöhte Temperatur.
Die vorliegende Erfindung geht nun von der Erkenntnis aus, dass es möglich ist, die Askorbinsäure nicht nur gegen äussere chemische oder physikalische Einflüsse, sondern auch gegenüber einem vorzeitigen Abbau im Organismus zu stabilisieren. Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass Askorbinsäure oder ein Salz derselben mit einer in menschlichem oder tierischem Protein vorkommenden Aminosäure oder einem Salz oder funktionellen Derivaten einer solchen in Gegenwart eines wasserfreien Lösungs- oder Verteilungsmittels unter ver- esternden Bedingungen zur Reaktion gebracht wird.
überraschenderweise hat sich gezeigt, dass die Umsetzungsprodukte der Askorbinsäure mit Amino- säuren im Körper nicht einem so schnellen und starken Abbau unterliegen wie die Askorbinsäure allein, sondern vielmehr auf Grund ihrer erhöhten Beständigkeit ihre Wirkung dort ausüben können, wo sie vom Körper zur Verhütung von Schäden oder zur Bekämpfung von Krankheiten gebraucht werden.
Ebensowenig war auch vorauszusehen, dass, wie im Tierversuch bewiesen wurde, bereits die Zuführung kleiner Mengen, zum Beispiel von 0,03 bis 1 mg pro Maus, dieser Umsetzungsprodukte von Askorbin- säure mit Aminosäuren genügen würde, um therapeutische Wirkungen zu entfalten, die die der bekannten bakterizid wirkenden Heilmittel, wie beispielsweise Sulfonamide oder Antibiotika, etwa erreichen .oder ihnen sogar weit überlegen sind. Es handelt sich also hier um eine ausgesprochen potenzierte Wirkung, wie sie mit gleichzeitigen oder aufeinanderfolgenden Gaben der Komponenten ebensowenig erreicht werden kann, wie etwa mit der Applizierung blosser Gemische.
Als besonderer Vorteil ist jedoch hervorzuheben, dass die Anwendung der erfindungsgemäss hergestellten Umsetzungsprodukte praktisch keine schädliche Nebenwirkungen, wie zum Beispiel Blutschädigungen, Schädigung der Darmflora, allergische Erscheinungen oder Dermatiden, nach sich zieht.
Im Interesse einer schnellen und vollständigen Umsetzung zu hochwirksamen Produkten wird bevorzugt bei erhöhten Temperaturen, zum Beispiel bei solchen zwischen 30 und 130 , insbesondere bei 35 bis 80 , gearbeitet. Als wasserfreies Lösungs- oder Verteilungsmittel wird vorzugsweise eine organische Flüssigkeit benutzt, und man kann die eine oder andere Reaktionskomponente als feinteilige Dispersion zur Anwendung bringen.
Geht man beispielsweise von Natriumaskorbinat aus, so wird zweckmässig in alkoholischer Suspension gearbeitet.
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Die Umsetzungsbedingungen werden so gewählt, dass die Reaktion in Richtung einer Veresterung verläuft, wobei man nach einer vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens die Umsetzung in Gegenwart von die Veresterung fördernden Stoffen, wie Säuren, durchführt. Insbesondere kommen hierfür Zusätze wie Thionylchlorid oder Bortrifluorid in Betracht.
Die Trennung des Reaktionsproduktes vom Reaktionsgemisch kann durch teilweises oder vollständiges Abdampfen der Lösungs- bzw. Dispersions- mittel, gegebenenfalls mit nachfolgender Kristallisation, erfolgen, wobei man die Abscheidung des festen Umsetzungsproduktes besonders durch Ausfällung mit organischen Flüssigkeiten, wie zum Beispiel Äther, Petroläther, befördern oder vervollständigen kann.
Da die Askorbinsäure erst nach erfolgter Umsetzung mit der Aminosäure eine erhöhte Stabilität gegen äussere und organische Einflüsse zeigt, ist es vorteilhaft, die Umsetzung unter Ausschluss von Sauerstoff vorzunehmen, indem die Reaktion beispielsweise in einer Stickstoffatmosphäre durchgeführt oder durch das flüssige Reaktionsgemisch Stickstoff hindurchgeleitet wird. Es haben sich besonders Aminosäuren mit einer oder mehreren schwefeltragenden Gruppen im Molekül bewährt.
Möglicherweise kann deren hervorragende Eignung, die vor allem bei Sulfhydrylgruppen enthaltenden Amino- säuren in Erscheinung tritt, darauf zurückzuführen sein, dass durch den Schwefelgehalt der durch das Ferment Askorbinase hervorgerufene Abbau verhindert oder doch wenigstens verzögert wird.
Von den für das Verfahren der Erfindung in Betracht kommenden Aminosäuren seien beispielsweise genannt Glykokoll, Alanin, Glutaminsäure und bevorzugt Methionin, Acetylmethionin, Äthionin, Cy- stin, vor allem Cystein, sowie Glutathion oder Homo- cystein. Selbstverständlich kann man auch von Gemischen dieser oder anderer Aminosäuren ausgehen.
Wie schon erwähnt, können die Säuren als solche für die Reaktion verwendet werden oder auch in Form ihrer funktionellen Derivate oder Salze. Es hat sich gezeigt, dass bei vielen Aminosäuren die Umsetzung am glattesten verläuft, wenn sie zunächst in Säurechlorid überführt und dann, gegebenenfalls in Gegenwart von Halogen abspaltenden Mitteln, etwa vor. Natriumcarbonat oder Pyridin, mit Askorbin- säure oder Natriumaskorbinat zur Umsetzung gelangen.
Das Verhältnis der Aminosäurekomponente zu der Askorbinsäurekomponente kann in gewissen Grenzen schwanken. Man kann diese Komponenten etwa äquimolikulär einsetzen, wird jedoch zweckmässig sich in Molverhältnissen zwischen 2:1, und 1:2 halten.
Beispiel 1 3,52 Teile wasserfreie Askorbinsäure und 3,15 Teile wasserfreies Cysteinhydrochlorid werden unter einer Stickstoffatmosphäre in 40 Teilen absolutem Alkohol in der Wärme gelöst. Nach dem Abkühlen auf Zimmertemperatur werden 0,2 Teile frisch de- stilliertes Thionylchlorid zugesetzt. Dann bleibt der Ansatz 24 Stunden stehen. Unter vermindertem Druck wird bis auf ein Volumen von etwa 25 Teilen eingeengt und im Anschluss daran mit 250 Teilen getrocknetem Äther gefällt. Der Niederschlag fällt zuerst ölig an, erstarrt dann aber nach einiger Zeit zu einer weissen kristallinen Masse. Der Niederschlag wird abgesaugt und getrocknet. - Ausbeute fast quantitativ.
Beispiel 2 3,52 Teile wasserfreie Askorbinsäure und 3,15 Teile wasserfreies Cysteinhydrochlorid werden in 40 Teilen absolutem Alkohol in der Wärme gelöst. Nach dem Abkühlen werden etwa 0,3 Teile Bor- trifluorid eingeleitet. Die weitere Aufarbeitung erfolgt wie im Beispiel 1 beschrieben.
Beispiel 3 1 Teil wasserfreies Cysteinhydrochlorid und 8 Teile wasserfreie Askorbinsäure werden unter Stickstoffatmosphäre mit 25 Teilen Aceton übergossen und 0,1 Teile Thionylchlorid zugesetzt. Dann bleibt der Ansatz 48 Stunden im Dunkeln bei Zimmertemperatur stehen. Dann wird abgesaugt, der Niederschlag mit wenig Aceton gewaschen und das Filtrat mit 150 Teilen absolutem Äther gefällt. Nach 24 Stunden ist der Niederschlag kristallin geworden. Das Lösungsmittel wird abgesaugt und der Niederschlag mit wenig Äther gewaschen.
Beispiel 4 3,1 Teile feinpulverisiertes, wasserfreies Cystein- hvdrochlorid werden bei 20 im Verlauf von 10 Minuten tropfenweise mit 6 bis 8 Teilen reinstem, frisch destilliertem Thionylchlorid versetzt. Hierauf wird im Wasserbad auf 37 erwärmt. Die einsetzende Gasentwicklung ist nach 25 bis 30 Minuten beendet. Zur Vervollständigung der Reaktion wird 3 bis 4 Stunden geschüttelt und das erhaltene Produkt mit trockenem Pretroläther gewaschen. Die Petrolätherreste werden im Vakuum entfernt, 1,5 Teile des auf diese Weise gewonnenen Produktes werden mit 2 Teilen Natrium- askorbinat versetzt, welches zuvor in 250 Teilen absolutem Alkohol fein suspendiert wurde.
Das Reaktionsgemisch wird 1 Stunde bei 40 bis 45 unter einer Stickstoffatmosphäre gerührt. Am folgenden Tag wird von dem Niederschlag dekantiert und der Alkohol im Vakuum bei 25 bis 30 abdestilliert. Bei beginnender Trübung der Lösung wird mit trockenem Äther ausgefällt und das abgetrennte Fällungsprodukt aus absolutem Alkohol umkristallisiert.
Beispiel 5 1,49 g fein pulverisiertes Methionin werden mit 200 ml absolutem Äthylalkohol versetzt und durch Zugabe von weiteren, insgesamt 0,36 g Chlorwasserstoff enthaltenden 20 ml Äthylalkohol unter Schütteln und leichtem Erwärmen in Lösung gebracht. Die noch etwa 40 warme Lösung versetzt man mit einer
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Suspension von 1,98 g Natriumaskorbinat in 20 ml absolutem Äthylalkohol und schüttelt nach Verdrängen des im Gefäss enthaltenen Sauerstoffes durch trockenen, reinen Stickstoff 30 Minuten lang bei einer Temperatur von 40 .
Nach Abkühlen filtriert man vom Ungelösten, engt das Filtrat bei schwachem Vakuum bis auf 75 ml ein, gibt 250 ml trockenen Äther zu und lässt 48 Stunden bei Kühlschrank- temperatur stehen. Es haben sich daraufhin 0,7 g feine, schuppenförmige, farblose Kristalle ausgeschieden, die sich ab 200 leicht bräunen, aber bei 260 noch nicht geschmolzen sind. Der Stickstoffgehalt der gefundenen Verbindung beträgt 4,5 0/0, der Schwefelgehalt 10,3 0/0.
Beispiel 6 Nach dem von S. Levine im I. Am. Chem. Soc., 76, 1382 (1954), beschriebenen Verfahren wird aus Methionin und Phosphorpentachlorid in Tetrachlor- kohlenwasserstoff das Methionin-Säurechlorid-Hydro- chlorid dargestellt.
1,92 g dieser stark hygroskopischen Verbindung schlämmt man unter Feuchtigkeitsausschluss in 100 ml trockenem Äther auf, gibt eine Suspension von 1,98 g Natriumaskorbinat in 100 ml Äther zu und verfährt weiter, wie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben.
Nach Reinigung erhält man wasserlösliche, farb- lose Prismen, deren Schwefelgehalt mit 9,1% und Stickstoffgehalt mit 4,2 % einer Bruttoformel C1oH1 1O-NS - HCl entsprechen würde.
Mit den nach den vorstehenden Beispielen darQestellten Produkten wurde eine grössere Reihe vergleichender Tierversuche durchgeführt. Zu diesen Versuchen wurden hochvirulente, von Menschen stammende Kulturen der folgenden Bakterienarten verwendet, nachdem sie zur Erhöhung der Virulenz noch fünf Tierpassagen unterworfen waren:
Pneumococcus, Streptococcus haemolyticus, Sta- phylococcus pyogenes (haemolyticus) und Bacterium coli haemolyticum. Es handelte sich teilweise um Staphylococcus, Stamm Oxford, sowie um Strepto- coccus haemolyticus Aronson. Mit diesen Bakterien wurden Mäuse (Kontrolltiere und Versuchstiere) mit jeweils drei Ösen intraperitoneal infiziert.
Die Versuchstiere erhielten nach verschiedenen Zeitabständen (bis 41/2 Stunden nach der Infektion) nur eine Gabe des Behandlungsmittels, und zwar je nach Zeitabstand steigende Mengen von 0,5 bis 5 mg in 0,3 ml physiologischer Kochsalzlösung. Die unbehandelten Kon- trolltiere starben, während die mit den Produkten nach Erfindung behandelten Versuchstiere sämtlich ohne erkennbare Schäden überlebten.
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Process for the production of a bacteriostatic to bactericidal compound of ascorbic acid The present invention relates to a process for the production of a bacteriostatic to bactericidal active ingredient which, when used in small doses, can have high bactericidal effects without, in contrast to similar known active ingredients, harmful side effects in the body to evoke.
It is known per se that ascorbic acid, as vitamin C, has beneficial effects on the human or animal body and, when given in large quantities, is also suitable to a certain extent to reduce the susceptibility to inflammation. However, vitamin C is extremely sensitive and of the better-known vitamins is the easiest to destroy. This applies to the influences that the organism exerts on ascorbic acid as well as to external influences such as chemical attacks by oxygen or increased temperature.
The present invention is based on the knowledge that it is possible to stabilize ascorbic acid not only against external chemical or physical influences, but also against premature degradation in the organism. The method according to the invention is characterized in that ascorbic acid or a salt thereof is reacted with an amino acid occurring in human or animal protein or a salt or functional derivative of such in the presence of an anhydrous solvent or distribution agent under esterifying conditions.
Surprisingly, it has been shown that the reaction products of ascorbic acid with amino acids in the body are not subject to such rapid and strong degradation as ascorbic acid alone, but rather, due to their increased resistance, can exert their effect where they are from the body to prevent damage or used to fight diseases.
Nor could it be foreseen that, as has been proven in animal experiments, even the administration of small amounts, for example from 0.03 to 1 mg per mouse, of these reaction products of ascorbic acid with amino acids would be sufficient to develop therapeutic effects that the known bactericidal remedies such as sulfonamides or antibiotics, for example, or are even far superior to them. It is therefore a matter of a markedly potentiated effect, which can no more be achieved with simultaneous or successive administration of the components, such as with the application of mere mixtures.
However, it should be emphasized as a particular advantage that the use of the reaction products prepared according to the invention has practically no harmful side effects, such as, for example, damage to the blood, damage to the intestinal flora, allergic phenomena or dermatids.
In the interests of rapid and complete conversion to highly effective products, elevated temperatures, for example between 30 and 130, in particular 35 to 80, are preferred. An organic liquid is preferably used as the anhydrous solvent or distribution medium, and one or the other reaction component can be used as a finely divided dispersion.
If, for example, sodium ascorbinate is used as the starting point, it is expedient to work in an alcoholic suspension.
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The reaction conditions are chosen so that the reaction proceeds in the direction of an esterification, wherein, according to an advantageous embodiment of the process, the reaction is carried out in the presence of substances which promote the esterification, such as acids. In particular, additives such as thionyl chloride or boron trifluoride come into consideration.
The reaction product can be separated from the reaction mixture by partial or complete evaporation of the solvent or dispersion medium, optionally with subsequent crystallization, the separation of the solid reaction product being promoted in particular by precipitation with organic liquids such as ether, petroleum ether or complete.
Since the ascorbic acid shows increased stability against external and organic influences only after the reaction with the amino acid has taken place, it is advantageous to carry out the reaction in the absence of oxygen, for example by carrying out the reaction in a nitrogen atmosphere or by passing nitrogen through the liquid reaction mixture. Amino acids with one or more sulfur-bearing groups in the molecule have proven particularly useful.
Their excellent suitability, which is particularly evident in the case of amino acids containing sulfhydryl groups, may be due to the fact that the sulfur content prevents or at least retards the degradation caused by the ascorbinase ferment.
Examples of amino acids suitable for the process of the invention are glycocoll, alanine, glutamic acid and preferably methionine, acetylmethionine, ethionine, cystine, especially cysteine, and also glutathione or homocysteine. Of course, you can also start from mixtures of these or other amino acids.
As already mentioned, the acids can be used as such for the reaction or else in the form of their functional derivatives or salts. It has been shown that with many amino acids the reaction proceeds smoothly when it is first converted into acid chloride and then, if appropriate, in the presence of halogen-releasing agents, for example. Sodium carbonate or pyridine react with ascorbic acid or sodium ascorbinate.
The ratio of the amino acid component to the ascorbic acid component can vary within certain limits. These components can be used approximately equimolar, but it is advisable to keep them in molar ratios between 2: 1 and 1: 2.
EXAMPLE 1 3.52 parts of anhydrous ascorbic acid and 3.15 parts of anhydrous cysteine hydrochloride are dissolved in 40 parts of absolute alcohol in the warm under a nitrogen atmosphere. After cooling to room temperature, 0.2 parts of freshly distilled thionyl chloride are added. Then the approach remains for 24 hours. It is concentrated under reduced pressure to a volume of about 25 parts and then precipitated with 250 parts of dried ether. The precipitate is oily at first, but then solidifies after some time to a white crystalline mass. The precipitate is filtered off and dried. - Almost quantitative yield.
Example 2 3.52 parts of anhydrous ascorbic acid and 3.15 parts of anhydrous cysteine hydrochloride are dissolved in 40 parts of absolute alcohol in the heat. After cooling, about 0.3 part of boron trifluoride is introduced. The further work-up is carried out as described in Example 1.
Example 3 25 parts of acetone are poured over 1 part of anhydrous cysteine hydrochloride and 8 parts of anhydrous ascorbic acid under a nitrogen atmosphere, and 0.1 part of thionyl chloride is added. The batch then remains in the dark at room temperature for 48 hours. It is then filtered off with suction, the precipitate is washed with a little acetone and the filtrate is precipitated with 150 parts of absolute ether. After 24 hours the precipitate has become crystalline. The solvent is filtered off with suction and the precipitate is washed with a little ether.
Example 4 6 to 8 parts of the purest, freshly distilled thionyl chloride are added dropwise to 3.1 parts of finely powdered, anhydrous cysteine hydrochloride over a period of 10 minutes at 20. This is then heated to 37 in a water bath. The onset of gas evolution has ended after 25 to 30 minutes. To complete the reaction, it is shaken for 3 to 4 hours and the product obtained is washed with dry pretrol ether. The petroleum ether residues are removed in vacuo, 1.5 parts of the product obtained in this way are mixed with 2 parts of sodium ascorbinate, which was previously finely suspended in 250 parts of absolute alcohol.
The reaction mixture is stirred at 40-45 for 1 hour under a nitrogen atmosphere. The following day is decanted from the precipitate and the alcohol is distilled off in vacuo at 25-30. When the solution begins to become cloudy, it is precipitated with dry ether and the separated precipitate is recrystallized from absolute alcohol.
Example 5 1.49 g of finely powdered methionine are mixed with 200 ml of absolute ethyl alcohol and dissolved by adding a total of 0.36 g of hydrogen chloride containing 20 ml of ethyl alcohol with shaking and gentle heating. The solution, which is still about 40% warm, is mixed with one
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Suspension of 1.98 g of sodium ascorbinate in 20 ml of absolute ethyl alcohol and, after displacing the oxygen in the vessel with dry, pure nitrogen, shake for 30 minutes at a temperature of 40.
After cooling, the undissolved material is filtered off, the filtrate is concentrated to 75 ml under a weak vacuum, 250 ml of dry ether are added and the mixture is left to stand for 48 hours at refrigerator temperature. Thereupon 0.7 g of fine, flaky, colorless crystals separated out, which turn slightly brown from 200, but have not yet melted at 260. The nitrogen content of the compound found is 4.5%, the sulfur content 10.3%.
Example 6 According to the method described by S. Levine in I. Am. Chem. Soc., 76, 1382 (1954), the methionine acid chloride hydrochloride is prepared from methionine and phosphorus pentachloride in tetrachlorohydrocarbon.
1.92 g of this strongly hygroscopic compound are suspended in 100 ml of dry ether with exclusion of moisture, a suspension of 1.98 g of sodium ascorbinate in 100 ml of ether is added and the procedure is continued as described in Examples 1 and 2.
After purification, water-soluble, colorless prisms are obtained whose sulfur content of 9.1% and nitrogen content of 4.2% would correspond to a gross formula C1oH1 10-NS-HCl.
A large number of comparative animal experiments were carried out with the products presented according to the above examples. Highly virulent, human-derived cultures of the following types of bacteria were used for these experiments after they had been subjected to five animal passages to increase virulence:
Pneumococcus, Streptococcus haemolyticus, Sta- phylococcus pyogenes (haemolyticus) and Bacterium coli haemolyticum. Some of these were Staphylococcus, the Oxford strain, and Streptococcus haemolyticus Aronson. Mice (control animals and test animals) were infected intraperitoneally with three loops each with these bacteria.
After various time intervals (up to 4 1/2 hours after infection), the test animals received only one dose of the treatment agent, namely increasing amounts of 0.5 to 5 mg in 0.3 ml of physiological saline solution, depending on the time interval. The untreated control animals died, while the test animals treated with the products according to the invention all survived without any noticeable damage.