Verfahren zur Herstellung von hochmolekularen Dextranabbauprodukten praktisch einheitlicher Molekülgrösse für pharmazeutische Zwecke.
Wie teilweise hydrolisiertes oder sonstwie abgebautes Dextran, so ist auch rohes Dextran polydispers, das heisst nicht einheitlich in bezug auf das Molekulargewicht. Insbesondere wenn Lösungen solcher Produkte intravenös injiziert werden (zum Beispiel bei Verwendung von teilweise abgebautem Dextran als Plasma-Ersatzmittel), ist gefunden worden, dass der physiologisehe Effekt in hohem Masse abhängig ist von der Grouse der Moleküle. Zu grosse Moleküle rufen bei intravenöser Einspritzung schädliche Reaktionen hervor und zu kleine Moleküle können die Blut- gefässe zu raseh durch die Kapillaren und durch die Membranen der Gefässknäuel (Mal pighische Körper) der Nierenwiederverlassen.
In gleicher Weise ist die Viskosität der Losun- gen von Dextran oder teilweise abgebautem Dextran, wiesie fürpharmazeutisehe Präparate benützt werden, durch das Molekulargewicht bestimmt. Es wäre demnach ein offensichtlicher Vorteil, molekular einheitlichere Dextran-Präparate herstellen zu können. Auch bei Verwendung von Dextran in Losungen für Funktionsteste, zum Beispiel der Nieren, ist es ein sehr grosser Vorteil, Dextranpräparate zu verwenden, welche in bezug auf die Molekülgrösse einheitlicher sind.
Es ist nun gefunden worden, dass es möglieh ist, molekular einheitlichere Dextranabbauprodukte, als sie bis heute hergestellt wurden, durch Ausnutzung der versehiedenen Loslichkeit der Moleküle versehiedener Grolle zu erzielen. Man kann in dieser Weise durch fraktionierende Behandlung in bezug auf das Molekulargewicht im grossen Ganzen einheitliche Dextranabbauprodukte herstellen.
Vorliegende Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Herstellung von hochmoleku- laren Dextranabbauprodukten von praktiseh einheitlicher Molekülgrosse für pharmazeu- tische Zwecke. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man Dextran einem sein Molekül teilweise depolymerisierenden Abbau unterwirft und dass man aus dem so erhaltenen teilweise abgebauten, noch hoeh- molekularen Produkt unter Verwendung von Wasser zusammen mit einem damit mischbaren, Dextran fällenden, aber chemisch nicht verändernden organischen Losungsmittel we nigstens eine Fraktion von praktiseh einheitlicher Molekülgrosse abtrennt.
Der das Dextranmolekül teilweise depolymerisierende Abbau kann zum Beispiel durch milde saure Hydrolyse oder durch Enzyme oder durch Alkalien in der Wärme erfolgen. Die Auftrennung des teilweise abgebauten polydispersen Dextrans in molekular einheitlichere Fraktionen kann durch Fällen der Dextranabbauprodukte aus ihren wässrigen Losungen durch geregelte stufenweise Zugabe eines Fällungsmittels der genannten Art, zum Beispiel eines Alkohols, durchgeführt werden.
Eine andere Möglichkeit besteht darin, das teilweise abgebaute Dextran naeheinander in Gemischen von Wasser und organischem Fäl- lungsmittel versehiedener Misehungsverhältnisse zu losen. Die so erhaltenen Fraktionen sind als Plasma-Ersatzmittel oder für andere pharmazeutische Präparate besser geeignet, als die nicht fraktionierten Abbauprodukte.
Im folgenden wird an Hand einiger Beispiele erläutert, wie es durch stufenweise Erhöhung der Konzentration des Fällungsmittels (zum Beispiel Alkohol) möglieh ist, eine fraktionierte Fällung von in bezug auf das Molekulargewicht praktisch einheitlichen Fraktionen zu erhalten. Wenn nämlich ein Fällungsmittel unter kräftigem Rühren langsam einer Lösung von teilweise abgebautem Dextran zugegeben wird, wird schliesslich eine solche Konzentration an Fällungsmittel erreicht, dass die höchstmolekularen Anteile der gelösten Produkte auszufallen beginnen.
Die zuerst gefällte Fraktion ist die höehstmolekulare. Wenn dann die Konzentration an Fällungsmittel sukzessive erhöht wird, erhält man stufenweise Fällungen von Fraktionen von immer niedrigerem Molekulargewicht.
Die Tatsache, dass die so erhaltenen Fraktionen bedeutend weniger polydispers sind als s die Gesamtheit der erhaltenen Abbaupro- dukte, kann zum Beispiel durch Ultrazentrifugierung und Diffusionsversuche gezeigt werden. Je hoher das Molekulargewicht der abgetrennten Fraktion ist, desto hoher ist die Viskosität. Die fraktionierte Auflösung von Dextranabba. nprodukten unterscheidet sich im Prinzip nicht von der fraktionierten Fäl lung, indem sowohl die fraktionierte Auf losung als auch die fraktionierte Fällung auf der Feststellung gründen, dass Moleküle verschiedener Grosse verschiedene Löslichkeiten besitzen.
Die fraktionierte Auflösung kann so ausgeführt werden, dass man festes fein pulverisiertes partiell abgebautes Dextran mit einer Mischung von Wasser und Fällungsmittel schüttelt, die so gewählt ist, dass ein niedrig molekularer Teil in Lösung geht und ein hoher molekularer Teil der polydispersen Abbauprodukte ungelöst bleibt. Wie im Falle der fraktionierten Fällung werden aueh hier Fraktionen erhalten, die in bezug auf die Molekülgrosse einheitlicher sind als die nach dem Abbau erhaltenen Abbauprodukte des Dextrans in ihrer Gesamtheit.
Beispiel 1.
2, 32 kg Rohdextran werden unter Rühren in 5,8 kg Wasser gelost. Bei 90 C wird hierauf 50 /oige NaOH-Losung sorfaltig in einer solchen Menge zugefügt, dass die NaOH- Konzentration in der Mischung 10% beträgt.
In bestimmten Intervallen werden Proben entnommen, welche neutralisiert und durch Fällung mit Alkohol gereinigt werden. Nach Trocknung der Niederschläge werden 4%ige wässrige Losungen aus den Proben hergestellt. Die relative Viskosität dieser Proben wird dann in einem m Ostwaldsehen Viskosi- meter bestimmt.
Sobald die festgestellte relative Viskosität unter den Wert 15 gesunken ist, was etwa nach 20-30 Stunden der Fall ist, wird der alkalische Abbau des Dextrans onterbrochen und das Dextranabbauprodukt durch Neutralisieren der Reaktionslosung und Fällung mit Alkohol isoliert. 250 cm3 einer 2%igen Lösung des so erhaltenen teilweise abgebauten Dextrans werden in ein Ge- fäss gebracht, das dann in einen Thermostat eingesetzt wird. Das Gefäss ist mit einem Rührer versehen. 96%iger Alkohol wird mit Hilfe einer Bürette tropfenweise zugesetzt.
Die Temperatur wird dabei auf +200 C gehalten. Naehdem Alkohol bis zur Trübung der Losung zugesetzt worden ist, wird die Tem peratur im Thermostat auf 25 bis 30 C erhöht. Nach einigen Stunden wird der Niedersehlag gelöst, und der Kontaktthermometer wird wieder auf eine Temepratur von 200 C eingestellt. Dann lässt man die Losung über Nacht stehen. Wenn die Temperatur sinkt, bildet sich der Niederschlag wieder zurück und wird durch Dekantieren abgetrennt. Hierauf wird der Niedersehlag in Wasser gelöst und mit Alkohol wieder gefällt.
Eine weitere Ausfällung wird in gleicher Weise durchgeführt. Die dekantierte Losung wird in das Gefäss zurückgeschüttet, welches dann wieder in den Thermostat eingebracht wird, wonaeh nochmals Alkohol durch die Bürette zugegeben wird. Der entstehende Niedersehlag wird in gleieher Weise wie vorher behandelt. Die Fraktionierung wird in gleicher Weise vorgenommen und insgesamt werden so fünf Fraktionen abgetrennt. Die erhaltenen Fraktionen des teilweise abgebau- ten Dextrans werden getrocknet und gewogen und die wahre Viskosität [#] der aus diesen Fraktionen hergestellten wässrigen Lösungen bestimmt.
[n] = (#sp = spezifische Viskosität ; c¯E0 c c = Iionzentration in /o) ; [#] nimmt zu, wenn das lTolekulargewicht der Dextranpro- dukte grosser wird.
Versuche mit der Ultrazentrifuge zeigen. dass die erhaltenen Fraktionen weniger polydispers sind als das nach dem Abbau erhaltene Produkt. Die Resultate sind in nachstehender Tabelle gegeben.
Tabelle 1.
Nr. der Alkohol Gewicht der
Fraktion in cm3 Fraktion in g [#] I 146, 1 1, 62 1, 50 Il 17, 6 0,27 l, 30
III 6,5 0, 16 0, 92
IV 13,0 0,44 0,70 V 60,0 0,29 0,40
Beispiel 2.
40 g wie gemäss Beispiel l teilweise abgebautes Dextran werden in einem Gefäss in 2 1 Wasser gelost. Alkohol wird dann sorg- fältig bei Zimmertemperatur wie in Beispiel 1 zugefügt. Wenn sich etwas Niedersehlag gebildet hat, wird die Mischung auf 40 C erwärmt, so dass sich der Niodersehlag wieder löst. Das Gefäss wird hierauf in einen Thermostat von der Temperatur von + 20 C eingebracht und über Nacht stehengelassen.
Der gebildete Niederschlag wird durch De kantieren abgetrennt, wieder gelöst und zwei- mal wieder gefällt. Die Fraktionierung wird auf gleiche Weise fortgesetzt durch sukzes- sives Erhöhen der Alkoholkonzentration.
Wenn fünf Fraktionen erhalten worden sind, wird mit der Fraktionierung aufgehort. Die Resultate des Versuches sind in der Tabelle 2 ? dargestellt. Zentrifugierungs-und Diffusions- versuche zeigen, dass die erhaltenen Fraktionen bedeutend einheitlicher sind in bezug auf das Molekulargewicht als das durch den Abbau des Dextrans erhaltene Produkt.
Tabelle 2.
Nr. der Alkohol Gewicht der
Fraktion in cm Fraktion in g [#] I 1475 sehr klein
II 90 2,67 0,48
III 70 3,59 0,38
IV 120 6, 40 0,29 V 150 4, 16 0,25
Beispiel 3.
Für diesen Versuch wird ein teilweise hydrolisiertes Dextran verwendet, das noch weiter abgebaut ist, als wie in Beispiel 1 be schrieben wurde. Es wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1 erhalten, aber nach etwa 70stündiger Hydrolyse. Es werden 200 cm3 einer 2 /oigen Losung dieses teilweise abgebauten Dextrans bereitet. Die Fraktionierung wird in gleicher Weise wie in Beispiel 2 durch sukzessive Erhöhung der Alkoholkonzentration durchgefiihrt. Ultrazentrifugierungsund Diffusionsversuche zeigen, dass die erhaltenen Fraktionen in bezug auf das Mole kulargewicht bedeutend einheitlicher sind als das naeh dem Abbau des Dextrans erhaltene Produkt.
Die Resultate sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt.
Tabelle 3.
Nr. der Alkohol Gewicht der
Fraktion in cm3 Fraktion in [#]
I 180 0,86 0,18
II 35 1,51 0,13
III 50 0,66 0,11
IV 10 0,41.0,09 (Die letzte Fraktion wurde erhalten, nachdem die Lösung auf ein kleines Volumen ein geengt worden war.)
Beispiel 4.
7 kg in gleicher Weise wie in Beispiel 3 teilweise abgebautes Dextran werden in so viel destilliertem Wasser gelöst, daR 70 kg Lösung erhalten werden. Die Lösung wird auf einer Temperatur von ungefähr 10 C über Zimmertemperatur gehalten. Es werden nun zuerst 37,6 kg 95 iger Alkohol unter Rühren zugesetzt. Die Mischung wird nun bei Zimmertemepratur stehengelassen und der sich bildende Niedersehlag abgetrennt. Hierauf werden weitere 40 kg Alkohol zugesetzt und der nach Stehenlassen der Mischung bei Zimmertemperatur (20 C) sich bildende Niederschlag abgetrennt. Dieser Niedersehlag wird getrocknet und gewogen. Die zuerst abgetrennte Fällung wog 1,1 kg, die zweite Fällung 4,6 kg.
Aus diesen zwei Fraktionen wurden 6 /oige wässrige Lösungen hergestellt, deren Viskosität dann gemessen wurde. Die relative Viskosität der ersten Fraktion betrug 4,9 und die der zweiten Fraktion 3,5. Eine gewisse Menge von niedriger molekularem ab gebautem Dextran ging bei der Fällung verloren. Auf diese Weise wurde eine Substanz erhalten, die besser geeignet ist für Injektionszwecke als das unfraktionierte Produkt, welches direkt durch den Abbau des Dextrans erhalten wurde.
Beispiel 5.
Zu 500 cm3 einer 46/oigen hochviskosen rohen Dextranlösung werden 200 cm3 einer Enzymlösung zugesetzt, welche durch Extraktion einer Cellvibrio-fulva-Kultur mit Wasser hergestellt worden ist. Der pll der Lösung beträgt 5,2 und die Temperatur wird auf 25 C gehalten. Nach drei Tagen wird das gebildete Dextranabbauprodukt mit Alkohol gefällt. Das teilweise abgebaute Dextran wird hierauf nochmals in Wasser gelöst und durch Dialyse gegen Wasser in einem Cellulosebeutel gereinigt, mit Alkohol gefällt und ge- troeknet.
3,0 g des so erhaltenen teilweise abgebauten Dextrans werden in fein pulverisier- tem Zustand in einer Mischung von 50 cm3 Wasser und 34 cm3 96%igem Alkohol suspen- diert. Die Mischung wird während 24 Stunden auf 25 C gehalten und von Zeit zu Zeit geschiittelt. Die überstehende Flüssigkeit wird hierauf abgegossen. Aus derselben wird das teilweise abgebaute Dextran durch Zugabe von überschüssigem Alkohol ausgefällt.
Sowohl dieses Dextran als auch dasjenige, welches nicht in Lösung gegangen ist, wird bei 105 C getrocknet. Bei der Durchführung der Versuche wurden aus beiden Proben 2 /oige Losungen in Wasser hergestellt, ebenso auch aus dem ursprüngliehen teilweise abgebauten Dextran. Für diese drei Lösungen wurde die Viskosität bei 25O C gemessen. Die spezifische Viskosität der nach dem Abbau erhaltenen Substanz betrug 0, 56, die des ungelösten Dextrans 0,58 und die des in Lösung gegangenen Dextrans 0,40.